Μέρος 1

Χαρακτηριστική ιδιότητα και λειτουργία των ενζύμων, είναι η
κατάλυση των χημικών αντιδράσεων.
• Μελέτη της καταλυτικής δράσης, πρέπει να βασίζεται στον
ποσοτικό προσδιορισμό της ταχύτητας της χημικής
αντίδρασης που καταλύεται.
• Από τη μελέτη της μεταβολής της ταχύτητας, καταλήγουμε
σε συμπεράσματα χρήσιμα για τη δομή και για το μηχανισμό
δράσης των ενζύμων ( κυρίως όταν το ένζυμο είναι υψηλής
καθαρότητας).
•Η μελέτη της ενζυμικής κινητικής είναι σημαντική και για
πρακτικούς λόγους:
• Ο ορισμός ικανοποιητικών μονάδων (Units) απαιτεί να
γνωρίζουμε
• τις βέλτιστες συνθήκες (pΗ, θερμοκρασία κ.λπ.) για τη
δράση του ενζύμου, καθώς και
• την επίδραση των διαφόρων παραγόντων
(αναστολείς, ενεργοποιητές κ.λπ.) σ’ αυτήν.

• Η γνώση της ενζυμικής κινητικής βοηθάει:
• στην κατανόηση των βιολογικών φαινομένων τα οποία,
είναι πολύ ευαίσθητα σε αλλαγές θερμοκρασίας, pΗ κ.λπ.
• στην επίλυση του ερωτήματος “με ποιο τρόπο δρουν τα
ένζυμα μέσα στο κύτταρο”.
• Για όλους τους παραπάνω λόγους, η ενζυμική κινητική ή
κινητική ενζυμικών αντιδράσεων, έχει εξελιχθεί σε ένα
ιδιαίτερο επιστημονικό κλάδο.
• Στην ενζυμική κινητική πρωταρχικό ρόλο παίζει η μελέτη
της ταχύτητας (v) της ενζυμικής αντίδρασης σε συνάρτηση με
τους διάφορους παράγοντες που επιδρούν σ’ αυτήν,
• με επίκεντρο τη μελέτη της σχέσης μεταξύ της ταχύτητας
της ενζυμικής αντίδρασης και της συγκέντρωσης
• του ενζύμου (Ε) και
• του υποστρώματος (S).

ΜΕΤΡΗΣΗ ΤΗΣ ΚΑΤΑΛΥΤΙΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΤΩΝ
ΕΝΖΥΜΩΝ
• Μερικά μόνο ένζυμα μπορούν να προσδιοριστούν με
άμεσες φασματομετρικές μεθόδους.
• Η παρουσία των περισσοτέρων ενζύμων πιστοποιείται
από τη θετική έκβαση των συγκεκριμένων αντιδράσεων που
καταλύουν
• Το ποσό των ενζύμων υπολογίζεται από την ταχύτητα της
αντίδρασης.
• Η μέτρηση λοιπόν της ταχύτητας της αντίδρασης, είναι το
πιο σημαντικό κομμάτι των τεχνικών που χρησιμοποιούνται
στη μελέτη των ενζύμων.

• Η μορφή της καμπύλης της αλλοίωσης του υποστρώματος
ήτηςπαραγωγής του προϊόντος συναρτήσει του βαθμού
προόδου της αντίδρασης, στις περισσότερες ενζυμικές
αντιδράσεις, είναι της γενικής μορφής του σχήματος (η
ταχύτητα μειώνεται συναρτήσει του χρόνου).
•Το φαινόμενο αυτό μπορεί να οφείλεται σε πολλούς λόγους:
• π.χ. τα προϊόντα της αντίδρασης αναστέλλουν το ένζυμο
• ο βαθμός κορεσμού του
ενζύμου από το υπόστρωμα
μειώνεται πιθανώς λόγω μείωσης
της συγκέντρωσης του υποστρώματος
συναρτήσει του βαθμού
προόδου της αντίδρασης,
• η αντίστροφη πορεία της αντίδρασης
γίνεται σε μεγαλύτερο
βαθμό λόγω της αύξησης της
συγκέντρωσης των προϊόντων
κ.λπ.

• Για να αποφευχθούν οι παραπάνω λόγοι, υιοθετήθηκε η
μέτρηση της αρχικής ταχύτητας, κατά την οποία οι
παραπάνω λόγοι δεν έχουν τη χρονική δυνατότητα να
παρέμβουν.
• Κατά τη μελέτη των ενζύμων, είναι απόλυτα αναγκαίο να
προσδιορίζεται ηεπίδρασηστηναρχικήταχύτηταενός
παράγοντα (pΗ, θερμοκρασία, συγκέντρωση ενζύμου κ.λπ.)
κάθε φορά.
• Για τη μέτρηση της αρχικής ταχύτητας, επιλέγεται συνήθως
ένας τέτοιος χρόνος, ώστε η αλλοίωση του υποστρώματος,
να είναι κάτω από το 20% της συνολικής.
• Μέχρι αυτού του ορίου, οι καμπύλες της ταχύτητας, σε
συνάρτηση με το μεταβαλλόμενο παράγοντα είναι συνήθως
ευθείες γραμμές.

•Για να ορισθεί η αρχική ταχύτητα, γίνεται μία σειρά πειραμάτων,
για να καθορισθούν τα όρια της γραμμικότητας, ώστε
• η παραγωγή του προϊόντος να είναι μέγιστη και
• οι καμπύλες της ταχύτητας συναρτήσει του χρόνου και
της συγκέντρωσης του ενζύμου [ v = f(t) και v = f([Ε])], να
είναι ευθείες.
•Καθορισμός αρχικής
ταχύτητας:
•Προσδιορίζεται
το Ρ = f (t), όταν
όλοι οι άλλοι παράμετροι,
είναι σταθερές
(π.χ.[S], pΗ,
T κ.λπ.) εκτός [E].

• Κατασκευάζεται υπολογιστικά [από το διάγραμμα
Ρ = f (t)], το διάγραμμα v = f([Ε]).
•Το διάγραμμα v = f([Ε]) για χρόνο t 0 είναι ευθεία γραμμή,
δηλαδή η ταχύτητα είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του
ενζύμου και αντιπροσωπεύει την αρχική ταχύτητα.
• Στο διάγραμμα v = f([Ε]) για χρόνο t 1 , υπάρχει ένα ευθύγραμμο
τμήμα, που
συμπίπτει με εκείνο
του χρόνου t 0 , ενώ
στο διάγραμμα
v = f([Ε]), που αντιστοιχεί
σε χρόνο t 2 ,
ηταχύτηταδενείναι
ανάλογη της συγκέντρωσης
του
ενζύμου.

• Από τα παραπάνω φαίνεται ότι η καμπύλη v = f([Ε]) είναι
ευθεία, μόνο όταν χρησιμοποιούνται αρχικές ταχύτητες.
• Επομένως, γιανααναφερόμαστεσεαρχικήταχύτητα, θα
πρέπει να χρησιμοποιείται
συγκέντρωση
ενζύμου ίση με
[Ε 1 ] και χρόνος t 1 .
•Τότε θα ικανοποιούνται
οι παραπάνω
απαιτήσεις,
δηλαδή η παραγωγή
του προϊόντος
να είναι
μέγιστη, αλλά και
οι καμπύλες v = f(t)
και v = f([Ε]), να
είναι ευθείες.

• Υπάρχουν όμως περιπτώσεις, όπου το διάγραμμα
προόδου της αντίδρασης δεν έχει τη μορφή του σχήματος:
• Η οξειδάση των D-αμινοξέων
απαιτεί για τη δράση της, την
παρουσία φλαβινοσυνενζύμων,
(στην πραγματικότητα
είναι προσθετικές
ομάδες) που συνδέονται με
το ένζυμο με αργό ρυθμό.
• Αυτό έχει σαν αποτέλεσμα
να αυξάνεται δραστικά το
ποσό του ενεργού ενζύμου
μετά την πάροδο κάποιου
χρονικού διαστήματος, από τη στιγμή της ανάμιξης των
αντιδρώντων.
• Το πρόβλημα αυτό θα μπορούσε να αντιμετωπιστεί με
προεπώαση ενζύμου και συνενζύμου (ή προσθετικής
ομάδας), πριν από την προσθήκη του υποστρώματος.

• Όταν αναφέρεται η λέξη ταχύτητα θα εννοείται πάντα η
αρχική ταχύτητα εκτός αν διευκρινίζεται κάτι διαφορετικό.
• Η παρακολούθηση του βαθμού προόδου μιας ενζυμικής
αντίδρασης μπορεί να γίνει:
• με τη λήψη δείγματος σε διάφορες διαδοχικές χρονικές
στιγμές από το ίδιο μίγμα αντίδρασης (sampling methods)
• με τη χρήση διαφορετικών μιγμάτων αντίδρασης που
έχουν ίδια σύσταση και τα οποία επωάζονται σε
διαφορετικούς χρόνους
(continuous methods),
μέθοδος που έχει
μεγαλύτερη εφαρμογή.

Ποσοτικός προσδιορισμός των ενζύμων
• Τα ένζυμα είναι πρωτεΐνες και συνυπάρχουν με άλλες
πρωτεϊνες και ενώσεις, καθιστώντας το χημικό
προσδιορισμό τους σχεδόν αδύνατο.
• Η ποσότητα του ενζύμου, υπολογίζεται με προσδιορισμό
της καταλυτικής της δράσης, η οποία εκφράζεται ποσοτικά
με τους παρακάτω όρους (σύμφωνα με τη Commision on
Εnzymes).
• Μονάδες ενζυμικής δραστικότητας
[U = μmol[S]/min]
1) Ειδική δραστικότητα [ U/mg πρωτεΐνης]
2) Μοριακή δραστικότητα [ U/μmol ενζύμου ]
3) Δραστικότητα
καταλυτικού κέντρου
[Αλλοιωμένα μόρια S / min
και προσθετική ομάδακαταλυτικό
κέντρο]

• Μονάδα ενζυμικής δραστικότητας (1U: Ιnternational Unit):
Το ποσό του E που αλλοιώνει 1 μmol S (ή παράγει 1 μmol P)
ανά 1 min, σε καθορισμένες συνθήκες.
•Όταν επηρεάζονται περισσότεροι από ένα δεσμοί σε κάθε
μόριο S: Το ποσό του Ε που καταλύει τη μετατροπή 1
μequivalent της ομάδας που επηρεάζεται ανά 1 min.
• Στις καθορισμένες συνθήκες περιλαμβάνεται
• η θερμοκρασία (αρχικά είχε ορισθεί 25 0 C μετά 30 0 C, 37 0 C
ενώ σήμερα χρησιμοποιείται η θερμοκρασία όπως
ορίζεται για κάθε περίπτωση)
• το pΗ και
• η συγκέντρωση του S.
(Για τα δύο τελευταία χρησιμοποιούνται συνήθως οι
βέλτιστες συνθήκες για το κάθε ένζυμο).
• Όταν αντιδρούν δύο ίδια μόρια S μεταξύ τους: Το ποσό του
E που καταλύει την αλλοίωση 2 μmoles S σε 1 min.
( μονάδα απόλυτη που επιτρέπει τη σύγκριση δραστικότητας
διαφορετικών ενζύμων).

1) Ειδική δραστικότητα ή ενεργότητα ή καθαρότητα (specific
activity): Οι μονάδες ενζυμικής δραστικότητας ανά mg
πρωτεΐνης, (U/mg πρωτεΐνης) ενζύμου ή ενζυμικού
παρασκευάσματος (γιατί συνήθως χειριζόμαστε ακάθαρτα
παρασκευάσματα, π.χ. ειδική δραστικότητα ενζυμικού
παρασκευάσματος).
• Δηλαδή, η ειδική δραστικότητα καθορίζεται από το ποσό
του προϊόντος που παράγεται ανά μονάδα βάρους ενζύμου.
• Επειδή το ένζυμο που μελετάται συνήθως δεν είναι 100%
καθαρό, αναγκαστικά χρησιμοποιούνται αυθαίρετες μονάδες,
ανάλογα με τις πειραματικές συνθήκες (γιαναπροκύπτουν
εύχρηστες αριθμητικές τιμές).
• Έτσι η καταλυτική δράση του ενζύμου εκφράζεται σε
αυθαίρετες μονάδες ενζυμικής δραστικότητας ανά mg
πρωτεΐνης (ή σπανιότεραανά100.000g, θεωρώντας ότι το
μοριακό βάρος των ενζύμων είναι περίπου 100.000).

2) Μοριακή δραστικότητα (molecular activity): Οι μονάδες
ενζυμικής δραστικότητας ανά μmol ενζύμου, σε βέλτιστες
συνθήκες συγκέντρωσης υποστρώματος.
• Δηλαδή είναι ο αριθμός των μορίων υποστρώματος που
αλλοιώνονται σε 1 min από 1 μόριο ενζύμου.
• Με άλλα λόγια, είναι το ποσό του προϊόντος που
παράγεται από ένα μόριο ενζύμου.
• Από την ενζυμική κινητική είναι γνωστό ότι
Vmax = κ 2 [Εt].
Όπου [Εt] είναι η συγκέντρωση του συνολικού ενζύμου.
• Όταν [Εt] = 1, τότε Vmax= κ 2 και μετριέται σε min-1.
• To κ 2 oνομάζεται αριθμός ανακύκλωσης (turnover number)
και δείχνει πόσα μόρια υποστρώματος αλλοιώνονται στη
μονάδα του χρόνου από ένα μόριο ενζύμου.
• Οι τιμές που έχουν ανακοινωθεί για τους αριθμούς
ανακύκλωσης των διαφόρων ενζύμων κυμαίνονται από 6
έως 17x10 6 .

3) Δραστικότητα καταλυτικού κέντρου: Οτρόποςέκφρασης
της καταλυτικής δράσης ενός ενζύμου, στην περίπτωση που
το ένζυμο έχει
• προσθετική ομάδα ή καταλυτικό κέντρο και
• εφ’ όσον η συγκέντρωση αυτών μπορεί να
προσδιορισθεί,
και ισούται με τον αριθμό των μορίων του υποστρώματος
που αλλοιώνονται ανά 1min, από 1 προσθετική
ομάδα/καταλυτικό κέντρο.

Μέθοδοι ποσοτικού προσδιορισμού της ενζυμικής
δράσης
Οι πιο σημαντικές κατηγορίες μεθόδων που χρησιμοποιούνται
σήμερα για τον προσδιορισμό της καταλυτικής
δράσης των ενζύμων είναι οι εξής:
• Φασματοφωτομετρικές μέθοδοι: Πολλά υποστρώματα και
προϊόντα μιας ενζυμικής αντίδρασης απορροφούν την
ακτινοβολία στην περιοχή του ορατού ήτουυπεριώδους
φάσματος.
• Σε αυτές τις περιπτώσεις μπορεί να επιλεγεί ένα μήκος
κύματος, στο οποίο θα παρακολουθείται ποσοτικά είτε η
σταδιακή εξαφάνιση του υποστρώματος, είτε η σταδιακή
εμφάνιση του προϊόντος.
• Όταν κανένα από τα δύο συστατικά της αντίδρασης δεν
απορροφά την ακτινοβολία, ο ποσοτικός προσδιορισμός
μπορεί να πραγματοποιηθεί με τη σύζευξη της
αντίδρασης που μελετάται, με μία άλλη.

Παραδείγματα φασματοφωτομετρικών μεθόδων:
1. Προσδιορισμός γαλακτικής αφυδρογονάσης:
Γαλακτικό οξύ + NAD +
Γαλακτική αφυδρογονάση
Πυροσταφυλικό οξύ + NADH + H +
•Το ΝΑD + απορροφά στα 260nm
•Το ΝΑDΗ στα340 - 260nm.
•Έτσι μπορούμε να μετρήσουμε είτε
• την ελάττωση της συγκέντρωσης του NAD + , είτε
• την αύξηση της συγκέντρωσης του NADH

2. Προσδιορισμός κινάσης 6-φωσφοφρουκτόζης:
6-φωσφοφρουκτόζη
1,6-διφωσφοφρουκτόζη
κινάση της 6-
φωσφοφρουκτόζης
αλδολάση
1,6-διφωσφοφρουκτόζη 3-φωσφογλυκεριναλδεΰδη +
φωσφοδιυδροξυακετόνη
Αυτά τα προϊόντα δεν απορροφούν στο υπεριώδες, αλλά
3-φωσφογλυκεριναλδεΰδη + NAD + + Pi
1,3-διφωσφογλυκερινικό οξύ + NADH
αφυδρογονάση της 3-
φωσφογλυκεριναλδεΰδης
Έτσι, επιτυγχάνονται έμμεσα οι συνθήκες του προηγούμενου
παραδείγματος.

Φθορισμομετρικές μέθοδοι: Είναι πιο ευαίσθητες από τις
φασματοφωτομετρικές μεθόδους.
•Χρησιμοποιείται κυρίως όταν κάποιο από τα συστατικά
της αντίδρασης φθορίζει π.χ. οι φλαβινο-ενώσεις, οι
οποίες φθορίζουν έντονα στις οξειδωμένες τους μορφές.
• Μπορεί ακόμα να εφαρμοσθεί η μέθοδος αυτή μετά από
μετατροπή κάποιου από τα αντιδρώντα συστατικά σε
φθορίζον παράγωγο.
Μανομετρικές μέθοδοι: Βρίσκουν κυρίως εφαρμογή στις
ενζυμικές αντιδράσεις, όπου ένα από τα συστατικά είναι
αέριο.
•Έχουν υιοθετηθεί για τη μελέτη των οξειδασών
(πρόσληψη Ο 2 ), των αποκαρβοξυλασών (αποβολή CΟ 2 )
κ.λπ.
•Οι μανομετρικές μέθοδοι μπορούν να χρησιμοποιηθούν
και στις περιπτώσεις που μία ενζυμική αντίδραση είναι σε
σύζευξη με μία άλλη και ένα από τα συστατικά της είναι
αέριο.

Μέθοδοι με ηλεκτρόδια: Ηχρήσητουηλεκτροδίου υάλου
δίνει τη δυνατότητα να παρακολουθούνται οι αντιδράσεις
κατά τις οποίες απελευθερώνονται όξινα προϊόντα,
• είτε με μέτρηση της πτώσης της τιμής του pΗ
συναρτήσει του χρόνου
• (μειονεκτήματα είναι ότι
• η αλλαγή στο pΗ κατά τη διάρκεια της αντίδρασης
θα επιφέρει και αλλαγή στη δραστικότητα του
ενζύμου
• ο ρυθμός μείωσης του pΗ εξαρτάται επίσης και
από τη ρυθμιστική δύναμη του ενζυμικού
συστήματος)
• είτε με συνεχή και αυτόματη τιτλοδότηση των όξινων
ομάδων με άλκαλι.

Πολωσιμετρικές μέθοδο εφαρμόζονται σε:
•Ένζυμα που δρουν μόνο στο ένα οπτικό ισομερές ενός
υποστρώματος και σ’ αυτές τις περιπτώσεις συνήθως τα
προϊόντα είναι οπτικώς ανενεργά.
•Ένζυμα που δρουν σε ανενεργό το υπόστρωμα και τα
προϊόντα είναι οπτικώς ενεργά.
•Ένζυμα που το υπόστρωμα και τα προϊόντα είναι
ενεργά, με διαφορετικές τιμές στροφικής ικανότητας.
• Σε όλες τις παραπάνω περιπτώσεις, η παρακολούθηση της
ενζυμικής αντίδρασης γίνεται με μέτρηση της ικανότητας
περιστροφής του πολωμένου φωτός συναρτήσει του χρόνου.
• Κλασικό παράδειγμα αποτελεί η αντίδραση
σακχαράση
σακχαρόζη
φρουκτόζη + γλυκόζη
Ησακχαρόζηέχεια D20 = +66,5, ενώ
το μίγμα γλυκόζης και φρουκτόζης έχει α D20 =-39,8.

Χημικές μέθοδοι: Ο βαθμός προόδου πολλών ενζυμικών
αντιδράσεων παρακολουθείται με τη λήψη δειγμάτων σε
διάφορες χρονικές στιγμές και στη συνέχεια με
προσδιορισμό του υποστρώματος ή του προϊόντος, με
χημικές μεθόδους.
•Για παράδειγμα οι φωσφατάσες, φωσφορυλάσες και
νουκλεοτιδάσες, προσδιορίζονται με μέτρηση του ποσού
του ανόργανου φωσφόρου που απελευθερώνεται ή
καταναλώνεται.
•Tο μειονέκτημα αυτών των μεθόδων είναι ότι απαιτούν
περισσότερο χρόνο.
Χρωματογραφικές μέθοδοι: Στις περιπτώσεις που δεν μπορεί
να εφαρμοστεί καμμία από τις παραπάνω μεθόδους:
• Η ανίχνευση του σχηματισμού του προϊόντος μπορεί να
γίνει χρωματογραφικά (το R f ή/και ο χρόνος έκλουσης είναι
ενδείξεις για την ταυτοποίησή του).
• Στη συνέχεια, στις καθαρές ενώσεις μπορεί να γίνει
ποσοτικός προσδιορισμός.

Η χρήση ραδιενεργών ισοτόπων: Είναι ένα χρήσιμο εργαλείο
για την παρακολούθηση των ενζυμικών αντιδράσεων.
• Για παράδειγμα το ραδιενεργό προϊόν ήτοεναπομένον
υπόστρωμα (μετά το διαχωρισμό τους) προσδιορίζεται
ποσοτικά με μετρητή ραδιενέργειας .

ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΤΟΥ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΟΣ
ΣΤΗΝ ΤΑΧΥΤΗΤΑ ΤΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ
• Η πλειοψηφία των ενζυμικών αντιδράσεων περιλαμβάνει
περισσότερα από ένα υποστρώματα.
•Ακόμα και στις υδρολάσες, οι οποίες συχνά θεωρούνται
αντιδράσεις ενός υποστρώματος, το δεύτερο υπόστρωμα
(το Η 2 Ο) υπάρχει σε υψηλές συγκεντρώσεις, και το ένζυμο
να είναι κορεσμένο στο Η 2 Ο σε όλες τις χρονικές στιγμές.
• Αν και η περίπτωση των ενζυμικών αντιδράσεων ενός
υποστρώματος είναι σπάνια στα βιοχημικά συστήματα, παρ’
όλ’ αυτά αντιπροσωπεύει ένα χρήσιμο μοντέλο για την
ανάπτυξη της θεωρίας της ενζυμικής κινητικής και τα
περισσότερα συμπεράσματα που εξάγονται βρίσκουν
εφαρμογή και στα πιο πολύπλοκα ενζυμικά συστήματα.
• Για τους λόγους αυτούς, θα αναπτυχθεί κυρίως η κινητική
των ενζυμικών αντιδράσεων με ένα υπόστρωμα πριν
αναφερθούν οι περιπτώσεις των ενζύμων με πολλά
υποστρώματα.

Η συγκέντρωση του υποστρώματος [S], είναι ένας από τους
σημαντικότερους παράγοντες που επιδρούν στην ταχύτητα
[v], των ενζυμικών αντιδράσεων.
• Σε μια πρώτης τάξης μη εvζυμική αvτίδραση, η μεταβoλή
της ταχύτητας, καθώς αυξάvει η συγκέντρωση του
υποστρώματος, είvαι σταθερή και η καμπύλη v = f(S) είvαι
ευθεία.
• Στις περισσότερες
περιπτώσεις σε μια
ενζυμική αντίδραση,
το διάγραμμα της αρχικής
ταχύτητας (ν) συναρτήσει
της συγκέντρωσης
του υποστρώματος
έχει τη μορφή
καμπύλης υπερβολής.

Τα σημεία που προέρχονται από το πείραμα της μέτρησης
της v=f (S), βρίσκονται επάνω σε μια καμπύλη, που αποτελεί
τμήμα της καμπύλης
που αποδίδεται
μαθηματικά σαν
καμπύλη υπερβολής
(χψ

• Αν ορισθούν οι συντεταγμένες (χ 0 , ψ 0 ) της αρχής (Ο) των
αξόνων (χ',ψ' ή v,[S]) του τμήματος της καμπύλης υπερβολής
που αντιστοιχεί στη
γραφική παράσταση
v=f([S]) του ενζυμικού
συστήματος και
θεωρηθεί ότι χ 0 =Κ Μ
και ψ 0 = -Vmax,
τότε ισχύουν τα
ακόλουθα:
• Τυχόν σημείο
Μ (χ'=[S], ψ'= v)
έχει συντεταγμένες
χ=χ'+χ 0 , ψ=ψ΄+ψ 0
·

• Θέτοντας τις τιμές αυτές στην εξίσωση υπερβολής
χψ=σταθερό, προκύπτει (χ'+χ 0 )(ψ΄+ψ 0 )=χ 0 ψ 0 οπότε
ψ'(χ'+χ 0 )=χ 0 ψ 0 -ψ 0 (χ'+χ 0 )=-ψ 0 χ' και λύνοντας ως προς ψ΄
ψ' = -ψ 0 χ'/χ'+χ 0
Αλλά εξ ορισμού:
• το ψ' = v
• το χ' = S
• το ψ 0 = - Vmax και
• το χ 0 = K M
Και η προηγούμενη
εξίσωση λαμβάνει
τη γνωστή μορφή
της εξίσωσης
Michaelis-Menten,
v = Vmax[S]/[S]+K M

Στις ενζυμικές αντιδράσεις ακολουθείται κινητική κορεσμού.
•Σε χαμηλές [S], η v εξαρτάται τόσο από τη [S] όσο και από
τη [E].
• Από μία τιμή [S] και μετά (όταν το Ε έχει κορεσθεί από το S)
η v είναι ανεξάρτητη
από τη [S] και
εξαρτάται μόνο
από τη [E].
• Δηλαδή, σε υψηλές
τιμές [S], το E έχει
κορεσθεί από
το S και η v έχει
αποκτήσει τη
μέγιστη τιμή της
το Vmax.

• Tο 1902, οι Βrown και Ηenri πρότειναν ότι το ένζυμο
δημιουργεί αρχικά ένα σύμπλοκο με το υπόστρωμα, το
οποίο διασπάται στη συνέχεια σε ένζυμο και στα
προϊόντα της αντίδρασης (Ρ)
Ε + S ES (1) και ES → E + P (2)
όπου οι κ 1 , κ -1 και κ 2 σταθερές ταχύτητας,
με διαστάσεις Μ -1 sec -1 για την κ 1 και
sec -1 για τις κ -1 και κ 2 .
• Tο 1913, οι Μichaelis - Μenten απέδωσαν με μαθηματικό
τρόπο το μηχανισμό δράσης των ενζύμων, στηριζόμενοι
στην ιδέα της δημιουργίας του ενδιάμεσου συμπλόκου
ενζύμου-υποστρώματος.

Θεωρία των Μichaelis - Μenten
(παραδοχή αποκατάστασης ισορροπίας)
• Βασίζεται στη γενική παραδοχή ότι έχει αποκατασταθεί μια
ισορροπία στο σύστημα.
•Oι σημαντικέςπαραδοχές είναιοιεξής:
κ 1
• Η αντίδραση μεταξύ του Ε και του S, Ε + S ES (1)
παραμένει σε ισορροπία και
• οποιαδήποτε επίδραση της αντίδρασης ES → E + P (2)
κ
στην (1), θεωρείται αμελητέα.
2
• Οι συνθήκες αυτές επιτυγχάνονται όταν ο ρυθμός
διάσπασης του συμπλόκου ΕS προς Ε και S είναι πολύ
μεγαλύτερος από το ρυθμό διάσπασής του σε Ε και Ρ
(δηλαδή κ -1 >>κ 2 ).
• Η συγκέντρωση του ελεύθερου S παραμένει σχεδόν
αμετάβλητη κατά την αρχική περίοδο της αντίδρασης,
και ισούται με τη συγκέντρωση του ολικού S,
δηλαδή [S] = [St].
κ -1

• Η σταθερά διάστασης (Κs) του συμπλόκου ΕS ορίζεται ως
[E][S] κ
K = =
-1
( 3)
S
[ES] κ
Οι διαστάσεις της Κs είναι sec-1/M-1 sec-1=M,
δηλαδή η Κs έχει διαστάσεις συγκέντρωσης.
• Στην (3) ισχύει η σχέση [Ε] = [Εt] - [ΕS] (4)
Η ταχύτητα της συνολικής αντίδρασης, με βάση την
αντίδραση ES → E + P (2) δίνεται από τον τύπο
• Με αντικατάσταση της [Ε] από την εξίσωση (4) στην
εξίσωση (3) λαμβάνεται η κάτωθι εξίσωση (6)
+1
dP
v=
= κ 2 [ ΕS] ( 5
dt
([ E ] - [ES]) [S]
K =
t
( 6 )
S
[ES]
)

• Η εξίσωση (6) αν λυθεί ως προς [ΕS] και αντικατασταθεί
στην εξίσωση (5) λαμβάνεται η εξίσωση (7)
v=
κ
2
[ E
t
[S] + K
][S]
S
• Όταν η [S] είναι πολύ μεγάλη σε σύγκριση με την Κ S
(δηλαδή Κ S /S τείνει στο 0), τότε η v ισούται με το γινόμενο
κ 2 [Εt] και έχει ήδη ορισθεί σαν Vmax.
(
7
)
v
=
κ
2
[ E
t
[S]
][S]
=
κ
2
[
Ε
t
] (
8
)
• Άρα η εξίσωση (8) μπορεί να γραφεί
v=
V
max
[S]
(
9
)
[S] + K
S

• Η σταθερά διάστασης του συμπλόκου (Κ S ) ονομάζεται
σταθερά Μichaelis - Μenten (Κ Μ ) και η εξίσωση (9)
v=
V
max
[S]
( 9 )
[S] + K
S
παίρνει την τελική μορφή της εξίσωσης Μichaelis- Μenten
(10)
v=
V
max
[S]
[S] + K
M
( 10
)

Θεωρία των Βriggs – Ηaldane
(παραδοχή της αποκατάστασης σταθεροποιημένης
κατάστασης)
• Μία διαφορετική μαθηματική προσέγγιση για τον τρόπο
δράσης των ενζύμων, αποδόθηκε το 1925 από τους Βriggs
και Ηaldane.
•Η θεωρίατουςβασίστηκε
στην παραδοχή
ότι σε κάθε χρονική
στιγμή, ο ρυθμόςσχηματισμού
και διάσπασης
του συμπλόκου
ΕS είναι σχεδόν ίσος,
έτσι ώστε να αποκαθίσταται
μια δυναμική
ισορροπία
(steady state).

• Με βάση τη θεωρία αποκατάστασης σταθεροποιημένης
κατάστασης
κ 1 κ 2
Ε + S ES → E + P
ισχύει ότι
κ -1
d [ES]
= κ 1[E][S] -κ
-1[ES] -κ
2 [ES] = 0 ( 11)
dt
[Ε] = [Εt] - [ΕS] (4)
dP
= [ S] ( )
v=
κ 2 Ε 5
dt
Λύνοντας την (4) ως προς [Ε] και αντικαθιστώντας την τιμή
αυτή στην (11), η οποία λύνεται στη συνέχεια ως προς [ES]
και αντικαθιστώντας την τιμή αυτή στην (5) προκύπτει η
σχέση

v=
κ 2 [ Et
] κ 1[S]
κ [S] + κ + κ
1
-1
2
v=
V max [S]
-1+
[S] +
κ κ
κ
1
2
( 12 )
• Ονομάζοντας το κλάσμα (κ -1
+ κ 2
)/κ 1
= Κ Μ
, η τελευταία
εξίσωση είναι ίδια με την εξίσωση των Μichaelis-Μenten, με
εξαίρεση ότι η Κ S
έχει αντικατασταθεί από την Κ Μ
όπου
κ + κ κ
K = − 1 2
= K +
2
(13
M S
κ
1
κ
+1
)
• Η Κ Μ έχει διαστάσεις συγκέντρωσης διότι
• τόσο η Κ S
• όσο και ο λόγος κ 2 /κ 1 =sec -1 /M -1 sec -1 =M,
έχουν διαστάσεις συγκέντρωσης.

Φυσική σημασία των σταθερών Κ Μ και Vmax
• Για τον πλήρη ορισμό της φυσικής σημασίας της σταθεράς
Κ Μ πρέπει να είναι γνωστές οι τιμές των σταθερών ταχύτητας
αφού με βάση την εξίσωση
κ + κ κ
K = − 1 2
= K +
2
(13
M S
κ
μπορεί να ισχύουν οι σχέσεις:
• κ -1 >> κ 2
• κ -1 = κ 2
• κ -1 < < κ 2
1
κ
+1
)

Κ Μ =
κ -1 + κ 2
κ 1 κ 2
Ε + S ES → E + P
κ -1
κ +1
Κ S =
κ -1
κ +1
• Αν κ -1 > > κ 2 , τότε η εξίσωση απλοποιείται και
ηΚ Μ ισούται με την Κ S και
ισχύει η παραδοχή της αποκατάστασης ισορροπίας που
έγινε στη θεωρία Μichaelis-Μenten,
δηλαδή είναι η σταθερά διάστασης του συμπλόκου
ενζύμου- υποστρώματος.
• Αν κ -1 = κ 2 , τότε η εξίσωση παραμένει ως έχει και
ηΚ Μ έχει την τιμή που βγαίνει από την παραδοχή της
αποκατάστασης σταθεροποιημένης κατάστασης.

κ 1
Ε + S ES → E + P
κ -1
κ -1 + κ 2
κ -1
Κ Μ =
Κ S =
κ
κ +1
+1
• Αν κ -1 < < κ 2 , τότε η Κ Μ ισούται με κ 2 /κ 1 δηλαδή δεν είναι
παρά ο λόγος δύο σταθερών ταχύτητας των δύο διαδοχικών
και πρακτικά μη αμφίδρομων αντιδράσεων
κ 1 κ 2
E + S ES E + P
όπου το αποτέλεσμα εξαρτάται πλέον από τη σχέση μεταξύ
κ 2 και κ 1 δηλαδή αν
• κ 2 κ 1
κ 2

κ 1 κ 2
E + S ES E + P Κ Μ = κ 2
κ 1
• Αν κ 2

κ 1 κ 2
E + S ES E + P Κ Μ = κ 2
κ 1
• Αν όμως κ 2 >κ 1 τότε δεν μπορεί ν’ αποκατασταθεί ούτε
δυναμική ισορροπία, διότι το σύμπλοκο ES μόλις
σχηματισθεί διασπάται (δηλαδή η ταχύτητα διάσπασης είναι
μεγαλύτερη από την ταχύτητα σχηματισμού του ES).
• Εδώ ισχύουν τότε οι ίδιοι νόμοι που ισχύουν σε αντίστοιχες
μη καταλυτικές χημικές αντιδράσεις που συντελούνται σε δύο
ή περισσότερα στάδια (με το σχηματισμό βραχύβιων
ενδιάμεσων προϊόντων), οπότε η ταχύτητα της συνολικής
αντίδρασης ισούται με την ταχύτητα του βραδύτερου
σταδίου.
• Στην περίπτωσή μας αυτό (ταχύτητα του βραδύτερου
σταδίου) είναι η πρώτη αντίδραση και
v= κ 1 [E][S]

κ 1 κ 2
E + S ES E + P Κ Μ = κ 2
κ 1
• Αφού, όπως αναφέρθηκε, το ES είναι βραχύβιο, πρακτικά
όλοτοένζυμοείναισεκάθεχρονικήστιγμήδιαθέσιμογια
αντίδραση, δηλαδή [E] = [Et] –[ES] = [Et].
• Οπότε η v= κ 1 [E][S] γίνεται v=κ 1 [Et].
• Αφού όμως και το [Et]=σταθερό, θα είναι και το v=σταθερό
(δηλαδή dv/dt =0), οπότε η αντίδραση έχει τη μορφή
αντίδρασης ψευδομηδενικής τάξης μέχρις ότου το [S]
ελαττωθεί σημαντικά.
• Όταν [S]

• Με άλλα λόγια, η εξίσωση Michaelis-Menten μπορεί να
θεωρηθεί μερική περίπτωση της γενικής εξίσωσης της
Θεωρία των Βriggs – Ηaldane που ισχύει όταν η ταχύτητα
διάσπασης του [ES] προς E+P είναι αμελητέα (δηλαδή η κ 2
είναι πολύ μικρότερη της κ -1 ).
• Από τα παραπάνω φαίνεται ότι αν η ταχύτητα μιας
ενζυμικής αντίδρασης ανταποκρίνεται στην εξίσωση
Μichaelis-Μenten, δε σημαίνει ότι ανταποκρίνεται και στο
πρότυπό της, δηλαδή ότι η Κ Μ είναι σταθερά διάστασης του
συμπλόκου και ισούται με την Κ S .
Vmax
• Αν στις εξισώσεις των δύο θεωριών
v=
δώσουμε v=Vmax/2, προκύπτει ότι
[S]+K
Κ Μ =[S], αλλά και το αντίστροφο.
• Δηλαδή η Κ Μ ισούται με εκείνη τη
συγκέντρωση υποστρώματος, στην
οποία η ταχύτητα της αντίδρασης έχει
τη μισή τιμή της μέγιστης ταχύτητας.
[S]
M

• Η σταθερά Κ Μ όπως φαίνεται
• έχει μονάδες συγκέντρωσης και
• αποτελεί χαρακτηριστική σταθερά του ενζύμου για
συγκεκριμένο υπόστρωμα.
• Επιπλέον,
• όσο μεγαλύτερη είναι η τιμή της Κ Μ , δηλαδή
(όσο περισσότερο ποσό υποστρώματος απαιτείται για να
αποκτήσει η
αντίδραση
v = Vmax/2)
• τόσο μικρότερη
είναι
ητάσησύνδεσης
(χημική συγγένεια)
μεταξύ Ε και S και
αντίστροφα.

• Τo Κ Μ είvαι σπoυδαία σταθερά χαρακτηριστική τoυ
εvζύμoυ,
• έστω και αv δεv είvαι γvωστή η ακριβής σημασία της,
• αφoύ καθoρίζει τηv πoσoτική εξάρτηση τoυ S από τo
E.
• Η Κ Μ αποτελεί λοιπόν ποσοτική έκφραση της αντίδρασης
σχηματισμού του συμπλόκου ΕS
Ε + S → ΕS
δείχνει την χημική συγγένεια του Ε και S και είναι ανεξάρτητη
από τη συγκέντρωση του ενζύμου.
• Η Vmax αποτελεί ποσοτική έκφραση της αντίδρασης
διάσπασης του ΕS
ΕS → Ε+ Ρ
και εξαρτάται από τη συγκέντρωση του ενζύμου.

• Οι παράγοντες που επηρεάζουν την αρχική ταχύτητα των
ενζυμικών αντιδράσεων, επιδρώντας είτε
• στο σχηματισμό του συμπλόκου, είτε
• στη διάσπασή του, είτε
• και στα δύο,
μεταβάλλουν τις τιμές των Κ Μ και Vmax.
• Όταν είναι γνωστή η μοριακή συγκέντρωση του ενζύμου,
τότε το Vmax εκφράζεται σε μονάδες ποσότητας (mol/L=M)
αντιδρώντος υποστρώματος (ή σχηματιζόμενου προϊόντος)
ανά μονάδα χρόνου, για συγκεκριμένη συγκέντρωση
ενζύμου, δηλαδή έχει μονάδες Μ.min -1 .
• Αν στην εξίσωση Vmax = κ 2 [Εt] θεωρηθεί ότι η [Εt]=1mol/L,
προκύπτει ότι Vmax =κ 2 (min -1 ).
• Για το λόγο αυτό, το κ 2 ονομάζεται αριθμός ανακύκλωσης
και δηλώνει πόσα μόρια υποστρώματος αλλοιώνονται από
ένα μόριο ενζύμου στη μονάδα του χρόνου.
• Ο αριθμός ανακύκλωσης αποτελεί επίσης χαρακτηριστική
σταθερά του ενζύμου για συγκεκριμένο υπόστρωμα

Συνόψιση των παραδοχών για την παραγωγή
της εξίσωσης Μichaelis-Μenten
1. Η δημιουργία του ενδιάμεσου συμπλόκου ΕS. Η υπόθεση
αυτή έχει μεγάλη σημασία στηv κιvητική τωv εvζυμικώv
αvτιδράσεωv και στηv καταvόηση τoυ μηχαvισμoύ
αvαστoλής.
2. Το ένζυμο αντιδρά με ένα μόνο υπόστρωμα, δηλαδή το S
συνδέεται σε ένα μόνο σημείο με το Ε. Αν το ένζυμο αντιδρά
με n μόρια υποστρώματος, γίνεται η αντίδραση
nS + E → ESn → E + nP
και η ταχύτητα αντίδρασης ισούται με
[S]
max
n
[S]
• Η ταχύτητα της αvτίδρασης θα παίρvει
τηv τιμή Vmax/2 όταv ησυγκέvτρωση τoυ υπoστρώματoς
γίvει [S]=K M
1/n
.
• Η γραφική παράσταση 1/v=f(1/S) δεv είvαι ευθεία,
ν
=
V
+
K
n
M

3. Στην ημιαντίδραση Ε+S ΕS θεωρείται ότι
αποκαθίσταται ισορροπία, ενώ στη δεύτερη ημιαντίδραση
ES→E+P, ότι το ΕS διασπάται γρήγορα προς ένζυμο και
προϊόντα.
• Δηλαδή γίvεται η παραδoχή ότι η ταχύτητα σχηματισμoύ
τoυ ES και η ταχύτητα διάσπασης τoυ ES πρoς ΕκαιS είvαι
πoλύ μεγαλύτερη από τηv ταχύτητα διάσπασης τoυ ES πρoς
ΕκαιΡ.
• Όλα τα αvωτέρω συvoψίζovται στηv υπόθεση ότι τo Κ Μ
είvαι η σταθερά διάστασης τoυ ES, πράγμα όχι πάvτα oρθό,
όπως φαίvεται από τη διερεύvηση της σχέσης (13).
• Διότι οι Brigg-Haldane δεν διατήρησαν αυτήν την
παραδοχή, αλλά δέχθηκαν την σταθεροποιημένη κατάσταση
ισοζυγίου, που συμπεριλαμβάνει και την ημιαντίδραση
διάσπασηςπροςΡ.
κ 1 κ 2
E + S ES → Ρ
κ -1

4. Ενώ η συγκέντρωση του συνολικού ενζύμου ορίζεται σαν
[Εt] = [Ε] + [ΕS]
η συγκέντρωση του ελεύθερου υποστρώματος θεωρείται ίση
με τη συγκέντρωση του ολικού υποστρώματος
[St]=[S]
• Η παραδοχή αυτή μπορεί να γίνει, γιατί ησχετική
συγκέντρωση του υποστρώματος ως προς το ένζυμο είναι
πολύ μεγάλη και η δεσμευμένη ποσότητα του υποστρώματος
στο ένζυμο, μπορεί να θεωρηθεί σαν αμελητέα.
• Αν δεν γίνει αυτή η παραδοχή, τότε στον υπολογισμό της
συγκέντρωσης του ΕS θα περιλαμβάνεται εκθετική εξίσωση.

5. Στην περιγραφή των σταδίων που διακρίνονται σε μια
ενζυμική αντίδραση, δεν περιλαμβάνεται η αντίδραση
κ κ 1 2 κ 3
Ε + S ES EP →
κ κ -1 -2
E + P
δηλαδή έγινε η παραδοχή ότι το κ 3 είναι πολύ μεγαλύτερο
από το κ -2 και το κ 2 .
• Αυτό συμβαίvει πoλλές φoρές, χωρίς vα είvαι γvωστό ότι
γίvεται στηv εvζυμική αvτίδραση.
• Αv δεv ισχύει αυτή η υπόθεση, τότε τα Vmax και Κ Μ δίvovται
από τoυς ακόλoυθoυς πoλύπλoκoυς τύπoυς και είvαι πoλύ
δύσκoλo vα εξηγηθεί η φυσική έvvoια τoυ Κ Μ .
V
max
=
κ
κ
2
3
κ
+
2
κ
[E ]
-2
t
+
κ
3
K
M
=
κ
-1
κ
κ
1
-2
(
κ
+
2
κ
+
-1
κ
κ
-2
3
+
+
κ
κ
3
2
κ
)
3

6. Tέλος, δε λαμβάνεται υπόψη η αντιστρεπτότητα της
αντίδρασης, αν και είναι γνωστό ότι τα ένζυμα καταλύουν
συνήθως την αντίδραση και προς τις δύο κατευθύνσεις.
• Γι’ αυτό το λόγο, έχει ήδη αναφερθεί ότι η ταχύτητα που
προσδιορίζεται είναι η αρχική, δηλαδή ότι η συγκέντρωση
των προϊόντων θεωρείται αμελητέα.
• Σε αντίθετη περίπτωση, η ταχύτητα της αvτίδρασης θα είvαι
συvάρτηση τωv
•Vmax, K M , [S], αλλά και των
• [P], V'max και Κ' Μ (πρoς τηv αvτίθετη κατεύθυvση).