Mitogen-stimulated DAT: a new method for the ... - Blood Transfusion

W Barcellini et al.Conclusions. In the test described here mitogenstimulation seems able to disclose a latent anti-RBCautoimmunity, both in AIHA in clinical remission and inB-CLL. MS-DAT could be proposed as an additional testfor the diagnosis and monitoring of AIHA, and for thescreening of those pathological conditions in which anti-RBC autoimmunity is known to be potentially harmful.Key words: AIHA, B-CLL, autoimmunity, mitogenstimulatedDATIntroductionAutoimmune haemolytic anaemias (AIHA) are aheterogeneous group of disorders characterised by the presenceof auto-antibodies directed against red cell surface antigens,and by a variable clinical picture and severity of haemolysis.AIHA can be distinguished in "warm" and "cold" basedon the thermal properties of the antibody, and in "primary"(idiopathic) and "secondary" to underlying disease. Thehallmark of AIHA is a positive direct antiglobulin test (DAT),by which IgG and/or complement (C3d) are found on the redblood cell (RBC) surface 1 .The vast majority of patients with AIHA present apositive DAT. However, in a minority of patients with AIHAthe DAT may be weakly positive in spite of fairly severehaemolysis in the patient. In some of these patientsunbound auto-antibody may be present in the serumalthough the patients' red cells are clearly not saturatedwith antibodies 2 . Moreover there are now many welldocumented cases of patients with the disease in whomno red cell-bound auto-antibody could be demonstratedby standard procedures 3-7 . In these patients, the diagnosisof DAT negative AIHA is made on the basis of theexclusion of other causes of haemolysis and of the clinicalresponse to steroid therapy.There are many laboratory techniques to detect anti-RBC antibodies. The traditional agglutination techniqueis relative insensitive, since commercially available reagentsprepared for routine use usually yield a positive reactionwhen a minimum of 100-150 antibodies attach to the surfaceof each erythrocyte 8 .More sensitive DAT techniques, such as thecomplement-fixing antibody consumption test 6,9 , variousimmunoradiometric ELISA and cytofluorimetric assays 10-14and the solid phase antiglobulin test 15 have been reportedto give positive results in some patients with negativeconventional DAT.However since all the methods available could give128dell'antiglobulina in fase solida 15 , si sono dimostratepositive in alcuni pazienti affetti da MEA TAD-negativacon i tradizionali test. Pertanto, si raccomanda di utilizzareper la diagnosi di MEA una batteria di esami piuttosto cheun singolo test, dal momento che tutte le metodiche adisposizione possono dare risposte falsamente positive ofalsamente negative 16 .Recentemente abbiamo descritto un nuovo metodoper la ricerca di anticorpi antieritrocitari, basato sullastimolazione con mitogeni di colture di sangue intero edenominato MS-DAT (Mitogen Stimulated-DirectAntiglobulin Test). Il test si è dimostrato in grado dirilevare nelle MEA la modulazione della produzioneanticorpale da parte delle citochine ed è risultato positivoin alcuni casi di MEA TAD-negative in remissione clinica,probabilmente perché la stimolazione con mitogeniinduce una produzione anticorpale in vitro 17 . Abbiamoinoltre valutato, mediante MS-DAT, la produzione in vitrodi anticorpi antieritrocitari in pazienti affetti da leucemialinfatica cronica a cellule B (B-LLC), malattia nella qualesi riscontra frequentemente una MEA 18 . MS-DAT si èdimostrato positivo non soltanto nei casi evidenti di MEAma anche in una frazione di pazienti con B-LLC senzaanemia emolitica, suggerendo l'esistenza di forme latentidi autoimmunità antieritrocitaria in corso di B-LLC, chepotrebbero essere evidenziate utilizzando la stimolazionein vitro con mitogeni 19 .Lo scopo di questo lavoro è di indagare l'incidenza diMS-DAT positività in un maggior numero di MEA sia TADpositiveche TAD-negative in fase diversa di attività clinicanonché in pazienti affetti da B-LLC con o senza MEA TADpositiva.Inoltre, è stato investigato il significato del test,eseguendolo routinariamente durante il monitoraggioclinico dei pazienti affetti da MEA e correlando i risultaticon il decorso clinico, i parametri emolitici e la risposta allaterapia.Materiali e metodiTAD, ricerca e identificazione degli anticorpiIl TAD in provetta è stato eseguito secondo la tecnicastandard, impiegando sieri antiglobuline poli emonospecifici. Si sono utilizzati reagenti monoclonali delcommercio (anti-IgG+C, anti-IgG, anti-C3d e anti-C3c), sieridi coniglio anti-IgA umane e sieri di capra anti-IgM umane,forniti dall'Ortho-Clinical Diagnostics (Raritan, NJ, USA),dalla Bioscot Ltd (Edimburgo, Scozia) e dalla GammaBiologicals Inc (Houston, TX, USA). I risultati vengonoBlood Transf 2003; 2: 127-36