expressão da alfa e beta amilase durante a ... - Deag.ufcg.edu.br

Revista Brasileira de Produtos Agroindustriais, Campina Grande, v.12, n.1, p.67-73, 2010 67<br />
ISSN 1517-8595<br />
EXPRESSÃO DA ALFA E BETA AMILASE DURANTE A GERMINAÇÃO DE<br />
CEVADA<br />
Iratan Jorge dos Santos 1 , Yaro Luciolo dos Santos 2 , Maria Goreti de Almeida Oliveira 3 ,<br />
Paulo Henrique Alves da Silva 4<br />
RESUMO<br />
O presente trabalho teve o objetivo de monitorar a expressão da alfa e beta amilase, durante o<br />
processo de maltagem. Foram utilizadas sementes de cevada (Hordeum vulgare L.) da<br />
variedade BR-2, umedecidas em bandejas de inox, através do processo cíclico 2/4/1/4/1<br />
intercalado que envolve umedecimento com água potável seguido de repouso a 20ºC, em<br />
seguida foi colocada para germinar com camada de 4 cm de espessura a 16ºC por 84 horas com<br />
umidade em torno 42 – 45 %, repondo água de 16 e 32 horas. Foram retiradas amostras em<br />
intervalos regulares de 8 horas para testes enzimáticos. Durante a germinação as atividades da<br />
enzima alfa amilase foram crescentes com incremento 24 e 72 horas. Com os maiores picos de<br />
aumento em relação ao tempo de germinação, pode-se monitorar a formação da enzima<br />
sugerindo melhores hidrólises amiláceas. Já a beta amilase Os maiores incrementos da atividade<br />
foram notados após 24, 32, e 64 horas de germinação. O estudo dos maiores aumentos dessa<br />
enzima em função da faixa de tempo de germinação pode fornecer informações necessárias para<br />
produção de malte com teores enzimáticos variados, sendo também importante, por ser<br />
indicativo de melhor poder diastático, crucial na produção de açúcares redutores.<br />
Palavra-chave: Hordeum vulgare L.; enzimas; maltagem; poder diastático.<br />
EXPRESSION OF ALPHA AND BETA AMYLASE DURING THE GERMINATION OF<br />
BARLEY<br />
ABSTRACT<br />
This study seeks to monitor the expression of alpha and beta amylase during malting process.<br />
Seeds of barley (Hordeum vulgare L.) of the variety BR-2, in trays of moistened steel, through<br />
cyclical process involving wetting 2/4/1/4/1 intermingled with drinking water put to rest at 20 °<br />
C were then placed to germinate on a 4 cm thick layer at 16 ° C for 84 hours at a humidity level<br />
ranging from 42 to 45%. Water was restored at intervals of 16 - 32 hours. Samples were taken<br />
at regular intervals of 8 hours for enzyme tests. During germination, the activity of the alpha<br />
amylase enzyme increased with time extension to 24 and 72 hours. At the highest increasing<br />
peaks, in relation to germination time, one can monitor the formation of the enzyme and suggest<br />
better amylases hydrolysis. As for the beta amylase, the biggest increases in activity were noted<br />
after 24, 32, and 64 hours of germination. The study of the largest increase of this enzyme as a<br />
function of time of germination may provide the information needed to produce malt with<br />
varied enzyme levels, being also an important indication of much better diastatic power –<br />
crucial for the production of sugars.<br />
Keyword: Hordeum vulgare L., enzymes, malting, diastatic power<br />
.<br />
Protocolo 103.002 80 de 25/09/2008<br />
1 Professor Doutor do Departamento de Tecnologia – Universidade Estadual de Feira de Santana. Br 116, km 03 Campus Universitário<br />
CEP:44031-460 Feira de Santana – BA, Brasil. E-mail: iratanjs@yahoo.com.br.<br />
2 Mestrando do Departamento de Microbiologia – Universidade Federal de Viçosa. Avenida Peter Henry Rolfs s/n, Campus Universitário,<br />
CEP 36579-000 Viçosa – MG, Brasil. E-mail: yarovines@hotmail.com<br />
3 Professora Doutora do Departamento de Bioquímica – Universidade Federal de Viçosa. Avenida Peter Henry Rolfs s/n, Campus<br />
Universitário, CEP 36579-000 Viçosa – MG, Brasil. E-mail: malmeida@ufv.br.<br />
4 Professor Doutor do Departamento de Tecnologia de Alimentos - Universidade Federal de Viçosa. Avenida Peter Henry Rolfs s/n, Campus<br />
Universitário, CEP 36579-000 Viçosa – MG, Brasil. E-mail: phsilva@ufv.br<br />
Revista Brasileira de Produtos Agroindustriais, Campina Grande, v.12, n.1, p.67-73, 2010

68 Expressão da alfa e beta amilase durante a germinação de cevada Santos et al.<br />
INTRODUÇÃO<br />
Na germinação da semente de cevada<br />
durante a etapa de maltagem ocorrem três fases<br />
evidentes: embebição de água, alongamento da<br />
célula e aumento do número de células. O<br />
início da germinação da cevada ocorre somente<br />
a partir de determinados teores de umidade<br />
acima de 30% (Ma et al., 2002; Helland et al.,<br />
2002).<br />
As enzimas na cevada são produzidas<br />
como resultado da ação de hormônios, que são<br />
distribuídos com a penetração de água do<br />
escutelo ao longo da camada de aleurona<br />
(Maya-ampudia & Bernal-lugo, 2006). Dentre<br />
as enzimas produzidas a alfa e beta amilase<br />
caracterizam-se por serem as principais<br />
enzimas produzidas durante a germinação<br />
(Onyeka & Dibia, 2002; Muralikrishna &<br />
Nirmala, 2005).<br />
A alfa-amilase (1,4-α-Dglucanohidrolase,<br />
EC 3.2.1.1, enzima<br />
dextrinizante) pode atacar as cadeias dos<br />
componentes do amido em qualquer ponto no<br />
interior da cadeia linear. Isto eqüivale dizer que<br />
a alfa-amilase é uma endoenzima que hidrolisa<br />
ligações O-glicosídicas α(1-4), produzindo<br />
oligossacarídeos que contêm ligações α(1-6),<br />
além de glicose e maltose. As ligações α(1-6)<br />
não são quebradas pela alfa-amilase (Georgkraemer<br />
et al., 2000; Macgregor et al, 2001;<br />
Juge et al., 2006; Xiao et al., 2006; Eneje et al.,<br />
2004; Adewale et al., 2006).<br />
Segundo Kunze (1996), a alfa-amilase<br />
não está acentuadamente presente na cevada; a<br />
maior parte da alfa-amilase é produzida no<br />
segundo e quarto dias de germinação e a<br />
quantidade desta enzima pode ser aumentada<br />
durante o prolongamento da germinação.<br />
Segundo Georg-kraemer et al. (2000) é crucial<br />
saber os momentos de ascensão das amilases<br />
durante a germinação.<br />
A beta amilase, α-1,4- α glucan<br />
maltohidrolase (EC 3.2.1.2) é uma exoenzima e<br />
hidrolisa ligações α(1-4), a partir da<br />
extremidade não-redutora, produzindo maltose<br />
(Clark et al., 2003; Mohan et al., 2005; Brien &<br />
Fowkes, 2005; Sahlström et al., 2003).<br />
Antes da germinação, a beta-amilase já<br />
está presente em quantidades maiores na<br />
cevada, quando comparada à alfa-amilase.<br />
Depois de uma diminuição inicial, a quantidade<br />
de beta-amilase tem aumentos consideráveis no<br />
segundo e terceiro dias de germinação (Molinacano<br />
et al., 2000, 2001; Kunze, 1996).<br />
A quantidade de alfa e beta-amilase<br />
depende de vários fatores: variedade da cevada,<br />
condições climáticas, tamanho do núcleo<br />
embrionário, conteúdo de água mais elevado na<br />
produção de malte verde, temperatura de<br />
germinação e maceração; quanto mais elevada<br />
à temperatura, mais rápido é o processo (Saika<br />
et al., 2005). Em função da importância desses<br />
fatores se faz necessário o estudo das condições<br />
com determinação de variáveis específicas de<br />
forma a otimizar as atividades enzimáticas.<br />
O objetivo do presente trabalho foi<br />
examinar as mudanças na expressão da alfa e<br />
beta amilase no endosperma da cevada da<br />
variedade BR2 em termos de atividade<br />
específica durante a germinação no processo de<br />
maltagem, de forma a verificar as maiores<br />
produções em relação ao tempo de germinação.<br />
Baseado no ponto de vista que são enzimas de<br />
fundamental importância para fabricação da<br />
cerveja na etapa de mosturação, pois são<br />
responsáveis pela hidrólise dos polissacarídeos<br />
em açúcares mais simples.<br />
MATERIAIS E MÉTODOS<br />
O presente trabalho foi conduzido nos<br />
Laboratórios de Armazenamento e<br />
Processamento de Produtos Agrícolas<br />
(Departamento de Engenharia Agrícola), de<br />
Tecnologia e Produção de Sementes<br />
(Departamento de Fitotecnia) e de Enzimologia<br />
(Núcleo de Biotecnologia Aplicada a<br />
Agropecuária), todos da Universidade Federal<br />
de Viçosa, Viçosa-MG.<br />
Foram utilizadas sementes de cevada<br />
(Hordeum vulgare L.) da variedade BR-2,<br />
processadas, fornecidas pela Companhia<br />
Brahma (Filial Malteria Navegantes, Porto<br />
Alegre-RS).<br />
As principais etapas do processo de<br />
malteação utilizadas no experimento foram:<br />
classificação, maceração, germinação, secagem<br />
e desbrotamento (Figura 1).<br />
Revista Brasileira de Produtos Agroindustriais, Campina Grande, v.12, n.1, p.67-73, 2010

Expressão da alfa e beta amilase durante a germinação de cevada Santos et al. 69<br />
CLASSIFICAÇÃO<br />
MACERAÇÃO<br />
GERMINAÇÃO<br />
SECAGEM<br />
DESBROTAMENTO<br />
Figura 1 - Fases do processo de malteação da<br />
cevada.<br />
Na etapa de maceração foram utilizadas<br />
amostras de 300 g de cevada, acondicionadas<br />
em bandejas de alumínio inoxidável, em um<br />
ambiente com temperatura controlada a 20 o C.<br />
Utilizou-se um processo cíclico,<br />
denominado “2/4/1/4/1” intercalado, recomendado<br />
pela Empresa Brahma. Este processo<br />
consiste de três etapas, que envolvem<br />
umedecimento com água potável, seguido de<br />
repouso ao ar ambiente. Na primeira etapa, o<br />
período de reumedecimento foi de 2 horas e o<br />
de repouso, 4 horas. Na segunda, os períodos<br />
de reumedecimento e de repouso foram,<br />
respectivamente, de 1 e 4 horas. Finalizando,<br />
na terceira etapa, os grãos foram umedecidos<br />
durante 1 hora. As pesagens das amostras<br />
foram realizadas no início do teste e após 2, 6 e<br />
12 horas. Os grãos, durante o processo, foram<br />
revolvidos manualmente, para retirada de CO 2 .<br />
Em todos os testes, as bandejas<br />
provenientes da etapa de maceração, contendo<br />
camadas finas de 4 cm de grãos, para facilitar o<br />
controle de CO 2, foram colocadas em<br />
germinadores a 16 o C, onde permaneceram<br />
durante 84 horas. O teor de água do produto,<br />
controlada por pesagens periódicas em balança<br />
eletrônica, foi mantida em torno de 42 – 45%<br />
b.u., com reposição de água nos intervalos de<br />
tempo de 16 e 32 horas. A quantidade de água<br />
usada na reposição foi determinada pela<br />
equação:<br />
⎛ ⎞<br />
⎜<br />
100 −U<br />
i<br />
Mt<br />
⎟<br />
f<br />
= Mti<br />
(1)<br />
⎝100<br />
−U<br />
f ⎠<br />
Mt f = massa total final; Mt i = massa total<br />
inicial; U i = umidade inicial; U f = umidade<br />
final.<br />
Durante o período de germinação<br />
(84 horas), foram retiradas amostras em<br />
intervalos regulares de 8 horas. Estas amostras<br />
foram submetidas a testes enzimáticos, para o<br />
acompanhamento do desenvolvimento da<br />
atividade da beta-amilase.<br />
Cinco gramas de malte, finamente<br />
triturados, foram dissolvidos em 100 ml de<br />
cloreto de sódio 0,5%, permanecendo por 1<br />
hora a 30 o C, em constante agitação. Em<br />
seguida, foram centrifugados (9.000 rotações<br />
por 5 minutos) e filtrados em papel-filtro. Dez<br />
mililitros do filtrado, diluídos em 100 ml de<br />
cloreto de sódio 0,5%, foram deixados à<br />
temperatura ambiente, antes da determinação<br />
da atividade.<br />
Foram pipetados 0,04 – 1,0 ml da<br />
solução de maltose com 5 micromoles/ml,<br />
fazendo-se a diluição para 2 ml, em cada tubo,<br />
com água deionizada. Após adicionar 1 ml de<br />
ácido dinitrossalicílico reativo de cor à solução,<br />
esta foi incubada em banho de água fervente,<br />
durante 5 minutos. Após o resfriamento à<br />
temperatura ambiente, a solução foi diluída<br />
com 10 ml, de água deionizada, em cada tubo,<br />
e fez-se a leitura a 540 nm, com o aparelho<br />
calibrado com o branco. Foi determinada a<br />
maltose liberada na curva-padrão.<br />
A atividade da alfa-amilase foi<br />
determinada pelo método de Bernfeld (1955),<br />
utilizando amido como substrato. Para isto, foi<br />
pipetado 0,5 ml da solução de extrato de cevada<br />
ou malte ou água, no caso do controle,<br />
adicionado a 0,5 ml da solução de amido 1%<br />
(p/v), em tampão fosfato de sódio 0,2 M, pH<br />
6,9, com 0,006 M de cloreto de sódio. Após a<br />
incubação dessa solução durante 3 minutos, a<br />
25 o C, adicionou-se 1 ml de ácido<br />
dinitrossalicílico 1% (p/v), reativo de cor, e,<br />
novamente, ela foi incubada durante 5 minutos,<br />
em banho-maria. Após este procedimento,<br />
levou-se a solução a 25 o C e, em seguida, foram<br />
adicionados 10 ml de água deionizada,<br />
determinando-se a absorvância da mistura de<br />
reação a 540 nm. A quantidade de micromoles<br />
de maltose liberada foi obtida por meio da<br />
curva-padrão. A partir desses valores, foram<br />
calculadas as atividades, utilizando a seguinte<br />
equação:<br />
Revista Brasileira de Produtos Agroindustriais, Campina Grande, v.12, n.1, p.67-73, 2010

70 Expressão da alfa e beta amilase durante a germinação de cevada Santos et al.<br />
Micromoles liberados<br />
U mg = (2)<br />
3 minutos x mg proteinas<br />
Utilizou-se o mesmo procedimento<br />
anterior, para determinação da beta-amilase.<br />
Neste caso, a solução-tampão utilizada foi<br />
acetato de sódio 0,016 M, pH 4,8.<br />
As dosagens de proteínas foram<br />
realizadas pelo método do ácido bicinconínico<br />
Smith et al. (1985), utilizando albumina sérica<br />
bovina como padrão, na concentração de 2,0<br />
mg/mL de água deionizada.<br />
Os compostos utilizados para reagir com<br />
as proteínas da cevada foram os reagentes A e<br />
B.<br />
Para o preparo do reagente A,<br />
dissolveram-se 1,0 de bicinconinato de sódio,<br />
160,0 mg de tartarato de sódio, 1,8 g de<br />
carbonato de sódio, 400,0 mg de hidróxido de<br />
sódio e 950,0 mg de bicarbonato de sódio, em<br />
100,0 ml de água deionizada, e o pH foi<br />
ajustado para 11,3.<br />
Para o preparo do reagente B,<br />
dissolveram 4,0 g de sulfato de cobre em 100,0<br />
ml de água deionizada.<br />
Para as dosagens, em triplicatas a 50 µl<br />
da amostra, adicionou-se 1,0 ml do reagente de<br />
trabalho (100:2 reagente A: reagente B). A<br />
solução foi agitada e levada para banho-maria a<br />
37 o C, por 30 minutos. Em seguida, os tubos<br />
foram resfriados à temperatura ambiente, por<br />
20 minutos, e a absorvância foi lida a 540 nm.<br />
RESULTADOS E DISCUSSÃO<br />
Procedendo ao processo germinativo do<br />
grão de cevada sob temperatura controlada de<br />
16°C foi conferido um incremento na enzima<br />
alfa-amilase (Figura 2).<br />
Figura 2 - Perfil de formação da alfa-amilase<br />
Nas primeiras horas de germinação, até<br />
atingir 8 horas, ocorreu redução, da atividade<br />
específica da enzima alfa-amilase de 79% que<br />
provavelmente segundo Georg-kramer et al.<br />
(2000), pode estar ligada a presença de um<br />
inibidor cujo principal propósito é amortecer a<br />
atividade da alfa amilase para evitar uma<br />
germinação prematura (Figura 2). Em trabalhos<br />
desenvolvidos por Kunze (1996) também foi<br />
observado que a alfa-amilase não está<br />
acentuadamente presente na cevada não<br />
malteada. No intervalo de tempo restante<br />
durante o processo germinativo a atividade da<br />
enzima permaneceu sempre em crescimento.<br />
Pode-se observar que nas 8 horas finais<br />
do primeiro dia, até completar 24 horas, ocorreu<br />
o primeiro grande aumento da enzima alfaamilase<br />
(141%), seguido de um aumento<br />
moderado até 64 horas (160%) (Figura 2). Após<br />
72 horas de germinação, notou-se um aumento<br />
acentuado da enzima, que passou de<br />
0,0437 U/mg (tempo zero) para 0,0828 U/mg<br />
(tempo 84 horas), resultados que estão de<br />
acordo com relatos de Kunze (1996), onde<br />
afirma que a maior parte da alfa-amilase é<br />
produzida no segundo e quarto dias de<br />
germinação e a quantidade desta enzima pode<br />
ser aumentada durante o prolongamento da<br />
germinação, quando são requeridos maltes<br />
muito ricos em enzimas para converter grandes<br />
quantidades de amido nas cervejarias. Também<br />
de acordo com trabalhos efetuados por Georgkraemer<br />
et al. (2000) os níveis das amilases<br />
produzidas na cevada aparecem em ascensão<br />
durante a maltagem com atividades diferentes<br />
ao longo do processo, e é importante determinar<br />
Revista Brasileira de Produtos Agroindustriais, Campina Grande, v.12, n.1, p.67-73, 2010

Expressão da alfa e beta amilase durante a germinação de cevada Santos et al. 71<br />
quando este momento ocorre durante a<br />
germinação porque é crucial para obter máxima<br />
produção da enzima para assegurar a<br />
degradação do amido em açúcares mais simples<br />
utilizados no processo fermentativo e para se ter<br />
um controle do tempo de germinação.<br />
Provavelmente os aumentos e<br />
diminuições na síntese da alfa amilase estão<br />
relacionadas a processo fisiológico na formação<br />
do grão e no desenvolvimento e início da<br />
germinação. Essa síntese está submetida ao<br />
controle hormonal das giberelinas na camada de<br />
aleurona (Maya-ampudia & Bernal-lugo, 2006;<br />
Muralikrishna & Nirmala, 2005).<br />
Durante as oito primeiras horas de<br />
germinação (Figura 3), foi observada redução,<br />
da atividade específica da enzima beta-amilase<br />
de 81% em relação ao total inicial da enzima.<br />
Isso pode estar relacionado provavelmente com<br />
a forma compacta em que a beta amilase está<br />
presente no grão de cevada, não tendo sua<br />
atividade totalmente evidenciada. Outras<br />
diminuições durante a germinação também<br />
foram observadas em trabalhos por Molinacano<br />
et al. (2001).<br />
Figura 3 - Perfil de formação da beta amilase em atividade específica<br />
No intervalo de tempo restante, a<br />
atividade da enzima foi sempre crescente<br />
(Figura 3) o que concorda com os resultados<br />
obtidos por Ziegler (1999) e Evans et al.<br />
(1997), que relataram aumentos sensíveis na<br />
atividade enzimática no decorrer da<br />
germinação. Foram observados três aumentos<br />
marcantes na atividade específica nos tempos<br />
de germinação de 24, 32 e 64 horas. Os<br />
resultados estão parcialmente de acordo com os<br />
de Kunze (1996), que relatou um aumento da<br />
enzima nos segundo e terceiro dias de<br />
germinação. As atividades dessa enzima podem<br />
estar relacionadas a processos fisiológicos<br />
ocorrentes na formação do grão e no inicio do<br />
desenvolvimento da germinação. Esses<br />
resultados estão de acordo com as pesquisas<br />
efetuadas por Evans et al. (1997) que também<br />
observou as maiores produções da beta amilase<br />
durante o desenvolvimento do grão tendo as<br />
maiores atividades no segundo dia de<br />
germinação e nos dias subsequentes, que podem<br />
estar relacionados à mudança da forma<br />
compacta para forma livre que ocorre nessa<br />
enzima. Em pesquisas realizadas por Wang et<br />
al. (2003) o autor afirma que a beta-amilase é<br />
sintetizada e acumulada durante<br />
desenvolvimento do grão, apresenta-se em duas<br />
formas principais: um complexo de proteína<br />
insolúvel (forma compacta) principalmente<br />
associado com a periferia dos grânulos de<br />
amido, e uma forma solúvel ou livre. A forma<br />
compacta é ligada por pontes de dissulfeto<br />
situadas na periferia dos endospermas dos<br />
grânulos de amido. A forma compacta não é<br />
completamente inativa, mas expressa uma<br />
fração da atividade após a liberação. A ativação<br />
enzimática pode ser em decorrência da redução<br />
das ligações dissulfeto levando a uma mudança<br />
na conformação na parte ativa ou em<br />
conseqüência de alguma despolimerização de<br />
oligômeros.<br />
A atividade de beta-amilase nesse<br />
experimento passou de 0,0510 U/mg (tempo<br />
zero) para 0,1136 U/mg (tempo 84 horas), um<br />
aumento de 2,23 vezes (Figura 3). A<br />
otimização do tempo de germinação<br />
adequado para atingir o nível de atividade da<br />
Revista Brasileira de Produtos Agroindustriais, Campina Grande, v.12, n.1, p.67-73, 2010

72 Expressão da alfa e beta amilase durante a germinação de cevada Santos et al.<br />
beta amilase e encerrar a germinação é<br />
fundamental para atingir bons resultados na<br />
maltagem. Para Georg-kramer et al. (2000)<br />
muitas empresas produtoras de malte vêm<br />
tentando reduzir o período de germinação no<br />
processo de maltagem, o que permitiriam a<br />
redução de despesas e a maltagem de uma<br />
quantidade de grãos em menos tempo. O<br />
processo de maltagem induz a germinação e<br />
assegura o crescimento da semente com<br />
produção de beta amilase de relevante<br />
influência no poder diastático.<br />
CONCLUSÃO<br />
Existe sempre uma tendência de aumento<br />
na atividade das duas enzimas.<br />
A beta amilase apresenta maiores<br />
atividades que a alfa amilase nas condições<br />
testadas<br />
Os maiores aumentos de atividade da alfa<br />
amilase acontecem após 24 e 72 horas de<br />
germinação. Já para beta amilase os maiores<br />
incrementos da atividade específica ocorrem<br />
após 24, 32, e 64 horas de germinação.<br />
O estudo dos maiores aumentos dessa<br />
enzima em função do faixa de tempo de<br />
germinação forneceu informações necessária<br />
para produção de malte com teores enzimáticos<br />
variados, podendo ser utilizado na hidrólise de<br />
amidos de varias origens.<br />
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