Agosto 2009 - Enea

minato cut-off, arbitariamente posto al 20% nelle leucemieacute (Bain, Barnett et al. 2002). A tutti i campionicon percentuale inferiore al 20% veniva attribuito unoscore di 0, mentre a tutti i campioni con percentuale egualeo superiore al 20% veniva attribuito uno score di 1.Il metodo del cut-off, applicato acriticamente, confondesistematicamente le popolazioni negative con le popolazionidebolmente, ma omogeneamente positive trasformandoin negativa una popolazione debolmente positiva.Nel Metodo Alternativo viene invece considerata lamediana del parametro indagato e viene consideratopositivo al 100% un test il cui spostamento rispetto alcontrollo (dato dalla differenza di inizio dei due istogrammi),sia almeno pari al 10% dell’intensità medianadi fluorescenza del controllo.Il campione veniva considerato positivo per il parametroanalizzato quando il suo valore di RFI (ratio of fluorescenceintensity) superava un valore di cut-off posto a1,5. Il valore di RFI veniva prodotto dividendo l’intensitàdi fluorescenza mediana del parametro indagato el’intensità di fluorescenza mediana del proprio controllonegativo.Tale valore veniva arbitrariamente portato a 1,5 nel tentativodi minimizzare gli effetti di eventuali shift strumentali,prediligendo così la robustezza del metodo a discapitodella sua sensibilità. A questo punto veniva adottato unduplice approccio. Nel primo approccio, detto metodoalternativo “qualitativo”, a tutti i campioni con RFIinferiore a 1,5 veniva attribuito uno score di 0, mentre aicampioni con RFI superiore a 1,5 veniva attribuito unoscore di 1. Si otteneva quindi una divisione dei risultati (0= negativo, 1 = positivo) concettualmente simile a quellaottenuta con il metodo tradizionale. Il confronto dei risultatipermetteva una valutazione differenziale dei duemetodi, in quanto eventuali differenze nella distribuzionedegli score erano riconducibili esclusivamente allaaumentata sensibilità del metodo alternativo. Nel secondoapproccio, detto metodo alternativo “quantitativo”,si sceglieva di attribuire a tutti i campioni con RFI inferiorea 1,5 uno score di 0, mentre ai campioni con RFIsuperiore a 1,5 venivano registrati con uno score di 1 nelcaso di RFI posto fra 10 0 e 10 1 , con uno score di 2 nelcaso di RFI posto fra 10 1 e 10 2 , e con uno score di 3 nelcaso di RFI posto fra 10 2 e 10 3 . Si procedeva quindi alconfronto tra i due approcci allo scopo di valutarel’impatto esercitato sui risultati finali da una metodologiadi registrazione che tenesse in considerazione non solamentela positività o la negatività, ma anche le diverseintensità di espressione degli antigeni esplorati.I risultati delle analisi dei singoli parametri, condottimediante i tre metodi citati (metodo tradizionale, metodoalternativo “qualitativo”, e metodo alternativo“quantitativo”), venivano organizzati in matrici, le cuirighe corrispondevano ai parametri indagati, e le cuicolonne corrispondevano ai soggetti studiati. Le matricicosì ottenute venivano quindi sottoposte ad analisi dicluster non supervisionata, adottando come parametricomputazionali le opzioni “complete linkage” e “correlationsimilarità”.I risultati ottenuti venivano quindi visualizzati mediantetecniche gerarchiche orizzontali di visualizzazione adalbero (horizontal hierachical tree plot). Le tecniche diclusterizzazione e di visualizzazione ad albero venivanoeseguite mediante i software “Cluster” e “Treeview”,generalmente usati nell’analisi dei dati prodotti daglistudi di gene expression, e liberamente disponibili pressoil sito http://rana.lbl.gov/EisenSoftware.htm (Eisen,Spellman et al. 1998).La semplice osservazione delle positività ottenute con ilmetodo “tradizionale” e con il metodo “alternativo” permettevadi rilevare come il metodo “alternativo” risultipiù sensibile, evidenziando nella popolazione indagata unnumero maggiore di casi positivi per un dato parametro. E’tuttavia interessante rilevare come l’aumento della percentualedi positività non riguardi tutti i parametri nello stessomodo, ma sembri prediligere gli antigeni legati alla maturazionemieloide, che probabilmente giocano un ruolo fisiologicoanche se espressi in membrana con un numero di molecolerelativamente basso. Il metodo alternativo non comportainvece nessun vantaggio selettivo nell’analisi di unaserie di antigeni linfoidi, tra cui segnatamente CD5, CD7,CD10, CD19, CD20 e TdT, che risultano omogeneamentenegativi con ambedue i metodi.L’analisi di cluster veniva condotta separatamente sullematrici di risultati ottenute rispettivamente mediante ilmetodo tradizionale, sulle matrici di risultati ottenutemediante il metodo alternativo con approccio qualitativo,e sulle matrici di risultati ottenute mediante il metodoalternativo con approccio quantitativo. In tutti icasi, alla luce dei risultati ottenuti dalla revisione dei datiprodotti dall’analisi citometrica, si espungevano dallematrici i valori relativi all’analisi degli antigeni CD5,CD7, CD10, CD19, CD20 e TdT.Il risultato dell’analisi di cluster della matrice degli scoreottenuti mediante applicazione del metodo tradizionalerisolve la popolazione in due cluster principali (Fig.1); lapopolazione globale può comunque essere assimilata aquattro gruppi principali, di cui uno più fenotipicamentelontano, e tre più vicini fra di loro, e riuniti nel secondocluster principale. Il cluster colorato in giallo appare particolarmenteinteressante per il suo comportamento e peralcune caratteristiche biologiche dei suoi componenti.Passando dalla clusterizzazione della matrice degli scoreottenuti mediante applicazione del metodo tradizionale aquella degli score ottenuti mediante applicazione delmetodo alternativo qualitativo (Fig.1), si assiste a untotale rimaneggiamento dei gruppi, con la notevole eccezionedel cluster colorato in giallo, che tende a mantenersiaggregato, pur riducendosi di numerosità. Il processo dirimaneggiamento aumenta ulteriormente passando allaclusterizzazione della matrice degli score ottenuti medianteapplicazione del metodo alternativo quantitativo28 ATTIVITÀ SCIENTIFICA Lettere GIC Vol. 18, Num. 2 - Agosto 2009