HNA GENOTYPING TEST, ITALIAN VERSION - One Lambda

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FOGLIO ILLUSTRATIVO
PIASTRA DI GENOTIPIZZAZIONE HNA
N. DI CATALOGO: HNAGEN
Per uso diagnostico in vitro.
USO PREVISTO
Per la determinazione molecolare di polimorfismo neutrofilo.
RIEPILOGO E SPIEGAZIONE
Gli antigeni neutrofili umani (HNA) interessano molte condizioni cliniche tra cui neutropenia immune, danno polmonare
acuto associato alla trasfusione (TRALI), refrattarietà alla trasfusione di granulociti e reazione trasfusionale febbrile. 1 Il
sistema HNA1 ha tre antigeni noti: HNA-1a, HNA-1b e HNA-1c, situati sul recettore IIIb Fcγ dei neutrofili (CD16b). 2
Questi antigeni sono caratterizzati dal gene FcγRIIIb di poliformismi a nucleotide multiplo. Mentre la base molecolare di un
sistema di antigeni HNA3 non è ben definita, l’antigene HNA-3a si trova su una glicoproteina 70-95 kDa ora considerata
parte del gene colina simile a trasportatore proteina-2 (CTL2). 3 Infine gli antigeni HNA-4 (Mart) e HNA-5 (Ond) sono
causati da mutazioni di nucleotide singolo nella catena αM (CD11b) e unità integrina αL (CD11a), sub-unità delle molecole
di adesione di leucociti (integrine β2), rispettivamente. 2 In passato, per la tipizzazione di HNA, sono stati usati metodi
sierologici. I metodi sierologici possono essere limitati dalla disponibilità di neutrofili specifici per tipo e anticorpi. Con
l’avvento delle tecnologie basate sulla reazione a catena della polimerasi (PCR, Polymerase Chain Reaction), le tecniche di
tipizzazione tissutale in biologia molecolare sono diventate di uso comune nei laboratori. Nella maggior parte di queste
metodiche basate sul DNA, il processo della PCR è utilizzato solo come procedimento di amplificazione allo scopo di
ottenere la quantità desiderata del DNA bersaglio. La tipizzazione richiede quindi una fase di post-amplificazione per
discriminare i diversi alleli (ad es., analisi RFLP, SSOP, reverse dot-blot). Al contrario, le piastre di genotipizzazione HNA
forniscono tutti i reagenti necessari per eseguire PCR con primer specifici per la sequenza (SSP) su DNA genomico isolato.
Tuttavia, a differenza di altri metodi basati su PCR, il metodo SSP impiegato da One Lambda, Inc. distingue tra i diversi
polimorfismi durante il processo PCR. 4 Ciò riduce i tempi del processo di post-amplificazione a un semplice passaggio di
rilevamento con elettroforesi su gel e i risultati sono positivi o negativi. Ciò abolisce l’esigenza di interpretazione complicata
dei risultati.
PRINCIPI
Il metodo PCR-SSP si basa sul principio secondo cui i primer oligonucleotidici completamente corrispondenti sono utilizzati
in maniera più efficiente per amplificare una sequenza target piuttosto che un primer oligonucleotidico non corrispondente
tramite Taq polimerasi ricombinante. Le coppie di primer sono progettate per corrispondere perfettamente con un singolo
allele o gruppo di alleli. In condizioni PCR severamente controllate, coppie di primer perfettamente corrispondenti
comportano l’amplificazione di sequenze target (cioè un risultato positivo), mentre coppie di primer non corrispondenti non
comportano l’amplificazione (cioè un risultato negativo). Dopo il processo PRC, i frammenti di DNA amplificato vengono
separati mediante elettroforesi su gel agarosio e vengono visualizzati tramite colorazione con bromuro di etidio ed
esposizione a luce ultravioletta. L’interpretazione dei risultati della PCR-SSP si basa sulla presenza o assenza di uno
specifico frammento di DNA amplificato. Poiché l’amplificazione durante la reazione PCR può essere influenzata
negativamente da diversi fattori (errori nella pipettatura, scarsa qualità del DNA, presenza di inibitori, ecc.), in ogni reazione
PCR è inclusa una coppia di primer di controllo interno. La coppia di primer di controllo amplifica una regione conservata
del gene della -globina umana, presente in tutti i campioni di DNA umano e usata per verificare l’integrità della reazione
PCR. In presenza di una banda di tipizzazione positiva (amplificazione specifica di un allele HNA), il prodotto della coppia
di primer di controllo interno potrebbe essere debole o assente a causa delle differenze di concentrazione e delle temperature
di fusione tra coppie specifiche di primer e coppia di primer di controllo interno. I frammenti di DNA amplificati delle coppie
di primer HNA specifiche sono più piccoli del prodotto della coppia di primer di controllo interno, ma più grandi della banda
di primer diffusi, non incorporati. Quindi, la reazione positiva di un allele o gruppo di allele HNA specifico viene visualizzata
sul gel come un frammento di DNA amplificato tra la banda del prodotto di controllo interno e la banda di primer non
incorporati (vedere Valori attesi/Interpretazione gel).
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REAGENTI
A. Identificazione
Le piastre di genotipo HNA forniscono primer oligonucleotidici a sequenza specifica per l’amplificazione di alleli HNA
e il gene della -globina umana tramite la reazione a catena della polimerasi (PCR). I primer pre-ottimizzati sono
presentati (essiccati) in diversi pozzetti di una piastra per provette con pareti sottili a 96 pozzetti da 0,2 ml per PRC e
sono pronti per l'aggiunta di campioni di DNA, Taq polimerasi ricombinante e mix di tamponi dNTP appositamente
formulati (Micro SSP D-mix). Ogni piastra di tipizzazione include una provetta di reazione di controllo negativo che
rileva la presenza del prodotto PCR di controllo interno generato dalla piastra di genotipizzazione HNA. Il prodotto PCR
di controllo interno amplificato dal gene della -globina umana è il prodotto PCR più probabilmente contaminante a
causa della sua amplificazione in ogni pozzetto. La quantità di ogni primer viene regolata in modo da ottenere
l'amplificazione ottimale di 100 ng di DNA del campione quando viene usato insieme al Micro SSP D-mix, alla
quantità prescritta di Taq polimerasi ricombinante e al profilo della reazione PCR descritto in questo documento (pag. 2).
Consultare il foglio di lavoro fornito per alleli specifici che possono essere amplificati da ogni set di primer, nelle
condizioni PCR specifiche del dosaggio. Per le posizioni del sito di primer di uno specifico lotto fare riferimento al
documento Informazioni primer.
B. Avvertenza o attenzione
1. Per uso diagnostico in vitro.
2. Le pipette usate per manipolazioni post-PCR non vanno utilizzate per manipolazioni pre-PCR.
3. Avvertenza di pericolo di origine biologica: Il bromuro di etidio usato per la colorazione del DNA è un potenziale
cancerogeno. Indossare sempre guanti durante l’uso di gel colorati.
4. Avvertenza di pericolo di origine biologica: Tutti i prodotti ematici vanno trattati come potenzialmente infettivi. Il
materiale di origine da cui è stato derivato questo prodotto è risultato negativo secondo i test attualmente richiesti
dalla FDA. Nessun metodo di test noto è in grado di garantire con certezza che i prodotti derivati da sangue umano
non trasmettano agenti infettivi.
5. Attenzione: Indossare occhiali protettivi anti-UV e non guardare direttamente fonti di raggi UV durante la
visualizzazione del gel o mentre si scattano fotografie.
6. Per informazioni dettagliate consultare la Scheda di sicurezza materiali.
C. Istruzioni per l’uso
Consultare le Istruzioni per l’uso.
D. Istruzioni per la conservazione
Conservare i reagenti alla temperatura riportata sulla confezione (da -80 a -20 °C). Utilizzare prima della data di
scadenza riportata sulla confezione.
E. Purificazione o trattamento richiesto per l’utilizzo
Consultare le Istruzioni per l’uso.
F. Indicatori di instabilità
1. Non utilizzare piastre di set primer con crepe sulle provette o sui bordi. Le crepe potrebbero causare perdite di
vapore.
2. Se la soluzione delle aliquote D-mix presenta precipitati salini durante la spedizione o la conservazione, scioglierli
nuovamente mediante agitazione avanzata a temperatura ambiente (da 20 a 25 C).
3. Le aliquote di D-mix, dopo lo scongelamento a temperatura ambiente (da 20 a 25 C), dovrebbero essere di colore
rosa o violetto. Eventuali aliquote di soluzione D-mix che non presentino tale colorazione vanno considerate
inutilizzabili.
APPARECCHIATURE RICHIESTE
A. Programmazione del termociclatore
Impostare la velocità di rampa a 9600. Programmare il termociclatore prima di iniziare la “Procedura guidata” nel
seguito.
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N. di cicli
Programma PCR One Lambda (OLI-1)
Temp. (C
Passaggio
Tempo (s)
1 1 96 130
2 63 60
9 1 96 10
2 63 60
20 1 96 10
2 59 50
3 72 30
Fine 1 4 ---
Preparazione di gel di agarosio al 2,5% usando Micro SSP Gel System, OLI, n. di catalogo MGS108
1. Impostazione:
Fare scorrere il perno di blocco sulla base portandolo in posizione di apertura.
Inserire il contenitore del gel nella base facendo corrispondere i lati codificati a colori per garantire il corretto
orientamento.
Bloccare il contenitore del gel nella base facendo scorrere il perno di blocco nella posizione di blocco.
Aiutarsi con le bolle della livella e le tre gambe regolabili in altezza per portare la base a livello.
2. Orientare e inserire completamente i 14 pettini per gel nel porta pettine.
3. Aggiungere 2,5 g di agarosio per elettroforesi a 100 ml di tampone 1x Tris-borato EDTA (TBE 1x) con 0,5 g/ml di
bromuro di etidio (in una bottiglia di vetro da 500 ml). Riscaldare fino ad avere una soluzione omogenea.
4. Aggiungere 30 ml di soluzione gel al contenitore del gel. Accertarsi che l’agarosio copra l’intera superficie in
maniera uniforme inclinando il contenitore del gel indietro e in avanti subito dopo aver aggiunto la soluzione gel.
Posizionare subito il porta pettine per gel sul contenitore con il gel facendo corrispondere i codici dei colori. Lasciar
riposare per 15 minuti.
5. Rimuovere i pettini per gel sollevando il porta pettine e mantenendo la base. Aggiungere in maniera uniforme 10 ml
di TBE 1x contenente 0,5 g/ml di bromuro di etidio sul gel in modo da riempire tutti i pozzetti.
B. Elettroforesi su gel usando Micro SSP Gel System, OLI, n. di catalogo MGS108
1. Al completamento della reazione PCR:
Orientare la piastra di set primer DNA e il contenitore del gel con il pozzetto di controllo negativo nell'angolo
superiore sinistro.
Rimuovere delicatamente il copripiastra evitando di spruzzare i campioni.
2. Trasferire ogni reazione PCR (10 l) in sequenza al gel di agarosio al 2,5%. Trasferire tutti i campioni nella
sequenza corretta (non è necessaria l’aggiunta di tintura di elettroforesi). Si consiglia l'uso di un Pipetman ® a 8 o 12
canali.
Nota: L’ordine dei campioni (corrispondente al foglio di lavoro) è da sinistra a destra, dall’alto in basso.
3. Coprire il contenitore del gel con l'apposito coperchio facendo corrispondere i lati codificati a colori. Eseguire
l’elettroforesi dei campioni a 140 - 150 volt finché il colorante tracciante rosso non è migrato a circa 0,5 cm nel gel
(circa 3-5 minuti, a seconda dell’agarosio utilizzato). Rimuovere il coperchio.
4. Far scorrere il perno di blocco sulla base portandolo in posizione di apertura e rimuovere il contenitore del gel.
Trasferire il contenitore del gel a un transilluminatore UV. Fotografare il gel completato.
5. Orientare la fotografia con la reazione di controllo negativo nell'angolo in alto a sinistra e segnare i gruppi di alleli
positivi corrispondenti sul foglio di lavoro fornito con la piastra.
RACCOLTA E PREPARAZIONE DEL CAMPIONE
A. Il DNA può essere purificato a partire da campioni di test umani, utilizzando il metodo di preferenza.
B. Il campione di DNA da utilizzare per l’analisi PCR-SSP deve essere risospeso in acqua sterile o in Tris-HCl 10 mM, a
pH 8,0 –9,0, a una concentrazione ottimale di 25 - 200 ng/l con il rapporto A260/A280 di 1,65 - 1,80.
C. I campioni non devono essere risospesi in soluzioni contenenti agenti chelanti. Gli anticoagulanti possono
includere ACD-A, ACD-B o K-EDTA.
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D. I campioni di DNA possono essere usati subito dopo l'isolamento o possono essere archiviati a una temperatura di -20 C
fino a 10 anni. .
E. In caso di trasporto, i campioni di DNA devono essere conservati a una temperatura di 4 C o inferiore al fine di
preservarne l’integrità durante il percorso (fino a 5 giorni).
PROCEDURA
A. Materiali forniti
1. Piastre di genotipizzazione HNA
2. Provette D-mix pre-aliquotate (numero appropriato per il test)
3. Copripiastra (numero appropriato per il test)
B. Materiali richiesti, ma non forniti
Taq polimerasi ricombinante (5 unità/l)
Dispositivi di pipettatura
Puntali per pipette monouso
Miscelatore Vortex
Microcentrifuga
Coperchio e rastrelliera per la conservazione delle microprovette della piastra PRC. Usare esclusivamente il
cuscinetto a pressione specifico per il proprio termociclatore.
Termociclatore per PRC da 96 pozzetti e piastra/fermo per provette di reazione a pareti sottili da 0,2 ml.
Piastra calda o forno a microonde per il riscaldamento delle soluzioni di agarosio
Alimentatore per camera elettroforetica (capacità minima 150 V)
Transilluminatore UV - Sistema di foto o videodocumentazione
Tampone TBE 1x (89 mM di Tris-borato; 2 mM di EDTA bisodico, pH 8,0) con 0,5 g/ml di bromuro di etidio
Agarosio per elettroforesi
C. Procedura guidata.
Consultare le Istruzioni per l’uso nel seguito.
ISTRUZIONI PER L’USO
A. Preparazione del campione
1. Purificare il DNA genomico dai campioni di test umano con il metodo prescelto. La concentrazione di DNA finale
deve essere di 25 – 200 ng/l (100 ng/l è ottimale) con un rapporto A260/A280 compreso tra 1,65 e 1,80.
2. Per informazioni specifiche sulla preparazione dei campioni e sulla conservazione, consultare Raccolta e
preparazione del campione in precedenza.
3. Eseguire PCR sui campioni di DNA purificati usando una piastra di genotipizzazione HNA o conservare il
campione di DNA a -20 °C fino a quando non sarà pronto per la tipizzazione, fino a 10 anni.
B. Preparazione dei reagenti e dell’apparecchiatura
1. Programmare un termociclatore per eseguire un programma PCR One Lambda (vedere “Apparecchiature richieste”
in precedenza).
2. Tenere a disposizione: Taq polimerasi ricombinante (5 unità/l). Preparare il gel per elettroforesi (agarosio al 2,5%)
usando il sistema gel Micro SSP (n. catalogo MGS108) o con almeno 96 pozzetti di campioni (distanziare le file
di pozzetti di almeno 1 cm).
C. Istruzioni per la pipettatura della Taq polimerasi
I test di controllo della qualità One Lambda indicano che il volume indicato sull’etichetta della Taq polimerasi è più che
sufficiente per il numero di test indicati su questo prodotto.
Per evitare sprechi, si prega di seguire le semplici istruzioni elencate di seguito per la pipettatura della Taq polimerasi.
Nota: La Taq polimerasi è molto viscosa ed è necessario adoperare molta cautela nella divisione in aliquote. Il mancato
rispetto delle istruzioni sottostanti può comportare la perdita di reagente.
1. Pipettare lentamente, utilizzando una pipettatrice calibrata. La punta della pipetta deve superare di poco lo strato
superficiale della Taq.
Avvertenza: Non immergere la punta della pipetta nella Taq.
2. Asciugare con cautela la Taq in eccesso dalla punta della pipetta sull’orlo della fiala.
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D. Procedura graduale
1. Rimuovere dalla temperatura di conservazione indicata: il volume (provetta) del Micro SSP D-Mix adeguato per
la piastra del set sottoposto a priming di genotipizzazione HNA (vedere la tabella di riferimento 1) e il numero
appropriato di campioni di DNA. Scongelare a temperatura ambiente (da 20 a 25 C).
Nota: È possibile tagliare la piastra e il copripiastra nel numero di test necessari per una singola sessione di lavoro.
Riportare immediatamente le parti non utilizzate alla temperatura di conservazione appropriata.
Agitare i campioni di DNA per miscelare.
Posizionare la piastra di set sottoposti a priming in una rastrelliera di conservazione microprovette della piastra
PCR e rimuovere l'etichetta della piastra.
2. Rimuovere la Taq polimerasi ricombinante dal congelatore e tenere in ghiaccio finché non si è pronti per l’uso.
3. Utilizzando una pipettatrice, aggiungere 1 l di diluente DNA alla prima provetta di reazione del controllo negativo
sulla piastra di set sottoposta a priming per ciascun test (pozzetto 1H o 7H).
4. Utilizzando una pipettatrice, aggiungere un volume appropriato di Taq polimerasi ricombinante (5 unità/l) alla
provetta Micro SSP D-mix (vedere la tabella di riferimento 1). Tappare la provetta e agitare per 5 secondi.
Ruotare a impulsi la provetta Micro SSP D-mix in una microcentrifuga per portare tutto il liquido in basso dai lati
della provetta.
5. Utilizzando una pipettatrice, pipettare 9 l di Micro SSP D-mix nella provetta di reazione del controllo negativo.
6. Utilizzando una pipettatrice, aggiungere il campione di DNA alla provetta Micro SSP D-mix (vedere la tabella di
riferimento 1).
# di file
per test
Tabella di riferimento 1
Volume D-mix
(μl) per test
(fornito)
DNA
Volume (µl)
per test
Taq polimerasi
Volume (µl)
per test
1-2 180 19 1
7. Tappare la provetta e agitare per 5 secondi. Agitare a impulsi la provetta Micro SSP D-mix in una
microcentrifuga.
8. Utilizzando una pipettatrice, aliquotare 10 l miscele campione-reazione dalla provetta Micro SSP D-mix in
ciascuna provetta di reazione, ad eccezione della prima provetta di reazione del controllo negativo, della piastra di
set sottoposti a priming di genotipizzazione HNA.
Importante: Accertarsi di applicare il campione sui primer (essiccato sul fondo di ciascuna provetta di reazione)
per evitare la contaminazione crociata tra provette. Toccare la parete interna della provetta con la punta della
pipetta per consentire al campione di scorrere verso il fondo della provetta. Controllare che tutti i campioni siano
finiti sul fondo di ciascuna provetta. In caso contrario, picchiettare delicatamente la piastra sulla sommità del
banco in modo che tutti i campioni si depositino sul fondo della provetta prima di iniziare la PCR.
9. Coprire le provette di reazione con il copripiastra fornito. Verificare che tutte le provette di reazione siano coperte
completamente dal copripiastra per garantire una chiusura completa e prevenire perdite per evaporazione durante la
PCR.
10. Posizionare la piastra dei set sottoposti a priming di genotipizzazione HNA nel termociclatore.
11. Collocare un cuscinetto a pressione al di sopra della piastra col lato testurizzato in alto prima di chiudere il
coperchio del termociclatore.
12. Inserire il numero di programma PCR di genotipizzazione HNA. Specificare un’opzione del volume di reazione da
10 l.
13. Avviare il programma PCR. Il programma impiega circa 1 ora e 16 minuti. L’ultima fase mantiene il campione a 4
C finché il ciclo non si arresta.
14. Rimuovere la piastra dei set sottoposti a priming dal termociclatore. Rimuovere delicatamente il copripiastra
evitando di spruzzare i campioni. Oppure conservare i campioni nella piastra dei set sottoposti a priming ad una
temperatura di -20 C o inferiore per la successiva elettroforesi su gel.
15. Trasferire ciascuna reazione PCR (10 l) in sequenza ad un gel di agarosio al 2,5% nel sistema Micro SSP Gel
(OLI n. di catalogo MGS108).
Nota: accertarsi di trasferire tutti i campioni nella sequenza appropriata, orientando la piastra dei set sottoposti a
priming con il pozzetto di reazione del controllo negativo nell’angolo superiore sinistro. L’ordine dei campioni
(corrispondente al foglio di lavoro) è da sinistra a destra, dall’alto in basso. Non è necessario aggiungere colorante di
elettroforesi.
16. Eseguire l’elettroforesi dei campioni a 140 - 150 volt finché il colorante tracciante rosso non è migrato a circa 0,5
cm nel gel (circa 3-5 minuti, a seconda dell’agarosio utilizzato).
17. Fotografare il gel su un transilluminatore UV.
18. Interpretare i risultati della tipizzazione utilizzando il foglio di lavoro fornito con le piastre.
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Nota: Quando le piastre di tipizzazione DNA One Lambda riempiono solo alcune file del gel di elettroforesi, è possibile
posizionare diversi campioni su un unico gel. Prestare attenzione nel registrare le posizioni dei campioni sul gel.
LIMITI DELLA PROCEDURA
A. Il PCR-SSP è un processo dinamico che richiede condizioni altamente controllate per garantire un’amplificazione
discriminatoria. La procedura fornita in questo prodotto deve essere seguita fedelmente.
B. Il DNA del campione estratto fornisce il modello per il processo di amplificazione specifico e, pertanto, deve presentare
concentrazione e purezza comprese negli intervalli specificati nella procedura.
C. Tutti gli strumenti (ad es. macchina PCR, dispositivi di pipettatura) devono essere calibrati secondo le raccomandazioni del
produttore. Per le informazioni specifiche per lotto, fare riferimento al documento Limiti della risoluzione.
D. La piastra di genotipizzazione HNA contiene materiali per l’amplificazione del DNA genomico mediante reazione a catena
della polimerasi e rilevamento qualitativo dei polimorfismi HNA-1a, HNA-1b, HNA-1c, HNA-3a, HNA-3b, HNA-4a,
HNA-4b, HNA-5a e HNA-5b tramite elettroforesi su gel di agarosio. Le variazioni nella sequenza di geni possono influire
negativamente sui risultati.
E. Questo test non deve essere utilizzato come sola base per una decisione clinica.
VALORI ATTESI
A. Analisi dei dati
1. Una banda di controllo interna (migrazione più lenta) dovrà essere sempre visibile nei pozzetti negativi (ad eccezione
del pozzetto di controllo negativo) in qualità di controllo della corretta amplificazione. La non amplificazione di un
pozzetto può invalidare i risultati del test.
2. Una banda di tipizzazione positiva a migrazione più veloce può essere osservata sul gel elettroforetico se un allele
specifico HNA è stato amplificato durante la PCR. Ciò indica un risultato di test positivo.
3. La banda di controllo interna può essere debole o assente nei pozzetti positivi.
4. Abbinare gli schemi di pozzetti positivi con le informazioni sul foglio di lavoro della piastra di genotipizzazione HNA
per ottenere la tipizzazione HNA del DNA campione.
5. La presenza della banda di controllo interna e/o della banda di tipizzazione positiva nel pozzetto di controllo negativo
invalida tutti i risultati del test.
B. Interpretazione gel*
Reazione
positiva
Reazione
negativa
Non
amplificazione
Pozzetto
Banda di controllo interno
Banda di tipizzazione positiva
Banda di priming
*La banda di controllo interna e la banda larga non incorporata fungono da marker dimensionali. Qualsiasi banda visibile tra
i due marker dimensionali deve essere considerata banda di tipizzazione positiva.
CARATTERISTICHE DEL TEST
È stato eseguito un confronto di tipizzazione della piastra di genotipizzazione HNA per HNA-1, HNA-3, HNA-4 e HNA-5. In
questo confronto sono stati analizzati sessantasette campioni casuali di DNA per la tipizzazione rispetto al sequenziamento
bidirezionale. I risultati mostrano una concordanza di tipizzazione del 100% tra i due metodi.
BIBLIOGRAFIA
1) Stroncek, D. Neutrophil Alloantigens. Transfuse Med Rev. 2002 Jan; 16(1):67-75.
2) Stroncek, D. Neutrophil Antigens and Antibodies. ASHI Quarterly; Scientific Communications. 2004; 54-57.
3) Curtis, B.R., Cox, N.J., Sullivan, M.J., Konkashbaev, A., Bowens, K., Hansen, K, and Aster, R.H. The neutrophil alloantigen
HNA-3a (5b) is located on choline transporter-like protein 2 and appears to be encoded by an R>Q154 amino acid
substitution. Blood, 2010 March Vol. 115, (10), 2073-2076.
4) Newton, C.R., Graham, A., Heptinstall, E., Powell, S.J., Summers, C., Kalsheker, N., Smith, J.C., and Markham,
A.F.Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS). Nucleic Acids Research
17: 2503-2516, 1989.
HNA-GENO-PI-IT-00, Rev 0 Pagina 6 di 8

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RISOLUZIONE DEI PROBLEMI
Problema Potenziali cause Soluzioni
Nessuna banda o
banda lieve
DNA Non utilizzato a sufficienza
Taq polimerasi
ricombinante
Non sufficientemente puro (A260/A280 non compreso tra
1,65 - 1,80)
Inibitore PCR presente (ad es. EDTA superiore a 0,5
mM)
Non utilizzato a sufficienza
Enzima degradato
Ripetere il test; utilizzare la quantità
indicata in Inserto prodotto piastra di
genotipizzazione HNA
Ripetere la preparazione del DNA;
verificare il A260/A280 compreso tra 1,65
- 1,80, quindi ripetere il test.
Ripetere la preparazione del DNA;
sospendere nuovamente il DNA in
soluzione con anticoagulante approvato
e ripetere il test.
Ripetere il test; utilizzare la quantità
indicata in Inserto prodotto piastra di
genotipizzazione HNA
Ripetere il test; utilizzare una nuova
provetta di enzima.
EtBr Non utilizzato a sufficienza Ripetere 1 X TBE con EtBr a 0,5 g/ml.
Ripetere il test.
Cuscinetto a
pressione
Bande errate DNA Usato troppo
Bande in controllo
negativo
Taq polimerasi
ricombinante
Cuscinetto a pressione usurato Sostituire il cuscinetto a pressione dopo
300 cicli di PCR.
Non sufficientemente puro (A260/A280 non compreso tra
1,65 - 1,80)
Contaminate (altro prodotto DNA o PCR)
Ripetere il test; utilizzare la quantità
indicata in Inserto prodotto piastra di
genotipizzazione HNA
Ripetere la preparazione del DNA;
verificare il A260/A280 compreso tra 1,65
- 1,80, quindi ripetere il test.
Utilizzare le nuove aliquote di tutti i
tamponi/reagenti per l’estrazione del
DNA e il PCR; ripetere l'estrazione del
DNA e il test.
Usata troppo Ripetere il test; utilizzare la quantità
indicata in Inserto prodotto piastra di
genotipizzazione HNA
EtBr Usato troppo Ripetere 1 X TBE con EtBr a 0,5 g/ml.
Ripetere il test.
Reagenti Contaminati (altro prodotto DNA o PCR) Utilizzare le nuove aliquote di
tamponi/reagente per l’estrazione del
DNA e il PCR; ripetere l'estrazione del
DNA e il test.
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MARCHI COMMERCIALI UTILIZZATI IN QUESTO
DOCUMENTO/PRODOTTO
One Lambda Inc. FMC SeaKem
GeneAmp Applied Biosystems
Fotodyne FOTO/UV21 FOTODYNE Incorporated
BREVETTI UTILIZZATI IN QUESTO DOCUMENTO
FMC Corporation
ARMS Zeneca Limited
Gilson® and Pipetman® Rainin Instrument Co., Inc.
Veriti Applied Biosystems
Avviso per l’acquirente di prodotti con autorizzazione: Il prezzo di acquisto di questo prodotto comprende diritti limitati, non
trasferibili, nell’ambito dei brevetti U.S.A. 4.683.202, 4.683.195 e 4.965.188 e le loro controparti di altri Paesi, di proprietà di
Roche Molecular Systems, Inc. e di F. Hoffmann-LaRoche Ltd (“Roche”), all’utilizzo della sola quantità di questo prodotto
necessaria per l’esecuzione del processo reazione a catena della polimerasi (Polymerase Chain Reaction, “PCR”) descritto nei
citati brevetti esclusivamente per le applicazioni di tipizzazione HLA dell’acquirente esclusivamente per il trapianto di organi,
midollo osseo o tessuti, ed esclude esplicitamente l’analisi di prove forensi o la determinazione della paternità. Con la presente è
anche concesso il diritto all’utilizzo di questo prodotto per eseguire e offrire servizi commerciali per la tipizzazione HLA per il
trapianto di organi o tessuti utilizzando PCR, comprese le relazioni dei risultati delle attività dell’acquirente dietro pagamento di
una tariffa o altra considerazione commerciale. Ulteriori informazioni sull’acquisto di autorizzazioni per l’utilizzo di PCR
possono essere ottenute contattando, negli Stati Uniti, il Direttore delle autorizzazioni presso Roche Molecular Systems, Inc.,
1145 Atlantic Avenue, Alameda, California 94501 e, all’esterno degli Stati Uniti, il Responsabile delle autorizzazioni PCR, F.
Hoffmann-La Roche Ltd, Grenzacherstr.124, CH-4070 Basilea, Svizzera.
La tecnologia SSP è concessa in licenza da Zeneca Limited, mediante la società Zeneca Diagnostics, Blacklands Way, Abingdon
Business Park, Abingdon, Oxfordshire, Inghilterra OX14 IDY ed è coperta dai seguenti brevetti di proprietà di Zeneca
Corporation: Brevetto
europeo n. 0 332 435 B1, brevetto USA n. 5.595.890, metodo autorizzato per il rilevamento delle sequenze di nucleotidi e
brevetto canadese n. 1323592 e brevetti equivalenti e richieste di brevetti in tutto il mondo.
I reagenti della piastra di genotipizzazione HNA sono prodotti e distribuiti da One Lambda, Inc., 21001 Kittridge Street, Canoga
Park, CA 91303, U.S.A. La Taq polimerasi ricombinante è prodotta da F. Hoffmann-LaRoche.
RAPPRESENTANTE AUTORIZZATO PER L’EUROPA
MDSS GmbH, Schiffgraben 41, D-30175 Hannover, Germania
CRONOLOGIA REVISIONI
Revisio
ne
Date Descrizione della revisione
0 2012/01 Pubblicazione iniziale, NPD155
HNA-GENO-PI-IT-00, Rev 0 Pagina 8 di 8