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142 RIGGIO ET AL Cromatografia per gel filtrazione di un estratto da fegato di Podarcis sicula Campioni di fegato prelevati dal lacertiliano Podarcis sicula sono stati omogenizzati in acetone preraffreddato e centrifugati. I residui sono stati essiccati sotto vuoto a temperatura ambiente. Le polveri acetoniche ottenute sono state estratte in tampone Tris-HCl 50 mM pH 8,6 e successivamente sottoposte ad un doppio trattamento con solventi organici, che determina la precipitazione selettiva delle metalloproteine (Comeau et al., 1992). Il campione ottenuto è stato incubato con CdCl 2 e cromatografato su una colonna di Sephadex G-75 equilibrata con tampone Tris-HCl 20 mM pH 8,6. L’eluato è stato analizzato per contenuto di Cu e Cd ed assorbanza a 280 nm (<strong>Scudiero</strong> et al., 1997). Retrotrascrizione dell’RNA epatico, amplificazione del cDNA codificante le proteine MT e CTR e 5' RACE L’RNA totale è stato estratto dal fegato di P. sicula e A. fragilis utilizzando il reagente TRI-REAGENT (Sigma Chemical), secondo il metodo messo a punto da Chomcyznski & Sacchi (1987). Il cDNA a singola elica è stato prodotto dall’ RNA totale da tessuto epatico di P. sicula e A. fragilis mediante polimerizzazione con l’enzima Trascrittasi inversa. La PCR è stata condotta utilizzando come DNA stampo il cDNA a singola elica ottenuto dalla reazione di trascrizione inversa. Per ciascuna reazione sono stati utilizzati un primer non specifico e un primer specifico disegnato sulla base di sequenze consenso delle proteine MT e CTR. I prodotti da PCR sono stati clonati in vettori plasmidici (<strong>Riggio</strong> et al., 2000). La 5'-RACE è stata effettuata utilizzando il kit di amplificazione Marathon (fornito dalla Clontech). Per la reazione di PCR sono stati utilizzati come primer specifici oligonucleotidi disegnati sulla base delle sequenze parziali delle proteine MT e CTR precedentemente ottenute. Le sequenze nucleotidiche e amminoacidiche sono state analizzate utilizzando programmi al computer, quali Blast, Fasta e Clastal X, presenti al sito www.ebi.ac.uk. Risultati e discussione Accumulo di metalli pesanti nei tessuti di P. muralis e di Rana synklepton esculenta Allo scopo di determinare il contenuto di “metalli traccia” nei tessuti delle specie esaminate, frammenti di tessuto sono stati sottoposti a combustione totale come descritto nei metodi, e il contenuto di zinco, rame e cadmio è stato determinato mediante spettrofotometria ad assorbimento atomico. I risultati ottenuti, riportati nelle tabelle I e II, dimostrano che lo zinco e il rame sono presenti in tutti i tessuti esaminati e il contenuto di zinco è generalmente maggiore rispetto a quello del rame. Ciò non è sorprendente perché, di norma, in situazioni fisiologiche, il contenuto tissutale di rame è di uno o più ordini di grandezza inferiore a
Micronutrienti metallici e metalli pesanti in Anfibi e Rettili del Matese 143 Zinco (ng/mg tessuto) Tessuti 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Fegato 76.00 132.00 84.00 240.00 120.00 24.00 70.00 140.00 90.00 40.00 50.00 40.00 35.00 Intestino N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. 110.00 N.D. 110.00 50.00 80.00 40.00 60.00 Pelle 142.00 40.00 42.00 68.00 36.00 N.D. 40.00 43.00 50.00 60.00 50.00 40.00 70.00 Muscolo 40.00 240.00 58.00 82.00 35.00 53.00 50.00 N.D. 50.00 50.00 N.D. 60.00 60.00 Lingua 100.00 148.00 226.00 44.00 47.00 N.D. N.D. 55.00 100.00 90.00 N.D. 130.00 70.00 Rame (ng/mg tessuto) Tessuti 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Fegato 4.50 10.50 11.56 44.2 6.8 4.00 1.70 16.5 6.10 2.80 2.30 3.90 2.80 Intestino N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. 7.10 N.D. 7.40 3.30 2.80 3.60 4.10 Pelle 4.44 2.74 1.38 3.20 2.70 N.D. 1.70 2.30 2.20 0.80 1.50 1.40 1.13 Muscolo 1.34 8.06 6.06 7.420 3.30 6.20 1.30 N.D. 1.05 5.30 N.D. 1.50 3.26 Lingua 5.20 17.54 42.00 2.60 5.20 N.D. N.D. 2.90 2.10 3.20 N.D. 3.00 2.30 Cadmio (ng/mg tessuto) Tessuti 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Fegato 0.90 1.19 2.40 3.10 0.97 1.70 0.80 1.50 1.00 2.40 1.60 1.00 0.32 Intestino N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. 2.30 N.D. 0.90 1.60 1.70 1.20 1.10 Pelle 0 0 0 0 0 N.D. 0 0 0 0 0 0 0 Muscolo 0 0 0 0 0 0 0 N.D. 0 0 N.D. 0 0 Lingua 0 0 0 0 0 N.D. N.D. 0 0 0 N.D. 0 0 Tabella I. Contenuto di zinco, rame e cadmio nei tessuti di P. muralis quello dello zinco. Dall’analisi statistica dei dati, non si riscontrano differenze significative nel contenuto di zinco e rame nei vari tessuti. Il cadmio è presente in quantità rivelabili solo nel fegato e nell’intestino degli individui esaminati. Poiché l’assunzione degli oligoelementi metallici è mediata dall’alimentazione, è verosimile ipotizzare la presenza di una contamiznazione ambientale da cadmio. Tuttavia tale eventuale contaminazione non è necessariamente riconducibile ad attività antropiche localizzate nell’area del Matese, essendo il cadmio un elemento volati-
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