Riggio Marilisa, Scudiero Rosaria, Borrelli Lucia, De Stasio Roberta ...

Micronutrienti metallici e metalli pesanti in Anfibi e Rettili del Matese 145
condividono le stesse caratteristiche topologiche, con tre domini transmembrana
e un dominio idrofilico extracellulare aminoterminale comprendente regioni ricche
di istidina e di metionina.
Proteine coinvolte nell’accumulo di metalli traccia nei lacertiliani P.sicula e P. muralis
Le metalloproteine contenute nel fegato di Podarcis sicula sono state identificate
mediante la procedura descritta nei materiali e metodi. L’estratto epatico, dopo
precipitazione con solventi organici, è stato incubato con CdCl 2
al fine di sostituire
lo Zn ++ , naturalmente complessato con le proteine, con il Cd ++ . Tale sostituzione
è stata effettuata allo scopo di rendere più sensibile la determinazione del contenuto
di metallo mediante lo spettrofotometro ad assorbimento atomico. L’estratto
è stato frazionato per cromatografia di permeazione molecolare su colonna di
Sephadex G-75. Il profilo di eluizione dimostra che i due metalli coeluiscono
sotto forma di due picchi (I e II). Il picco I eluisce con proteine di elevato peso
molecolare, il picco II eluisce nella zona in cui eluisce la MT di mammifero utilizzata
come standard.
Le sequenze aminoacidiche delle metallotioneine di P. sicula e di P. muralis sono
state dedotte dalle sequenze nucleotidiche dei cDNA clonati. I cDNA a doppio
filamento sono stati amplificati usando come primer 5' specifico un oligonuclotide
denominato PMT1 disegnato sulla sequenza codificante i primi sette aminoacidi
della sequenza N-terminale di una MT di osteitto. I prodotti da PCR ottenuti, di
circa 350 bp, contenevano l’estremità carbossiterminale della proteina e la regione
non tradotta al 3'. La sequenza completa del cDNA è stata ottenuta applicando il
protocollo per la 5' RACE descritto nei Metodi, usando come primer specifico un
oligonucleotide denominato PMT2, complementare ad un tratto di sequenza
comune ad entrambe le MT. I prodotti da PCR sono stati ligati nel vettore
plasmidico TOPO TA vector, clonati in E. coli e sequenziati. La sequenza
nucleotidica della MT di P. sicula consiste di una regione codificante di 189 bp,
fiancheggiata da due sequenze non tradotte al 5' e al 3' di 30 e 108 nucleotidi
rispettivamente. La sequenza della MT di A. fragilis comprende una regione codificante
di 189 nucleotidi e due regioni non codicanti al 5' e al 3' di 12 e120
nucleotidi rispettivamente.
Dall’allineamento delle sequenze aminoacidiche delle MT di Podarcis sicula e Anguis
fragilis con le MT di altri Vertebrati risulta che la sequenza N-terminale (MDPQD),
il maggiore epitopo antigenico della molecola, è identica in Podarcis, Anguis, Xenopus
e negli Uccelli, mentre differisce da quella degli Osteitti, nella quale mancano i
residui glutammina (Q) e acido aspartico (D), e da quella dei Mammiferi, in cui
manca la glutammina (Q) e l’ acido aspartico (D) è sostituito dall’asparagina (N).
È noto che l’espressione tissutale delle MT può aumentare in conseguenza dell’
incremento della concentrazione di metalli pesanti presente nell’ambiente in cui