LABType SSO Typing Tests, DANISH VERSION - One Lambda

21001 Kittridge Street, Canoga Park, CA 91303-2801 USA | Tlf.: +1 (818) 702-0042 Fax: +1 (818) 702-6904 | www.onelambda.com 

INDLÆGSSEDDEL 

LABType® SSO-typebestemmelsestests 

Katalognr.: 

Se referencetabel til LABType ® SSO-typebestemmelsestests for at få oplyst de katalog-ID'er, der er dækket af denne indlægsseddel. 

Til in vitro-diagnostisk brug. 

Tilsigtet anvendelse ..................................................................................1 

Sammendrag og redegørelse.................................................................1 

Principper ....................................................................................................1 

Reagenser...................................................................................................1 

Instrumentkrav............................................................................................3 

Prøvetagning og forberedelse ................................................................3 

Procedure....................................................................................................3 

A. Leverede materialer ...............................................................3 

B. Påkrævede materialer, der ikke er vedlagte.....................3 

C. Anbefalede materialer, der ikke er vedlagte.....................4 

D. Trinvis procedure....................................................................4 

TILSIGTET ANVENDELSE 

DNA typebestemmelse af HLA alleler, klasse I eller klasse II. 

Indholdsfortegnelse 

Brugsanvisning ..........................................................................................4 

A. Perlehåndtering og opbevaring ...........................................4 

B. Forstærkning............................................................................4 

C. Opsætning af test ...................................................................5 

D. Testprocedure ................................................................7 

Resultater....................................................................................................9 

Procedurens begrænsninger ..................................................................9 

Forventede værdier ................................................................................10 

Specifikke præstationskarakteristika ..................................................10 

Bibliografi ..................................................................................................10 

Licensering, patenter og varemærker.................................................11 

Europæisk autoriseret repræsentant ..................................................11 

Sammendrag af protokol til 96-prøveanalyse...................................12 

SAMMENDRAG OG REDEGØRELSE 

Historisk har fastlæggelsesmetoden for bestemmelse af HLA-antigener været lymfocytotoksicitetstesten. 1 Ved fremkomsten 

af PCR-teknologier er DNA-baserede vævstypeteknikker imidlertid blevet rutine i laboratoriet. For de fleste DNA-baserede 

metodologier anvendes PCR-processen kun som et forstærkende trin til at opnå den nødvendige mål-DNA. HLAtypebestemmelsesprocessen 

kræver dernæst et efterforstærkende trin for at kunne skelne mellem de forskellige alleler (f.eks. 

RFLP, SSOP, omvendt punktdiagram). LABType® SSO anvender sekvensspecifikke oligonukleotide prober (SSO) bundet 

til fluorescenskodede mikrosfærer til at identificere alleler kodet af prøve-DNA'en. Indførelsen af et trin, der forstærker mål- 

DNA'en via en polymerase kædereaktion (PCR), sammenkoblet med hybridisering og detektion i en enkelt 

reaktionsblanding, gør denne metode egnet til testning i både lille og stor skala. I modsætning til 

lymfocytotoksicitetsreaktionsskalaen (1 = negativ til 8 = positiv), er LABType®-testresultater enten positive eller negative. 

Dette afskaffer behovet for den komplicerede fortolkning af resultater. Yderligere kan enkelt nukleotide ændringer være 

diskriminante i PCR-SSO, mens krydsreagerende grupper (CREG'er) giver større udfordringer til serologisk 

typebestemmelse. 

PRINCIPPER 

LABType® anvender Luminex ® -teknologi til den omvendte SSO DNA-typebestemmelsesmetode. Først PCR-forstærkes 

mål-DNA vha. en gruppespecifik primer. PCR-produktet biotinyleres, hvilket gør det muligt at detektere det vha. R- 

Phycoerythrin-konjugeret Strepavidin (SAPE). 

PCR-produktet denatureres og får lov til at rehybridisere til komplementære DNA-prober, der er konjugeret til 

fluorescenskodede mikrosfærer. Flowanalysatoren LABScan 100, identificerer PE's (phycoerythrin) fluorescensintensitet 

for hver mikrosfære. Tildelingen af HLA-typebestemmelsen er baseret på reaktionsmønstret sammenlignet med mønstre, der 

er forbundet med offentliggjorte HLA-gensekvenser. 

REAGENSER 

A. Identifikation 

LABType® SSO DNA-typebestemmelsessystemet giver sekvensspecifikke oligonukleotide prober, der er immobiliseret 

til mikrosfærer til identifikation af HLA-alleler i forstærkede genomiske DNA-prøver gennem en kontrolleret DNA- 

DNA-hybridiseringsreaktion, efterfulgt af flowanalyse vha. LABScan 100 flow-analysator. Systemkomponenterne 

består af: 

Præoptimeret og testet blanding af mikrosfærer med prober, der er forbundet covalent. 

Hybridiseringsreaktionsbuffer, der letter bindingen af mål-DNA til proben. 

RSSO-LTYP-PI-DA-00, Rev 21 Side 1 af 12

Vaskebuffer til at vaske ubundet DNA af med 

SAPE-buffer til fortynding af SAPE-stamopløsning. 

DNA-forstærkningsreagenser (præoptimeret HLA stedbetinget primerblanding): Det er vigtigt at anvende den 

kit-specifikke primer- og perleblanding sammen med hvert LABType-produkt. Disse kitreagenser er 

lotspecifikke og må ikke anvendes til andre kit eller lot. 

D-blanding (specielt formuleret forstærkningsbufferblanding). 

Mikrosfæreblandingen består af et sæt fluorescensmærkede mikrosfærer, der bærer unikke sekvensspecifikke 

oligonukleotide prober til HLA-alleler. Hver mikrosfæreblanding omfatter negative og positive kontrolmikrosfærer til 

subtraktion af ikke-specifikke baggrundssignaler og normalisering af rådata til justering af mulig variation i 

prøvekvantitet og reaktionseffektivitet. Mikrosfæreblandingerne er præoptimerede til særlige PCR-produkter, der er 

opnået ved DNA-forstærkning vha. de specificerede HLA locusspecifikke primerblandinger. HLA locusspecifikke 

primerblandinger er præoptimerede til forstærkning af specifikke HLA-gener fra 40 ng oprenset genomisk DNA i 20 lmængde, 

når anvendt sammen med D-blandingen, den foreskrevne mængde rekombinant Taq polymerase og PCRreaktionsprofilen 

beskrevet nedenfor. For hvert lot, se det vedlagte arbejdsark til specifikke HLA-alleler, der kan 

identificeres af hver probe vha. procedurerne beskrevet nedenfor. For lotspecifikke probesteder, se dokumentet 

Perleprobeinformation. 

B. Advarsel eller forsigtighed 

1. Til in vitro-diagnostisk brug. 

2. Advarsel: Ethidiumbromid, som anvendes til gelfarvning og som ikke er inkluderet med dette produkt, er et kendt 

carcinogen. Håndtér med passende forholdsregler. Kan være skadeligt, hvis det optages gennem huden. Undgå at 

sprøjte det i øjnene, eller på huden eller tøjet. Beholderen skal være helt tillukket. Vask dig grundigt efter 

håndtering. Skyl eventuelt spildområde med en vandsprøjte. 

3. Advarsel: Denatureringsbuffer og neutraliseringsbuffer er ætsende og kan forårsage forbrændinger. I tilfælde af 

kontakt skylles øjne eller hud straks med rigelige mængder vand i mindst 15 minutter og kontamineret tøj og sko 

fjernes ligeledes (se indlægssedlen). 

4. Forsigtig: LABType® SSO-perleblanding er lysfølsom og skal beskyttes mod lys. 

5. Forsigtig: Anvend LABType® SSO-perleblanding inden for tre måneder efter, at det er optøet. 

6. Der henvises til sikkerhedsdatabladet for detaljeret information. 

C. Brugsanvisning 

Der henvises til “Brugsanvisning”. 

D. Opbevaringsanvisninger 

Alle LABType®-reagenser og buffere kan opbevares forsvarligt frossent ved -80 C til -20 C i produktemballagen. 

Undgå unødvendig håndtering. Det anbefales, at pakken forbliver intakt og nedfrosset ved modtagelse, indtil den er klar 

til brug. Når perleblandingerne er blevet optøet til anvendelse, skal de opbevares ved 2 C til 8 C og bør aldrig fryses 

ned igen. 

En kort oversigt over de påkrævede opbevarings- og håndteringsbetingelser, der er nødvendige for optimal stabilitet for 

LABType®-reagenser følger nedenfor. 

LABType®-buffere: 

Alle LABType®-buffere, med undtagelse af SAPE-bufferen, har et tilladeligt temperaturområde på -80 C til 25 C og 

kan fryses ned igen. SAPE-bufferen må ikke fryses ned igen. SAPE-bufferen skal opbevares ved -80 C til 8 C. Når den 

er optøet, skal SAPE-bufferen opbevares afkølet ved 2 C til 8 C. 

LABType® SSO-perleblandinger: 

LABType®-perleblandingerne er mest stabile frosne. Vi anbefaler indledende opbevaring af perler ved -80 C til -20 C, 

indtil klar til brug. Når perlerne er blevet optøet til brug, skal de opbevares ved 2 C til 8 C i op til 3 måneder. 

Vigtigt: For at forlænge perlernes levetid, må de ikke nedfryses og optøs igen. 

LABType®-primersæt og D-blanding: 

LABType®-primersæt og D-blanding er mest stabile frosne ved -80 C til -20 C. Begge reagenser kan komme ud for 

gentagne fryse-tø-cykler. Vi anbefaler således opbevaring ved -80 C til -20 C hele tiden. 

E. Påkrævet rensning eller behandling før anvendelse 

Se BRUGSANVISNING. 

F. Indikationer for ustabilitet 

1. Perler der udviser misfarvning eller ansamling, der ikke kan fjernes med vortex, bør betragtes som ubrugelige. 

2. Hvis der er udfældet salte af produktreagenserne under forsendelse eller opbevaring, opløses disse igen vha. 

langvarig vortex ved stuetemperatur (20 C til 25 C). 


3. D-blandingsalikvoter bør være lyserøde til lyslilla i farve ved optøning ved stuetemperatur (20 C til 25 C). Ethvert 

D-blandingsalikvot uden den specificerede farve bør betragtes som ubrugelig. 

INSTRUMENTKRAV 

LABScan 100 flow-analysator (Luminex 100/200) 

Luminex ® XY-platform (ekstraudstyr til automatiseret 96-prøvelæsning på LABScan 100 flow-analysatoren fra 

Luminex Corporation) 

Centrifuge 

- Rotor til 1,5 ml mikrofugeglas (14.000 til 18.000 g) 

- Svingspandsrotor til 96-brønds mikroplade (1000 - 1300 g) 

Vortexmixer med justerbar hastighed 

96-brønds GeneAmp® PCR-system 9600, 9700 eller Veriti 96-brønds termisk cycler (Applied Biosystems). Indstil 

rampehastigheden til 9600 for 96-brønds GeneAmp® PCR-systemet 9700. Indstil rampehastigheden til 9600 

emuleringstilstand for Veriti 96-brønds termisk cycler. 

PRØVETAGNING OG FORBEREDELSE 

A. DNA kan oprenses fra alle humane celler med valideret metode, der opfylder nedenstående kriterier. DNA-prøven, der 

skal anvendes til PCR bør resuspenderes i sterilt vand eller i 10 mM Tris-HCl, pH 8,0-9,0 ved en optimal koncentration 

på 20 ng/l i A260/A280-forholdet på 1,65-1,80. 

B. Prøver skal være fri for hæmmere af DNA-polymerase og bør ikke resuspenderes i opløsninger, der indeholder 

chelaterende agenter, såsom EDTA, over 0,5 mM i koncentration. 

C. DNA-prøver kan anvendes straks efter isolering eller opbevaret ved -20 C eller under i længere tid uden uheldige 

påvirkninger af resultater. 

D. DNA-prøver bør forsendes ved 4 C eller under for at bevare deres integritet under transport. 

PROCEDURE 

A. Leverede materialer 

Bemærk: De leverede mængder er lidt mere end den mængde, der kræves til testningen. Det er for at medregne 

utilsigtet tab, som resultat af pipettering. Bland ikke komponenter fra forskellige produktlot. 

2,25 ml denatureringsbuffer – 

1 hætteglas 

2,5 ml neutraliseringsbuffer – 

1 hætteglas 

3,4 ml hybridiseringsbuffer – 

1 hætteglas 

55 ml vaskebuffer – 1 flaske 

100 tests pr. pakke 20 tests pr. pakke 

4,95 ml SAPE-buffer – 

1 hætteglas 

1,38 ml primersæt D-blanding - 

2 hætteglas à 690 l 

400 1 locusspecifikt primersæt 

– 1 hætteglas 

Perleblanding – 

400 l LABType ® SSO primær - 

1 hætteglas 

* 20 l Supplement – 

1 hætteglas* 

50 l Denatureringsbuffer – 

1 hætteglas 

100 µl neutraliseringsbuffer - 

1 hætteglas 

680 µl hybridiseringsbuffer – 

1 hætteglas 

10 ml vaskebuffer – 

1 hætteglas 

990 µl SAPE-buffer – 

1 hætteglas 

276 µl primersæt D-blanding - 

1 hætteglas 

80 l locusspecifikt primersæt – 1 

hætteglas 

80 l LABType® SSO- eller HDperleblanding 

- 1 hætteglas 

*Bemærk: LABType ® (100 test) kits kan indeholde to perlehætteglas efter behov for fortsat optimale opløsninger: en 

primær perleblanding og en supplerende perleblanding. 

B. Påkrævede materialer, der ikke er vedlagte 

Afioniseret vand 

70 % ethanol 

20 % chlorblegemiddel (eller tilsvarende) 

R-Phycoerythrin-konjugeret Streptavidin--SAPE) (OLI kat. nr. LT-SAPE) 

Sheath-væske (OLI kat.nr. LXSF20 eller LSXF20X5) 

Rekombinant Taq polymerase (AmpliTaq Polymerase, OLI-katalog-id’er TAQ30, TAQ50 og TAQ75) 

15-50 ml engangsglas 

96-brønds, tyndvægget PCR-bakke eller glas og holder, der kan modstå 1000-1300 g i en centrifuge 

Forsigtig: PCR-plade skal have tæt kontakt med varmeblok. 

Bakkesegl (OLI kat. nr. SSPSEA300) 

Bemærk: PCR-bakker (25) og bakkesegl (180) tilstrækkeligt til 2400 prøver kan bestilles fra One Lambda (OLI kat. 

nr. PCRTRAC) 


Elektroforeseapparat/strømforsyning150V minimumskapacitet (Micro SSP gelsystem, OLI kat. nr. MGS108) 

UV-transilluminator (eksempel: Fotodyne FOTO/UV®21) 

Fotografisk eller billeddokumentationssystem 

1x TBE buffer (89 mM tris-borat; 2 mM dinatrium EDTA, pH 8,0) med 0,5 g/ml ethidiumbromid eller 5XTBE 

buffer med ethidiumbromid (OLI kat. nr. 5XTBE100) 

Agarose af elektroforesekvalitet (feks. FMC Seakem ® LE) 

PCR-pude 

Knust is 

C. Anbefalede materialer, der ikke er vedlagte 

1,5 ml mikrofugeglas 

Pipettespidser (Rainin -GPS 10G, 250, 1000) 

96-brønds mikroplade af hvid polystyren med en 250 l V-bund og en ubehandlet overflade 

Aluminiumsfolie 

D. Trinvis procedure. 

Der henvises til ”Brugsanvisning” nedenfor. 

BRUGSANVISNING 

Forsigtig: Vær særlig omhyggelig med alikvot-processen. Hvis de nedenfor beskrevne trin ikke følges, kan det resultere i 

reagenstab. 

A. Perlehåndtering og opbevaring 

1. Anvendelse af de anbefalede plastikprodukter (glas, bakker og spidser) kan minimere tab af perler pga. ikke-specifik 

adhæsion. (Se "Påkrævede materialer, der ikke er vedlagte.") 

2. LABType® SSO-perler kan bundfælde sig, hvis de forbliver i glasset. Perler skal distribueres jævnt før de 

dispenseres. Perler skal altid blandes kraftigt ved pipettering adskillige gange eller ved anvendelse af vortex i 

vandret position i 10 til 30 sekunder eller så længe, det er nødvendigt, for at opnå en helt homogen blanding. 

3. For LABType® SSO HD-produkter anbefaler vi de følgende procedurer for at hjælpe med at forhindre 

perleansamling. Straks efter fjernelse af supernatanten i trin 2f, 2g og 3c i nedenstående testprocedure fjernes så 

meget væske som muligt ved at vende den om og meget forsigtigt banke bakken på en tør papirsserviet. Dæk bakken 

med bakkeforsegling og vortex grundigt ved lav hastighed for at løsne pillerne. Fortsæt til næste trin som beskrevet. 

4. LABType ® SSO-perler er pakket i en pose af aluminiumsfolie. Perler må ikke fjernes fra folieposen, indtil klar til 

brug. 

5. LABType ® SSO-perler indeholder fluorescensfarve indvendigt samt HLA allel-specifikke prober, der er tilkoblet 

deres overflader. For at undgå fotoblegning af perlerne, beskyttes perlerne mod lys under anvendelse og opbevaring. 

Opbevar perlerne ved -20 ºC i det stramt tillukkede glas, der er vedlagt, indtil klar til brug. Dæk perler med 

aluminiumsfolie eller tilsvarende under analyse. 

Forsigtig: 

Når perlerne er optøet, opbevares de ved 2C til 8C og anvendes inden for 3 måneder. Må ikke fryses igen. 

Poser med forstærkningsprimerblandingen og D-blandingen må kun åbnes i præforstærkningsområdet. 

Opbevar disse produkter ved -80 C til -20 C i præforstærkningsområdet.. 

B. Forstærkning (opsætning i præforstærkningsområdet.) 

1. Indtast “LABType® PCR-programmet,” i din termiske cycler som vist i tabel 2. Bekræft alle parametre. 

2. Tænd for thermocycleren for at varme det opvarmede låg op. 

3. Optø DNA, forstærkningsprimere og D-blanding. Opbevar på is indtil de skal anvendes. 

4. Justér koncentrationen af genomisk DNA til 20 ng/l med sterilt vand. 

5. Vortex D-blanding og forstærkningsprimer i 15 sekunder; centrifugér i 3-5 sekunder. 

6. Vha. tabel 1 nedenfor blandes den angivne mængde D-blanding og primere. Vortex i 15 sekunder og anbring på is. 

For nøjagtig pipettering af Taq polymerase anbefales det, at du forbereder masterblanding i mindst 10 reaktioner. 

7. Tilføj Taq polymerase straks før anvendelse. 

Tabel 1: Forstærkningsblanding 

D-blanding Forstærkningspri Taq polymerase 

Antal reaktioner 

(l) 

mer (l) 

(l) 

1 13,8 4 0,2 

10 138,0 40 2,0 

50 690,0 200 10,0 

96 1491,0 432 21,6 (22) 


8. Pipettér 2 µl DNA (ved 20 ng/l) i bunden af et glas (for endelig volumen på 20 µl pr. PCR-reaktion). Opbevar 

glassene eller bakken delvis dækket for at forhindre fordampning og kontaminering. 

9. Tilsæt en passende mængde Taq polymerase (feks. 0,2 l pr. 20 l reaktion) til forstærkningsblandingen forberedt i 

trin B.6. 

10. Vortex i nogle få sekunder og centrifugér i 3-5 sekunder. 

11. Alikvotér 18 µl forstærkningsblanding i hver brønd med DNA. 

Forsigtig: For at forhindre krydskontaminering sørges der for ikke at berøre det præalikvoterede DNA i bunden. 

12. Sæt låg på eller forsegl. Hvis du anvender an bakkeforsegling sørges der for, at den er trykket forsvarligt ned mod 

kanten af hver brønd. Anbring en PCR-pude, der er egnet til din thermocycler, på bakken før du lukker låget. Luk og 

stram låget på thermocycleren til. 

13. Kør “LABType® SSO PCR-programmet,” vist på tabel 2. 

14. For GeneAmp PCR System 9700, indstilles “rampehastighed” til 9600-programmet. For andre systemer konsulteres 

fabrikantens dokumentation for justering af rampehastighed således at det kan simulere GeneAmp 9600-programmet 

nøje. Anvendelse af en signifikant anderledes rampehastighed vil påvirke forstærkningseffektiviteten. 

Tabel 2: LABType® SSO PCR-program 

Trin Temperatur og inkubationstid Antal cykler 

Trin 1: 96 ºC 03:00:00 1 

Trin 2: 96 ºC 00:20 5 

60 ºC 00:20 

72 ºC 00:20 

Trin 3: 96 ºC 00:10:00 30 

60 ºC 00:15:00 

72 ºC 00:20 

Trin 4: 72 ºC 10:00:00 1 

Trin 5: 4 ºC altid 1 

15. Forstærket DNA er nu klar til at blive testet vha. testproceduren i afsnit D. Det anbefales imidlertid først at anvende 

2 - 5 µl forstærket DNA til analyse via gelelektroforese. Bekræftelse af et forstærkningsprodukt (bånd) før 

hybridiseringsanalyse sikrer generering af optimale signaler. 

16. Opbevar den tildækkede DNA-bakke ved -80 C til -20 C i op til en måned. 

C. Opsætning af test 

1. Tænd for LABScan 100 og XY-platform og følg opstartsproceduren beskrevet i afsnit D i Brugsanvisningen. 

LABScan 100 kræver mindst 30 minutters opvarmningstid. 

2. Tænd for thermocycleren og kør programmet til 60 °C HOLD, eller tilsvarende, i mindst 1,5 timer (eller hold altid). 

Hav en PCR-pude, der er egnet til din thermocycler, parat til brug. Sørg for, at du venter indtil det opvarmede låg på 

thermocycleren når den passende temperatur før brug. Anvend den passende 96-brønds PCR-bakkeholder for at 

sikre den korrekte inkubationstemperatur. 

3. Fjern alle reagenser (undtagen brun 100X SAPE-flaske) fra opbevaring til stuetemperatur. Alikvotér nødvendige 

mængder reagenser i rene beholdere. (Anvend tabellerne nedenfor som reference). Sørg for at forberede 1X SAPE 

under det tredje vasketrin. Fjern kun 100X SAPE-flasken fra opbevaring, når det er nødvendigt og returnér straks til 

2 C til 8 °C. Returnér eventuelle ubrugte portioner perleblanding og SAPE-buffer til 2 C til 8 °C. (Perleblanding 

må ikke fryses ned igen efter optøning.) 

4. LABType ® perlepræparat til 100-testkit, der indeholder to perlehætteglas: 

a) Til LABType ® kits, der indeholder 2 perlehætteglas, gives glassene en hurtig centrifugering (10-15 sekunder 

ved 100 RCF (relativ centrifugalkraft) i de fleste små centrifuger) umiddelbart efter optøning. 

b) Vortex hætteglassene ved medium styrke i 20 sekunder, og giv dem dernæst en hurtig centrifugering igen som 

beskrevet ovenfor. 

c) Tag det primære perlehætteglas og pipettér langsomt, men grundigt, op og ned adskillige gange vha. P1000 eller 

tilsvarende for at blande perleopløsningen og for at prime pipettespidsen. 

d) Vha. samme pipettespids fra trin (c) overføres hele mængden af primære perler forsigtigt til det supplerende 

perlehætteglas. 

e) Bortskaf det tomme primære perlehætteglas. Det supplerende glas er mærket med den nye lot/batchidentifikation 

for de kombinerede perler. Dette lotnummer er forbundet med de korrekte analyse-kat-filer og 

dataark. 

f) Bland de kombinerede perler kraftigt ved at vortexe hvert glas med hætten på 3 gange i 10 sekunder for at få en 

homogen perleblanding. Skal anvendes straks eller opbevares under forhold, der er beskrevet på side 2, 

Opbevaringsanvisninger. Sørg for at vortexe perlehætteglasset ved medium hastighed i mindst 20 sekunder 

umiddelbart før anvendelse. 


Reagens 

Mængde pr. 

test 

Perleblanding 4 µl 

Hybridiseringsbuffer 

Vaskebuffer 

Denatureringsbuffer 

Neutraliseringsbuffer 

SAPE - 

stamopløsning 

(100X) 

34 µl 

480 µl 

2,5 µl 

5 µl 

0,5 µl 

SAPE-buffer 49,5 µl 

Tabel 3: Klargøring af reagens 

Klargøringsmetode og forslag 

Alikvotér passende mængde, plus ekstra mængde*, for det påkrævede antal tests i et rent glas 

ved stuetemperatur. 

Skal beskyttes mod lys. Anvend hele indholdet af perleblandingsglasset til 96 prøver. 

Vortex straks før brug. 

Alikvotér til nøjagtigt det samme antal tests som anvendt til perleblandingen. 

Tilsæt den præalikvoterede perleblanding til den forberedte hybridiseringsblanding. 

Opbevares ved stuetemperatur (20 C til 25 C) intil brug. 

Alikvotér passende mængde, plus ekstra mængde*, for det påkrævede antal tests og opbevar 

ved stuetemperatur (20 C til 25 C). 

Anvend hele indholdet i et trug til 96 prøver. 

Alikvotér en passende mængde, plus ekstra volumen*, til antallet af tests. 

Anvend hele indholdet i et trug til 96 prøver. Opbevares ved stuetemperatur (20 C til 25 C). 

Alikvotér en passende mængde, plus ekstra volumen*, til antallet af tests. 

Anvend hele 2,5 ml til 96 prøver. Opbevares ved stuetemperatur (20 C til 25 C). 

Under det sidste centrifugeringstrin forberedes 1X SAPE-opløsning ved at fremstille en 1:100 

opløsning af SAPE-stamopløsning med SAPE-buffer til det passede antal tests, plus ekstra 

mængde.* 

Skal beskyttes mod lys. 

Tilbered nok 1XSAPE-opløsning til 96 prøver (ca. det der svarer til 110 prøver afhængig af 

observerede pipetteringsfejl). 

Opbevar SAPE-stamopløsningsflaske ved 2 C til 8 °C. 

*Bemærk: Den ekstra påkrævede mængde afhænger af pipetteringsteknik og udstyrets kalibreringsstatus. Anvend en hel 

mængde perleblanding i det vedlagte glas (nok til ca. 110 tests) til 96 tests. Tilbered 1X SAPE til 115 tests og anvend hele 

mængden af andre reagenser for at forhindre en mangel. Vi anbefaler kalibrering af alle pipetteringsanordninger og testning 

af disse anordninger ved alikvotering af vand. For reagenser vedlagt i for store mængder, såsom denatuerings- og 

neutraliseringsbuffer, kan du anvende et trug til multikanal-pipettering. 

Antal tests 

Denatureringsbuff 

er (µl) 

Tabel 4: Reagensmængder 

Neutraliseringsbuf 

fer (µl) 

Hybridiseringsbuff 

er (µl) 

Vaskebuffer (µl) 

Bakkemetode 

Perleblanding 

(µl) 

1 2.5 5 34 480 4 

10 25 50 340 4800 40 

20 50 100 680 9600 80 

50 125 250 1700 24000 200 

96 240 480 3264 46080 384 

Antal 

tests 

Tabel 5: SAPE- og SAPE-buffermængder 

SAPE stammængde 

(µl) 

SAPE-buffer 

mængde (µl) 

1 0,5 49,5 

10 5,0 495,0 

20 10,0 990,0 

50 25,0 2475,0 

96 48,0 4752,0 

Bemærk: Mængden af reagenser i tabel 4 og 5 er til det nøjagtige antal tests. Det faktiske antal alikvoter afviger afhængig af 

pipetteringsnøjagtighed. For en hel 96-prøves analyse anbefaler vi at anvende hele perleblandingen, hele mængden af 

hybridiseringsbufferen, 57,5 l stam-SAPE og 5693 l SAPE-buffer, som er lidt mere end den nøjagtige mængde, der er 

påkrævet til testen. 


D. Testprocedure 

TEKNISKE FORHOLDSREGLER 

1. For at analysere et lille antal prøver (48 eller færre) kan du anvende en 96-brønds bakke, en 

bakke, der er blevet tilskåret til det passende antal brønde, eller et 0,2 ml tyndvægget PCRstripglas. 

Sørg for at anvende et glasrack, når der anvendes en beskåret bakke eller et 

stripglas. 

2. Blanding af prøver i en 96-brønds bakke involverer forsegling af bakken og vortex på lav 

hastighed i nogle få sekunder. Justér vortexmixerens hastighed, således at væsken i 96brønds 

PCR-bakken er tilstrækkeligt rystet uden for megen stænkning. Bemærk 

hastighedsindstillingen og anvend den til 96-brønds bakkemetoden. 

3. Forseglingen af 96-brønds PCR-bakken skal udføres omhyggeligt og fuldstændigt for at 

forhindre prøvekontaminering brønd-til-brønd. Forsegl bakken ved at trykke seglet mod hver 

kant af de 96 brønde. Bakkeseglene må ikke genbruges. Der skal anvendes et nyt segl for 

hvert trin, der kræver applicering af et bakkesegl. En gentagelsespipette kan anvendes, hvor 

det er relevant; en sådan er imidlertid mindre nøjagtig i mængdelevering. 

4. Vi anbefaler regelmæssig kalibrering og en manuel mængdekontrol for hver mængde, der skal 

leveres. Anvend ikke en gentagelsespipette til dispensering af hybridiseringsblandingen. 

1. Denaturering/neutralisering 

a) Forbered et bad med knust is. 

b) Anbring en ren 96-brønds plade i en bakkeholder. 

c) Overfør 5 l af hver forstærket DNA-prøve i en brønd på en ren 96-brønds plade. Sørg for, at prøvested og –ID 

er nedskrevet. 

d) Tilsæt 2,5 l denatureringsbuffer. Bland grundigt (helst vha. pipettering op og ned) og inkubér ved 

stuetemperatur (20-25 C) i 10 minutter. 

e) Tilsæt 5 l neutraliseringsbuffer med pipette og bland grundigt (helst vha. pipettering op og ned). Bemærk 

farveændringen fra lys pink til bleggul eller klar. 

f) Anbring PCR-pladen med neutraliseret PCR-produkt på isbadet. 

Forsigtig: Undgå kontaminering af PCR-produkt med vand. 

2. Hybridisering 

Bemærk: Sørg for, at thermocycleren er blevet tændt og 60C-programmet er blevet startet til opvarmning af 

varmeblokken. 

a) Kombinér passende mængder perleblanding og hybridiseringsbuffer til forberedning af 

hybridiseringsblandingen. 

b) Tilsæt 38 l hybridiseringsblanding til hver brønd. 

c) Dæk bakken med bakkeforsegling og vortex grundigt ved lav hastighed. 

d) Fjern fra bakkeholderen og anbring PCR-bakken i den forvarmede thermocycler (60 C). 

e) Anbring PCR-puden oven på bakken eller sæt hætter på PCR-glassene. Luk og stram låget til. Inkubér i 

15 minutter. 

f) Anbring bakken i bakkeholderen og fjern bakkeforseglingen. Tilsæt hurtigt 100 l vaskebuffer til hver brønd. 

Dæk bakken med bakkeforseglingen. Centrifugér bakken i 5 minutter ved 1000 – 1300 g. Anbring bakken i 

bakkeholderen og fjern vaskebufferen. 

g) Gentag trin 2.f ovenfor to gange til, så der er i alt tre vasketrin. Husk at tilberede 1X SAPE-opløsning under 

tredje centrifugering. 

3. Etikettering 

a) Anbring bakke i bakkeholder. Tilsæt 50 l af 1X SAPE-opløsning til hver brønd. Dæk bakken med 

bakkeforsegling og vortex grundigt ved lav hastighed. Anbring bakken i den forvarmede thermocycler (60 C). 

Anbring PCR-puden oven på bakken eller sæt hætter på PCR-glassene. Luk og stram låget til. Inkubér i 

5 minutter. 

b) Fjern bakke. Anbring bakke i bakkeholder. Fjern forseglingen og tilsæt hurtigt 100 l vaskebuffer til hver 

brønd. 

c) Dæk bakken med bakkeforseglingen. Centrifugér bakken i 5 minutter ved 1000 -1.300 g. Anbring bakken i 

bakkeholderen og fjern supernatanten. 

d) Tilsæt 70 l vaskebuffer til hver brønd. Bland forsigtigt via pipettering. Overfør til aflæsningspladen vha. en 8eller 

12-kanals pipette. Undgå prøve-til-prøve kontaminering vha. brug af friske pipettespidser. 

Bemærk: Endelig mængde bør være mindst 80 l. 


e) Dæk bakken med bakkeforsegling og aluminiumsfolie. Hold bakken i mørke og ved 4 C indtil anbragt i 

LABScan 100 til aflæsning. 

f) For at opnå de bedste resultater aflæses prøverne så snart som muligt. Langvarig opbevaring af prøver (længere 

end 4 timer) kan resultere i tab af signal. Opbevar prøver natten over ved 4 C i mørket med en bakkeforsegling, 

hvis de ikke straks kan aflæses. Sørg for grundigt at blande prøverne straks før aflæsning. 

A 

B 

C 

D 

E 

F 

G 

H 

1 

2 3 4 5 6 7 8 9 11 10 12 

Figur: Luminex ® XY-platformen aflæser prøverne i følgende mønster: 

A1 til H1, A2 til H2, A12 til H12. 

4. Dataindsamling: Beskrevet nedenfor er en generel vejledning til dataindsamling. Detaljer om anvendelsen af 

LABScan 100 er at finde i “Luminex ® 100/200 Brugervejledning” til den softwareversion, som du anvender. 

a) Tænd for systemet og indstil LABScan 100 til prøveindhentning og kalibrering i henhold til “Luminex ® 

Brugervejledning” 1 for den softwareversion, der aktuelt bliver anvendt. 

b) Vælg en skabelon ifølge produktkatalog-ID'en og lotnummeret. 

1) Indhentningsskabeloner fås fra One Lambda på en CD eller kan downloades via One Lambda's website. 

2) Man kan oprette sin egen indsamlingsskabelon ved at følge anvisningerne i kapitlet om indsamling i 

”Luminex Brugervejledning”. Opstart 

c) Opret et filnavn for de prøver, der skal køres. 

d) Sørg for, at alle skabelonindstillingerne er korrekte. 

e) Indtast prøve-ID’erne. 

Forsigtig: Hvis den samme prøve testes mere end en gang, skal den tildeles en anden ID. 

f) Pladen er nu klar til at blive kørt. 

g) Indsæt pladen ind i XY-platformen og fyld beholderen med sheath-væske. 

h) Klik på knappen START for at starte sessionen. Efter at prøverne har endt deres kørsel, skal data-outputtet 

gemmes i en .csv-fil. 

i) Vask maskinen 2 gange med sheath-væske efter sessionens afslutning. 

5. LABType ® HD-analyse: 

1) Luminex ® software version IS 2.2/2.3 eller xPONENT 3.1 eller senere skal anvendes 

2) Sørg for at specificere det/den nye (supplerende) lot/batch, når data læses og analyseres. 

3) Indlæs og gem hele kørselsfilen fra Luminex ® flow-analysator for dataanalyse. 

RESULTATER 

Databeregning 

A. Middel fluorescensintensiteten (MFI) genereret af Luminex ® Data Collector-softwaren, eller tilsvarende, indeholder FI 

for hver perle (eller probe, der er bundet til perlen) pr. prøve. Den procentpositive værdi beregnes som: 

Procent positiv værdi = 100 x [MFI (Probe n) - MFI (Probe negativ kontrol)/MFI (Probe positiv kontrol) - MFI (Probe negativ kontrol)] 

Den positive reaktion defineres af procenten af positive værdier for proben, der er højere end den forudindstillede 

grænseværdi for proben. Den negative reaktion defineres som procenten af positive værdier, der er lavere end grænseværdien. 

B. Sammenlign beregnede procentpositive værdier med de forudbestemte grænseværdier for hver testprobe. Tildel en 

positiv attribut til prober, der har en procentpositiv over grænseværdien og en negativ attribut til dem, der er under 

grænseværdien. Den positive kontrols MFI bør ligge inden for 1200-7000 MFI. (MFI-værdien kan falde uden for dette 

område (se Forventende værdier, afsnit C) og varierer for hver positive kontrolprobe og lot). MFI'en for hver probe 

normaliseres mod den positive kontrol MFI og udtrykkes som en procentdel af den positive kontrol-MFI. Den 

forudindstillede grænseværdi for hver probe blev etableret vha. et 100- til 200-prøve DNA-panel. 

C. Bestem HLA-allel (eller allel-grupper) af prøven ved at matche mønstret af positive og negative perle-ID'er med 

oplysningerne på LABType® SSO-arbejdsarket. 

D. For LABType højdefinitionsanalyser og LABType analyser, der indeholder supplerende perlehætteglas, er det 

nødvendigt at anvende HLA Fusion software version 2.0 eller højere til dataanalyse. 


PROCEDURENS BEGRÆNSNINGER 

LABType® SSO-systemet kombinerer en HLA locus-specifik DNA-forstærkningsproces og DNA-DNAhybridiseringsproces. 

Proceduren, så vel som udstyrets kalibrering beskrevet i dette produkt, skal følges nøje. 

DNA-forstærkning er en dynamisk proces, der kræver stærkt kontrollerede betingelser for at få PCR-produkter, der er 

specifikke for et målsegment af HLA-gen(er). Proceduren der er forklaret for DNA-forstærkningsprocessen skal følges nøje. 

Da prøve-DNA-kvantitet og -kvalitet signifikant kan påvirke forstærkningsreaktionen, anbefales en standardiseret DNAekstraktionsprocedure 

og spektrofotometriske måling af DNA-kvantitet og –kvalitet, efterfulgt af gelelektroforetisk analyse, 

på det kraftigste. Yderligere skal alle materialer, der er genereret efter DNA-forstærkning (post-PCR-materialer, herunder 

reaktionsblandinger; alle engangsplastikmaterialer; og udstyr såsom pipetteringsanordninger og gelelektroforeseanordninger), 

fysisk adskilles fra materialer, der blev anvendt før DNA-forstærkning (præ-PCR-materialer, herunder alle 

engangsplastikmaterialer, pipetteringsanordninger, prøve-DNA'er og alle andre reagenser, der blev anvendt til at opsætte 

forstærkningsreaktioner), for at undgå kontaminering af oprindelige materialer med PCR-produkter. Rutinemæssig 

aftørringstestning af præforstærkningsarbejdsområdet med valideret detektionsmetode, der er i overensstemmelse med 

retningslinjerne tilvejebragt af vedrørende myndighed, anbefales. 

DNA-DNA hybridiseringsbaseret analyse vha. LABType® SSO er en meget temperaturfølsom proces. Temperaturen, der 

anvendes til analysen, skal tjekkes hyppigt (kalibreres). Nøje overholdelse af temperaturerne og inkubationstiderne beskrevet 

i denne procedure er kritisk for at få de bedste resultater. LABType® SSO-mikrosfærer er lysfølsomme og skal beskyttes 

mod lys så meget som muligt. Undgå nedfrysning og optøning for at sikre maksimal holdbarhed. For at minimere tab af 

mikrosfærer i løbet af analysen følges protokollen beskrevet her og der må kun anvendes de anbefalede pipettespidser og 

glas. Mikrosfæreblandingen, der er vedlagt, indeholder en nøje optimeret mængde af mikrosfæresæt, der bærer HLA allelspecifikke 

prober. Enhver ændring af blandingen ville påvirke nøjagtigheden af analysen signifikant og ville ugyldiggøre 

resultaterne. 

Når sammenlignet med SSP, har SSO flere tvetydigheder, da proberne, der anvendes i SSO kun kan interrogere prøve-DNA 

med en region pr. test, og SSP kan interrogere prøve-DNA med to regioner pr. test. Dette er en grundlæggende begrænsning i 

SSO-metoden, som er velkendt af den HLA professionelle. Som nævnt tidligere er der vedlagt en liste over 

opløsningsbegrænsninger for hvert lot af LABType® SSO-typebestemmelsestests som en hjælp til fortolkningen af 

reaktionsmønstrene og tildelingen af HLA-typebestemmelse. 

Alle instrumenter (feks. thermocycler, pipetteringsanordninger, LABScan 100 og varmeblok) skal kalibreres i henhold til 

fabrikantens anbefalinger. 

For lotspecifikke oplysninger, se dokumentet Perleprobeinformation. 

Pga. kompleksiteten af HLA-alleliske definitioner bør en certificeret HLA-tekniker eller specialist gennemse og fortolke 

dataene og tildele HLA-typebestemmelsen. 

Denne test må ikke anvendes som det eneste grundlag til at træffe en klinisk beslutning. 

FORVENTEDE VÆRDIER 

A. Prøveforstærkning 

1. Det forventes, at den HLA locus-specifikke primerblanding, der er vedlagt, har et tilstrækkeligt udbytte af forstærket 

DNA. Opdages et forstærkningsprodukt af ethidiumbromid farvet agarosegel elektroforese ikke, ugyldiggør dette 

testresultaterne. 

2. DNA-forstærkning er udsat for kontaminering af tidligere forstærket DNA. Opdagelse af kontaminering (ved at 

udføre en kontrolforstærkning vha. vand eller forudetableret DNA-strygningstest til opdagelse af kontaminerende 

forstærkningsprodukter) kan ugyldiggøre testresultater. 

B. LABScan 100 analysator 

1. LABScan 100 er en avanceret flowanalysator, der kræver daglig vedligeholdelse og kalibrering. Se 

Luminex® 100/200 Brugervejledning for alle nødvendige vedligeholdelseshandlinger. Daglig vedligeholdelse 

omfatter rutinemæssige opstarts- og nedlukningsprocedurer. For den bedste ydelse kalibreres instrumentet som del 

af den rutinemæssige opstart. Kalibrér instrumentet, når d Cal Temp-temperaturen, som er vist på systemets 

monitorpanel er højere end 3 ºC. 

2. Instrumentet skal bestå en kalibreringstest før LABType® SSO-prøver analyseres. 


C. Dataindsamling og -analyse 

For at kunne opnå gyldige data, skal to parametre, tælling og middel-fluorescensintensitet (MFI), monitoreres for hver 

dataindsamling. Tællingen repræsenterer det samlede antal perler, der er blevet analyseret, og tællingen bør være over 

100 ±25 %. En signifikant reduktion i tællingen antyder perletab under prøveindsamling eller –analyse og kan 

ugyldiggøre resultaterne. MFI repræsenterer et PE-signal, der detekteres i de optalte perler. MFI varierer afhængigt af 

reaktionsresultatet. MFI'en for den positive kontrolprobe kan variere fra lot til lot og også pga. prøvekvantitet og/eller - 

kvalitet, teknik, instrumentkalibrering og alle reagensernes tilstand, herunder forstærket DNA, buffere, SAPE og 

perleblandingen. Datainformation om produktets kvalitetskontrol i analysesoftwaren præsenterer lotspecifikke værdier, 

der er indhentet vha. DNA, der opfylder prøvekrav (side 3, afsnit B i PRØVETAGNING OG FORBEREDELSE). 

Brugere tilrådes på det kraftigste at bestemme deres egne kontrolværdiområder vha. referencemæssige 

prøvevalideringstests for hvert lot. En signifikant reduktion eller forhøjelse i MFI for den positive kontrolprobe, ledsaget 

af ikke-tildelelige reaktionsmønstre, kan betyde utilstrækkelig prøvekvantitet og/eller -kvalitet, ringe analyseeffektivitet 

eller instrumentsvigt og kan ugyldiggøre testresultater. 

SPECIFIKKE PRÆSTATIONSKARAKTERISTIKA 

I normale prøver og anvendelse af analyse- og dataindhentningsbetingelser, der ligger inden for specifikationerne beskrevet i 

denne indlægsseddel (feks. startende genomisk DNA-koncentration på 20 ng/μl og renhed, UD260/280 på 1,65 til 1,80, 

hybridiseringsinkubationstemperatur og vaskeforhold samt LABScan 100 analysatorens ydelsesstatus), bestemmes positive 

og negative reaktioner ved at sammenligne den relative middelfluorescensintensitet (MFI) for en prøve med dens tilsvarende 

grænseværdi. Grænseværdien er eksperimentalt blevet bestemt for et givent lot af LABType® SSO-produkt og 

grænseværdien anvendes til at skelne mellem positive og negative signaler, baseret på prøvens HLA-genotype. Resultaterne 

forventes at afspejle tilstedeværelsen eller fraværet af (en) vis(se) HLA-allel(er), hvilket giver en tydelig 

typebestemmelsestildeling. 

Anordningsydelsesundersøgelser blev foretaget vha. QIAamp DNA Blood Maxi-sæt solgt af Qiagen Corporation. 

BIBLIOGRAFI 

1. Terasaki, PI, Bernoco, F, Park MS, Ozturk G, Iwaki Y. Microdroplet testing for HLA-A, -B, -C, and –D antigens. American Journal 

of Clinical Pathology 69:103-120, 1978. 

2. Slater RD, Parham P. Mutually exclusive public epitomes of HLA-A, B, C Molecules. Human Immunology 26: 85-89, 1989. 

3. The Luminex® 100 User’s Manual, Luminex Corporation, PN 89-00002-00-005 Rev. B. 

4. Ng J, Hurley CK, Baxter-Lowe LA, et al. Large-scale oligonucleotide typing for HLA-DRB1/3/4 and HLA-DQB1 is highly accurate, 

specific, and reliable. Tissue Antigens. 1993; 42: 473-479. 

5. Bodmer JG, Marsh SGE, Albert E, Bodmer WF, Bontrop RE, Dupont B, Erlich HA, Hansen JA, Mach B, Mayr WR, Parham P, 

Petersdorf EW, Sasasuki T, Schreuder GMT, Strominger JL, Svejgaard A, Terasaki PI. Nomenclature for factors of the HLA system, 

1998. Tissue Antigens, 53, 407-446, 1999. Human Immunology, 60, 361-395, 1999. European Journal of Immunogenetics, 26, 81- 

116, 1999. 

6. Colinas RJ, Bellisario R et al. Multiplexed genotyping of beta-globin variants from PCR-amplified newborn blood spot 

DNA by hybridization with allele-specific oligodeoxynucleotides coupled to an array of fluorescent microspheres. 

Clinical Chemistry 46: 996-998, 2000. 

LICENSERING, PATENTER OG VAREMÆRKER ANVENDT I DETTE DOKUMENT 

ANVENDTE PATENTER I DETTE DOKUMENT 

Bemærkning til køber vedrørende licenseret produkt: Købsprisen af dette produkt inkluderer begrænsede, ikke-overførbare rettigheder 

under amerikanske patenter 4,683,202; 4,683,195 og 4,965,188 og deres udenlandske modparter, ejet af Roche Molecular Systems, Inc. og 

F. Hoffmann-LaRoche Ltd ("Roche"), som består i kun at anvende denne mængde af produktet til at praktisere polymerase kædereaktions- 

("PCR") processen beskrevet i nævnte patenter kun til HLA-typebestemmelsesanvendelser af køber udelukkende til organ, knoglemarv 

eller vævstransplantation og ekskluderer udtrykkeligt analyse af retslægeligt bevis eller faderskabskontrol. Retten til at anvende dette 

produkt med henblik på at udføre og tilbyde kommercielle tjenesteydelser mht. HLA-typebestemmelse til organ- eller vævstransplantation 

vha. PCR, herunder rapportering af resultaterne af købers aktiviteter mod et gebyr eller andet kommercielt vederlag, gives hermed også. 

Yderligere oplysninger vedrørende køb af licenser til at anvende PCR kan fås ved i USA at kontakte Director of Licensing, Roche 

Molecular Systems, Inc., 1145 Atlantic Avenue, Alameda, Californien 94501, og uden for USA, PCR Licensing Manager, F. Hoffmann-La 

Roche Ltd, Grenzacherstr.124, CH-4070 Basel, Schweiz. 

LABType ® -typebestemmelsesreagenser fremstilles og forhandles af One Lambda, Inc., 21001 Kittridge Street, Canoga Park, CA 91303, 

U.S.A. Rekombinant Taq polymerase fremstilles af F. Hoffmann-LaRoche. 

Amplitaq er et varemærke, der tilhører Roche Molecular Biochemicals. 

LABScan er et varemærke, der tilhører One Lambda, Inc. 

®LABType er et registreret varemærke, der tilhører One Lambda, Inc. 

®Luminex er et registreret varemærke, der tilhører Luminex Corporation. 

®Pipetman er et registreret varemærke, der tilhører Rainin Instrument Co., Inc. 

®Fotodyne FOTO/UV21 er et registreret varemærke, der tilhører FOTODYNE Incorporated. 

®FMC SeaKem er et registreret varemærke, der tilhører FMC Corporation. 


EUROPÆISK AUTORISERET REPRÆSENTANT 

MDSS GmbH, Schiffgraben 41, D-30175 Hannover, Tyskland 

Sammendrag af protokol til 96-prøveanalyse 

A. Før opsætning 

1. Tænd for LABScan 100-analysator og begynd opstartsproceduren. Tænd for thermocycleren og start 

inkubationsprogram på 60°C . 

2. Tilbered et knust isbad (tilsæt en lille mængde vand, således at PCR-bakken kan stå lige på isen) 

3. Optø og vortex D-blanding og DNA. 

4. Fjern alle reagenser (undtagen 100x SAPE-flaske) fra opbevaringstemperatur og anvend ved stuetemperatur. 

5. Bland hele mængden af hybridiseringsbufferen grundigt og hele perleblandingen i et rent glas; beskyttes mod lys. 

B. Forstærkning 

1. Optø alle forstærkningsreagenser og anbring på is. 

2. Alikvotér 2 l genomisk DNA til hver af de 96 brønde i en PCR-bakke. 

3. Bland 432 l primerblanding, 1491 l D-blanding og 22 l Taq polymerase. Vortex grundigt og giv det en hurtig 

centrifugering. 

4. Alikvotér 18 l forstærkningsblanding fra trin 3 i alle 96 brønde med DNA. 

5. Læg låg på eller forsegl PCR-bakken. 

6. Kør bakken i en PCR-ovn vha. LABType® SSO PCR-programmet. 

7. Fjern PCR-bakken fra PCR-ovnen og kontrollér det forstærkede DNA med en 2,5 % agarosegel (anvend 5 l pr. 

brønd). 

C. Denaturering/neutralisering 

1. I en ren, tyndvægget 96-brønds PCR-bakke, alikvoteres 2,5 l denatureringsbuffer pr. brønd. 

2. Tilsæt 5 l forstærket DNA pr. brønd. Bemærk prøveplaceringerne i de 96 brønde. 

3. Bland grundigt indtil blandingen ændrer sig til en klar lyserød farve. 

4. Inkubér ved stuetemperatur (20 C til 25 ºC) i 10 minutter. 

5. Tilsæt 5 l neutraliseringsbuffer pr. brønd. 

6. Bland grundigt indtil blandingen bliver klar eller lysegul. 

7. Anbring bakken forsigtigt på isbadet. 

D. Hybridisering/vaskning 

1. Alikvotér 38 l hybridiseringsblanding (fra A.5. ovenfor) pr. brønd ind i helt neutraliseret DNA. 

2. Dæk bakken med bakkeforsegling og vortex grundigt ved lav hastighed. 

3. Inkubér bakken i en 96-brøndsblok i en 60 ºC thermocycler (anvend PCR-pude) i 15 minutter. 

4. Tag bakken ud. Tilsæt 100 l vaskebuffer til hver brønd. Anbring en ny forsegling på bakken og centrifugér ved 1000 

g i 5 minutter. 

5. Fjern supernatanten, hvilket efterlader ca. 10 l eller mindre. 

6. Gentag trin D.4 og D.5 to gange til for i alt 3 vaske. 

7. Under det sidste centrifugeringstrin, tilberedes 1X SAPE (57,5 µl stamopløsning og 5693 µl SAPE-buffer) og efterlad 

tildækket ved stuetemperatur. 

E. Etikettering 

1. Efter fjernelse af supernatanten fra tredje vask (D.6 ovenfor), tilsættes 50 l 1X SAPE pr. brønd. 

2. Anbring en bakkeforsegling forsvarligt på bakken og vortex grundigt ved lav hastighed. 

3. Inkubér ved 60 ºC i thermocycleren som ovenfor i 5 minutter. 

4. Tag bakken ud og tilsæt 100 l vaskebuffer til hver brønd. Anbring en ny forsegling på bakken og centrifugér ved 

1000 g i 

5 minutter. 

5. Bortskaf supernatanten. Tilsæt vaskebuffer, således at den endelige mængde bliver 80 l. 

6. Bland vha. pipettering og overfør alle prøver til en 96-brønds mikroplade til dataindhentning. 


REVISIONSHISTORIE 

Revision Dato Beskrivelse af revision 

Fjern LABType 40-testkit fra procedureafsnit A. Vedlagte materialer (udgåede); Tilføj yderligere forslag i 

19 2010/10 Perlehåndtering og opbevaring A.3; opdateret denaturerings/neutraliseringstestprocedure D.1.e, prøvetagning og 

forberedelse afsnit A, B og C og opdatér afsnittet Procedurens begrænsninger. 

20 2011/09 Inkluderet information om supplerende perler til LABType-kits. 

21 2011/12 

Afsnittet Opdaterede reagenser skal inkludere, at anvendelsen af kit-specifikke primer- og perleblandinger er 

vigtige og at de ikke kan udskiftes indbyrdes mellem de forskellige kit og lot. TUV foreslår lovmæssig ændring; 

tilføj fodnote sammen med 0197; tilføj yderligere CE-mærke for produkter, der ikke indgår i Bilag II, Liste B. 

Tilføjet fabrikantens symbol. Tilføjet xPONENT 3.1 opdatering 

* 

*0197 Gælder kun for produkter i Bilag II, Liste B.

LABType SSO Typing Tests, DANISH VERSION - One Lambda

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?