8 E 9 DE OUTUBRO DE 2012 Piracicaba - Genética - USP

ANAIS ANAIS 

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO 

ESCOLA SUPERIOR DE AGRICULTURA “LUIZ DE QUEIROZ” 

DEPARTAMENTO DE GENÉTICA 

o 

29o 

Encontro Sobre 

Temas de Genética e 

Melhoramento 

Tema: 

" Genômica Populacional e Genética 

da Conservação" 

8 e 9 de outubro de 2012 

http://www.genetica.esalq.usp.br/29temas/ 

http://twitter.com/lgn_esalq_usp/

ANAIS 

29º ENCONTRO SOBRE 

TEMAS DE GENÉTICA E MELHORAMENTO 

VOLUME 29 

“GENÔMICA POPULACIONAL E 

GENÉTICA DA CONSERVAÇÃO” 

8 E 9 DE OUTUBRO DE 2012 

Piracicaba - SP 




2012

ANAIS 

29º ENCONTRO SOBRE TEMAS DE GENÉTICA E 

MELHORAMENTO 

VOLUME 29 

“GENÔMICA POPULACIONAL E 

GENÉTICA DA CONSERVAÇÃO” 

8 E 9 DE OUTUBRO DE 2012 

Piracicaba - SP 

EDITORES 

JOSÉ BALDIN PINHEIRO 

GIANCARLO CONDE XAVIER OLIVEIRA 

GERHARD BANDEL 

ELIZABETH ANN VEASEY 

MARIA LÚCIA CARNEIRO VIEIRA 

RICARDO ANTUNES DE AZEVEDO

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação 

DIVISÃO DE BIBLIOTECA - ESALQ/USP 

Encontro sobre Temas de Genética e Melhoramento (29: 2012: Piracicaba, SP) 

“Genômica populacional e genética da conservação” ; anais ... / edição 

de José Baldin Pinheiro ... [et al.]. - - Piracicaba: ESALQ/LGN, 2012. 

57 p. 

Bibliografia. 

1. Genética de populações 2. Melhoramento genético vegetal I. Pinheiro, J. B., 

ed. II. Oliveira, G. C. X., ed. III. Bandel, G., ed. IV. Veasey E. A., ed. V. Vieira, M. L. 

C., ed. VI. Azevedo, R. A. de., ed. VII Título 

CDD 631.522 

G335e


Reitor: Prof. João Grandino Rodas 

Vice Reitor: Prof. Hélio Nogueira da Cruz 


DIRETOR: Prof. José Vicente Caixeta Filho 

VICE-DIRETOR: Profa. Marisa Aparecida Bismara Regitano d’Arce 

PREFEITURA DO CAMPUS “LUIZ DE QUEIROZ” 

PREFEITO: Prof. Wilson Roberto Soares Mattos 


ESALQ/USP 

CHEFE: Ricardo Antunes de Azevedo 

SUPLENTE: Silvia Maria Guerra Molina 

2012

AGRADECIMENTOS 

A Comissão organizadora do 29º Encontro Sobre Temas de Genética e 

Melhoramento e o Departamento de Genética da ESALQ nesta ocasião agradecem 

o apoio decisivo recebido das seguintes instituições: 

Departamento de Genética da ESALQ (LGN), Programa de Pós-graduação em 

Genética e Melhoramento de Plantas (PPG-GMP-ESALQ/USP), Associação 

Brasileira de Melhoramento de Plantas (SBMP), Coordenação de Aperfeiçoamento 

de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Sociedade Brasileira de Genética (SBG), 

Sociedade Brasileira em Recursos Genéticos (SBRG) e Ministério da Agricultura, 

Pecuária e Abastecimento (MAPA). 

Assim como aos Servidores Não Docentes da ESALQ: 

Antonio de Pádua Gorga 

Carlos Roberto Macedonio 

Fernando Leopoldino 

Maídia Maria Thomaziello 

Rogério Antonio Marim 

Silvia Cristina Menuzzo Molina 

Valdir Próspero

ÍNDICE 

Setores de Pesquisa e Corpo Docente ........................................................................... 1 

Apresentação ................................................................................................................. 2 

Programa do Evento ....................................................................................................... 3 

Análise genética de populações naturais em escala genômica – 

desafios e perspectivas - Alexandre Siqueira Guedes Coelho, UFG ............................... 4 

Detecting selection using high-density SNP genotype data 

Tiago Rodrigues Antão, University of Cambridge, UK ..................................................... 5 

Contributions of population genetics to tree conservation: 

challenges under changing scenarios 

Andrea Cecília Premoli, Universidad Nacional del Comahue - Argentina ........................ 12 

Genômica de populações: aplicações na genética da conservação de 

plantas e no manejo de insetos-pragas 

Maria Imaculada Zucchi, APTA-Pólo Centro Sul ............................................................. 17 

Distribuição da diversidade genética e conservação de espécies arbóreas em 

remanescentes de floresta ombrófila mista em Santa Catarina 

Adelar Mantovani, UDESC.............................................................................................. 24 

Medindo o tempo evolutivo a partir de moléculas: 

Os 50 anos do relógio molecular 

Carlos Guerra Schrago, IB-UFRJ.................................................................................... 38 

Identificação molecular da biodiversidade com vistas à sua conservação 

Claudio de Oliveira , UNESP-Botucatu ........................................................................... 42 

The GAMA approach to the analysis of large germplasm collections: 

the example of common bean landraces from Brazil 

Paul Gepts, UCLA-Davis - EUA ...................................................................................... 50

29º ENCONTRO SOBRE TEMAS DE GENÉTICA E MELHORAMENTO 

"Genômica Populacional e Genética da Conservação" 

DEPARTAMENTO DE GENÉTICA – ESALQ/USP 

SETORES DE PESQUISA E CORPO DOCENTE 

LABORATÓRIO DE BIOLOGIA MOLECULAR DE PLANTAS 

Prof. Dr. Márcio de Castro Silva Filho 

LABORATÓRIO DE CITOGENÉTICA 

Prof. Dr. Gerhard Bandel 

LABORATÓRIO DE CITOGENÉTICA MOLECULAR DE PLANTAS 

Prof. Dr. Mateus Mondin 

Docente com Atividades em Conjunto: 

Profa. Dra. Margarida Lopes Rodrigues de Aguiar-Perecin 

LABORATÓRIO DE DIVERSIDADE GENÉTICA E MELHORAMENTO 

Prof. Dr. José Baldin Pinheiro 

LABORATÓRIO DE ECOGENÉTICA 

Profa. Dra. Silvia Maria Guerra Molina 

LABORATÓRIO DE EVOLUÇÃO 

Prof. Dr. Giancarlo Conde Xavier Oliveira 

LABORATÓRIO DE GENÉTICA APLICADA À ESPÉCIES AUTÓGAMAS (SOJA) 

Prof. Dr. Natal Antonio Vello 

LABORATÓRIO DE GENÉTICA BIOQUÍMICA DE PLANTAS 

Prof. Dr. Ricardo Antunes de Azevedo 

LABORATÓRIO DE GENÉTICA ECOLÓGICA DE PLANTAS 

Profa. Dra. Elizabeth Ann Veasey 

LABORATÓRIO DE GENÉTICA ESTATÍSTICA 

Prof. Dr. Antonio Augusto Franco Garcia 


Prof. Dr. Roland Vencovsky 

LABORATÓRIO DE GENÉTICA FISIOLÓGICA 

Prof. Dr. Carlos Alberto Labate 

LABORATÓRIO DE GENÉTICA DE LEVEDURAS 

Prof. Dr. Flávio Cesar Almeida Tavares 

LABORATÓRIO DE GENÉTICA DE MICRORGANISMOS 

Profa. Dra. Aline Aparecida Pizzirani-Kleiner 


Prof. Dr. João Lúcio de Azevedo 

LABORATÓRIO DE GENÉTICA DE MICRORGANISMOS PROF. JOÁO LÚCIO DE AZEVEDO - 

GRUPO DE GENÔMICA 

Profa. Dra. Cláudia Barros Monteiro Vitorello 

LABORATÓRIO DE GENÉTICA MOLECULAR DE PLANTAS CULTIVADAS 

Profa. Dra. Maria Lúcia Carneiro Vieira 

LABORATÓRIO DE GENÉTICA QUANTITATIVA E MELHORAMENTO DE SOJA 

Prof. Dr. Isaias Olívio Geraldi 

LABORATÓRIO DE MELHORAMENTO DE AVES 

Prof. Dr. Vicente José Maria Savino 

Prof. Dr. Antonio Augusto Domingos Coelho 

LABORATÓRIO DE MELHORAMENTO DE MILHO – I 

Prof. Dr. José Branco de Miranda Filho 

LABORATÓRIO DE MELHORAMENTO DE MILHO – II 

Prof. Dr. Cláudio Lopes Souza Junior 

Departamento de Genética, ESALQ/USP - http://www.genetica.esalq.usp.br/29temas/ 

1



APRESENTAÇÃO 

__________________________ 

A tipagem em nível de um ou poucos genes (“genotipagem’) vem sendo feita com 

métodos moleculares desde meados do século passado e um ferramental vasto vem-se 

acumulando, permitindo a detecção de variação em diversas regiões do genoma. O 

desenvolvimento de técnicas mais sofisticadas nas últimas duas décadas catapultou 

para níveis inéditos a quantidade de marcadores que podem ser usados para 

genotipagem simultânea em um indivíduo, de modo que, agora, pode-se fazer a tipagem 

de genomas (“genomotipagem” ?), saturando-se o mapa genético com locos 

informativos ou sequenciando-se o genoma todo. A tipagem de genomas inteiros, a 

princípio, é uma extensão quantitativa de genotipagens mais modestas, mas a enorme 

quantidade de dados gerados e a utilização de técnicas estatísticas de análise 

especialmente criadas para tratá-los têm facultado a investigação, com um nível de 

abrangência sem precedentes, de fenômenos populacionais, como seleção, deriva, fluxo 

gênico, eventos históricos, demografia, filogenia e outros, estabelecendo as bases 

teóricas e empíricas do que se convencionou chamar GENÔMICA POPULACIONAL. 

Este programa de pesquisa baseia-se em dois pontos principais: a história evolutiva e 

demográfica afeta igualmente certos parâmetros populacionais dos locos neutros, mas a 

seleção afeta diferencialmente os das regiões não-neutras, que aparecem como outliers 

identificáveis nos testes estatísticos e deixam assinaturas de seleção dispersas nos 

genomas de uma população. A Genômica Populacional tem aplicações potenciais 

imediatas em programas de CONSERVAÇÃO GENÉTICA, como a identificação 

molecular massiva de táxons, o resgate de populações declinantes com genótipos 

adaptados e a detecção de focos de biodiversidade intraespecífica, e certamente 

continuará a irrigar esses programas com dados e diretrizes mais abundantes e 

confiáveis. 

________________________________________________________ 


2




TEMA: "Genômica Populacional e Genética da Conservação" 

08 de outubro de 2012 - (segunda-feira) 

08:00 - 08:30 - INSCRIÇÕES 

08:30 - 09:00 - SESSÃO DE ABERTURA 

1a SESSÃO - Manhã 

Presidente da Sessão: José Baldin Pinheiro, ESALQ/USP 

09:00 - 10:00 - Análise genética de populações naturais em escala genômica – desafios e 

perspectivas - Alexandre Siqueira Guedes Coelho, UFG. 

10:00 - 10:30 - Intervalo 

10:30 - 11:30 - Detecting selection using high-density SNP genotype data - Tiago Rodrigues 

Antão, University of Cambridge, UK. 

2a SESSÃO - Tarde 

Presidente da Sessão: Roland Vencovsky, ESALQ/USP 

14:00 - 15:00 - Contributions of population genetics to tree conservation: challenges under 

changing scenarios - Andrea Cecília Premoli, Universidad Nacional del 

Comahue – Argentina. 

15:00 - 15:30 - Intervalo 

15:30 - 16:30 - Genômica de populações: aplicações na genética da conservação de plantas e 

no manejo de insetos-pragas - Maria Imaculada Zucchi, APTA-Pólo Centro Sul. 

09 de outubro de 2012 - (terça-feira) 

3a SESSÃO - Manhã 

Presidente da Sessão: Giancarlo Conde Xavier Oliveira, ESALQ/USP 

09:00 - 10:00 - Distribuição da diversidade genética e conservação de espécies arbóreas em 

remanescentes de floresta ombrófila mista em Santa Catarina - Adelar 

Mantovani, UDESC. 

10:00 - 10:30 - Intervalo 

10:30 - 11:30 - Medindo o tempo evolutivo a partir de moléculas: Os 50 anos do relógio 

molecular - Carlos Guerra Schrago, IB-UFRJ. 

4a SESSÃO - Tarde 

Presidente da Sessão: Elizabeth Ann Veasey, ESALQ/USP 

14:00 - 15:00 - Identificação molecular da biodiversidade com vistas à sua conservação - Claudio 

de Oliveira , UNESP-Botucatu. 

15:00 - 15:30 - Intervalo 

15:30 - 16:30 - The GAMA approach to the analysis of large germplasm collections: the example 

of common bean landraces from Brazil - Paul Gepts, UCLA-Davis – EUA. 

16:40 – Encerramento 


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ANÁLISE GENÉTICA DE POPULAÇÕES 

NATURAIS EM ESCALA GENÔMICA – 

DESAFIOS E PERSPECTIVAS 

Alexandre Siqueira Guedes Coelho 

Escola de Agronomia, Universidade Federal de Goiás 

Email: coelho@agro.ufg.br 

Palavras-chave: genética de populações, genômica, populações naturais 

A disponibilidade recente de técnicas de genotipagem de alto desempenho deverá provocar 

nos próximos anos uma verdadeira revolução nos métodos de análise genética de 

populações naturais. Estes novos métodos permitem a avaliação de dezenas de milhares de 

locos em centenas de indivíduos a um custo inferior aos exigidos pelos atuais marcadores 

genéticos comumente utilizados em estudos de genética de populações. O potencial de 

utilização destas informações para a análise em escala genômica do polimorfismo presente 

em populações naturais e suas implicações para a melhor compreensão dos processos 

microevolutivos serão discutidos. Serão ainda apresentados exemplos de aplicação destas 

informações em estudos sobre tamanho efetivo, parentesco, identificação de locos sobre 

seleção e caracteres quantitativos de importância adaptativa. 


4



DETECTING SELECTION USING HIGH-DENSITY 

SNP GENOTYPE DATA 

Tiago Rodrigues Antão 

Department of Biological Anthropology, 

University of Cambridge, Cambridge CB2 1QH, UK 

Email: tiagoantao@gmail.com 

Abstract 

Testing for selection is becoming one of the most important steps in the analysis of genomic 

datasets. Dense genotyping data might allow the reliable reconstruction of haplotypes and 

thus the usage of haplotype based methods to detect selection. Here we will consider some 

methodological guidelines, based on experience with human datasets, to reliably detect 

selection using phased data. We will discuss basic requirements (e.g. the need for a linkage 

map for the species being studied), phasing strategies and also the assumptions and 

limitations of two widely used methods to detect selection. 

Introduction 

The advent of next-generation sequencing made possible the use of haplotype based 

methods of selection detection. The fundamental intuition (Sabeti et al., 2002) behind these 

approaches relies on the observation that positive selection causes a rapid rise in the allele 

frequency not only of the causative mutation but also of spatially close mutations. If such a 

process occurs on a short enough time then recombination will not substantially break down 

the haplotype carrying the selected mutation. A signature of selection will then be an 

haplotype that is unusually long. 

Reliable haplotype phasing (Browning and Browning, 2011) is thus fundamental for the 

application of any method discussed here, therefore we will start with a presentation of the 

basic issues regarding phasing. We will then discuss two of the most widely used haplotype 

based statistics: Integrated Haplotype Score (iHS (iHS Voight et al., 2006)) and Cross 

Population Extended Haplotype Homozygosity ((XP-EHH Sabeti et al., 2007)). We finalize 

with some general comments applicable regarding the future of haplotype based methods. 

Most of the observations made here are based on experience with human datasets. For 

humans there is generally much more information available than for other species. In some 

cases the applicability of these approaches might not be feasible due to the lack of a 

fundamental artifact (e.g. reliable linkage maps or information about ancestral/derived 

alleles). 

In this presentation we trade rigour for clarity and simplicity. For precise definitions, 

readers are directed to the reference list. 

Phasing 

In a diploid individual, genotyping data does not directly provide information about the 

gametic phase (the original allelic combinations than an individual received from each 

parent), therefore methods to reliably infer the phase are required. Any application of a 

haplotype based method to detect selection is highly dependent on the quality of the 


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phasing. Widely used applications to phase datasets include fastPHASE (Scheet and 

Stephens, 2006), Beagle (Browning and Browning, 2007) and ShapeIt (Delaneau et al., 

2011). 

Several studies (see, e.g. Andrés et al., 2007; Marchini et al., 2006; Browning, 2008) have 

been done using simulation or human datasets in order to determine factors influencing the 

quality of phasing We can use the switch error rate Stephens and Donnelly (2003), i.e., the 

proportion of heterozygous positions mis-assigned relative to the previous heterozygous 

position as a measure of accuracy of phasing algorithms. 

The number of individuals phased is known to be a fundamental variable for phasing 

accuracy (Marchini et al., 2006) but our (unpublished results) suggest that effective 

population size (Ne) might be a more important factor: A larger Ne increases the switch error 

rate (Figure 1). 

Figure 1: Switch error rate as a function of sample size and Ne. The X-axis is the 

sample size (i.e., the number of individuals phased together) and the Y-axis is the 

switch error rate. The blue line depicts a human population know for its high Ne, 

whereas the green line shows a population with low Ne. 

Extrapolation of these results to other species should be done with care because 

elements like recombination rates and marker density can vary substantially, but they can 

serve as general guidelines for phasing of other species. A decisive factor to choose a 

phasing algorithm might be the existence of a linkage map for the species being studied as 

not all phasing algorithms require one (e.g. Beagle). But, published comparisons suggest 

that ShapeIt (Marchini et al., 2006) (in agreement with our unpublished results) might have 

the best statistical performance and linkage maps will be needed for most selection tests 

anyway. 

There are many other important issues related with phasing, most notably allele 

imputation and the use of reference populations, which will not be addressed here. The 

fundamental message regards the sample size being phased: while there are some 

exceptions phasing more individuals simultaneously lowers the switch error rate. 


6



Haplotype based selection detection 

The two methods presented here will be based on the concept of Extended Haplotype 

Homozygosity (EHH) Sabeti et al. (2002): the probability that two randomly chosen 

chromosomes in a population carry an haplotype of interest. If an haplotype carries a 

mutation that has been recently selected, it is expected that such haplotype has bigger EHH 

than haplotypes carrying neutral mutations. 

Integrated Haplotype Score (iHS) 

The problem of the above definition is that EHH is also dependent on other factors, notably 

haplotypes in areas of high recombination will have EHH values lower than haplotypes in 

other areas (even if under selection). 

iHS addresses this issue by first computing the decay (i.e. integrating) of EHH from a core 

SNP of interest until EHH reaches 0.05 for each allele at a SNP position and then making the 

log-ratio between both alleles. The insight is that the EHH of the selected allele can be 

compared with the EHH of the non-selected allele as the recombination strength around both 

alleles is equal. 

As there will be a score per SNP (with an exception pointed below), the decision on which 

areas of the genome are under selection will be done using an empirical distribution (as there 

are typically hundreds of thousands of SNPs, i.e. observations). Typically the top 1% of the 

absolute iHS values are inspected for genes under selection. As the number of points will still 

be too high (e.g., with an array with 1 million SNPs there will be 10,000 top 1% observations) 

a further step is normally taken to reduce the number of areas to analise. A common strategy 

(Pickrell et al., 2009) involves analyzing the human genome in windows of 200kb 

(approximately 0.2cM) in size and rank them by the percentage of absolute iHS scores 

above 2. An implication of this approach is that windows with low marker density (below 20 in 

Pickrell et al. (2009)) are dropped as the number of samples per window is not enough to 

produce a meaningful comparison. 

The first caveat with iHS is that it requires information about which allele is 

ancestral/derived. This is needed as the distribution of the ratio is sensitive to the frequency 

of the derived allele (Figure 2) (and the method uses the frequency of the derived allele to 

calibrate the score). 

The second caveat is that there have to be enough samples of both alleles to be able to 

compute EHH per allele: for a sample size of 20 individuals (40 reads), a minimum allele 

frequency (MAF) of 5% (2 samples of MAF allele) is required. This entails that (i) loci with low 

MAFs will not have iHS computed and (ii) if they are computed but the sample size is still 

small there is a possibility of skewing EHH. This effect will probably more important in high 

Ne populations with a bigger frequency of loci with low MAFs. This will have impact on the 

statistical power to detect selected loci and iHS typically requires more samples than XP- 

EHH (Figure 3). Most importantly, from the same figure, the power to detect selection with 

iHS is maximised with the frequency of the selected allele is at intermediate values. 

Interestingly, from figure 3 it seems that the power of iHS to detect selected loci is quite 

low… 


7



Figure 2: Mean and standard deviation of iHS scores as a function of the frequency of 

the ancestral allele. The standard deviation of this example is quite uncommon as the 

sample size is 120 individuals: with iHS and more common sample sizes the standard 

deviation (a good measure of lack of reliability) will increase at the extremes. The mean 

has the typical behavior with iHS. 

Cross Population Extended Haplotype Homozygosity (XP-EHH) 

XP-EHH takes a different approach by comparing, per SNP, the EHH scores between two 

populations: the log-ratio between the EHH score of population A divided by the EHH score 

of population B. High positive values suggest that a region is under selection in population A 

(higher EHH, thus longer haplotypes), whereas the converse is true if the value is negative. 

As in iHS, outliers from the empirical distribution are potentially indicative of selection 

(considering extreme positive or negative values – on even both – depends on the research 

problem). As with iHS, XP-EHH scores can be clustered together in windows of 200kb, but 

the criteria to evaluate each window is the maximum XP-EHH value of the window (not unlike 

what is suggested for FST when there many observations (Akey et al., 2004)). 

XP-EHH requires less individuals than iHS for the same statistical power (Figure 3) – though 

this is the number of samples per population. Another difference is that XP-EHH has more 

power when the selected allele tends to fixation. This approach has no need of information 

about the allele (ancestral/derived) but requires obviously a second population sampled. This 

reference population should be carefully chosen as signal overlaps between both populations 

might hide some of the selection areas on the population of interest. 


8



Figure 3: Power of iHS (A) and XP-EHH (B) based on a simulated African demography 

(Figure taken from Pickrell et al. (2009) supplementary material). iHS has maximum 

power at intermediate allele frequencies, whereas XP-EHH requires the derived allele 

frequency to be near fixation. 

Discussion 

The successful application of these and other similar methods is dependent on having 

enough genotyping density and sometimes other data like linkage maps and 

ancestral/derived allele information. While such information might still not be available for 

many species, fast developments in sequencing might make such methods feasible 

somewhere in the near future for a broad spectrum of taxa. 

Many of the (statistical) performance studies of these methods have been made using 

computational models of human demography (e.g., the cosi model (Schaffner et al., 2005)). 

This is unfortunate because there is no research done on the impact of important parameters 

like effective population size and selection strength on these estimators. There is also no 

study on the compound effects of demography and phasing. It can be speculated that these 

estimators (especially iHS) have worse performance with high Ne populations, but it is not 

known if this is caused by higher switch error rates at phasing or a property of the method 

itself. Indirectly, and because Pickrell et al. (2009) reports better performance with simulated 

African human demographies rather than European demographies, we can speculate that 

iHS might perform better with high Ne, but the switch error rate is a more important factor, 

effectively inverting the result. On the other hand, with higher percentage of rare alleles in 

high Ne populations, we could speculate that under-performance is inherent to the method 

due to the method’s sensitivity to alleles with low frequency. There is arguably a need for 

more research on the performance of these methods in non-humans. 

Another field of ongoing research is the precise pinpointing of causative mutations. Most 

methods do not have spatial precision, i.e., the signals tend to exist in a somewhat large area 

encompassing the area under selection. For instance the (very strong) signal of lactase 

tolerance in North-Western Europeans spans around 8 genes for iHS. Several alternatives 

have been suggested (e.g. CMS Grossman et al. (2010)), but they have so far revealed 

problematic. For instance CMS requires the creation of a accurate demographic 

computational model, which is difficult even with many human populations and surely much 

more complex with the vast majority of other species. A side observation is that while 

simulations suggest that iHS is more powerful at intermediate frequencies and XP-EHH near 

fixation of the selected allele, it is impossible to know, by that criteria, which one to choose 

(there will be many signals around the causative mutation, with varying derived allele 

frequencies). On the other hand, if the frequency of the phenotype is known in the 

population, that information might be useful to interpret both statistics. 


9



Finally, it is worth noting that iHS and XP-EHH were designed to detect directional 

selection and that polygenic adaptation (where multiple genes contribute to a phenotype 

without a “hard-sweep” signature being generated) is currently an area of intense research 

(Pritchard et al., 2010). While we might see new methods to detect this kind of adaptation 

there have been attempts (Metspalu et al., 2011) to use these approaches to detect 

polygenic adaptation. The strategy is to use gene enrichment analysis on top of iHS/XP-EHH 

results: the top 1% windows of the genome are tested for enrichment (i.e. if some gene 

ontology – GO – terms are over-expressed in the selected areas compared to the whole 

genome). Not only has this approach not been thoroughly evaluated but also it is quite 

improbable that it can be successfully used outside humans and a handful of other model 

species for which there is extensive GO annotations. 

Next generation sequencing presents us with new ways to analyze our data. The datasets 

generated for human data are normally more dense and better annotated that for other 

species, but this is mostly a time issue: what is available to analyze human data today will be 

usable with more and more species in the near future. Hopefully this small introduction will 

have helped researchers to critically assess the applicability of these or similar methods to 

their existing or future datasets. 

References 

J.M. Akey, M.A. Eberle, M.J. Rieder, C.S. Carlson, M.D. Shriver, D.A. Nickerson, and L. 

Kruglyak. Population history and natural selection shape patterns of genetic variation in 

132 genes. PLoS biology, 2(10):e286, 2004. 

A.M. Andrés, A.G. Clark, L. Shimmin, E. Boerwinkle, C.F. Sing, and J.E. Hixson. 

Understanding the accuracy of statistical haplotype inference with sequence data of 

known phase. Genetic epidemiology, 31(7):659–671, 2007. 

S.R. Browning. Missing data imputation and haplotype phase inference for genome-wide 

association studies. Human genetics, 124(5):439–450, 2008. 

S.R. Browning and B.L. Browning. Rapid and accurate haplotype phasing and missing-data 

inference for whole-genome association studies by use of localized haplotype 

clustering. The American Journal of Human Genetics, 81(5):1084–1097, 2007. 

S.R. Browning and B.L. Browning. Haplotype phasing: existing methods and new 

developments. Nature Reviews Genetics, 12(10):703–714, 2011. 

O. Delaneau, J. Marchini, and J.F. Zagury. A linear complexity phasing method for 

thousands of genomes. Nature Methods, 9(2):179–181, 2011. 

S.R. Grossman, I. Shylakhter, E.K. Karlsson, E.H. Byrne, S. Morales, G. Frieden, E. 

Hostetter, E. Angelino, M. Garber, O. Zuk, et al. A composite of multiple signals 

distinguishes causal variants in regions of positive selection. Science, 327(5967):883– 

886, 2010. 

J. Marchini, D. Cutler, N. Patterson, M. Stephens, E. Eskin, E. Halperin, S. Lin, Z.S. Qin, 

H.M. Munro, G.R. Abecasis, et al. A comparison of phasing algorithms for trios and 

unrelated individuals. The American Journal of Human Genetics, 78(3):437–450, 2006. 

M. Metspalu, I.G. Romero, B. Yunusbayev, G. Chaubey, C.B. Mallick, G. Hudjashov, M. 

Nelis, R. Mägi, E. Metspalu, M. Remm, et al. Shared and unique components of human 

population structure and genome-wide signals of positive selection in south asia. The 

American Journal of Human Genetics, 89(6):731–744, 2011. 

J.K. Pickrell, G. Coop, J. Novembre, S. Kudaravalli, J.Z. Li, D. Absher, B.S. Srinivasan, G.S. 

Barsh, R.M. Myers, M.W. Feldman, et al. Signals of recent positive selection in a 

worldwide sample of human populations. Genome Research, 19(5):826–837, 2009. 

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10



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11



CONTRIBUTIONS OF POPULATION GENETICS TO 

TREE CONSERVATION: CHALLENGES UNDER 

CHANGING SCENARIOS 

Andrea C. Premoli 1* , Paula Mathiasen 1 , M. Cristina Acosta 1,2 

1 Laboratorio Ecotono, Universidad Nacional del Comahue-CONICET 

2 IMBIV CONICET-Universidad Nacional de Córdoba 

*Email: andrea.premoli@gmail.com 

ABSTRACT 

The study of multiple populations and species of a given region using molecular markers is a 

valuable tool to design conservation strategies. These may be guided by the analysis of 

species of conservation concern such as those under threat or endangered. Some of such 

species have a restricted range and thus may be genetically depauperate as a result of 

genetic drift that tends to erode genetic diversity within populations. Nonetheless, genetic 

analysis of species pairs occurring in sympatric populations show that range alone may not 

be sufficient to explain genetic patterns. On the other hand, while widespread woody taxa 

may be relatively common through a region, those occurring as almost pure populations may 

also be of conservation value given that an entire community depends upon them. This is 

particularly the case of species that inhabit environments prone to suffer from changes in 

climate such as altitudinal gradients of temperate regions. Although neutral markers may 

yield information on patterns of genetic diversity with elevation, quantitative traits including 

ecophysiological characteristics from experimental trails can be used as a valuable tool to 

predict species responses under warming. 

BACKGROUND 

The application of molecular techniques has greatly contributed to understand the processes 

involved in shaping the gene pool of tree species relevant in conservation. Such tools 

provided significant information on the distribution of genetic polymorphisms along species’ 

ranges. As a result, significant bulk of studies yielded information on the hierarchical 

distribution of genetic variation in their components within- and among-distinct populations. 

Also, it is of conservation value the existence of centers of genetic diversity as well as the 

presence of unique variants. While the former are the raw material for adaptive variation and 

thus evolutionary change, the latter may provide information on directional selection under 

novel and/or unique environments. All this genetic information that is necessary for it to be 

used to design conservation practices. 

Many conservation genetic studies were developed on species of conservation concern. 

These are species that are considered rare some of which are at risk. Nonetheless the 

concept of rarity has been largely discussed in the conservation literature. The most 

comprehensive classification of distinct forms of rarity in plants was made by Rabinowitz and 

collaborators (1986) who distinguished sevens such types that arose from the combination of 

geographic range, habitat specificity, and population size. Therefore taxa may distinctively be 

rare. While some could be rare because of restricted range, others although widespread may 

consist of small populations associated to particular habitat types. Thus, different forms of 

rarity may result in distinct genetic consequences. Early studies have shown that for many 

plant species the distribution range in combination with the breeding system canbest explain 

patterns of diversity of natural populations (Hamrick and Godt 1989). In particular, 

widespread and generally outcross species maintain higher genetic diversity than other taxa 


12



with distinct traits such as those with small range that may suffer the effects of genetic drift 

which tend to erode the genetic diversity within populations. Later similar studies considered 

the comparison among closely related taxa to provide a phylogenetic control and thus to 

directly test differences in traits of interest such as the range effect (e.g. Gitzendanner and 

Soltis 2000). 

The use of molecular markers is a powerful tool to screen multiple populations and species 

and it has greatly contributed to the development of the conservation genetics discipline. 

Because they are neutral, additional data from quantitative traits is needed to understand 

adaptive responses due to environmental influences. Under changing scenarios this 

information is crucial given that organisms overcome such stressful conditions via dispersal, 

plastic changes, or populations may undergo evolutionary adaptation (Hoffman and Sgro 

2011). In addition, while populations located towards the center of the geographic range may 

buffer those effects, such modifications may be notorious towards species’ margins because 

marginal populations must suddenly adapt to ecological conditions that were previously only 

found outside the range (Bridle and Vines 2007) 

In a series of case studies at regional geographic scales we tested the hypothesis if 

geographic range is a good predictor of genetic characteristics to be used in the design of 

conservation efforts. We also developed studies at the local scale using distinct molecular 

markers and adaptive traits towards distribution margins to predict potential responses under 

global change in mountain environments. 

RESULTS AND DISCUSSION 

The comparison of woody related taxa endemic to south temperate forests with different 

latitudinal distribution prompted the question if range extent explains genetic traits. These are 

conifers within the Cupressaceae that coexist in wet environments. While Fitzroya 

cupressoides (hereafter Fitzroya) has a more restricted range, Pilgerodendron uviferum 

(hereafter Pilgerodendron) has the most extended latitudinal distribution of any conifer of the 

temperate Andes. Both are monotypic genera and are listed as CITES Appendix I which 

means that they are threatened with extinction and exploitation and international trade is 

banned. Following similar sampling designs and laboratory protocols we collected fresh leaf 

tissue along their distributions for genetic analysis. Some populations were sympatric given 

that both conifers coexist along their distribution range particularly in northern Patagonia. 

Results from isozyme analysis based yielded higher genetic diversity and lower amongpopulation 

divergence in the range restricted Fitzroya than Pilgerodendron based on 12 and 

14 loci, respectively. While reduced genetic polymorphism in the widespread Pilgerodendron 

was an unexpected result, other life history traits different than range alone may explain the 

pattern observed. Despite its smaller total range, Fitzroya usually consists of larger 

populations which also occupy distinct habitats. Although widespread, Pilgerodendron most 

often is associated to inundated terrains which are scattered throughout the Patagonian 

region where it occurs as relatively small and isolated populations. Therefore, range in 

combination with population size and the degree of population connectivity may better 

explain genetic traits in this species. Results of those studies also yielded pockets of high 

genetic diversity throughout their current ranges including southern, i.e. cold, populations 

(Premoli et al. 2000 conservation Genetics; 2002 Diversity and Distributions). In contrast to 

scenarios proposed for tree taxa of the Northern Hemisphere during cold phases that 

resulted in glacial refugia towards southern, i.e. warmer, areas and postglacial colonization to 

the north after glacial retreat, genetic evidence on the cold tolerant species Fitzroya and 

Pilgerodendron suggested the hypothesis of local tree survival in multiple refugia during ice 

ages in Patagonia. Understanding species’ responses under different climates is relevant in 

long-term conservation given that we might be able to predict potential future responses. In 

particular, if cold hardy taxa were able to endure the ice ages without major range shifts, they 

may be prone to suffer from local population extirpation under warmer trends. Conservation 


13



actions will be probably needed in populations outside protected areas. Total range of 

Fitzroya in Argentina is only 20,625 ha whereas in Chile attains an order of magnitude 

greater extent of 264,982 ha. However, while 85% of its area is protected in Argentina only 

17% is so in Chile. In addition, Pilgerodendron in Chile occupies an area of 970,326 ha, 70% 

of which are protected. Meanwhile in Argentina consists of scatter small populations the 

majority of which are included within protected areas (Rovere et al. 2002 Bosque). Therefore, 

populations of Fitzroya outside protected areas are threatened and genetic tools can be used 

to guide conservation actions. Populations towards the southern range in Argentina are 

reservoirs of genetic diversity and may be used as source populations to restore nearby 

degraded areas. 

Distribution patterns of genetic polymorphisms of rare taxa are often used to direct 

conservation efforts mainly at local spatial scales. Nonetheless widespread taxa may provide 

valuable information at larger geographic scales. In particular, patterns of genetic diversity 

within populations and among-population divergence of widespread trees may guide the 

detection of areas valuable in conservation. However, similarly widespread taxa may show 

different genetic patterns. The analysis of distribution patterns of genetic polymorphisms of 

sympatric populations along the latitudinal range of two widespread Nothofagus yielded 

contrasting results. These are the deciduous cold tolerant species Nothofagus pumilio and 

Nothofagus antarctica. They are found along the total latitudinal range of the temperate 

forests of Argentina and Chile. They have different autoecological traits: N. pumilio is the 

species that characterizes mountain areas and presents clinal variation along altitudinal 

gradients whereas N. antarctica shows ecotypic variation at different habitat types. Post 

disturbance regeneration occurs predominantly by seed in N. pumilio and although N. 

antarctica produces seeds with reduced germination rates, it vigorously resprouts from base 

trunks. The analysis of 20 sympatric population pairs by isozyme electrophoresis along 

latitude showed that the sprouter N. antarctica maintains significantly greater average 

genetic diversity than tah found in N. pumilio. Thus sprouting has favoured the maintenance 

of similarly diverse genets in relatively large populations along its range that were probably 

less affected by drift through time (Acosta et al. 2012). In contrast, N. pumilio had increased 

diversity towards southern, i.e. colder latitudes. Ecological niche modeling provided evidence 

that in the south N. pumilio has probably persisted in ice free areas towards the steppe 

(Premoli et al. 2010). In the northern end of the range, i.e. warm, N. pumilio is mostly 

restricted to mountain habitats where it has been historically affected by changes in climate 

and reduced availability of niches for persistence. In the south, more stable conditions 

probably favored long-lasting persistence of genotypes. Similarly to nuclear polymorphisms, 

non-coding sequences of the chloroplast (cpDNA) along the entire latitudinal range of N. 

pumilio and N. antarctica yielded greater haplotype diversity in the latter (M.C. Acosta 

unpublished). However, at any one location, both species shared cpDNA sequences. This 

was interpreted as chloroplast capture events resulting from recurrent past and 

contemporaneous hybridizations and introgressions (Acosta and Premoli 2010). 

Nonetheless, they have maintained species’ identity by ecological selection. In sum, 

genetically polymorphic populations in combination with plasticity in diverse habitats (Steinke 

et al. 2008), have resulted in greater resilience of N. antarctica under changing scenarios. On 

the other hand, climate oscillations may have resulted in the loss of genetic variants due to 

genetic bottlenecks and increased inbreeding of N. pumilio particularly in northern areas 

(Mathiasen and Premoli 2010). Therefore, predominantly non sprouter N. pumilio may be 

prone to suffer population extirpation under warming particularly in the north (Acosta et al. 

2012). 

Altitudinal gradients of northern Patagonia are dominated by N. pumilio where it occurs as 

almost pure stands along more than 2000 km of the high-elevation Andes. At its northern 

range, inhabits climates of Mediterranean regime, with wet winters and dry summers. A 

series of studies on dry forests of N. pumilio at its northern range provided a synthesis on 

ecophysiological responses under natural conditions in the field, common gardens, and 

reciprocal transplants. The aim was to analyze if the variation along such gradients had a 


14



genetic basis and if such genetic differences may affect potential responses under warming. 

Also those studies evaluated the extent to which ecophysiological and functional traits of N. 

pumilio result from distinct selection pressures with elevation by means of plasticity or 

genetically based adaptation. Population genetic studies using isozyme markers and 

microsatellites showed a decrease in genetic diversity with elevation (Premoli 2003). In 

addition lower genet diversity was measured at isozyme and microsatellite markers in highelevation 

populations (P. Mathiasen unpublished). Reduced opportunities for establishment 

in high elevation populations may erode genetic diversity. Photosynthetic rates were higher 

in plants from the upper altitudinal limit under field conditions which were also maintained in 

the common garden (Premoli and Brewer 2007). This suggests a genetic control on net 

photosynthesis and also that no shortage for carbon assimilation exist at high elevation. 

Therefore, photosynthetic responses and morphological traits are probably related to 

nitrogen economy and a shorter growing season at high elevations. In contrast, conductance 

and stomatal density showed plastic responses which will be advantageous for a deciduous 

species like N. pumilio given that the growing season coincides with drought. Additionally, 

plants from contrasting elevations had significant differences in terms of architectural 

features of individuals, as well as leaf morphology and phenology under the common 

gardens suggesting strong genetic control (Premoli et al. 2007). Reciprocal transplants 

between contrasting elevations indicated that plants of low-elevation origin, which in turn 

were the most genetically diverse by molecular markers, outgrew high-elevation ones. 

Bioclimatic data showed that drought and high temperatures result in limited growth and 

more profuse branching (Mathiasen 2010). These results suggest that ecophysiological 

characteristics in N. pumilio combine genetic and plastic responses. Nevertheless, 

genetically fixed traits will probably limit adjustments particularly of high-elevation plants 

under changing conditions. On the other hand, plasticity in combination with greater genetic 

variation of low-elevation plants may favor their performance and thus they may ascend in 

elevation under warmer climates. 

CONCLUSIONS 

Molecular evidence using distinct types of markers in combination with ecophysiological 

evidence and ecological niche modeling provide information that can be used as guidelines 

for forest conservation genetics. Pockets of high genetic diversity throughout species’ ranges 

call for the design of conservation strategies considering multiple-population approaches 

which in some cases may involve beyond borders actions. Although not endangered, 

widespread taxa may suffer from significant range shifts under global change. Genetic 

information in concert with the location of areas where potential expansions and/or 

contractions will take place in the near future may assist the development of conservation 

actions. Therefore, multidisciplinary approaches are needed. This may include information on 

neutral and adaptive markers such as variation in ecophysiological responses to novel or 

changing conditions, and ecological niche modeling. Patterns of genetic diversity of 

widespread taxa such as those yielded by cpDNA polymorphisms may elucidate past 

vicariant events and cryptic secondary contact areas that could have also shaped 

biodiversity patterns. Thus, phylogeographic structures in combination with biodiversity 

hotspots may help to design conservation guidelines at larger geographic scales. The 

establishment of experimental trials of adaptive traits and monitoring programs of natural 

populations particularly at species’ distributions margins will greatly contribute to gain 

information valuable in conservation. 

The conservation genetics of forest resources poses a significant challenge to managers, 

conservation practitioners, and scientists whose decisions to be undertaken will not be 

excepted from controversy. Future physical settings may well be beyond conditions that 

some taxa have experienced in the past (Millar et al. 2007) which not only may affect within 

species’ adjustments but also may influence species’ associations. Species populations and 

communities of conservation value or in restoration need may face new environmental 


15



settings where previous paradigms on past forest range and variability may not fully apply. 

Also conservation actions will probably include areas outside protected areas where also 

different stakeholders will need to get involved. 

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16



GENÔMICA DE POPULAÇÕES: APLICAÇÕES NA 

GENÉTICA DA CONSERVAÇÃO DE PLANTAS E 

NO MANEJO DE INSETOS-PRAGAS 

Maria Imaculada Zucchi 1* , Camila Menezes Trindade. Macrini 1 , Marcos Vinícius Bohrer 

Monteiro Siqueira 1 e Vitor Antonio Corrêa Pavinato 2 

1 

APTA - Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegócios - Pólo Centro Sul. 

2 

Universidade Estadual de Campinas 

*Email: mizucchi@apta.gov.sp.br e mizucchi@gmail.com 

Palavras-chave: genética de populações, AFLP, sequenciamento de nova geração, SNPs, “genome 

scan”, variação genética adaptativa. 

Resumo: Atualmente vivemos uma revolução sem precedentes dentro do estudo genético 

de populações. Com os avanços tecnológicos nas ferramentas moleculares, obtemos dados 

de variação no DNA em quantidade nunca antes possível. Atento a essa revolução os 

geneticistas tem aproveitado cada vez das novas tecnologias de seqüenciamento nos 

trabalhos de pesquisa. Com a utilização de novas plataformas de seqüenciamento, 

chamadas de “Sequenciamento de Nova Geração” (do inglês “Next Generation 

Sequencing”) podemos obter uma quantidade enorme de polimorfismo de DNA a um baixo 

custo por loco. As aplicações vão além do estudo da diversidade genética. A genômica de 

populações pode ser entendida como o uso de ampla amostragem do genoma para 

identificar e separar locos sobre efeito específico (não neutros) de locos sobre efeito amplo 

(neutros) com o objetivo de aumentar nosso entendimento sobre eventos micro evolutivo. 

Hoje podemos estudar a adaptação de organismos a pressões seletivas impostas pela 

natureza. Neste contexto, esta palestra irá abordar a aplicação dos conhecimentos da 

genômica de populações com o objetivo de entender a forma como organismos se adaptam 

a seus ambientes, frente às mudanças ecológicas que ocorrem na natureza e causadas pelo 

homem. Estamos desenvolvendo trabalhos buscando entender adaptações ecológicas de 

uma espécie de inseto, tido como praga agrícola a mudanças na composição do 

agroecossistema agrícola e trabalhos que buscam entender a diversidade ligada a áreas 

naturais e em restauração florestal. 

A ecologia molecular é um ramo da biologia evolutiva que aplica os conhecimentos 

da genética de populações, evolução molecular e mais as recentes ferramentas genômicas 

em estudos ecológicos. Como tema de pesquisa, vem ganhando espaço por permitir estudar 

aspectos ecológicos sob a óptica da biologia evolutiva. As áreas que compõe a genética 

ecológica vão desde a aplicação de conceitos da genética de populações para acessar a 

diversidade genética dentro e entre populações, dinâmica de fluxo gênico, a estudos de 

filogeografia e adaptação molecular. Embora um pouco diversificada, as áreas de pesquisa 

dentro de ecologia molecular são unidas pelo uso de marcadores moleculares que permitem 

acessar as informações genéticas e assim compreender a ecologia e a evolução de 

organismos na natureza (Freeland 2003). 

Os marcadores moleculares microssatélites são os preferidos e os mais utilizados 

atualmente para estudos de ecologia molecular. Conhecido como “seqüência de repetição 

simples em tandem” (SSR “Simple Sequence Repeats”), os marcadores microssatélites são 

altamente polimórficos e abundantes nos genomas de eucariotos (Goldstein & Schlotterer 


17



1999; Kalia et al, 2011, Seeb et al, 2011). Suas características inerentes, tais como alto 

polimorfismo, genotipagem fácil e confiável, além de herança codominante, associada a 

possibilidade de uso de métodos estatísticos poderosos como Bayesiana e métodos de 

máxima verossimilhança (Luikart 1999) levou esses marcadores a serem amplamente 

utilizados pelos geneticistas de populações de insetos e ecologistas (Beadell et al. 2010; 

Pavinato et al. 2011). 

Nosso grupo de pesquisa está envolvido em duas linhas de pesquisa: o estudo 

ecológico evolutivo de insetos e o estudo da dinâmica evolutiva por trás da restauração 

florestal. Em ambas as frentes, o poder desses marcadores é conhecido em estudos de 

ecologia molecular. Destacamos alguns exemplos de aplicações em estudos com insetos: 

estimação de diversidade e estrutura genética para obter informações sobre ecologia básica 

(Endersby et al. 2007); investigação de possíveis padrões de mudanças na composição 

genética de populações associada a planta hospedeira (Carletto et al. 2009); e detecção de 

descontinuidades espaciais (Abila et al. 2008) e temporais (Franck & Timm 2010) e 

divergência genética determinada por especiação simpátrica (Santos et al. 2010). Já no 

estudo genético de plantas, os locos microssatélites permitem o entendimento mais refinado 

de estruturas populacionais (Slatkin 1995) e podem se tornar uma importante ferramenta 

para o entendimento e caracterização de germoplasma de várias espécies cultiváveis 

(Siqueira et al 2010). A utilização dos microssatélites pode igualmente fornecer subsídios 

para o estabelecimento de áreas destinadas à conservação de espécies vegetais 

ameaçadas (Heywood; Iriondo, 2003; Oliveira et al, 2006). 

Assim, uma nova área de pesquisa nasce dentro da genética de populações e 

permite identificar regiões genômicas ligadas a adaptações de espécies ao seu ambiente. 

Essa é conhecida como Genômica de Populações, pois nos permite estudar em populações 

naturais, utilizando ferramentas genômicas de nova geração. Essa abordagem pode ser 

entendida como o uso de ampla varredura do genoma (“genome scan”) para identificar e 

separar locos sobre efeito específico (sobre seleção, mutação, acasalamentos preferenciais 

e recombinação) de locos sobre efeito amplo (sobre deriva genética, efeito de gargalho 

genético, fluxo gênico e endogamia) com o objetivo de aumentar nosso entendimento sobre 

eventos micro evolutivo (“short term-evolution”) (Black et al. 2001). 

Com a genômica de populações fazemos um “scan” no genoma buscando locos com 

padrão de diferenciação “outliers”. Esses locos, que na verdade são regiões genômicas 

compostas por um número desconhecido de genes, podem nos levar as bases genéticas da 

adaptação. Para isso necessitamos de numerosos marcadores de DNA e de genotipagem 

em larga escala, pois assim podemos amostrar grande parte do genoma. Além disso, 

precisamos de estratégias de amostragem populacional, pois o delineamento experimental 

permite associar gradientes de pressões seletivas (variação de estresse abiótico/biótico) 

com a variação genética. Dessa forma é possível identificar regiões genômicas de variação 

não-neutra e associá-las, por meio de testes estatísticos, com eventos de seleção local/ e ou 

ecológica que estão sujeitas as populações da espécie estudada (Luikart et al. 2003; 

Allendorf et al. 2010). Para acessar uma parte maior do genoma, temos que utilizar muitos 

marcadores moleculares, ou seqüenciar o genoma dos organismos e populações 

estudadas. A utilização de marcadores microssatélites seria não recomendada para a 

maioria dos organismos, pois além do custo para se obter uma grande quantidade de locos, 

leva se muito tempo, sendo inviável, portanto em estudos de curta duração. Para isso, os 

primeiros marcadores a serem utilizados nos estudos de genômica de populações foram o s 

marcadores AFLPs do inglês: “Amplified fragment length polymorphism” (Polimorfismo de 

fragmento amplificado). 

Alguns exemplos de aplicações em ecologia molecular de insetos podem ser citados. 

Primeiro, a ampla varredura genômica (“genome scan”) através da genotipagem de 

aproximadamente 600 indivíduos; com 253 locos AFLP, permitiu detectar locos com 

distribuição diferencial em amostras de Diabrotica virgifera, uma espécie de besouro 

considerada praga agrícola, associados a diferentes regimes de rotação de cultura. Apesar 


18



da baixa correlação encontrada entre polimorfismo (“outliers”) e os regimes de rotação de 

cultura, foi possível acessar polimorfismo relacionado a pressão seletiva (Miller et al. 2007). 

Outro trabalho interessante, através da genotipagem de 15 populações de Neochlamisus 

bebbianae (“leaf beetle”) uma espécie de besouro, coletadas em duas plantas-hospedeiras 

distintas (duas espécies de coníferas), com 415 locos AFLP permitiu relacionar locos com 

distribuição “outlier” (15% dos locos) com a planta-hospedeira onde a população do inseto 

foi coletada. Através desse estudo foi possível refinar as estimativas populacionais com a 

retirada dos locos “outliers” e detectar regiões genômicas com variação genética não-neutra 

com potencial para se chegar em genes candidatos relacionados com a adaptação do inseto 

com a planta-hospedeira (Egan et al. 2008). 

Outro estudo semelhante, considerando a relação planta-hospedeira e variações 

ambientais abióticas (não definida), permitiu relacionar marcas AFLP com gradiente de 

pressões seletivas encontradas na natureza (amostragem em escalas geográficas distintas). 

Entretanto os autores ressaltam a necessidade de utilizar métodos estatísticos de correlação 

para relacionar a variação na distribuição das marcas com as variações ambientais sob as 

quais as populações amostradas se encontram (Manel et al. 2009). 

Trabalhos desenvolvidos com marcadores AFLP em genômica de populações em 

plantas começaram a surgir na literatura científica na década de 90. Muluvi et al (1999) 

usaram 140 indivíduos de uma importante espécie arbórea (Moringa oleifera Lam.) e a partir 

de 236 marcas de AFLP, permitiu-se concluir que os altos níveis de diferenciação 

populacional detectados sugeriram que seu centro de origem devia ser preservado e usado 

como uma importante fonte de recurso genético. Em um trabalho com duas espécies de 

palmeiras (Howea forsteriana e Howea belmoreana) endêmicas da ilhas “Lord Howe”, 

situadas na oriental da Australia, permitiu desvendar o processo de especiação simpátrica 

em plantas. Espera-se que nos eventos de especiação simpátrica a variação genética nãoneutra 

seja de maior importância, já que a separação das linhagens ocorre em função da 

adaptação da diferentes condições ecológicas. Com a genotipagem de indivíduos dessas 

duas espécies com 274 locos AFLPs, foi possível detectar poucos locos (“outliers”) com 

valores altos de divergência (FST) entre espécies (Savalainen et al 2006). 

Contudo, hoje podemos acessar os genomas em busca de variação SNPs, que 

significa: “Single Nucleotide Polymorphism” (Polimorfismo de um único nucleotídeo) de 

organismos não modelos a baixo custo, utilizando as tecnologias modernas de 

seqüenciamento. Uma dessas tecnologias é o seqüenciamento de uma parte do genoma 

que permite a busca e genotipagem de SNPs concomitantemente. Essa técnica é conhecida 

como RAD-seq (do inglês “Restriction-site Associated Sequencing”). Com o seqüenciamento 

de pequenos fragmentos de DNA na plataforma Illumina, permite acessar uma grande 

quantidade de polimorfismo de DNA. Com essa grande quantidade de dados genômicos, os 

estudos populacionais ficarão mais robustos, pois podemos acessar estimativas genômicas 

dos parâmetros tais como: variação entre populações - FST, heterozigosidades esperada 

(HE) e observada (HO), além de podermos acessar praticamente todo o genoma em busca 

de locos com padrão de distribuição “outlier”(Hohenlohe et al. 2010). 

A genômica populacional como uma abordagem nova dentro da genética de 

populações além de permite: identificar e quantificar a variação genética não neutra e refinar 

as estimativas populacionais demográficas (fluxo gênico, estruturação genética, endogamia, 

entre outros) com a retirada desses locos de distribuição específica e; pode levar a 

descoberta de genes candidatos relacionados à características ecológicas e de interesses 

agronômicos (ex.: à adaptação de organismos ao estresse biótico e abiótico) (Stapley et al. 

2010). 


19



Genômica aplicada a genética de conservação de plantas 

O nosso grupo de pesquisa está envolvido com a aplicação dos conhecimentos da 

genômica de populações, no estudo da adaptação de organismos ao seu ambiente, em dois 

contextos distintos, mas que são intrinsicamente associados, pois ambos se tratam de 

eventos de evolução recente (“short term evolution”). 

Uma das aplicações das ferramentas modernas de sequenciamento e obtenção de 

dados genômicos, com “frame work” da genômica de populações é o estudo da restauração 

florestal, e da adaptação das plantas a esse ambiente que sofre constantemente com a 

ação do homem. A prática da restauração florestal no Brasil é recente, e gradativamente 

têm incorporado novas metodologias para aumentar as chances de sustentabilidade das 

áreas restauradas. Uma das principais preocupações dos pesquisadores em relação à 

viabilidade biológica dessas áreas diz respeito à diversidade genética. De forma empírica, 

sabe-se que a maioria dos projetos de restauração florestal foram implantados a partir de 

sementes provenientes de um número reduzido de matrizes, ou seja, com baixa diversidade 

genética, de forma que a sustentabilidade pode estar ameaçada. As análises de diversidade 

genética e de estrutura de populações serão geradas pelo uso de alguns marcadores 

moleculares como os microssatélites, AFLP e SNPs, e dessa forma será possível gerar 

parâmetros populacionais que subsidiarão o manejo e a conservação de importantes 

espécies de uso florestal e medicinal, além de permitir estudar as bases genéticas da 

adaptação no processo de restauração florestal. 

Funk et al 2012 fornecem uma nova estratégias para integrar dados em marcadores 

neutros e adaptáveis para proteger a biodiversidade. Segundo os autores dados genômicos 

tem o potencial de revolucionar a delimitação das unidades de conservação (CUs). Dados 

de marcadores genômicos (neutros e adaptativos) fornecem diferentes tipos de informações 

que devem, portanto ser combinados para a tomada de decisões na conservação. 

A detecção de locos “outliers” pode ajudar a definir UES (unidades evolutivamente 

significativas; Ryder, 1986) , o que pode ser de essencial importância para o manejo de 

áreas restauradas. O conceito de UES, vem sendo a muito discutido e pode ser definido 

como uma linhagem que demonstra fluxo gênico altamente reduzido em relação a outras 

linhagens (Fraser & Bernatchez) e, que possuem diferentes adaptações e pressões 

seletivas, além de relações ecológicas distintas (Crandall et al, 2000). Como parte de um 

dos nossos projetos, faremos enriquecimento genético de áreas reflorestada visando 

maximizar a variação neutra e minimizar a variação adaptativa. Ao se levar em 

consideração, neste processo, somente a variação neutra, pode-se misturar linhagens com 

locos adaptativos (“outliers”) diferentes e desta forma, produzir uma depressão exogamica 

nestes locais (Edmands et al, 2007). Assim, a utilização de marcadores neutros e 

adaptativos, possibilita o manejo de populações ameaçadas com o menor risco. 

Genômica aplicada ao manejo de insetos-pragas 

Outro cenário interessante de estudo é o de manejo de pragas. Neste, o nosso grupo 

irá utilizar a abordagem genômica para entender e quantificar as mudanças evolutivas que 

as pragas agrícolas passam durante o processo de manejo de populações e mudanças na 

paisagem. Escolhemos como modelo de estudo, a broca-da-cana, Diatraea saccharalis, 

principal praga da cultura da cana-de-açúcar e uma das pragas do milho (Passos & 

Canechio 1981). Atualmente essa espécie vem se destacando como praga nas culturas do 

arroz e sorgo. Por ser uma espécie de hábito alimentar polífago/generalista, se torna um 

importante modelo de estudo para aspectos evolutivos da associação entre inseto e plantahospedeira. 

O cenário ecológico que a espécie está inserida traz fatores que deixa o estudo 

da especiação simpátrica ainda mais interessante. O cenário agrícola é um ecossistema que 

sofre constantes mudanças tanto no aspecto da paisagem (arranjo das culturas no mosaico 

agrícola) quanto em conseqüência do manejo de pragas. Os conhecimentos sobre aspectos 

ecológicos/evolutivos por traz da distribuição da variabilidade genética como: fluxo gênico e 


20



associação entre praga e planta-hospedeira são determinantes para o desenvolvimento de 

tecnologia de manejo compatíveis e eficazes ao contexto que a espécie se encontra. 

Os conhecimentos que se tem a respeito de características bioecológicas, obtidos 

tradicionalmente por estudos ecológicos e da biologia das pragas não são suficientes para 

conhecer os padrões de dispersão, migração, e associação com as plantas hospedeiras, 

sendo necessários, portanto, estudos mais refinados utilizando marcadores moleculares e o 

embasamento teórico da genética de populações (Bourguet et al. 2000, Martinelli et al. 

2007; Malausa et al. 2008). Se valendo de tecnologias de genotipagem em larga escala que 

permite cobrir grande parte do genoma com custo reduzido, o trabalho de pesquisa com 

insetos-pragas traz uma nova abordagem para estudos evolutivos de organismos não 

modelos além de contribuir com informações a respeito de aspectos genômicos da evolução 

inseto-planta Acreditamos que essa abordagem permitirá um estudo molecular sobre a 

associação evolutiva da praga com plantas hospedeiras além de gerar subsídios para 

prática de manejo de pragas mais eficientes e sustentáveis. 

Agradecimentos 

Os autores agradecem à FAPESP que financia um auxílio à pesquisa Programa 

Biota: Taxonomia, Sistemática e Filo Geografia projeto intitulado “Biologia da conservação 

de espécies nativas da Mata Atlântica com potencial fitoterápico: Uma abordagem genética 

sobre restaurações florestais”, responsável: Maria Imaculada Zucchi, vigência: 08/2013, 

(processo 2011/50296-8). Agradecemos também a FAPESP pela bolsa de Marcos Vinicius 

Bohrer Monteiro Siqueira - bolsista de pós-doutorado FAPESP (processo 2011/06756-4) e 

Camila Menezes Trindade Macrini – bolsista de pós-doutorado FAPESP (processo 

2011/21295-3). 

Ao CNPq pelo projeto Universal Título: Novas abordagens em Genética de 

Populações de Insetos: Genômica de Populações e Scan Genômico Comparativo no estudo 

de aspectos evolutivos de pragas agrícolas, CNPq (Edital Universal - processo 

484338/2011-0), Responsável: Maria Imaculada Zucchi, Vigência: 12/2013. 

À CAPES pela bolsa concedida ao aluno Vitor Antonio Correa Pavinato - Doutorando 

do programa de pós-graduação em Genética e Biologia Molecular da IB/UNICAMP. 

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23



DISTRIBUIÇÃO DA DIVERSIDADE GENÉTICA E 

CONSERVAÇÃO DE ESPÉCIES ARBÓREAS EM 

REMANESCENTES DE FLORESTA OMBRÓFILA 

MISTA EM SANTA CATARINA 

Adelar Mantovani 1,2* , Alexandre Mariot 2 , Juliano Zago da Silva 2 , Ricardo Bittencourt 2 , 

Felipe Steiner 2 , Tiago Montagna 2 e Maurício Sedrez dos Reis 2 

1 Departamanto de Eng. Florestal, UDESC-CAV 

2 Núcleo de Pesquisas em Florestas Tropicais, UFSC 

* Email: a2ama@cav.udesc.br 

Palavras-chave: genética de populações, estrutura genética, alelos raros, alelos exclusivos. 

RESUMO 

Introdução: Durante décadas as formações vegetais catarinenses foram exploradas 

observando-se apenas critérios econômicos, como resultado desta exploração, estas 

formações, apresentam hoje uma significativa redução e fragmentação. Os efeitos de 

redução de tamanho populacional atuam diretamente na redução da variabilidade genética 

das populações remanescentes, levando a perdas da capacidade adaptativa e declínio 

populacional. O estudo da estrutura e da diversidade genética permite o conhecimento da 

organização e distribuição da variabilidade genética entre e dentro de populações naturais. 

Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar como a diversidade genética de algumas 

espécies da Floresta Ombrófila Mista (Araucaria angustifolia, Dicksonia sellowiana, Ocotea 

porosa, Butia eriospatha e Podocarpus lambertii) está distribuída no Estado, visando 

fundamentar estratégias efetivas de conservação. A variação genética foi caracterizada a 

partir das estimativas das frequências alélicas e dos principais índices de estrutura e 

diversidade genética. Resultados: de uma maneira geral os resultados indicam grande 

variação de diversidade genética potencial em cada uma das espécies e, principalmente 

entre as populações das mesmas. Contudo, os índices de fixação foram, na sua maioria, 

elevados, refletindo os efeitos da redução dos tamanhos populacionais nas populações 

estudadas em decorrência do processo histórico de super-exploração. Na maioria dos os 

casos a divergência entre as populações foi elevada. Os índices de fixação por microrregião 

foram, em geral, superiores a média das respectivas populações, refletindo os efeitos da 

fragmentação florestal existente. Conclusões: a situação de fragmentação das florestas e 

de redução do tamanho populacional leva a uma perspectiva de perdas ainda maiores de 

diversidade (elevados índices de fixação de alelos) para as espécies avaliadas. O conjunto 

de resultados reforça as possibilidades de perda de adaptabilidade e dinamismo 

populacional, o que traz como consequência, com o passar do tempo (gerações), grande 

aumento no risco de extinção local. Os resultados obtidos até o momento apontam para a 

necessidade de políticas públicas que favoreçam a ampliação da conectividade entre 

fragmentos como principal fator de reversão da situação de fragilidade em que se 

encontram as espécies e remanescentes florestais. Os resultados indicam também que, 

apesar das fragilidades, há populações e regiões com reservas de diversidade potencial 

elevada. 

* To whom correspondence should be addressed. 


24



1 INTRODUÇÃO 

O estado de Santa Catarina está inserido no bioma Mata Atlântica e apresenta três 

formações florestais predominantes, a Floresta Ombrófila Mista (FOM), Floresta Ombrófila 

Densa (FOD) e a Floresta Estacional Decidual (FED), e uma formação campestre, os 

Campos de altitude. De acordo com Klein (1978), tais formações cobriam 44,9%, 30,7%, 8% 

e 14,2% da superfície do estado, respectivamente. 

Durante décadas as formações vegetais catarinenses foram exploradas observando-se 

apenas critérios econômicos, especialmente no século passado. Conforme Reitz et al. 

(1979), o auge da exploração florestal no estado se deu entre as décadas de 1950 e 1970, e 

como resultado desta exploração, as formações vegetais catarinenses apresentam hoje uma 

significativa redução e fragmentação. 

Os efeitos da ação antrópica não produziram apenas uma redução da área de cobertura 

florestal em todas as formações do estado, mas também uma redução no tamanho 

populacional (número de indivíduos) das espécies presentes nestes remanescentes, 

principalmente as de valor madeireiro, devido à exploração madeireira ao longo do século 

XX. Assim, além da redução da cobertura e fragmentação, a exploração madeireira levou a 

um empobrecimento em termos populacionais e de riqueza de espécies nos remanescentes. 

A percepção da situação sintetizada nos parágrafos anteriores (ainda que sem 

quantificação adequada antes desta publicação) levou à estruturação de 

legislações/regulamentações cada vez mais restritivas em relação ao uso e conservação 

das espécies da Mata Atlântica em Santa Catarina, bem como a indicação de espécies 

ameaçadas em listas cada vez maiores (IBAMA 1992; MMA 2008; II Workshop sobre 

espécies vegetais ameaçadas de extinção em Santa Catarina, 2011). 

Os efeitos de redução de tamanho populacional atuam diretamente na redução da 

variabilidade genética das populações remanescentes, levando a perdas da capacidade 

adaptativa e declínio populacional, como discutido em Templeton et al. (1990), Bawa & 

Krugman (1990), Murawsky & Hamrick (1992) e Murawsky (1995), por exemplo. 

A redução da variabilidade genética ocorre não apenas por perda de diversidade, mas 

também pela redução das trocas alélicas decorrente da ausência de vetores efetivos do 

fluxo gênico ou de dificuldades na efetivação das trocas alélicas em decorrência da 

fragmentação. Direta ou indiretamente, a redução do número de indivíduos de uma dada 

espécie nos remanescentes e a fragmentação florestal afetam a fauna polinizadora e 

dispersora de sementes, bem como os mecanismos de movimentação dos alelos entre e 

dentro de populações, aumentando e retroalimentando os riscos de perda de diversidade 

genética e de declínio populacional. Os mecanismos envolvidos neste processo são muitas 

vezes complexos e podem envolver efeitos negativos de deriva genética, cruzamento entre 

aparentados, depressão por endogamia, expressão de alelos deletérios, redução da 

adaptabilidade, entre outros (Crow & Kimura 1970; Allard 1971; Mettler & Gregg 1973; 

Falconer 1981; Bawa & Krugman 1990; Murawsky & Hamrick 1992; Ellstrand & Elam 1993). 

A manutenção de elevados índices de diversidade, bem como dos mecanismos 

associados à manutenção desta diversidade, para uma dada espécie, garante as gerações 

futuras à possibilidade de formarem novos recombinantes, garantindo assim a capacidade 

de adaptação a novos ambientes e a própria manutenção da dinâmica populacional, 

conforme discute Reis (1996). 

O estudo da estrutura e da diversidade genética permite o conhecimento da 

organização e distribuição da variabilidade genética entre e dentro de populações naturais. 

Esse entendimento é imprescindível à escolha de estratégias visando à conservação e a 

exploração das populações em seu habitat, com a perspectiva de manutenção da 

diversidade e garantia de sustentabilidade (Oyama 1993; Reis 1996). 


25



Desta forma, a caracterização de aspectos da diversidade genética em populações 

naturais de espécies endêmicas e ou ameaçadas, além de identificar com eficiência a 

situação, em termos de diversidade e erosão genética (perda da diversidade genética ao 

longo das gerações, normalmente acompanhada de redução da capacidade adaptativa) nas 

populações destas espécies, traz fundamentos importantes para a definição de estratégias 

no sentido da proteção destas populações e reversão do quadro de risco de extinção. 

Exemplos para o Estado de Santa Catarina podem ser vistos em Auler et al. (2002), Conte 

et al. (2003; 2006; 2008), Mantovani et al. (2006), Tarazi et al. (2010), Hmeljevski et al. 

(2011), Ferreira et al. (2012), Bitencourt et al. (a, b, submetidos), Montagna et al. (a, b, 

submetidos), entre outros. 

A diversidade genética é uma medida da quantidade de variação existente em uma 

dada população (local) de uma espécie, obtida por meio de um conjunto de 

indicadores/índices a partir de marcadores genéticos. A caracterização da diversidade 

genética permite estabelecer se uma dada população de uma espécie possui muita ou 

pouca variação que pode ser transmitida aos seus descendentes, permite avaliar se já 

ocorreu muita perda desta variação em função do processo de exploração feito no passado 

ou da fragmentação florestal. Com a avaliação de várias populações de uma dada espécie é 

possível estabelecer qual a situação para a espécie numa dada abrangência geográfica, o 

Estado de Santa Catarina ou uma região do Estado, por exemplo. 

Assim, é possível verificar em que regiões do Estado existe maior ou menor diversidade 

genética e o que pode ser feito para favorecer a conservação de uma dada espécie. Por 

exemplo, restabelecer ligações (conectividade) entre populações para facilitar o aumento da 

diversidade genética nas populações que apresentam baixa diversidade, via possibilidade 

de cruzamentos entre as populações (fluxo gênico). Portanto, um dos objetivos do Inventário 

Florístico Florestal de Santa Catarina (IFFSC) foi avaliar como a diversidade genética de 

algumas espécies da flora nativa ameaçadas, ou potencialmente ameaçadas, de extinção 

está distribuída no estado, visando fundamentar estratégias efetivas de conservação. 

2 RESULTADOS E DISCUSÃO 

Os resultados obtidos para as cinco espécies escolhidas estão apresentados nas 

Tabelas de 1 a 5. Em termos gerais, os resultados indicaram comportamentos com uma 

tendência semelhante em termos de alta perda de diversidade nas populações (índice de 

fixação elevado). Estes resultados podem ser relacionados aos processos históricos de uso, 

como a superexploração, expansão das fronteiras agrícolas com redução da área de 

cobertura florestal e fragmentação dos remanescentes. Tais processos produzem redução 

dos tamanhos populacionais e redução do fluxo gênico entre populações, causando 

isolamento e perda de diversidade em nível local. Por outro lado, a exceção de Podocarpus 

lambertii, todas as demais espécies apresentam populações com diversidade alta, 

individualmente ou em conjunto, indicando um grande potencial para conservação e 

recomposição das populações remanescentes. 

Para Araucaria angustifolia (Tabela 1), o conjunto de populações apresentou um total de 

37 alelos nos 13 locos avaliados (Â = 1,77 ± 0,15). As populações apresentaram em média 

diversidade genética moderada (P99% = 0,45 ± 0,10; Ĥo = 0,094 ± 0,023; Ĥe = 0,124 ± 

0,026). O índice de fixação foi elevado ( fˆ = 0,245 ± 0,129), sendo superior a 0,2 em 17 

(54,8%) das 31 populações avaliadas, fato que indica um possível histórico de cruzamentos 

entre aparentados, uma vez que a espécie é dioica, bem como, reflexo dos reduzidos 

tamanhos populacionais em que se encontram as populações da mesma. Aspecto já 

ressaltado em Auler et al. (2002). Pode-se observar também (Tabela 1) uma grande 

quantidade de alelos raros e alelos exclusivos em quatro populações, reforçando a 

evidência de tamanhos populacionais reduzidos. 

A divergência genética entre as populações de A. angustifolia também foi relativamente 

alta ( F ˆ st = 0,129) e significativa, indicando diferenças importantes entre as populações, 

reforçando a necessidade de conservação de grande número de remanescentes. Os 


26



principais índices de diversidade se mostraram também variáveis entre as populações, 

refletindo a fragilidade em que se encontram a maior parte das populações, mas também 

indicando que há populações em situação de menor fragilidade (p. ex., cinco populações 

com valores de fˆ não diferente de zero e seis populações com Ĥe superior a 0,15, Tabela 

1). Estas últimas apresentam grande potencial como fonte de diversidade e áreas para 

coleta de sementes. 

Em relação às microrregiões, observa-se também uma variação expressiva para os 

principais índices de diversidade (Tabela 1, em negrito). Por exemplo, Chapecó e 

Curitibanos são as duas microrregiões com maior diversidade genética, mas também com 

grandes diferenças entre as populações amostradas. Estes resultados indicam, novamente, 

uma grande heterogeneidade, agora entre as microrregiões. Além disso, chama a atenção 

os valores elevados dos índices de fixação para cada uma das microrregiões, geralmente 

superiores à média dos valores das populações na respectiva região. Este resultado reflete 

a existência de diferenças expressivas entre as populações dentro de cada região, 

possivelmente decorrente de processos históricos (e/ou pré-históricos) que ocorreram nesta 

escala e reforçam a importância de medidas de conservação em escala regional: criação de 

Unidades de Conservação associadas a políticas/ações para ampliação de conectividade 

entre remanescentes. 

Para a imbuia (Ocotea porosa) (Tabela 2), foram encontrados 51 alelos nos 15 locos 

avaliados (Â = 2,25 ± 0,19). A diversidade genética média encontrada para o conjunto de 

populações foi alta (P99% = 0,76 ± 0,08; Ĥo = 0,221 ± 0,058; Ĥe = 0,271 ± 0,045), 

entretanto o índice de fixação médio também foi alto ( fˆ = 0,188 ± 0,158), sendo maior que 

0,2 para sete (53,8%) das 13 populações avaliadas, fato que pode estar associado à 

fragmentação e ao reduzido tamanho das populações. Nessas condições, os efeitos de 

deriva genética são favorecidos, demonstrando uma fragilidade das populações da espécie. 

A divergência genética entre as populações foi alta ( F ˆ st = 0,191) e significativa, reflexo 

de um aparente reduzido fluxo gênico da espécie (Bittencourt et al. submetido a). Também 

foram identificados alelos exclusivos em duas populações. Estes resultados refletem a 

fragilidade em que se encontram a maior parte das populações, mas também indicam que 

há populações em situação favorável em termos de conservação (p. ex. três populações 

com alta diversidade e índice de fixação não diferente de zero, Tabela 2). Estas últimas 

apresentam grande potencial como fonte de diversidade para restauração e áreas de coleta 

de sementes. 

Em relação às microrregiões, observam-se diferenças importantes entre a microrregião 

de Xanxerê e as demais, especialmente em relação ao índice de fixação. Tal resultado está, 

em grande parte, associado ao fato de duas das três populações amostradas nesta região 

apresentarem índice de fixação não diferente de zero; ambas estão em Unidades de 

Conservação (Parque Nacional das Araucárias). Nas demais microrregiões, os resultados 

obtidos indicam um padrão semelhante ao da araucária, valendo as mesmas considerações. 


27



Tabela 1. Índices de diversidade intrapopulacional, índice de fixação, alelos raros e 

exclusivos para 31 populações de Araucaria angustifolia em suas respectivas microrregiões 

de ocorrência. n = nº indivíduos; P99% = % locos polimórficos (13 loc.); Â = alelos por loco; 

Ĥo = heterozigosidade observada; Ĥe = heterozigosidade esperada; fˆ = índice de fixação * 

(p< 0,05); AR = nº alelos raros (freq.




exclusivos para 13 populações de Ocotea porosa em suas respectivas microrregiões de 

ocorrência. n = nº indivíduos; P99% = % locos polimórficos (15 loc.); Â = alelos por loco; Ĥo 

= heterozigosidade observada; Ĥe = heterozigosidade esperada; fˆ = índice de fixação * (p< 

0,05); AR = nº alelos raros (freq.



0,022; Ĥe = 0,078 ± 0,021). As frequências genotípicas das populações apresentaram 

desvios significativos das frequências esperadas em panmixia, evidenciando um alto índice 

de fixação médio ( fˆ = 0,372). Foram também encontrados alelos raros em todas as 

populações, além de dois alelos exclusivos. Estes resultados refletem a situação 

preocupante na qual se encontram a maior parte das populações. 


exclusivos para 14 populações de Butia eriospatha em suas respectivas microrregiões de 

ocorrência. n = nº indivíduos; P99% = % locos polimórficos (13 loc.); Â = alelos por loco; Ĥo 

= heterozigosidade observada; Ĥe = heterozigosidade esperada; fˆ = índice de fixação * (p 

< 0,05); AR = nº alelos raros (freq. < 0,05); AE = nº alelos exclusivos. 

Microrregião População n P99% Â Ĥo Ĥe fˆ Fraiburgo 56 53,8 1,77 0,110 0,131 0,161* 

AR AE 

5 

Joaçaba 

Matos Costa 

Lebon Régis 

56 

56 

38,5 

38,5 

1,62 

1,62 

0,154 

0,143 

0,187 

0,149 

0,176* 

0,040 

1 

2 1 

Microrregião 168 53,8 2,00 0,136 0,190 0,288* 5 2 

Santa Cecília 42 38,5 1,54 0,115 0,113 -0,023 3 

Curitibanos 1 49 23,1 1,39 0,064 0,057 -0,116 2 

Curitibanos 

Curitibanos 2 

Curitibanos 3 

52 

51 

38,5 

30,8 

1,54 

1,46 

0,081 

0,091 

0,096 

0,079 

0,155* 

-0,154* 

2 

2 

Monte Carlo 50 53,8 1,69 0,074 0,099 0,255* 4 

Microrregião 243 46,5 1,85 0,088 0,107 0,182* 6 1 

Otacílio Costa 55 30,8 1,39 0,048 0,060 0,212* 

Campos de Lages 

São J. do Cerrito 1 

São J. do Cerrito 2 

54 

55 

7,7 

30,8 

1,23 

1,31 

0,037 

0,106 

0,042 

0,104 

0,111 

-0,018 

2 

Microrregião 164 38,5 1,54 0,063 0,079 0,198* 4 0 

Alto Bela Vista 47 61,5 2,00 0,172 0,186 0,077 5 2 

Concórdia 

Irani 1 

Irani 2 

52 

52 

38,5 

38,5 

1,39 

1,46 

0,134 

0,093 

0,127 

0,120 

-0,057 

0,230* 

Microrregião 151 54,0 2,08 0,130 0,176 0,260* 7 2 

Estado Média 52 37,0 1,53 0,102 0,111 0,083 - - 


exclusivos para 12 populações de Podocarpus lambertii em suas respectivas microrregiões 



(p < 0,05); AR = nº alelos raros (freq. < 0,05); AE = nº alelos exclusivos. 

Microrregião População n P99% Â Ĥo Ĥe fˆ São Cristóvão 52 64,6 1,82 0,059 0,097 0,388* 

AR 

6 

AE 

Curitibanos 

Curitibanos 1 

Curitibanos 2 

70 

51 

54,5 

54,5 

1,91 

1,82 

0,091 

0,053 

0,096 

0,071 

0,052 

0,247* 

8 

6 

Microrregião 173 63,6 2,46 0,070 0,131 0,467* 13 0 

Lebon Régis 1 56 63,6 1,82 0,050 0,093 0,457* 6 

Joaçaba 

Lebon Régis 2 

Caçador 

55 

61 

54,5 

45,5 

1,55 

1,73 

0,024 

0,039 

0,059 

0,039 

0,597* 

0,015 

4 

6 

Microrregião 172 63,6 2,27 0,038 0,067 0,442* 12 0 

Painel 55 45,5 1,55 0,052 0,092 0,436* 3 

Campos de São José Cerrito 53 45,5 1,73 0,016 0,064 0,744* 6 1 

Lages 

Capão Alto 50 60,0 2,20 0,042 0,062 0,320* 10 

Microrregião 158 63,6 2,27 0,036 0,070 0,493* 12 2 

Mafra 53 54,5 1,82 0,045 0,078 0,431* 6 

Canoinhas/São Bela V. Toldo 58 45,5 1,73 0,036 0,084 0,571* 7 

Bento do Sul Campo Alegre 52 45,5 1,91 0,085 0,110 0,224* 7 1 

Microrregião 164 63,6 2,18 0,054 0,092 0,413* 8 1 

Estado Média 56 48,0 1,80 0,049 0,078 0,372 - - 

A divergência entre populações amostradas de P. lambertii foi elevada ( F ˆ st = 0,216) e 

significativa, indicando existirem diferenças importantes entre as populações do Estado e, 

portanto, a relevância de se considerar várias populações em ações para a conservação. A 


30



baixa diversidade encontrada é um forte indicativo da necessidade de ações urgentes de 

conservação, inclusive ex-situ. 

Em relação às microrregiões, observa-se um comportamento semelhante ao 

mencionado para as espécies já descritas. Contudo, a baixa diversidade populacional 

também se reflete nas microrregiões (Tabela 4), reforçando a situação de ameaça desta 

espécie em todo o Estado. 

Para Dicksonia sellowiana (Tabela 5), os sete sistemas utilizados revelaram oito locos 

passíveis de interpretação, todos polimórficos. Foram encontrados 26 alelos para o conjunto 

das 30 populações (Â = 2,10 ± 0,28). Em todas as populações foram encontrados alelos 

raros. As populações apresentaram diversidade genética intermediária (P99% = 0,65 ± 0,14; 

Ĥo = 0,117 ± 0,058; Ĥe = 0,144 ± 0,049) e um índice de fixação bastante variável de 0,184 ± 

0,185, entretanto 17 (56,7%) das 30 populações amostradas apresentaram índice de fixação 

maior que 0,2, fato que pode ser reflexo da fragmentação do ambiente natural da espécie. 

Por outro lado, seis populações apresentaram índice de fixação negativo e/ou não diferente 

de zero e nove populações apresentaram Ĥe superior a 0,15. Estes últimos resultados 

indicam a existência de uma diversidade potencial expressiva e possibilidade de alteração 

da situação de vulnerabilidade em que se encontra a espécie. 

Observou-se também uma elevada e significativa divergência genética interpopulacional 

( F ˆ st = 0,439), evidenciando um baixo fluxo gênico aparente entre as populações. O valor 

elevado da divergência entre populações indica existirem diferenças importantes entre as 

populações ao longo do Estado. Esta divergência pode ser explicada, em parte, pela 

especificidade de ambiente ocupado pela espécie, que pode restringir o seu fluxo gênico. O 

xaxim apresenta crescimento lento e está muito associado às áreas ciliares, este aspecto 

demonstra a importância da preservação destas áreas para o estabelecimento de ações de 

conservação para a espécie. 

Em termos de microrregiões, os valores de diversidade (Ĥe) média são elevados (> 0,2) 

em quatro microrregiões (Tabela 5), contudo, os resultados indicam também a existência de 

fortes divergências entre as populações dentro de cada região. Tais resultados reforçam a 

importância de medidas de conservação em escala regional: criação de Unidades de 

Conservação associadas à políticas/ações para ampliação de conectividade entre 

remanescentes. 


31




exclusivos para 30 populações de Dicksonia sellowiana em suas respectivas microrregiões 



(p < 0,05); AR = nº alelos raros (freq. < 0,05); AE = nº alelos exclusivos. 

Microrregião População n P99% Â Ĥo Ĥe fˆ São Cristóvão – 453 52 88,9 2,2 0,136 0,185 0,266* 

AR AE 

4 

Curitibanos – 369 47 62,5 2,0 0,069 0,092 0,252* 5 

Camp. Novos – 321 44 75,0 2,4 0,079 0,110 0,280* 4 

Curitibanos Curitibanos – 562 45 50,0 2,1 0,063 0,098 0,364* 5 

Santa Cecília – 623 53 88,9 2,3 0,145 0,230 0,372* 4 

Ponte Alta – 413 56 77,8 2,2 0,101 0,130 0,224* 4 

Microrregião 317 87,5 3,25 0,099 0,229 0,567* 11 0 

Chapecó – 537 52 55,6 1,8 0,096 0,125 0,234* 2 

Chapecó 

Campo Erê – 919 

São L. D'oeste – 877 

55 

53 

50,0 

62,5 

1,9 

2,0 

0,100 

0,062 

0,121 

0,132 

0,171* 

0,534* 

4 

4 

Microrregião 159 75,0 2,38 0,086 0,134 0,357* 6 0 

D. Cerqueira - 1001 56 77,8 1,9 0,110 0,125 0,119* 3 

São Miguel do Oeste 

Palma Sola – 6003 

Palma Sola – 6001 

45 

52 

75,0 

88,9 

2,5 

2,2 

0,104 

0,124 

0,134 

0,134 

0,228* 

0,079 

5 

4 

Microrregião 152 87,5 3,00 0,111 0,134 0,173* 13 0 

Campo B. do Sul – 727 52 88,9 2,0 0,130 0,131 0,011 3 

São Joaquim –92 61 88,9 2,2 0,103 0,168 0,390* 4 

Urubici – 140 51 88,9 2,1 0,165 0,217 0,241* 4 

Campos de Lages 

Painel – 211 

Urubici – 167 

53 

60 

66,7 

77,8 

1,7 

2,1 

0,055 

0,176 

0,089 

0,210 

0,383* 

0,161* 3 

Anita Garib.– 5000 49 100 3,0 0,087 0,117 0,259* 8 

Urubici – 192 51 75,0 2,3 0,149 0,182 0,183* 4 

Microrregião 383 87,5 3,25 0,123 0,272 0,546* 9 0 

Major Vieira – 895 53 77,8 2,1 0,073 0,144 0,499* 3 

Canoinhas/São Mafra – 1061 48 66,7 2,1 0,168 0,151 -0,118* 5 

Bento do Sul Itaiópolis – 901 50 66,7 2,0 0,157 0,133 -0,186* 4 

Microrregião 149 75,0 2,38 0,125 0,138 0,098* 8 0 

Passos Maia – 832 52 77,8 2,1 0,139 0,183 0,239* 4 

São Domingos – 926 53 44,4 1,8 0,113 0,101 -0,121* 2 

Xanxerê 

Ponte Serrada – 720 

Ponte Serrada – 718 

55 

51 

66,7 

66,7 

1,9 

1,9 

0,044 

0,068 

0,069 

0,078 

0,366* 

0,127* 

2 

2 

Fax. Guedes – 714 53 77,8 2,4 0,131 0,148 0,117* 5 

Microrregião 259 75,0 2,75 0,095 0,311 0,695* 6 0 

Macieira – 724 52 66,7 2,0 0,091 0,133 0,318* 5 

Joaçaba 

Joaçaba – 1980 

Caçador – 729 

52 

96 

77,8 

88,9 

2,1 

2,2 

0,123 

0,358 

0,142 

0,295 

0,135* 

-0,214* 

4 

5 

Microrregião 200 87,5 2,75 0,225 0,248 0,092* 8 0 

Estado Média 54 65,2 2,1 0,117 0,144 0,184 - - 

3 CONCLUSÕES 

Os resultados obtidos, de maneira geral, ressaltam a importância de medidas de 

conservação em escala regional, evidenciando a necessidade e importância de políticas que 

favoreçam a ampliação de conectividade entre fragmentos florestais, além da criação de 

Unidades de Conservação. Ações que estimulem a conservação pelo uso, estruturadas em 

escala regional, apresentam grande potencial para recompor a conectividade entre os 

remanescentes florestais na área de ocorrência da espécie. 

Embora tenham sido observados, para todas as espécies, valores elevados dos índices 

de fixação, bem como alelos exclusivos em algumas populações, que são fortes evidências 

de estruturação e de limitações de fluxo gênico e, portanto, de redução da performance 

adaptativa, produtiva e reprodutiva das espécies em questão, os valores observados de 

diversidade genética indicam que, para o conjunto das populações de quase todas as 

espécies estudadas, existe grande diversidade passível de ser resgatada. Neste sentido, 

ações voltadas ao aumento do fluxo gênico/conectividade, como a criação de corredores 

ecológicos, áreas de coleta e produção de sementes, proteção à fauna e o enriquecimento 


32



de áreas que apresentam baixa diversidade e/ou alta fixação com sementes originadas em 

fragmentos próximos com maior diversidade genética, devem ser incentivadas. 

A identificação de áreas com grande diversidade genética para a criação de áreas 

públicas de conservação, como Parques e Florestas Nacionais, ou para identificação de 

áreas privadas com potencial para formação de áreas de coletas de sementes é de 

fundamental importância. A criação de áreas de coleta de sementes em Unidades de 

Conservação parece ser atualmente uma ação de grande efetividade para a conservação. 

Sobretudo pelo fato de que, nestas áreas, informações genéticas que norteiam a captura da 

maior diversidade genética possível poderiam ser geradas e estarem disponíveis e 

acessíveis aos coletores de sementes, que serão os principais agentes, além da fauna, a 

recomporem a diversidade genética que vem continuamente sendo perdida. Por exemplo, a 

distância entre plantas, dada pela coancestria, para evitar a coleta em uma mesma deme 

ou, ainda, a incorporação do tamanho efetivo, para diminuir os efeitos da endogamia. 

Índices que apresentam processos simples de obtenção, porém caros e muito variáveis 

entre áreas, mas que poderiam estar disponíveis em áreas públicas destinadas a 

conservação. 

Os trabalhos de Montagna et al. (submetido a;b) são exemplos onde os autores 

comparam a diversidade genética de araucária e xaxim encontrada dentro e fora de 

Unidades de Conservação. Estes trabalhos revelam que as Unidades de Conservação 

estudadas capturam de maneira efetiva, para estas espécies, a maioria da diversidade 

genética presente no estado de Santa Catarina. O cálculo das distâncias de coleta entre 

matrizes e a correção dos tamanhos efetivos poderiam ser gerados para cada área e ações 

voltadas à recuperação de outros fragmentos ou mesmo a fundação de novas populações 

apresentariam maior garantia de efetividade, sobretudo pelo fato de que a maioria das 

espécies amostradas pelo IFFSC tem caracterizado populações com elevados valores de 

índice de fixação, logo, coletas de sementes realizadas ao acaso ou sem critérios genéticos 

apresentam riscos de agravarem ainda mais o declínio populacional local. 

Entre as espécies estudadas, Podocarpus lambertii e Butia eriosphata estão em pior 

situação em termos de reduzida diversidade atual e risco futuro de ampliação de perdas. 

Ainda que P. lambertii tenha apresentado os menores índices, o ambiente de ocorrência de 

B. eriospatha apresenta atualmente grande pressão de uso, aumentando os riscos de perda 

de populações inteiras para esta espécie. 

Por outro lado, ainda que com riscos e em situações diferente, Araucaria angustifolia 

apresenta abrangência e reserva de diversidade, bem como valor de uso como recurso não 

madeireiro (sementes – pinhões) para ser empregado em programas de restauração e 

ampliação de conectividade entre fragmentos. Ademais, esta espécie já é empregada em 

sistemas agroflorestais importantes para a agricultura familiar no Estado. No caso da 

araucária, sistemas tradicionais como caívas e faxinais já representam um avanço efetivo no 

sentido da ampliação de conectividade entre fragmentos e aumento da cobertura florestal, 

além da conservação da espécie, como discutido em Reis et al. (2010). Assim, as 

informações obtidas sobre diversidade genética, dão suporte a políticas públicas de estímulo 

a: a) formação de áreas de coleta de sementes de espécies nativas, estruturadas com base 

genética; b) plantios de restauração ou comerciais com espécies nativas; c) definição de 

áreas prioritárias para o estabelecimento de ações de conservação e uso; d) definição de 

ações prioritárias de conservação. 

Material e mÉtodos 

No IFFSC a avaliação da diversidade genética foi realizada priorizando espécies que se 

encontravam na lista de espécies ameaçadas de extinção (IBAMA 1992; MMA 2008) e que 

apresentam grande demanda econômica e/ou social. Assim, algumas espécies não 

incluídas nas listas foram também avaliadas visando uma maior representatividade regional. 

Entre as espécies que aparecem na Lista das Espécies Ameaçadas desde 1992, ocorrem 

em Santa Catarina e possuem grande demanda econômica e social, portanto, pressão de 

uso, estão: araucária (Araucaria angustifolia), imbuia (Ocotea porosa), xaxim (Dycksonia 


33



sellowiana). Mais recentemente também aparece na Lista das Espécies Ameaçadas (MMA 

2008) e possue grande demanda sócio econômica o butiá-da-serra (Butia eriospatha). 

Além das espécies mencionadas no parágrafo anterior, foi escolhido o pinho-bravo 

(Podocarpus lambertii), de modo a dar uma abrangência geográfica para a FOM e, ao 

mesmo tempo, permitir a obtenção de resultados que possam ser estendidos para outras 

situações no Estado. 

Também foi considerada a importância de uma abordagem com abrangência e 

representatividade regional no Estado e uma perspectiva maior de integração das diferentes 

abordagens, para a estruturação do produto final através de um portal (SIG). Assim, decidiuse 

por uma amostragem que permitisse representatividade por microrregião, buscando-se 

amostrar ao menos três populações por microrregião, conforme a área de ocorrência de 

cada espécie. Deste modo, o número de populações amostradas variou conforme a área de 

abrangência/ocorrência da espécie no Estado, bem como a existência de populações que 

permitissem uma amostragem consistente. O número de populações amostradas por 

espécie variou de 12 para 31 (Figura 1). 

Figura 1. Locais de coleta das cinco espécies avaliadas na Floresta Ombrófila Mista. 

Além disso, em cada população a amostragem foi de ao menos 50 indivíduos adultos, 

visando dar consistência aos resultados. O número de plantas amostradas em cada 

população define a capacidade do método na detecção de alelos mais raros, portanto com 

maior probabilidade de serem afetados (ter sua frequência alterada, ou até serem 

eliminados ou fixados) em processos de perda de diversidade. Uma amostra de 50 plantas é 

capaz de detectar com igual probabilidade desde alelos de alta frequência até alelos com 

frequência próxima a 1% (Calili-Garcia et al., 2001; 2006). 

A coleta das amostras foliares foi realizada sempre procurando abranger toda a área do 

fragmento florestal, respeitando uma distância mínima entre indivíduos coletados de 50 m. A 

coleta de material vegetal foi efetuada das árvores adultas, procurando coletar folhas e 

ramos intactos e sadios. Estas amostras foram acondicionadas (sacos plásticos 

identificados por indivíduo, colocadas em recipientes térmicos com gelo), transportadas para 

o Laboratório de Fisiologia do Desenvolvimento e Genética Vegetal da Universidade Federal 

de Santa Catarina (LFDGV-UFSC) e armazenadas a aproximadamente 5 C°. 

O procedimento amostral priorizou, ainda, fragmentos em melhor estado de conservação, 

preferindo áreas mais extensas, com árvores de maior porte e florestas com melhor 

estrutura de dossel e sub-bosque. 

A extração de enzimas foi realizada macerando aproximadamente 50 mg de material 

foliar com três gotas de solução de extração n° 1 (Alfenas et al. 1998) e cerca de 10 mg de 

polivinilpolipirrolidona (PVPP). A eletroforese de isoenzimas foi realizada em gel de 

penetrose 30 a 13%, submetido à corrente elétrica com sistema tampão-eletrodo e sistemas 

isoenzimáticos específicos para cada espécie, a partir das recomendações básicas descritas 


34



em Alfenas et al. (1998) e Kephart (1990). A variação genética foi caracterizada a partir das 

estimativas das frequências alélicas e dos índices de diversidade (porcentagem de locos 

polimórficos (P99%), número total de alelos, número médio de alelos por loco (Â), 

heterozigosidade observada (Ĥo) e esperada (Ĥe), e índice de fixação ( f ˆ ), empregando-se o 

programa Fstat (Goudet 2001) e GDA (Lewis & Zaykin 2001). Foram também avaliados o 

número de alelos raros e de alelos exclusivos encontrados em cada população com auxílio 

do Microsoft Excel. As estatísticas F de Wright (Wright 1951) ( F ˆ is, F ˆ it, F ˆ st) foram estimadas 

com auxílio do programa Fstat (Goudet 2001), que utiliza o método descrito por Weir & 

Cockerham (1984) para estimar as estatísticas. 

5 INFORMAÇÕES SOBRE OS AUTORES 

Adelar Mantovani – Eng. Agrônomo, doutor em Ciencias Biológicas – Biologia vegetal, 

professor da Universidade do Estado de Santa Catarina, Lages, SC. 

mantovani@cav.udesc.br 

Alexandre Mariot - Eng. Agrônomo, doutor em Ciências – Recursos Genéticos Vegetais – 

UFSC. 

Juliano Zago da Silva - Eng. Agrônomo, doutor em Ciências – Recursos Genéticos 

Vegetais– UFSC. 

Ricardo Bittencourt - Eng. Agrônomo, doutor em Ciências – Recursos Genéticos Vegetais– 

UFSC. 

Felipe Steiner - Eng. Florestal, mestrando em Ciências – Recursos Genéticos Vegetais– 

UFSC. 

Tiago Montagna - Eng. Agrônomo, mestrando em Ciências – Recursos Genéticos Vegetais– 

UFSC. 

Maurício Sedrez dos Reis - Eng. Agrônomo, doutor em Agronomia, professor da 

Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, SC. msreis@cca.ufsc.br. 

AGRADECIMENTOS 

Agradecemos todos os integrantes do Núcleo de Pesquisas em Florestas Tropicais –UFSC. 

Financiamento: Fundação de Amparo à Pesquisa e Inovação do Estado de Santa Catarina 

(FAPESC). 

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37



MEDINDO O TEMPO EVOLUTIVO A PARTIR DE 

MOLÉCULAS: OS 50 ANOS DO 

RELÓGIO MOLECULAR 

Carlos Guerra Schrago, 

Departamento de Genética, IB-UFRJ 

Email: guerra@biologia.ufrj.br 

Palavras-chave: Evolução molecular, taxas evolutivas, taxa de substituição, filogenias, 

modelo de evolução 

RESUMO 

Nesta palestra será fornecido um breve histórico da teoria do relógio molecular e sua 

importância no estabelecimento da disciplina da evolução molecular e na compreensão da 

escala cronológica de evolução da vida. Será mostrado os recentes desenvolvimentos da 

teoria, como a unificação da biogeografia e a filodinâmica de patógenos de evolução 

1 A EVOLUÇÃO DOS MODELOS DE RELÓGIO MOLECULAR 

A evolução dos organismos deve ser interpretada nos eixos temporal e espacial, pois são 

nestes em que as mudanças genéticas e ecológicas ocorrem. Quando o eixo temporal é 

considerado, deve-se caracterizar não apenas a idade das linhagens, mas também a taxa 

de mudança das mesmas entre os eventos de especiação. A biologia evolutiva, portanto, é 

uma ciência que necessariamente deve ser entendida em quatro dimensões – as três 

espaciais e o tempo (SIMPSON 1944). 

Neste sentido, a genética, por estudar a dinâmica da hereditariedade, encontra-se numa 

posição distinta. Pois são as moléculas informacionais que possibilitam que as 

características dos organismos sejam mantidas ao longo das gerações. Além disso, todas 

as modificações evolutivamente significativas também serão gravadas nestas moléculas. 

Desta forma, esta ciência é capaz de abordar a dimensão temporal de forma única. 

Entretanto, as primeiras abordagens evolutivas desenvolvidas por geneticistas estava 

voltada para uma escala de tempo muito reduzida, pois somente fenômenos populacionais 

eram investigados (MAYR 1985). Foi na década de sessenta do século 20, após o trabalho 

de Zuckerkandl e Pauling (1965), que estudos macroevolutivos usando moléculas 

informacionais tiveram início. Esses trabalhos, caracterizados na época como ‘paleogenética 

química’, eram estudos comparativos de proteínas homólogas em diversas espécies. Um 

dos fenômenos mais interessantes observados nesta fase foi que taxa de substituição de 

nucleotídeos e aminoácidos era aproximadamente constante nas diversas linhagens, de 

forma a caracterizar um ‘relógio molecular’ (KIMURA 1968). 

Se a taxa de evolução molecular é aproximadamente constante, existe uma relação linear 

entre o número de substituições acumuladas e o tempo de divergência. Assim, é possível 

inferir uma escala cronológica para os eventos de especiação a partir das distâncias 

genéticas por simples proporcionalidade; basta conhecer-se a idade de separação de um 

par de linhagens, ou seja, um ponto de calibração. Tal informação poderia ser obtida do 

registro fóssil das mesmas (NEI and KUMAR 2000). 


38



A hipótese da homogeneidade de taxas evolutivas foi severamente criticada pelos muitos 

evolucionistas, pois era inconcebível que genes homólogos em linhagens tão diferentes 

quanto primatas e artiodáctilos apresentassem número aproximado de substituições após a 

separação do ancestral. Diversos testes foram então propostos para verificar a hipótese do 

relógio molecular (e.g, FITCH and LANGLEY 1976). 

Contudo, o conhecimento dos tempos de diversificação das linhagens é tão importante para 

o entendimento de fenômenos macroevolutivos que, na década de oitenta, o 

desenvolvimento de metodologias estatísticas para o estudo do relógio molecular foi 

motivado (KUMAR 2005). Agora, o foco não era mais provar a teoria do relógio, pois, 

conforme mais dados foram disponibilizados, verificou-se que a constância de taxas era 

uma exceção. O objetivo era testar a hipótese do relógio de forma que os tempos de 

divergência inferidos a partir desta resultassem em estimativas razoáveis. 

Esta linha de ação desdobrou-se em metodologias robustas como a de Felsenstein (1985), 

Tajima (1993) e Takezaki et al. (1995). Entretanto, estes testes necessitavam que todas 

linhagens estudadas apresentassem taxas de evolução molecular aproximadamente 

homogêneas. Quando uma delas violava o relógio, ela deveria ser descartada da análise. 

Isso consistia numa grande limitação, pois muitas vezes a espécie eliminada era justamente 

o foco principal do estudo. Além disso, a eliminação de dados não é estatisticamente 

aconselhável (YANG 2006). 

No final da década de noventa um grupo de trabalhos abordou o problema da inferência de 

tempos de divergência de uma forma inovadora. O impedimento central dos métodos 

anteriores era a incapacidade de decomposição da distância genética entre ancestrais e 

descendentes numa filogenia, que é dada pelo produto entre a taxa de substituição � pelo 

tempo de divergência. Como somente seu produto é observável, i.e., o número de 

substituições, era impossível inferir os tempos absolutos sem assumir a constâncias das 

taxas ao longo da árvore filogenética. A decomposição da distância genética é possível pela 

adoção de um modelo explícito de evolução das taxas de substituição (THORNE et al. 

1998). 

Esta modelagem, no entanto, inclui um número considerável de parâmetros e métodos 

estatísticos comumente usados em evolução molecular, como máxima verossimilhança e 

mínimos quadrados, não possuem um desempenho desejável nestas circunstâncias. Por 

exemplo, a superfície de máxima verossimilhança pode apresentar múltiplos máximos locais 

que dificultam a otimização da função (YANG 2006). Nestes casos, a abordagem bayesiana 

é mais eficiente, pois a inferência paramétrica de modelos complexos pode ser realizada por 

simulação estocástica (Monte Carlo) via cadeias de Markov (MCMC, Markov Chain Monte 

Carlo) (GAMERMAN and LOPES 2006). 

Neste sentido, Thorne et al. (1998) propuseram um método bayesiano de relaxamento do 

relógio molecular que aplica um modelo auto-correlacionado de evolução das taxas de 

substituição ao longo da filogenia. O modelo foi posteriormente modificado para possibilitar o 

uso de múltiplos genes (THORNE and KISHINO 2002). Esta metodologia permite a 

decomposição da distância genética e, logo, o pesquisador pode inferir os tempos de 

divergência sem assumir o relógio molecular estrito. 

O trabalho seminal de Thorne e colaboradores motivou o desenvolvimento de métodos de 

relógio molecular relaxado. Basicamente, as técnicas posteriores avaliaram o uso de 

modelos alternativos de evolução de taxas de substituição (ARIS-BROSOU and YANG 

2003). Por exemplo, Huelsenbeck et al (2000) usa um modelo de Poisson generalizado, 

enquanto Rannala e Yang (2007) assumem que as taxas evolutivas não apresentam 

correlação entre nós ancestrais e descendentes. A flexibilidade estatística da inferência 

bayesiana permite, inclusive, que não necessitemos de uma topologia fixa para inferir 

tempos de divergência. Neste caso, a topologia e considerada um parâmetro de distúrbio 

(nuisance parameter) e o tempo do ancestral comum de um conjunto de sequências é obtido 

através de integração pelo espaço topológico (DRUMMOND et al. 2006). 


39



2 CONCLUSÕES 

A inferência de tempos e taxas evolutivas em árvores filogenéticas ganhou grande 

importância nos últimos anos por duas razões principais. Primeiramente, o conhecimento do 

tempo dos eventos macroevolutivos permite que estes sejam correlacionados com eventos 

geoclimáticos, elucidando o cenário em que a diversificação de uma linhagem ocorreu 

(SCHRAGO and RUSSO 2003). Em segundo lugar, as estimativas de taxas evolutivas 

absolutas possibilita que saibamos o modo de evolução de molecular, um problema central 

em genética evolutiva, pois permite que tenhamos idéia da ação das forças evolutivas. 

Porém, a aplicação do relógio molecular relaxado é complicada por fatores relacionados à 

modelagem evolutiva de taxas e tempos de divergência. Ainda não está claro qual modelo 

de evolução apresenta melhor adequação às diversas situações biológicas de variação de 

taxas intra e inter-específicas. O mesmo se aplica aos modelos probabilísticos das 

divergências (LEPAGE et al. 2007). Além disso, os métodos de relaxamento do relógio 

implementado em diversos programas ainda não foram extensivamente testados. De fato, 

ainda não tem-se idéia dos limites do relógio molecular relaxado. Afinal, esses modelos têm 

uma capacidade finita de acomodar a variação de taxas. As perguntas centrais são: quanto 

de variação é suportada e o que pode aumentar a eficácia do método. 


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41



IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DA 

BIODIVERSIDADE COM VISTAS À SUA 

CONSERVAÇÃO 

Claudio Oliveira * , Gláucia Maria Garcia Maia 

Depto. Morfologia, Instituto de Biociências, UNESP 

* Email: claudio@ibb.unesp.br 

Resumo 

Hoje a ideia de conservação é, felizmente, uma unanimidade entre todos, 

particularmente os Biólogos. Ainda que a conservação de ecossistemas deva ser a pedra 

fundamental dos programas de conservação, em muitos casos o foco se volta às espécies 

ou populações. Nesse segundo caso as coisas não são tão simples pois há um grande 

número de conceitos teóricos de 'espécie', muitos bastante divergentes, e, na prática, o 

reconhecimento das espécies é uma tarefa extremamente difícil, principalmente pela falta de 

profissionais treinados nessa área. Em decorrência do desenvolvimento das técnicas de 

sequenciamento de DNA, assim como de novas máquinas cada vez mais eficiente, hoje o 

acesso à essa tecnologia é quase universal. Apoiados nessa tecnologia, um grupo de 

pesquisadores se propôs a realizar um estudo diferente: sequenciar um (ou alguns poucos) 

genes de todas as espécies do planeta! Nasceu assim a técnica conhecida como DNA 

barcoding que pretende facilitar a identificação das espécies, assim como seus produtos 

derivados. O desenvolvimento do projeto de DNA barcode tem sido extremamente rápido, 

de forma que, atualmente, cerca de 1,5 milhões de espécimes representantes de cerca de 

145 mil espécies dos mais diferentes grupos de organismos e regiões do planeta já foram 

sequenciados. Toda essa informação pode ser rapidamente acessada via internet através 

do sítio www.barcodinglife.com. Desta maneira, ainda que em processo de construção, já 

temos à nossa disposição, uma ferramenta extremamente poderosa para a identificação de 

espécies, o que certamente terá um impacto significativo na conservação da biodiversidade 

de Terra. 

Identificação molecular da biodiversidade com vistas à sua conservação 

A espécie é uma unidade de comparação fundamental em todos os campos da 

Biologia, da Anatomia ao Comportamento, Desenvolvimento, Ecologia, Evolução, Genética, 

Biologia Molecular, Paleontologia, Fisiologia, Sistemática, etc. (de Queiroz, 2005). Ao longo 

da história muitos conceitos de espécie foram propostos, incluindo o tipológico, morfológico, 

biológico, por isolamento reprodutivo, etc. Ainda que extensos debates sejam 

constantemente travados em relação a esses conceitos de espécie (de Queiroz, 2005; 

Waugh, 2007), do ponto de vista prático os taxonomistas são os profissionais responsáveis 

pela caracterização dessas entidades biológicas e sua classificação, tornando-as palpáveis 

e reconhecíveis pela atribuição de um nome, erigido de acordo com os códigos 

internacionais de nomenclatura (Köhler, 2007). 

Essa atribuição de um nome não constitui uma simples aplicação de regras de 

nomenclatura, mas sim na elaboração de uma hipótese, segundo a qual, um determinado 

conjunto de caracteres (usualmente morfológicos) é capaz de identificar uma entidade 

(espécie) com características biológicas próprias e histórias evolutivas independentes de 


42



outras entidades biológicas similares. Essas hipóteses podem ser testadas de diversas 

maneiras e, como todas as hipóteses, podem ser refutadas ou não. Adicionalmente, quando 

as descrições de espécies são baseadas em uma ampla base de dados, elas se tornam 

hipóteses científicas interessantes permitindo a elaboração de predições explícitas sobre os 

atributos dos organismos (Lipscomb et al., 2003). 

Os dados morfológicos foram, historicamente, os primeiros a serem utilizados na 

identificação de espécies simplesmente pelo fato de que foram os primeiros disponíveis aos 

pesquisadores que iniciaram a sistematização do conhecimento sobre os seres vivos. Com 

o desenvolvimento de novos métodos de estudos, novas metodologias foram se tornando 

disponíveis para o estudo da biodiversidade. Dessa maneira, há mais de 40 anos, a 

eletroforese de proteínas em géis de amido foi, pela primeira vez, utilizada para identificar 

espécies (Manwell e Baker, 1963). Há aproximadamente 30 anos, a análise de sequências 

de genes de DNA ribossômico foi utilizada para investigar as relações evolutivas em níveis 

superiores (Woese e Fox, 1977) e as pesquisas em DNA mitocondrial dominaram a 

Sistemática Molecular no final da década de 70 e início da década de 80 (Avise, 1994) e 

hoje constituem um dos principais sustentadores desse tipo de investigação, com várias 

revistas dedicadas exclusivamente à esse campo como: Molecular Phylogenetics and 

Evolution, Molecular Biology and Evolution e Journal of Molecular Evolution. Entre os dados 

moleculares utilizados em Taxonomia e Sistemática temos as análises citogenéticas, 

bioquímicas, as isozimas, dados imunológicos e, mais recentemente, as sequências de 

nucleotídeos (Hillis et al., 1996). Nos estudos taxonômicos essas ‘novas’ categorias de 

dados têm sido sempre adicionadas aos dados morfológicos, nunca pretendendo substituílos. 

Exemplos desse tipo de integração são cada vez mais comuns, como na descrição de 

Gymnotus sylvius (Albert et al., 1999) e a nossa descrição de uma nova espécie de tainha, 

Mugil rubrioculus (Harrison et al., 2007) e de uma nova espécie de Moenkhausia (Benine et 

al., 2009). Esses exemplos são particularmente relevantes, pois são referentes a novas 

espécies de dois gêneros de peixes bastante complexos, que foram descritas após o 

acumulo de evidências citogenéticas e moleculares que demonstravam a singularidade das 

amostras em estudo com relação a seus respectivos congêneres. 

Embora ferramentas moleculares tenham fornecido uma ampla gama de novas 

oportunidades para estudar questões em Biologia Evolutiva (como nos processos de 

especiação) e em Sistemática Filogenética, só recentemente foi proposto que um curto 

segmento de 648 nucleotídeos da extremidade 5’ do gene mitocondrial Citocromo Oxidase I 

(COI) seria suficiente, em muitos metazoários, para identificá-los a nível de espécie (Hebert 

et al., 2003a; 2003b). O uso dessa metodologia, denominada DNA barcode, ganhou muita 

relevância com a criação em 2004 do Consortium for the BarCode of Life (CBOL) cuja meta 

é a criação de um banco de dados de códigos de barra, sequências parciais de DNA do 

gene COI, da biodiversidade global, com o objetivo de facilitar o processo de automação da 

identificação das espécies (ver o sítio www.barcoding.si.edu para maiores detalhes). Como 

pode ser observado na literatura, outros segmentos gênicos também têm sido sugeridos 

para esse mesmo fim, como dos genes mitocondriais 16S rRNA e Citocromo B (Vences et 

al., 2005) ou outros genes (Lahaye et al., 2008), porém, por questões de padronização e 

pelo seu aparente melhor desempenho, o CBOL adotou como sequência padrão o 

fragmento citado do gene COI. 

Paralelamente à proposição de criação do sistema de DNA barcode (Hebert et al., 

2003a; 2003b), foi lançada uma discussão sobre a criação de um sistema de taxonomia 

baseado em sequências de DNA por Tautz et al. (2002, 2003) denominado DNA Taxonomy. 

Essa proposição foi levantada tendo em vista a extensão da diversidade dos organismos 

vivos, estimados entre 10 e 100 milhões de espécies (May, 1988; Whitfied, 2003), e, 

segundo os proponentes dessa metodologia, na dificuldade em nomeá-las com os métodos 

correntemente em uso, cujo emprego, desde sua criação por Linnaeus em 1758, permitiu a 

nomeação de cerca de 1,7 milhão de espécies (Stoeckle, 2003). Outro problema levantado 

dizia respeito ao problema de formação de novos taxonomistas para substituir os 

especialistas que encerram suas carreiras. O que Tautz et al. (2003) propuseram 

formalmente era que as sequências de DNA deixassem de ser um elemento auxiliar na 


43



identificação de espécie e passassem a ocupar uma posição central nesse processo de 

descrição de espécies. Essa proposição gerou uma grande animosidade entre os 

taxonomistas e os biologistas moleculares. Várias críticas a esse artigo de Tautz et al. 

(2003) foram publicadas (ex.: Lipscomb et al., 2003; Ebach e Holdrege, 2005; Carvalho et 

al., 2007) nas quais os autores invariavelmente mostravam preocupação com a Taxonomia 

tradicional e seus praticantes. Entretanto, com exceção de uma breve referência ao trabalho 

de Hebert et al. (2003a), em nenhum ponto do artigo de Tautz et al. (2003) a palavra 

barcode é mencionada! Assim, fica evidente que o que Tautz et al. (2003) propunham é algo 

independente do conceito de DNA barcode, ainda que exista uma similaridade em relação 

ao uso de sequências de DNA, porém com finalidades totalmente diferentes. 

Essencialmente, o que os usuários da metodologia de DNA barcode pretendem é 

tornar possível a atribuição de indivíduos a espécies e facilitar a descoberta de novas 

espécies (Moritz e Cicero, 2004). Os primeiros estudos realizados com essa metodologia 

foram extremamente satisfatórios com um grau de resolução taxonômica maior que 95% 

(Hebert et al., 2003a, 2003b). Além disso, a metodologia foi aplicada satisfatoriamente para 

identificar espécimes imaturos, espécies extintas, indivíduos em diferentes estágios do ciclo 

de vida de algumas espécies e possíveis espécies crípticas. Porém, com o avanço dos 

estudos, encontraram-se também grupos que não puderam ser prontamente resolvidos, a 

nível de espécie, como alguns cnidários bentônicos, dois grupos de anfíbios e algumas 

espécies de gastrópode, possivelmente porque esses grupos eram formados por espécies 

com tempo de divergência bastante reduzido (ver revisão em Waugh, 2007). 

Apesar da metodologia de DNA barcode ser extremamente recente diversas críticas 

têm sido levantadas a respeito dessa metodologia. Algumas dessas críticas representam 

simples opiniões pessoais como, por exemplo, a colocação de Ebach e Holdrege (2005) de 

acordo com a qual o financiamento de projetos de DNA barcode desviaria recursos que 

poderiam ser destinados a projetos de taxonomia, o que foi elegantemente rebatido por 

diversos autores como, por exemplo Gregory (2005), que argumentam que esses tipos de 

projeto não competem por recursos uma vez que usualmente são apresentados em áreas 

diferentes da Biologia (Genética vs. Zoologia) e, por outro lado, todos projetos de boa 

qualidade podem ser financiados, independente de sua natureza. Outras realmente 

discutem aspectos científicos relacionados à metodologia do DNA barcode (Wiemers e 

Fiedler, 2007) e os principais aspectos são discutidos abaixo. 

Assim, a princípio, alguns críticos sugeriram que o DNA barcode não seria uma 

atividade científica porque não visaria testar hipóteses e gerar conhecimento, mas sim 

simplesmente produzir informações (Lipscomb et al., 2003; Ebach e Holdrege 2005). 

Entretanto, qualquer experimento gera informações que necessitam ser interpretadas sob a 

luz de hipóteses e essa é uma atividade científica. Segundo as palavras de Lipscomb et al. 

(2003) reduzir a taxonomia somente à identificação de espécies a torna uma simples tarefa 

técnica ao invés de uma ciência baseada em hipóteses. Esse mesmo raciocínio se encaixa 

perfeitamente nos estudos de DNA barcode uma vez que esses nunca se limitam a 

relacionar as sequências encontradas para cada indivíduo, mas sim procuram interpretar as 

semelhanças e diferenças entre essas sequências e suas relações com as espécies 

reconhecidas por outros métodos. Assim, é forçoso concluir que Taxonomia e DNA barcode 

são igualmente atividades científicas. Waugh (2007) argumenta também que a aplicação da 

técnica de DNA barcode serve ainda para testar a hipótese de que as espécies podem ser 

identificadas utilizando essa técnica e, no futuro, pode ser uma fonte de dados que gerará 

outras hipóteses, o que é também uma atividade essencialmente científica. 

Uma crítica mais recente, apresentada por Wiemers e Fiedler (2007), diz respeito ao 

chamado problema de barcode gap. Os proponentes do uso do DNA barcode sugeriram que 

a diferença genética interespecífica excede a diferença intra-específica de tal maneira que 

um claro gap permitiria assinalar um espécime desconhecido à sua espécie com uma taxa 

de erro insignificante (Hebert et al., 2004a). Os desvios a essa regra seriam atribuídos a um 

pequeno número de pares de espécies incipientes, com separação incompleta de linhagens 

(Hebert et al., 2004b). Como consequência, o estabelecimento da quantidade de divergência 

entre duas amostras acima de um determinado limite (proposto como sendo pelo menos 10 


44



vezes maior do que dentro das espécies) iria indicar uma distinção a nível de espécie, 

enquanto uma diferença abaixo desse limite indicaria uma identidade taxonômica entre as 

amostras. Além disso, a existência de um barcode gap tornaria possível a identificação de 

espécies não descritas (Hebert et al., 2004b; Smith et al., 2006). Possíveis erros com essa 

abordagem incluem falsos positivos e falsos negativos (Wiemers e Fiedler, 2007). Falsos 

positivos ocorrem se populações dentro de uma espécie são muito distintas geneticamente, 

i.e., populações distantes com fluxo gênico limitado ou populações alopátricas com fluxo 

gênico interrompido. No último caso deve ser notado que, dependendo da quantidade de 

diferenciação morfológica e o conceito de espécie aplicado, tais populações podem ser 

qualificadas como “espécies crípticas” na visão de alguns cientistas. Falsos negativos, por 

outro lado, ocorrem quando pouca ou nenhuma variação nas sequências do fragmento de 

DNA utilizado é encontrada entre diferentes espécies [= grupos de populações 

reprodutivamente isoladas, sensu Mayr (1969)]. Aqui, falsos negativos são mais críticos para 

a metodologia de DNA barcode, porque a existência de tais casos revelaria exemplos onde 

essa metodologia é menos poderosa do que o uso de outras metodologias, mais holísticas, 

para delimitar as espécies (Wiemers e Fiedler, 2007). 

Enquanto estudos em peixes (Ward et al., 2005; Hubert et al., 2008; Valdez-Moreno 

et al., 2009; Ward et al., 2009), aves (Hebert et al., 2004a), artrópodes (Hogg e Hebert, 

2004; Barrett e Hebert, 2005; Stahls e Savolainen, 2008) e plantas (Kress et al., 2005) 

corroboram a existência do barcode gap, outros estudos em gastrópodes (Meyer e Paulay, 

2005), moscas (Meier et al., 2006) e borboletas (Brower, 2006; Wiemers e Fiedler, 2007) 

desafiam sua existência. As razões para essa discrepância não são inteiramente claras. Os 

estudos disponíveis sugerem que os níveis de divergência nas sequências de COI diferem 

entre táxons mais antigos e mais recentes, como seria esperado. Assim, por exemplo, uma 

média excepcionalmente baixa de divergência em sequências de COI, de apenas 1%, foi 

encontrada entre pares de espécies de cnidária, comparado a 9,6 a 15,7% em outros filos 

animais. Moluscos com 11,1% de divergência média entre espécies (Meyer e Paulay, 2005) 

e dípteras com 9,3% (Meier et al., 2006) seriam atípicos com relação a essa propriedade. 

Meyer e Paulay (2005) sugerem que a amostragem insuficiente a nível interespecífico e 

intraespecífico poderia criar, artificialmente, um barcode gap. Os proponentes do DNA 

barcode argumentam, entretanto, que a principal razão para essa sobreposição seria o 

pouco conhecimento taxonômico disponível para alguns grupos e a necessidade de revisão 

taxonômica dos mesmos. Deve-se levar também em conta que estudos estatísticos recentes 

mostram que os testes de monofilia correntemente empregados precisam ser revistos uma 

vez que podem se apresentar altamente tendenciosos e passíveis de novas interpretações 

(DeSalle et al., 2005; Rosenberg, 2007). De qualquer maneira taxas excepcionalmente 

baixas de divergência entre sequências do COI apesar de não permitir a separação das 

espécies podem indicar a ocorrência de especiação recente, o que é um achado importante 

para vários grupos de organismos. 

Uma proposição alternativa e extremamente importante em relação ao estudo das 

sequências geradas nos projetos de DNA barcode foi apresentada por DeSalle et al. (2005). 

Segundo esses autores, um dos principais problemas com relação à análise dos dados 

gerados nos projetos de DNA barcode diz respeito ao uso extensivo da construção de 

árvores por métodos fenéticos (como Neighbour-Joining). Eles ressaltam que os equívocos 

do uso dessa metodologia têm levado a conclusões também equivocadas quanto ao uso do 

DNA barcode. Segundo os autores, a metodologia taxonômica corrente usa a descoberta de 

caracteres diagnósticos, independentemente de árvores, para estabelecer sistemas 

taxonômicos e, principalmente para identificar espécies. Assim, concluem que o uso dos 

caracteres de DNA em um contexto de diagnose seria muito mais compatível com os 

processos correntemente empregados em taxonomia, superando em muito a abordagem 

por árvores. Além disso, DeSalle et al. (2005), propõe explicitamente que deve haver uma 

ponte entre as pesquisas moleculares e morfológicas e que isso deve aprimorar o processo 

de identificação de espécies. Isso também deve ampliar nosso conhecimento sobre a 

diversidade de mecanismos envolvidos na origem dessas espécies. Por essa razão, no 


45



presente estudo, o trabalho será conduzido em conjunto, por especialistas em Biologia 

Molecular e Taxonomia de peixes. 

Outra crítica levantada por oponentes do uso da metodologia de DNA barcorde diz 

respeito ao reduzido número de indivíduos amostrados por espécie. As recomendações em 

curso sugerem que cinco exemplares deveriam ser amostrados de cada espécie, 

procedentes, sempre que possível, de diferentes pontos dentro da área estudada. 

Rosenberg (2007), em um estudo estatístico sobre capacidade de determinação de 

monofilia em comparações interpares, demonstrou que uma pequena amostra, de apenas 

dez indivíduos, para cada grupo testado pode ser suficiente para uma discriminação 

altamente significativa do ponto de vista estatístico. Considerando que existem grandes 

diferenças biológicas entre grupos de organismos quanto a esse número mínimo, o emprego 

inicial de cinco indivíduos pode ser uma escolha metodologicamente viável, principalmente 

se encararmos essa escolha inicial como um 'experimento piloto'. A necessidade desses 

experimentos pilotos com diferentes números de organismos é sugerida por DeSalle et al. 

(2005) que afirmam ainda que esse número pode ser orientado pelo conhecimento 

disponível sobre a história de vida das espécies, sua capacidade de dispersão e padrões de 

cruzamento. Essa crítica a um número tão reduzido de amostras também pode ser 

igualmente aplicada a vários trabalhos em Taxonomia em que novas espécies são erigidas 

com base em um ou muito poucos exemplares. Nos estudos biológicos há um consenso de 

que havendo disponibilidade de um grande número de amostras essas devem ser 

analisadas, mas havendo impedimentos, as análises devem ser feitas com o número 

possível de amostras. 

Considerando a literatura disponível, pode-se observar claramente que em alguns 

casos a metodologia de DNA barcode é prontamente aplicável a nível de grupo animais, 

como as aves (ex. Hebert et al., 2004a) ou a faunas regionais, como no caso dos peixes 

marinhos da região australiana (Ward et al., 2005) ou de água doce do Canadá (Hubert et 

al., 2008) e do México e Guatemala (Valez-Moreno et al., 2009). As principais falhas que se 

têm apontado dizem respeito a estudos feitos com grupos animais ricos em espécies, como 

no caso das borboletas (Wiemers e Fiedler, 2007), onde os autores utilizaram a abordagem 

de árvores. Dos estudos disponíveis, que são ainda muito restritos em relação às diferentes 

formas de vida que habitam o planeta, pode-se concluir que em alguns casos essa 

metodologia é útil enquanto em outros não. Exatamente pela escassez de estudos não é 

possível advogar contra nem a favor da metodologia sem isenção de espírito, assim como 

não é possível saber como os dados se comportarão em determinado grupo animal antes 

que um estudo detalhado seja executado. Nesse ponto é forçoso concluir, em outras 

palavras, que a hipótese de existência de um DNA barcode, para um determinado grupo de 

organismos, tem que ser testada para se concluir, sem isenção se ela pode ser refutada ou 

não. 

Segundo Rubinoff (2006), Hajibabaei et al. (2007), Godfray (2007) e Miller (2007) a 

metodologia de DNA barcode pode contribuir, como vem sendo demonstrado, com a 

Taxonomia, Sistemática e Genética de Populações. Na Taxonomia o DNA barcode pode ser 

utilizado para identificar espécimes atípicos e contribuir para revisão da nomenclatura de 

vários grupos, assim como pode ser utilizado como método de rotina para auxiliar na 

identificação de espécies. Na Sistemática o DNA barcode pode servir como ponto de partida 

para a seleção de táxons e as sequências de DNA obtidas nos projetos de DNA barcode 

podem ser adicionadas ao conjunto de sequências utilizadas para elaboração de filogenias. 

Na Genética de Populações o DNA barcode pode fornecer um primeiro sinal sobre a 

extensão e natureza das divergências populacionais o que facilitará os estudos 

comparativos da diversidade de várias espécies. 

De acordo com Stoeckle et al. (2005), há pelo menos dez razões para a realização 

do projeto de Código de Barras dos seres vivos, que são: 

1. Trabalho com segmentos. O Código de Barras pode identificar espécies a partir de 

pequenos pedaços ou fragmentos, incluindo material não utilizado no processamento de 

plantas e animais, e produtos morfologicamente não facilmente reconhecíveis, derivados de 

espécies protegidas ou reguladas. 


46



2. Trabalho com todos os estágios do ciclo de vida. O Código de Barras pode identificar uma 

espécie em suas múltiplas formas, de ovos ou sementes, passando pelos estágios de larva 

ou mudas, até o estágio de adultos. 

3. Identificação de espécies similares. O Código de Barras pode distinguir entre espécies 

que são morfologicamente muito similares, incluindo organismos perigosos (como os 

portadores de venenos) similares a outros não perigosos, e assim permitir uma visão mais 

acurada da biodiversidade. 

4. Redução de ambiguidades. Um Código de Barras fornece um meio digital, não ambíguo, 

para identificação de espécies, não carecendo do uso de descrições subjetivas baseadas 

em gradações de formas e cores, por exemplo. 

5. Possibilidade dos especialistas irem mais longe. Os cientistas podem fazer uso do Código 

de Barras para uma identificação mais rápida dos organismos e também para facilitar um 

reconhecimento mais rápido de novas espécies que assim podem ser descritas pelos 

métodos tradicionais. 

6. Democratização do acesso. Uma biblioteca padronizada de Código de Barras aumentará 

muito o número de pessoas capazes de nomear as espécies. 

7. Abertura de caminhos para criação de um dispositivo portátil para identificação de 

espécies em campo. O Código de Barras liga a identificação biológica às fronteiras 

avançadas do sequenciamento de DNA, eletrônica e ciência da informação, criando um 

caminho para criação de dispositivos portáteis para identificação de espécies. 

8. Possibilita o posicionamento de novas folhas na árvore da vida. Estabelecer as 

similaridades e diferenças entre o Código de Barras das estimadas 10 milhões de espécies 

de plantas e animais ajudará a mostrar onde suas folhas, representando as espécies, 

devem estar posicionadas na árvore da vida. 

9. Demonstração do valor das coleções. A compilação de uma biblioteca de Códigos de 

Barra começa com os milhões de espécimes em museus, herbários, zoológicos, jardins 

botânicos e outros repositórios de materiais biológicos, pondo em evidência seus esforços 

para preservar e entender a biodiversidade da Terra. 

10. Compilação mais rápida da enciclopédia da vida. Uma biblioteca de Código de Barras, 

ligada a espécimes nomeados, ampliará o acesso do público ao conhecimento biológico, 

auxiliando na criação de uma enciclopédia on-line da vida na Terra. 

Dessa maneira, ainda que a metodologia de DNA barcode possa não ser suficiente 

para permitir a identificação de todas as espécies da Terra, avanços nessa metodologia 

seguramente poderão auxiliar em muito em nossa compreensão da biodiversidade do 

planeta e auxiliar na identificação mais precisa dessa biodiversidade. 


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49



THE GAMA APPROACH TO THE ANALYSIS OF 

LARGE GERMPLASM COLLECTIONS: THE 

EXAMPLE OF COMMON BEAN LANDRACES 

FROM BRAZIL 

Gepts P 1* , Burle ML 1,2 , Noronha SE 2 , Fonseca JR 3 , del Peloso MJ 3 , Melo LC 3 , Temple 

SR 1 , Kami JA 1 

1 Department of Plant Sciences, UCLA-Davis,USA 

2 EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia 

3 EMBRAPA Arroz e Feijão 

* Email: plgepts@ucdavis.edu 

Keywords: adaptation, drought, heat, Phaseolus vulgaris, geographic information systems, SSR 

markers 

ABSTRACT 

Background: The sheer size of some germplasm collection prevents a more thorough 

evaluation of their agronomic diversity. Here we propose a novel approach combining data of 

Geographic information systems, Agronomic evaluation, and Molecular analyses (GAMA) to 

facilitate a preliminary screen of the germplasm and identify genetically distinct groups of 

accessions with characteristic agronomic traits and putative adaptation to specific 

environmental conditions. Following this hypothesis-defining phase, a hypothesis-verifying 

phase should be conducted to verify the adaptation under controlled experimental conditions. 

Results: We illustrate this approach using a sample of 279 geo-referenced landraces of 

common bean from the different bean-growing regions in Brazil. This sample was first 

characterized at the molecular level with 74 markers of known map location and at the 

phenotypic level for agronomic traits. Subsequently, this bean sample was evaluated for 

morpho-agronomic traits at UC Davis and Santo Antônio de Goiás. Finally, correlations 

between coordinates of origin or markers and a broad range of environmental variables, 

including temperature and rainfall, were determined. Some of the results include: a) There 

were limited differences in environmental distribution between Andean and Mesoamerican 

gene pool beans; and b) The ‘mulatinho’ market class originated in regions that were warmer 

and received less rainfall than those of other market classes, such as the ‘roxo’ class. 

Correlations between environmental variables and specific markers identified 24 markers 

associated with rainfall during the growing season, five markers with average annual 

temperature and a sixth with altitude. Further research will be conducted to verify the heat 

and drought tolerance of ‘mulatinhos’ and further narrow down those regions of the bean 

genome that are responsible for drought and heat tolerance. Conclusion: This example 

illustrates how the GAMA approach can help narrow down a germplasm collection, in this 

case identify a group of cultivars with potential tolerance to drought or heat tolerance, which 

can then be analyzed in more detail. 

1. BACKGROUND 

Since the 1930s, there has been a realization and preoccupation that the genetic diversity of 

our crops is decreasing and even threatened by extinction in agricultural fields (e.g., Harlan 

and Martini 1936). There are multiple causes for this phenomenon, including the tremendous 

population growth our planet has witnessed in the 20 th century and the ensuing habitat 

destruction, the development of improved varieties and the corresponding displacement of 

traditional (heirloom or landrace) varieties, and the increased marketing exigencies, 


50



especially in a globalized context. Further research on genetic diversity of crops has outlined 

three major phases of reduction in genetic diversity (Gepts 2004, 2006). In addition to the 

reduction in the 20 th century just mentioned, there was also a reduction in genetic diversity 

during the process of domestication and initiation of agriculture, which has been documented 

in numerous crops and with several molecular approaches (e.g., Gepts et al. 1986, Sonnante 

et al. 1994, Hyten et al. 2006, Kim et al. 2012, Veasey et al. 2011). Subsequent to 

domestication, the spread of cultivars from the initial domestication centers to other regions 

of the world also led to reductions in genetic diversity 

In response to this so-called genetic erosion (van de Wouw et al. 2010) not only of seeds or 

other planting materials but also of traditional knowledge (Brush and Stabinski 1996; Brush 

2004). It should be noted that very few activities have been set in motion to mitigate the 

causes of genetic diversity losses. Instead, two main approaches have been proposed to 

conserve crop genetic diversity per se, which are in situ and ex situ conservation (Gepts 

2006). The former approach involves conservation in the native habitats, whether agricultural 

or natural. The latter approach involves a network of gene banks where crop biodiversity can 

be stored and maintained. The scope and size of these gene banks differ tremendously, with 

some of the largest containing several tens of thousands of accessions (Qualset and Shands 

2005). 

Paradoxically, the size of the gene banks can limit their impact because it becomes quite 

difficult to implement a generalized and systematic evaluation of all accessions. To address 

this issue, the concept of “core collection” has been proposed (Brown 1989; Brown and 

Spillane 1999). A core collection consists of a sample including 5-10% of the whole 

collection; individual accessions of the core collection are chosen to represent the diversity of 

the entire collection. Thus, the purpose of the development of a core collection is to 

maximize the genetic diversity within the core sample. Because most accessions, however, 

have not been evaluated, the choice is made based generally on the basis of geographic 

information, i.e., often by country of origin and some readily available traits such as seed 

type. 

A potential weakness of the core collection concept is that the development of a robust core 

collection actually depends on evaluation data, which are – almost by definition – not 

available. This situation calls for the search for alternative data to be used in the 

development of core collection, specifically, and the use of germplasm collection, in general. 

One type of data is the geographic origin, based on precise coordinates. Based on these 

coordinates one can then establish correlations between specific phenotypes and 

environmental variables, such as climate data. Furthermore, landscape genetic approaches 

can then be applied to determine the existence of correlations between these variables and 

specific alleles at molecular loci. Both types of correlations are hypothesis-generating in that 

the associations just mentioned can be verified with additional field experimentation. 

In the research reported here, we sought to test this approach on a sample of Brazilian 

landraces of common bean from the germplasm collection at EMBRAPA-CNPAF. We call 

this approach GAMA (GIS-Agronomic-Molecular Approach) because the germplasm 

characterization involves an integration of these three types of data. 

2. RESULTS AND DISCUSSION 

2.1 Bean sample 

Accessions included in the sample for this study were provided by the Common Bean Gene 

Bank at the Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA) Arroz e Feijão 

(CNPAF, Santo Antônio de Goiás, GO). Based on passport data, one randomly chosen 

accession per Brazilian municipality was included in the study sample to maximize the 

geographic representation of the sample. To the best of our knowledge, all accessions were 


51



landraces; special attention was applied to ensure that the most important landraces within 

each region were 

represented in the study sample. Thus, a total of 279 geo-referenced landrace accessions of 

common bean were included (Supplementary (Table 1; Fig. 1). Two other accessions of 

common bean were included as controls: BAT93 as a breeding line typical of the 

Mesoamerican gene pool, and Jalo EEP553 as a representative Andean cultivar (and, 

furthermore, a cultivar in Brazil; Voysest 1983). The two lines are also the parents of the 

BAT93 x Jalo EEP558 recombinant inbred population, the core mapping populations in P. 

vulgaris (Freyre et al. 1998; Gepts et al. 2008). To our knowledge, this is one of the broadest 

surveys of bean diversity in Brazil. 

2.2 Main results 

2.2.1. Molecular diversity 

Diversity at the molecular diversity was studied with a sample of 74 molecular markers – 

mostly microsatellite or SSR markers - distributed over the 11 chromosomes of the commonbean 

genome (Burle et al. 2010). Both domesticated gene pools – Andean and 

Mesoamerican – were present in Brazil, confirming earlier observations of Gepts et al. (1988) 

and Pereira and Souza (1992), but at quite different frequencies. Andean accessions 

accounted for 20% of the sample, whereas Mesoamerican accessions represented 80% of 

the sample. Quite strikingly, however, there was limited introgression between the two gene 

pools (< 5%), in spite of the sympatry of the two gene pools. This observation is consistent 

with observations by others (e.g., Kwak and Gepts 2009; Blair et al. 2009). Compared to 

centers of origin in Mesoamerica and the Andes, Brazilian landraces showed less genetic 

diversity as mean gene diversity was 0.46 (0.63 in a domesticated sample from the primary 

centers of origin: Kwak and Gepts 2009). In spite of their sympatry, the distinctness of the 

Andean and Mesoamerican gene pools is maintained. This may be due to the high frequency 

of hybrid inviability genes in the predominant eco-geographic races present in Brazil, namely 

race Mesoamerica (in the Mesoamerican gene pool) and race Nueva Granada (in the 

Andean gene pool). 

Analyses of SSR genetic diversity within the two major gene pools showed that the Andean 

gene pool in Brazil is quite homogeneous. In contrast, the Mesoamerican gene pool can be 

further subdivided into four groups and – intriguingly – a large fraction of accessions that 

represent hybrids among the four groups. The high frequency (about half of the 

Mesoamerican accessions) of hybrid accessions, resulting from admixture among the 

different Mesoamerican groups raises several questions, such as the frequency of 

hybridizations. Previous studies have shown the importance of gene flow in common bean 

(although they were primarily focused on wild x domesticated crosses; Papa and Gepts 

2003). Nevertheless, it is reasonable to assume that admixture can take place among 

domesticated types as well (Ibarra-Pérez et al. 1997). An addition question is the 

consequence of this extensive hybridization for bean breeding. Do hybrid accessions have 

broader adaptation than their “pure” parents? Are they higher yielding? Further research is 

needed to answer these questions. 

Molecular marker analyses also showed extensive multilocus associations, even among 

markers on different linkage groups. In the entire study sample (combining Andean and 

Mesoamerican accessions), 80% of the 1,676 locus pairs were in genome-wide linkage 

disequilibrium (LD). When considering the two gene pools separately, the frequency of locus 

pairs in LD decreased to 8% in the Andean gene pool and 23% in the Mesoamerican gene 

pool. The LD data, and earlier information on allozyme data (Koenig and Gepts 1989, Singh 

et al. 1991), suggest that association analyses should be conducted separately in the 


52



Andean and Mesoamerican gene pools to avoid confounding effects between gene pool 

membership and associations due to close linkage. 

2.2.2. Morpho-agronomic diversity 

Field observations showed that the sample included high levels of diversity, particularly for 

seed types (color, size), growth habit, and susceptibility to rust and common bacterial blight. 

However, like for molecular diversity, not all diversity observed in the centers of origin was 

present among Brazilian landraces. A principal component analysis showed a major 

separation along the first axis (39%) corresponding to the divergence between Andean and 

Mesoamerican gene pools (Burle et al. 2011). 

The second axis of the principal component analysis revealed subdivisions within the two 

gene pools according to growth habit and the number of days to flowering. A canonical 

discriminant analysis confirmed the principal component analysis. It showed that the main 

traits separating accessions on the first canonical axis were – in decreasing order of 

magnitude – seed weight, flower color (wind and standard), pod beak position, and flower 

standard striping. On the second canonical axis, the main traits were flower wing color, seed 

coat color pattern, and growth habit (Burle et al. 2011). 

When combining molecular and morpho-agronomic data, it is possible to identify four groups 

within the Mesoamerican gene pool (in addition to the Andean group). Each of these groups 

includes different market types (Table 1). 

Table 1. Brazilian market types identified in each group of accessions (subpopulations). 

The groups of accessions were identified in Burle et al. (2010) based 

on molecular data (74 markers) and presetting Structure to K=5 (table from Burle 

et al. 2011). 

Groups of 

accessions Market types 

1 (A) a 

Manteigão, Preto, Branco, Vermelho, Amendoim, Outros 

2 (M) Preto (91%), Pardo 

3 (M) Carioca, Mulatinho, Rosinha, Pardo, Preto, Vermelho, Amarelo, Outros 

4 (M) Roxo, Rosinha, Amarelo, Pardo b , Mulatinho b 

5 (M) Preto (70%), Mulatinho, Pardo b , Branco b 

H c 

Pardo, Roxo, Rosinha, Preto, Mulatinho, Amarelo, Branco, Outros. 

a A=Andean gene pool; M=Mesoamerican gene pool, according to Burle et al. (2010) 

b Just one single accession of the commercial type was identified in the respective group. 

c Accessions identified as hybrid among the Mesoamerican groups (accessions with less than 

80% of genetic background from a single group were considered as hybrids), according to Burle 

et al. (2010). 

Several market types occurred predominantly in a single group, such as the Carioca, 

Mulatinho, and Roxo types. The Preto types were members of two different groups. Overall, 

the morpho-agronomic diversity suggests that two of the six major eco-geographic races are 

represented in Brazil, namely race Mesoamerica for the Mesoamerican gene pool and race 

Nueva Granada for the Andean gene pool. 

2.2.3 Geographic Information System (GIS) data 

Collection sites were over- layered with geographic information system data from ecogeographic 

databases using ARCGIS 9.2. (Table 2) (Burle 2008). 


53



Table 2. Sources of geographic information system (GIS) data (from Burle et al., in 

preparation) 

Environmental variables Source Reference 

Major biomes Federal Conservation Units of Brazil IBGE 1994 

Geomorphological Units Mapa de Unidades de Revelo do 

Brasil 

IBGE 1993 

Soil fertility classes, soil slope classes Macroecological Delineation of EMBRAPA 

Brazil 

1992/1993 

Mean annual temperature IBGE 1978 

Mean diurnal temperature range (BIO2), annual 

precipitation (BIO12), and precipitation 

seasonality (BIO15); precipitation of warmest 

quarter (BIO18), precipitation of wettest quarter 

(BIO16), mean temperature of warmest quarter 

(BIO10), mean temperature of wettest quarter 

(BIO8) 

BIOCLIM Hijmans et al. 2005 

Common bean in Brazil is grown in a wide range of environments, including the Atlantic 

Forest, Caatinga, Cerrado, Coastal vegetation, Grasslands, Pantanal, Pine forest, and Semideciduous 

forest. In the quarter that most likely matches the bean cultivation period, total 

precipitation ranged from 50 to 900 mm and mean temperature from 28 to 40°C. There was 

no difference in the geographic or environmental distribution of Andean and Mesoamerican 

accessions, with the exception of altitude. For the latter variable, there was a significant 

although small difference (Andean: 622 m; Mesoamerican: 530 m) (Burle 2008). 

Among market types, there were statistically significant differences between the ‘mulatinho’, 

types on the one hand, and other market types, on the other. In general, ‘mulatinho’ types 

were grown at lower altitudes and in areas with higher mean annual temperatures and lower 

annual precipitation (Burle et al., in preparation). These data suggests that, on average, 

‘mulatinho’ varieties may be more tolerant to heat and drought than other market classes. 

Further research is needed to confirm the overall drought tolerance of the ‘mulatinho’ class, 

to determine variability within this class, and to identify the actual mechanism involved (Burle 

2008). 

2.2.4 Molecular linkage mapping 

Two statistical methods were used to identify molecular markers correlated with climatic 

variables. The FDIST2 (Beaumont and Nichols 1996) is based on the relationship between 

differentiation (FST) and heterozygosity. Outliers of this relationship may be under selection or 

linked to genomic regions under selection. The SAM method (Joost et al. 2007) runs logistic 

regressions and uses a likelihood ratio test or the Wald test to determine statistical 

significance. 

The SAM software identified 24 loci correlated with total precipitation for the cultivation 

trimester, distributed over 9 of the 11 chromosomes of common bean. In contrast, SAM 

identified only five loci significantly correlated with mean annual temperature. FDIST2 

identified six loci showing a significant departure in the relationship between FST and 

heterozygosity. A conservative approach is to focus primarily on those markers identified by 

two or more of the methods (Table 3). 

Table 3. Number of loci significantly associated with rainfall during the cultivation 

trimester (P) and mean annual temperature (Temp) as identified by SAM (Joost et al. 

2007) and loci with significant divergence as identified by FDIST2 (Beaumont and Nichols 

1996) 

SAM P SAM Temp FDIST2 

SAM P 18 3 3 

SAM Temp 2 

FDIST2 1 


54



SAM P, temp & FDIST2 2 

Two loci were identified by the three analyses, two by FDIST2 and SAM P, and three by 

SAM P and SAM Temp. These loci (or the regions they mark) are primary targets for further 

analyses to confirm these results and, eventually, to identify the genes involved. 

3 CONCLUSIONS 

The GAMA (GIS data - Agronomic data – Molecular data) approach described here provides 

a powerful way to characterize germplasm data, i.e., to identify potential accessions for 

further testing to identify specific agronomic traits. Combined with a genomic approach, it 

also provides a means to identify potential genes or genome regions involved in the 

inheritance of these agronomic traits. Limitations include the need for: a) coordinates of 

origin; b) GIS data of relevance to the geographic distribution of variables that represent 

potential selective forces. For abiotic variables, such as climate, the information may be 

present already. For biotic information, however, the information needs to be developed. 

There is a substantial need for further research to confirm the main findings. This research 

involves plant physiology, genetics, and genomics. The ultimate goals are, of course, the 

more efficient use of germplasm collections and the development of improved cultivars. 

4. MATERIALS AND METHODS 

For more information on the Materials and Methods used in these studies, the reader is 

referred to Burle (2008) and Burle et al. (2010, 2011). 

5. AUTHOR INFORMATION AND CONTRIBUTIONS 

PG conceived of the study and directed research conducted by MB. He also wrote the 

present contribution. MB performed most of the field research, molecular analyses, and 

statistical analyses, as part of her PhD thesis research at the University of California, Davis. 

SEN contributed to the statistical analyses of GIS-related data. MJP and LCM evaluated the 

materials in the field at EMBRAPA-CNPAF. SRT helped in the field experiments at UC Davis. 

JAK assisted in the molecular analyses. 

ACKNOWLEDGEMENTS 

We very grateful to the former Curator Jaime Fonsêca, who helped choosing the landrace 

sample and helped on the classification into market types. 

Funding: A CAPES (Brazil) fellowship to MLB is gratefully acknowledged. 

USDA/FAS/ICD/RSED provided funds for the molecular analysis. EMBRAPA Arroz e Feijão 

provided funds to conduct the field experiment in Brazil. 

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PPG-GMP 

Pós-Graduação 


ESCOLA SUPERIOR DE AGRICULTURA 

“LUIZ DE QUEIROZ” 





http://www.genetica.esalq.usp.br/29temas/

8 E 9 DE OUTUBRO DE 2012 Piracicaba - Genética - USP

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