Alice Fernandes Pinto Fertilidade Feminina: O Tabagismo e a ...

_________________________________________________________Material e Métodos
Preparam-se dois gradientes de densidade de partículas de sílica – 80% e 55% –
(Supra Sperm System, with phenol red, MediCult®, Dinamarca) em tubos cónicos de
centrífuga (Nunc®, Dinamarca), sobre o qual se adicionou a amostra de sémen. Após
centrifugação a 600G durante 15 minutos rejeitou-se o sobrenadante.
Ressuspendeu-se o pellet em novo tubo, onde se procedeu a duas lavagens
sucessivas com SPM por centrifugações a 300G durante 10 minutos. Após a recolha do
pellet, adicionou-se SPM, e incubou-se na estufa a 37ºC, sob atmosfera húmida a 5% de
CO2, de forma a que os espermatozóides de melhor qualidade ascendessem à superfície
pela técnica de swim-up. Com este procedimento seleccionaram-se os espermatozóides a
usar nas técnicas de RMA.
2.6 AS TÉCNICAS DE REPRODUÇÃO MEDICAMENTE ASSISTIDA
2.6.1 FIV
Os ovócitos, depois de lavados em SPM foram colocados numa placa de 4 poços
em meio IVF TM e colocados na estufa a 37ºC, sob atmosfera húmida a 5% de CO2. Cerca
de aproximadamente 4 horas da PF os ovócitos foram inseminados com um total de
100.000/ml de espermatozóides móveis em 0,7 ml de meio IVF TM em placa de 4 poços
(Nunc®, Dinamarca).
2.6.2 ICSI
Após incubação dos ovócitos durante 3 a 6 horas em estufa a 37ºC sob atmosfera
húmida a 5% de CO2, estes foram desnudados através da remoção das células do complexo
cumulus-corona antes da fecundação, quer por acção enzimática, tendo sido colocados
cerca de 20 segundos em Hyadase (Synvitro Hyadase; MediCult®, Dinamarca), quer por
acção mecânica com auxílio de uma pipeta de desnudação (Swemed®, Suécia). Após
sucessivas lavagens em SPM, a fim de retirar o excesso de enzima, os ovócitos foram
transferidos novamente para a estufa.
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