LABSCREEN, ITALIAN VERSION - One Lambda

21001 Kittridge Street, Canoga Park, CA 91303-2801 USA Tel: +1 (818) 702-0042 Fax: +1 (818) 702-6904 www.onelambda.com
FOGLIO ILLUSTRATIVO
LABScreen ®
Vedere la tabella di riferimento LABScreen® per l’identificazione dei prodotti.
Per uso diagnostico in vitro.
USO PREVISTO
I prodotti LABScreen ® sono previsti per l’uso nella rilevazione dell’anticorpo HLA mediante la tecnica della citometria a flusso.
RIASSUNTO E SPIEGAZIONE
I prodotti LABScreen ® si avvalgono di microsfere coattate con antigeni HLA purificati di classe I o di classe II e reagenti pre-ottimizzati per la
rilevazione degli anticorpi HLA di classe I o di classe II nei sieri umani. I prodotti LABScreen ® utilizzano il sistema Lambda Array Beads
Multi-Analyte System® (LABMAS), che si avvale dell’analizzatore a flusso LABScan 100 per l’acquisizione e l’analisi dei dati. Il dosaggio
Mixed rileva la presenza di anticorpo contro gli antigeni HLA di classe I e/o classe II. I test PRA possono rilevare gli anticorpi e le loro specificità
contro gli antigeni HLA in ciascun pannello LABScreen ® . Il dosaggio con antigene singolo consente la conferma della specificità degli anticorpi
suggerita da un precedente test PRA, mentre le singole sfere individuali sono utilizzate per focalizzarsi sulle reazioni contro uno o alcuni antigeni,
ad es. per confrontare la reattività di diversi campioni di siero dello stesso soggetto. Un siero di controllo negativo consente di stabilire il valore di
fondo per ciascuna sfera in un batch di test.
PRINCIPI DEL TEST
I prodotti LABScreen ® sono utilizzati per i test di rilevazione degli anticorpi che si avvalgono di un pannello di sfere contrassegnate
con colori diversi e coattate con antigeni HLA purificati. È possibile combinare fino a 100 sfere diverse in una sospensione per un
singolo test.
Il siero del test viene prima incubato con le sfere LABScreen ® . Gli eventuali anticorpi HLA presenti nel siero del test si legano agli
antigeni, quindi vengono etichettati con IgG antiumane di capra coniugate con R-ficoeritrina (PE). L’analizzatore a flusso
LABScan 100 rileva l’emissione fluorescente di PE da ciascuna sfera, consentendo l’acquisizione dei dati quasi in tempo reale.
Il pattern di reazione del siero del test viene confrontato con il foglio di lavoro specifico del lotto per definire l’array dell’antigene e
assegnare la specificità PRA e HLA.
REAGENTI
A. Identificazione
Consultare la Tabella di riferimento LABScreen per la descrizione del prodotto.
B. Avvertenza o precauzione
1. Per uso diagnostico in vitro.
2. Per maggiori informazioni, consultare la scheda informativa sulla sicurezza dei materiali.
3. Avvertenza: i reagenti del test LABScreen ® PRA contengono sodio azide (NaN3) allo 0,1% come conservante. La sodio
azide in condizioni di acidità rilascia acido idrazoico, un componente altamente tossico. I reagenti contenenti sodio azide
devono essere diluiti con acqua corrente prima di essere smaltiti. Tali condizioni sono consigliate onde evitare la formazione
di depositi nelle tubazioni che potrebbero comportare il rischio di esplosione.
4. Avvertenza: tutti i prodotti ematici devono essere trattati come potenzialmente infettivi. Il materiale di origine da cui è
derivato questo prodotto è risultato negativo secondo le modalità di analisi attualmente richieste dalla FDA. Nessuna tecnica
di analisi nota è in grado di garantire con certezza che i prodotti derivati da sangue umano non trasmettano agenti infettivi.
5. Attenzione: Per scuotere manualmente le piastre, utilizzare un moto rapido del braccio verso il basso senza movimento del polso per
evitare effetti di movimento ripetuto.
C. Istruzioni per l'uso
1. Consultare la sezione Modalità d’uso qui sotto.
2. Se la soluzione presenta precipitati salini, ridiscioglierli scaldandola delicatamente prima di preparare la diluizione di
lavoro.
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D. Conservazione
1. I prodotti LABScreen® sono spediti all’utente finale in ghiaccio secco. L’intera confezione può essere conservata in un
congelatore a -65 C o a una temperatura inferiore fino alla data di scadenza indicata sull’etichetta.
2. NON RICONGELARE le sfere dopo averle scongelate. Conservare a 2 - 8 C per un periodo massimo di tre mesi o fino alla
data di scadenza (se precedente).Dopo il primo utilizzo, conservare il tampone di lavaggio a 2–5 C fino alla scadenza.
3. Dopo il primo utilizzo, conservare il tampone di lavaggio a 2–8 C fino alla scadenza.
E. Purificazione o trattamento richiesto
Consultare la sezione “Modalità d’uso” qui sotto.
F. Indicazioni di instabilità
Nessuna
APPARECCHIATURE RICHIESTE
A. Apparecchio necessario
Analizzatore a flusso LABScan 100
Piattaforma Luminex ® XY (accessorio opzionale per la lettura automatica di 96 campioni sull'analizzatore a flusso
LABScan 100)
Centrifuga
Rotore per provette per microcentrifuga da 1,5 ml (14.000–18.000 g) o rotore con contenitore oscillante per
micropiastra
a 96 pozzetti (1.300 g)
Vortex
Agitatore per piastre o piattaforma rotante
Per l’opzione con piastra filtrante:
Collettore di vuoto Millipore (n. di cat. Millipore MAVM0960R o equivalente)
Piastra filtrante Millipore (Multiscreen-BV, n. di cat. Millipore MABVN1210, o equivalente)
Pompa a vuoto con una pressione inferiore a 100 mmHg
Agitatore per piastre o piattaforma rotante
B. Calibrazione delle apparecchiature
Attenersi alle istruzioni indicate dal produttore per la calibrazione dell’analizzatore a flusso LABScan 100.
C. Software consigliato
HLA Fusion® (N. cat. OLI FUSPGR)
RACCOLTA E PREPARAZIONE DEL CAMPIONE
A. I campioni di sangue non aperti possono essere conservati a temperatura ambiente per un massimo di 4 giorni. Il siero (da
campioni coagulati) o il plasma (in ACD o K-EDTA) separati possono essere refrigerati per un massimo di 7 giorni, oppure le
aliquote possono essere congelate a -20 °C o a temperature inferiori e scongelate subito prima del dosaggio. Tuttavia, è
necessario rimuovere gli aggregati dal siero/plasma dell’analisi mediante centrifugazione (8.000–10.000 g per 10 minuti) o
filtrazione (0,2 m) prima dell’analisi. Aggregati o contaminazione del campione possono generare risultati non validi.
B. Il siero o il plasma del test non devono essere inattivati per calore, poiché possono provocare un fondo elevato nel test.
C. Per il test vengono generalmente utilizzati siero o plasma non diluiti. Tuttavia, se per questa analisi si diluisce un campione di
siero con un fondo elevato, il siero di controllo negativo deve essere analizzato alla stessa diluizione.
PROCEDURA
A. Materiali forniti – Consultare la Tabella di riferimento LabScreen per i materiali forniti per ciascun prodotto.
Nota: i volumi sono forniti in quantità leggermente in eccesso rispetto alla quantità necessaria per l'analisi in previsione di
possibili perdite che possono avere luogo durante la pipettatura.
B. Materiali necessari ma non forniti
IgG antiumane di capre coniugate con PE (OLI, n. di cat. LS-AB2)
PBS (filtrata)
Provetta per microcentrifuga da 1,5 ml (Scientific USA)
Puntali per pipette (Rainin GPS)
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Se il test viene eseguito in una piastra a 96 pozzetti:
Micropiastra da 250 l per 96 pozzetti UNIPLATE (Whatman, n. 7701-2250) o equivalente (superficie non trattata)
Copripiastra (OLI, n. di cat. SSPSEA300)
Siero di controllo negativo (OLI, n. di cat. LS-NC, o equivalente—non contenente anticorpo HLA quando analizzato con il
metodo LABScreen ® ).
Per l’opzione con piastra filtrante:
Piastra filtrante Millipore: (Multiscreen-BV, n. di cat. Millipore MABVN1210, o equivalente)
C. Procedura guidata
Consultare la sezione “Modalità d’uso” qui sotto.
MODALITÀ D'USO
Note:
1) Usare molta cautela nella divisione in aliquote. Il mancato rispetto delle istruzioni sottostanti può comportare lo spreco di
reagente.
2) Le sezioni da A a C indicano i volumi di reagenti necessari per il test di un singolo gruppo di sfere. Se si sta eseguendo un
test combinato, vedere la sezione D prima di procedere.
3) Attivare lo strumento LABScan 100 almeno 30 minuti prima di iniziare il dosaggio.
4) Creare un nome file e un foglio di codice di esempio per ciascuna piastra di test.
A. Per completare il test in una provetta per microcentrifuga da 1,5 ml:
Nota: consultare la sezione B qui sotto per istruzioni sull’uso di una piastra a 96 pozzetti.
1. Le sfere LABScreen ® devono essere miscelate accuratamente agitandole con delicatezza o pipettandole su e giù
ripetutamente prima dell’uso.
2. Incubare 5 µl di sfere LABScreen ® con 20 µl di siero del test in provette per microcentrifuga separate da 1,5 ml al buio per
30 minuti a 20 - 25 ºC con un leggero scuotimento.
3. Per ciascun batch di test, è necessario analizzare un siero di controllo (OLI, n. di cat. LS-NC o equivalente) per stabilire
i valori di fondo.
4. Diluire il tampone di lavaggio 10X (n. di cat. LSPWABUF) in acqua distillata per ottenere una soluzione 1X.
5. Aggiungere 1 ml di tampone di lavaggio in ciascuna provetta con soluzione sfera/siero e agitare. Centrifugare a 9300 g per
2 minuti. Aspirare ed eliminare il sopranatante.
6. Ripetere due volte la fase 5.
7. Diluire 1 µl per ogni test di IgG antiumane coniugate con PE 100X (n. di cat. LS-AB2) con 99 µl di tampone di lavaggio 1X
per ottenere una soluzione 1X.
8. Aggiungere 100 µl di IgG antiumane coniugate con PE 1X in ciascuna provetta. Agitare e incubare al buio per 30 minuti a
20–25 ºC con un leggero scuotimento.
9. Ripetere due volte la fase 5.
10. Aggiungere 80 l di PBS in ciascuna provetta. Il campione è pronto per l'acquisizione e l’analisi dei dati, oppure può essere
conservato a 2–5 °C al buio per un massimo di 24 ore prima dell'analisi.
B. Per completare il test in una piastra a 96 pozzetti:
Attenzione: la chiusura ermetica della piastra a 96 pozzetti va fatta attentamente e in modo completo per evitare la
contaminazione dei campioni da un pozzetto all'altro. Sigillare la piastra premendo l'etichetta adesiva contro il bordo di
ciascuno dei 96 pozzetti. Non riutilizzare i copripiastra. Usare un copripiastra nuovo per ogni fase che richiede
l'applicazione di un copripiastra.
1. Le sfere LABScreen ® devono essere miscelate accuratamente agitandole con delicatezza o pipettandole su e giù
ripetutamente prima dell’uso.
2. Incubare 5 µl di sfere LABScreen® con 20 µl di siero del test in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti al buio per
30 minuti a 20–25 ºC con un leggero scuotimento.
3. Per ciascun batch di test, è necessario usare un siero di controllo (OLI, n. di cat. LS-NC o equivalente) per stabilire i valori di fondo.
4. Diluire il tampone di lavaggio 10X (n. di cat. LSPWABUF) in acqua distillata per ottenere una soluzione 1X.
5. Dopo l’incubazione, aggiungere 150 l di tampone di lavaggio 1X in ciascun pozzetto della piastra. Coprire con il
copripiastra (OLI, n. di cat. SSPSEA300) e agitare mediante vortex. Centrifugare a 1.300 g per 5 minuti.
6. Rimuovere il tampone di lavaggio dai pozzetti della piastra scuotendo le piastre manualmente (flicking) o con aspirazione
a vuoto.
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7. Aggiungere 200 l di tampone di lavaggio 1X in ciascun pozzetto della piastra. Coprire con un nuovo copripiastra e agitare
mediante vortex. Centrifugare a 1.300 g per 5 minuti.
8. Rimuovere il tampone di lavaggio dai pozzetti della piastra scuotendo le piastre manualmente (flicking) o con aspirazione
a vuoto.
9. Ripetere le fasi 7 e 8.
10. Diluire 1 µl per test di IgG antiumane coniugate con PE 100X (n. di cat. LS-AB2) con 99 µl di tampone di lavaggio 1X per
ottenere una soluzione 1X.
11. Aggiungere 100 µl di IgG antiumane coniugate con PE 1X in ciascun pozzetto. Coprire con il copripiastra e agitare
mediante vortex. Incubare per 30 minuti al buio a 20–25 °C scuotendo delicatamente la miscela.
12. Centrifugare a 1.300 g per 5 minuti.
13. Rimuovere le IgG antiumane coniugate con PE 1X dai pozzetti della piastra scuotendo le piastre manualmente (flicking)
o con aspirazione a vuoto.
14. Ripetere due volte le fasi 7 e 8.
15. Aggiungere 80 l di PBS 1X in ciascun pozzetto. Coprire con un nuovo copripiastra e agitare mediante vortex. Il campione
è pronto per l'acquisizione e l’analisi dei dati, oppure può essere conservato a 2–5 °C al buio per un massimo di 24 ore prima
dell'analisi.
C. Per completare il test in una piastra filtrante a 96 pozzetti:
1. Diluire il tampone di lavaggio 10X (n. di cat. LSPWABUF) in acqua distillata per ottenere una soluzione 1X
(circa 3,2 ml/piastra/lavaggio).
2. Coprire con un copripiastra alcuni pozzetti della piastra, che rimarranno inutilizzati durante il test e che dovranno rimanere
asciutti. Pre-umettare i filtri nella piastra dispensando 300 l di tampone di lavaggio solo nei pozzetti che saranno utilizzati
per l’analisi.
3. Incubare la piastra per 10 minuti su un agitatore per piastre a bassa velocità.
4. Aspirare tutto il tampone di lavaggio dai pozzetti usando un collettore di vuoto Millipore. Non superare la pressione di
vuoto di 100 mmHg!
5. Aggiungere 5 µl di sfere LABScreen ® con 20 µl di siero del test per ciascun pozzetto della piastra.
a. Agitare mediante vortex o pipettare delicatamente su e giù per miscelare le sfere LABScreen ® PRA prima dell’uso.
b. Per ciascun batch di test, è necessario analizzare un siero di controllo negativo (OLI, n. di cat. LS-NC o equivalente)
per stabilire i valori di fondo.
c. Durante le fasi di dispensazione delle sfere e del campione, premere delicatamente i puntali delle pipette contro
i pozzetti della piastra filtrante per evitare la rottura dei filtri.
6. Incubare per 30 minuti al buio a 20–25 °C scuotendo delicatamente la miscela.
7. Aggiungere 275 µl di tampone di lavaggio in ogni pozzetto (potrebbe essere sufficiente una quantità inferiore a seconda del
volume del campione e delle sfere già nel pozzetto).
8. Accendere la pompa a vuoto. Non superare la pressione di vuoto di 100 mmHg! Premere con fermezza la piastra sul
collettore di vuoto. Assicurarsi che il liquido fuoriesca lentamente. Un vuoto rapido determina la perdita di sfere che
rimangono intrappolate nei fori della carta filtrante. Assicurarsi che tutto il liquido sia fuoriuscito dai pozzetti prima di
procedere alla fase di lavaggio successiva.
9. Ripetere 4 volte le fasi 7 e 8 precedenti.
10. Aggiungere 100 µl di IgG antiumane coniugate con PE 1X in ciascun pozzetto.
11. Incubare per 30 minuti al buio a 20–25 °C scuotendo delicatamente la miscela.
12. Ripetere cinque volte le fasi 7 e 8.
13. Aggiungere 80 l di PBS 1X in ciascun pozzetto.
14. Leggere il campione sull’analizzatore LABScan 100 regolando, se necessario, l’altezza della sonda.
D. Test combinati:
1. Uno qualunque dei protocolli precedenti può essere utilizzato per un test combinato per alcuni prodotti (vedere Tabella di
combinazione delle sfere LABScreen ® sul sito Web di One Lambda, Inc. per le combinazioni di lotti accettabili).
2. Per il test combinato di classe I e di classe II (OLI, n. di cat. LS12PRA) utilizzare 5 l di ciascuna sospensione di sfere con
40 l di siero del test.
3. Per combinare qualsiasi coppia di gruppi di sfere con antigeni singoli, utilizzare 5 l di ciascun gruppo di sfere e 20 l di
siero del test.
4. Per combinare qualsiasi terna di gruppi di sfere con antigeni singoli, utilizzare 5 ul di ciascun gruppo di sfere e 30 ul di siero
del test.
Nota: È possibile miscelare prima volumi uguali di sfere. Quindi erogare la quantità appropriata aggregata (10 o 15 ul) di miscela di sfere per
ciascun test.
5. I gruppi LABScreen ad antigene singolo di Classe I Combi e Classe II non possono essere combinati in quanto gli ID delle
microsfere si sovrapporrebbero.
6. Le opzioni per le combinazioni di microsfere e le quantità da erogare sono elencate nella Tabella seguente.
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ID catalogo Volume di Microsfere di Volume di campione
microsfere per test controllo (NC/PC) per test
LS12PRA (microsfere CI e CII) 5 l + 5 l Incluse 40 l
LS1A01, LS1A02, LA1A03
(qualsiasi combinazione di due)
5 l + 5 l 5 l 20 l
LS1A01, LS1A02, LA1A03
(tutti e tre)
5 l + 5 l + 5 l 5 l * 30 l*
LS1A04 5 l Incluse 20 l
Vedere l’opzione D.3 nel seguito.
E. Singoli LABScreen®:
Il dosaggio è essenzialmente uguale a quello descritto in precedenza. Tuttavia, notare quanto segue:
1. Utilizzare le sfere singole per le situazioni in cui si desidera esaminare le reazioni contro un solo antigene o pochi antigeni
singoli.
2. Quando si analizzano 1 o 2 sfere singole, aggiungere 5 μl delle sfere singole selezionate e 5 μl di sfere di controllo singole
LABScreen® (NC/PC) a ciascuna provetta, con 20 μl di siero del test.
3. Opzionale: se si combinano più di due microsfere singole, centrifugare la miscela (più i controlli) a 5.000 g per 5
minuti, aspirare il sopranatante lasciando 5 l di sopranatante. Risospendere le microsfere. Quindi aggiungere 20 μl di siero
del test.
3. Per l’acquisizione dei dati, selezionare il modello di gruppo antigene singolo Classe I Combi o Classe II LABScreen, a
seconda dell’opportunità. Continuare a raccogliere dati su ciascun campione fino a raggiungere il timeout automatico.
4. Se non si analizza un siero di controllo negativo, utilizzare i valori predefiniti LS-NC pubblicati nella scheda tecnica LS-NC
per sfere antigene singolo di Classe I Combi o Classe II con LABScreen ® per calcolare il rapporto NBG.
Nota: Le sfere singole di Classe I e Classe II non vanno combinate.
RISULTATI
A. Acquisizione dei dati
1. Impostare il LABScan 100 per l’acquisizione dei campioni e la calibrazione secondo il Luminex User’s Manual 1.
2. Scegliere un template in base al numero di catalogo del kit di prodotti e al numero di lotto.
a. I template di acquisizione sono disponibili presso OLI su CD o scaricandoli dal nostro sito web.
b. Per creare un proprio template di acquisizione, seguire le istruzioni nel capitolo Acquisition del Luminex Users
Manual.
3. Creare un nome file per i campioni da analizzare.
4. Assicurarsi che tutte le impostazioni del template siano corrette. Le specifiche tecniche del template sono:
a. Volume del campione (Sample volume) impostato su 50 uL.
b. Time-out del campione (Sample time-out) impostato su 80 secondi.
c. Porta di discriminazione doppia (Doublet discriminator gate) impostata su 8000 (limite inferiore) e 16000 (limite
superiore).
d. Numero e ID delle sfere selezionate secondo il foglio di lavoro specifico del prodotto e fornito con lo stesso.
e. Numero minimo di eventi acquisiti impostato su 100 per ogni sfera.
f. Portata impostata a FAST se si sta utilizzando Luminex ® Versione 1.7 (ciò non vale per le versioni Luminex ® IS).
5. Inserire gli ID dei campioni. Attenzione: se lo stesso campione viene analizzato più di una volta, occorre assegnare un ID
diverso.
6. La piastra è ora pronta per l’analisi.
7. Caricare la piastra sulla piattaforma XY e riempire il serbatoio con l’apposito fluido (sheath fluid).
8. Fare clic sul pulsante di avvio per avviare la sessione. Al termine dell’analisi dei campioni, i dati generati devono essere
salvati in un file .csv.
9. Al termine della sessione, lavare due volte l’apparecchio con lo sheath fluid.
B. Analisi dei dati
1. È possibile valutare la reattività di ogni siero con il segnale fluorescente per ciascuna sfera coattata con HLA dopo la
correzione per il legame non specifico alla sfera di controllo negativa (NC, n. 001). Tutti i dati vengono normalizzati in base
ai risultati ottenuti con il siero di controllo negativo (OLI, n. di cat. LS-NC).
2. La reattività del campione del test viene calcolata in base ai valori di fluorescenza , che possono essere ricavati dal file .csv.
3. Per LABScreen® PRA, LABScreen® antigene singolo o LABScreen® singoli, il valore fluorescente normalizzato per
ciascuna sfera coattata con HLA è uguale al valore di tale sfera diviso per il valore della sfera NCPer LABScreen® Mixed,
il segnale fluorescente normalizzato è uguale al valore della sfera coattata di classe I o di classe II meno il valore della sfera
NC.
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4. Il valori di fondo per ciascuna sfera HLA e per la sfera NC si ottengono eseguendo l’analisi con un siero di controllo
negativo.
5. La concentrazione della reattività anti-HLA è assegnata dal rapporto di fondo normalizzato (rapporto NBG - normalized
background ratio). Consultare i calcoli sottostanti.
Nota: il segnale fluorescente (valore) può essere la media compensata o il valore mediano.
C. Calcoli
1. Le abbreviazioni utilizzate in questa sezione sono definite qui sotto:
Rapporto NBG Normalized Background ratio utilizzato per assegnare la concentrazione di ogni reazione anti-HLA
S#N Valore di fluorescenza specifico del campione, Sample-specific, per la sfera #N
SNC bead Valore di fluorescenza specifico del campione, Sample-specific, per la sfera di controllo negativa,
Negative Control bead
BG#N Valore di fluorescenza specifico del siero NC di fondo, Background, per la sfera #N
BGNC bead Valore di fluorescenza specifico del siero NC di fondo, Background, per la sfera di controllo negativa,
Negative Control bead
NC Serum Negative Control Serum (OLI, n. di cat. LS-NC) validato per un determinato lotto di sfere LABScreen ®
2. Per prodotti LABScreen ® PRA o LABScreen ® antigene singolo o singoli:
NBG ratio =
Per LABScreen ® Mixed:
NBG ratio =
S#N / SNC bead
BG#N / BGNC bead
S#N - SNC bead
BG#N - BGNC bead
Nota: Se (sfera BG#N-BGNC) 8, applicare il calcolo descritto al punto 2c.
(2) Se [rapporto NBG max/rapporto NBG min] 5, il rapporto NBG min deve essere regolato sulla metà del rapporto NBG max e il
rapporto NBG relativo va ricalcolato (come descritto al punto 2c) in base al rapporto NBG modificato. Alla
reazione si assegna quindi il punteggio come illustrato sopra.
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ii. rapporto NBG max 1,5 nel test LABScreen ® PRA si correlano adeguatamente a reazioni positive nel
test FlowPRA®.
3. Per il calcolo del PRA (Panel Reactive Antibody) in %, dividere il numero delle reazioni positive per il numero complessivo
di reazioni valide per ciascun siero di test.
4. Per stabilire la specificità dell'anticorpo HLA, immettere il punteggio della reazione nel foglio di lavoro specifico
e analizzare il pattern della reazione.
B. LABScreen ® Mixed
1. Assegnare un punteggio alle reazioni HLA di classe I e di classe II separatamente, in base al livello di reattività del siero per
ciascun gruppo di sfere.
2. Se qualche sfera del dosaggio Mixed è positiva, è necessario assegnare un risultato positivo.
3. I nostri dati mostrano che rapporti NBG > 2,2 nel test LABScreen ® Mixed si correlano adeguatamente a reazioni positive nel
LAT Mixed.
C. Prodotti con antigene singolo e singoli LABScreen ®
1. Gli allosieri possono produrre rapporti segnale/fondo molto superiori a quelli ottenuti nel dosaggio PRA. Stabilire cut-off del
dosaggio mediante il rapporto NBG relativo (come descritto in Risultati, sezione D-2c) è l’unico modo per normalizzare i dati.
2. I nostri dati mostrano che un cut-off positivo/negativo o un rapporto NBG relativo >15% del rapporto NBG compreso nel
range di lavoro calcolato per ciascun siero di test genera risultati confrontabili al dosaggio LABScreen ® PRA.
3. La reattività delle singole microsfere individuali dovrebbe essere simile alle microsfere corrispondenti nei gruppi di antigeni singoli
Classe I Combi e Classe II. II
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D. Linee guida generali
1. Ogni conteggio di sfere deve essere superiore a 50. Un conteggio di sfere inferiore può essere dovuto a perdita di campione
durante le fasi di lavaggio. Potrebbe anche essere dovuto a una calibrazione impropria o a ostruzione del LABScan 100.
Un conteggio di sfere basso può anche essere causato da sfere fotodecolorate che sono rimaste fuori dalla regione mappata.
2. I valori del segnale sono l'intensità di fluorescenza di ciascun gruppo di sfere rispetto al siero del test. Con lo stesso batch
di campioni è necessario analizzare un siero di controllo negativo per stabilire valori di fondo per la sessione di analisi.
3. Si raccomanda il siero di controllo negativo (OLI, n. di cat. LS-NC o equivalente). L’uso di un altro siero di controllo
negativo può richiedere la regolazione dei valori di cut-off.
4. Le sfere di controllo negative (Ag ID = NC) non sono coattate con antigene HLA. Il valore di fluorescenza può variare tra
sieri diversi a causa del legame non specifico dei sieri o di un lavaggio insufficiente. Il valore NC è solitamente inferiore a
500 fatta eccezione per i campioni di siero con un fondo elevato. Deve sempre essere inferiore a 1500 e inferiore o uguale
a metà del valore PC.
5. Le sfere di controllo positive (Ag ID = PC) sono sfere coattate con IgG umane purificate. Per produrre un segnale positivo,
devono legarsi all’anticorpo secondario. Il valore PC deve essere superiore a 500 e come minimo il doppio del valore NC.
E. Convalida del dosaggio
1. Se si utilizza un nuovo siero di controllo negativo, è necessario validare il valore di cut-off del segnale rispetto al fondo.
2. Per un determinato siero, il valore per PC/NC deve essere maggiore di 2. Un valore inferiore può essere dovuto a un valore
di fondo molto alto della sfera NC per il siero del test, un segnale elevato della sfera HLA per il controllo NS, o un segnale
basso proveniente dall’anticorpo secondario o dal sistema LABScan 100. In tal caso, può essere necessario confermare i
dati.
3. Ogni operatore deve valutare la performance del dosaggio nel proprio laboratorio per validare i cut-off selezionati.
4. I campioni di plasma possono dare un FI minore o valori di fondo maggiori del siero. L’utente potrebbe voler normalizzare
i dati se i risultati di confronto tra i campioni di siero e di plasma (vedere riferimento 5) per gli stessi soggetti del test o per
soggetti diversi.
LIMITI DELLA PROCEDURA
A. I campioni di plasma o di siero che contengono contaminanti o aggregati possono ostruire il LABScan 100 e generare dati non
accurati. Gli aggregati presenti nel campione del test devono essere rimossi mediante centrifugazione o filtrazione del siero
prima dell’analisi.
B. La temperatura dell’ambiente in cui il LABScan 100 è situato può influire sulla calibrazione dell’apparecchio. Se la temperatura
cambia, può essere necessario ricalibrare l’apparecchio. Per ulteriori informazioni al riguardo consultare il manuale del produttore.
C. L’accuratezza dell’acquisizione dei dati dipende dal corretto funzionamento del LABScan 100. L’apparecchio deve essere
calibrato correttamente e sottoposto a una adeguata manutenzione. Se il sistema non è sciacquato adeguatamente, gli aggregati
presenti nel campione possono creare ostruzioni nell’apparecchio e causare la generazione di dati non validi.
D. L’assegnazione della specificità anticorpale è limitata agli antigeni HLA presentati in ciascun pannello di sfere (consultare il
foglio di lavoro specifico del lotto).
CARATTERISTICHE DEL TEST
A. Usando i cut-off di analisi cui si è fatto riferimento sotto Valori attesi, i dosaggi LABScreen ® hanno dato risultati
confrontabili ai risultati dei dosaggi One Lambda FlowPRA ® e Lambda Antigen Tray. Tuttavia, i pattern degli anticorpi
HLA possono essere alquanto complessi. Un determinato campione di test può contenere diverse specificità di anticorpi HLA
di classe I e di classe II, ciascuna con una diversa avidità; tuttavia, non tutte le specificità saranno riconosciute in dosaggi con
una sensibilità inferiore. Quindi, ogni laboratorio deve stabilire e validare cut-off di analisi propri in base alla propria
esperienza nel riconoscimento dei pattern CREG HLA e a una valutazione della performance dell’analisi mediante allosieri
HLA con specificità definite.
B. Il confronto del siero rispetto al plasma per 1.000 donatori di sangue nello studio NIHLBI REDS-II (5) ha mostrato una buona
correlazione nel range di lavoro del dosaggio. Per gli anticorpi anti-HLA CI e CII i valori R2 erano rispettivamente 0,88 e 0,91.
Tuttavia, il rapporto NBG era in genere 1,3 volte maggiore per i campioni di siero.
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RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI
1. Il Manuale per l’utente Luminex® 100 o 200, Luminex Corporation, NP 89-00002-00-005 o NP 89-00002-00-109.
2. R Pei, J-H Lee, T Chen, S Rojo, and PI Terasaki. Flow Cytometric Detection of HLA Antibodies Using a Spectrum of Microbeads.
Human Immunology 60, 1293-1302 (1999).
3. R Pei, G Wang, C Tarsitani, S Rojo, T Chen, S Takemura, A Liu, and J-H Lee. Simultaneous HLA Class I and Class II antibodies
screening with flow cytometry. Human Immunology 59, 313-322 (1998).
4. RA Bray, DA Sinclair, L Wimoth-Hosey, C Lyons, P Chapman and J Holcomb. Significance of the flow cytometric PRA in the
evaluation of patients awaiting renal transplantation. Department of Pathology, Emory University, Atlanta, GA. ASHI abstract,
1998.
5. PJ Norris, J-H Lee, D Carrick, JL Gottschall, M Lebedeva, R De Castro, SH Kleinman, and MP Bish. Long-term in vitro
reactivity for HLA antibodies and comparison of detection using serum vs. plasma. Transfusion. In stampa (2008).
MARCHI COMMERCIALI E RESPONSABILITÀ LIMITATA
LABScan e Lambda Antigen Tray sono marchi commerciali di One Lambda, Inc.
Luminex è un marchio commerciale di Luminex Corporation.
® FlowPRA, LABScreen e LABMAS sono marchi registrati di One Lambda, Inc.
Tutti i prodotti One Lambda sono indicati in ausilio agli operatori esperti nell’analisi di HLA in quanto suggeriscono risultati di
tipizzazione o assegnazioni di anticorpi. Tutti i risultati dei test devono essere esaminati attentamente da operatori qualificati che ne
garantiscano la correttezza.
RAPPRESENTANTE AUTORIZZATO PER L’EUROPA
MDSS GmbH, Schiffgraben 41, D-30175, Hannover, Germania
CRONOLOGIA DELLE REVISIONI
Revisione Data Descrizione della revisione
9 2005/04 Cambiare i volumi di campione di lavaggio per adeguarli al metodo della piastra. Aggiungere al documento la cronologia delle
revisioni. Aggiungere l'ID con n. catalogo (LS1A03, LS2A01). Chiarire i vincoli sui test di combinazione.
9A 2005/07 Correzione di un errore tipografico a Risultati, sezione D, passo 1A.
10 2006/02 Rivedere le istruzioni per il combinato. Rimuovere i riferimenti ai valori fluorescenti mediani. Vedere le istruzioni a pagina 4,
sezione D, pagina 5, sezione B e C e sezione Risultati, passo A.
11 2006/06 Aggiungere riferimento alla Tabella di combinazione delle sfere LABScreen alla sezione ‘Modalità d’uso’, passaggio D.1.
11A 2006/12 Numero di catalogo.
12 2007/01 Aggiungere informazioni per i nuovi prodotti con antigene singolo e singoli. Modificare l’ID del documento.
13 2008/09 Modificare la temperatura di conservazione delle sfere LABScreen dopo lo scongelamento, sezione reagenti D.2.
14 2008/11
Aggiornare le condizioni di conservazione per il tampone di lavaggio. Aggiungere un messaggio di attenzione relativo allo
scuotimento. Aggiungere il software consigliato. Aggiungere il plasma come campione di test, l’anticoagulante e le condizioni di
conservazione del campione. Aggiungere le note procedurali (n. 3-4). Notare la differenza tra plasma e siero nei Valori attesi
(E4) e nelle Caratteristiche del test (B). Aggiungere NP per il manuale dell’utente Luminex 200 e il n. 5 alla Bibliografia.
Correzione/chiarimenti nelle frasi. Aggiungere tabella nelle Istruzioni per l’uso (C).
15 2009/05 Modificare il riferimento a pagina 4, punto 12 dai passaggi 6-7 a 7-8.
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