Lambda Cell Tray, FRENCH VERSION - One Lambda

One Lambda, Inc.
21001 Kittridge Street, Canoga Park, CA 91303-2801 États-Unis | Tél : +1 818.702.0042 Fax : +1 818 702.6904 | www.onelambda.com
NOTICE DE PRODUIT
LAMBDA CELL TRAY
Références catalogue LCT1W30, LCT1W60, LCT1W72
Uniquement pour le Diagnostic In Vitro.
APPLICATION
Ce produit est destiné à la détection des anticorps anti-HLA par le test de microcytotoxicité dépendant du complément.
RÉSUMÉ ET EXPLICATION
Les plaques Lambda Cell Tray (LCT) permettent la détection des anticorps anti HLA cytotoxiques. Chaque puits contient environ
1 µl de lymphocytes humains en suspension dans un mélange de congélation exclusif contenant du sulfoxyde diméthylique
(DMSO) dans un milieu Mc Coy. Pour empêcher l'évaporation, 5 µl d'huile minérale visqueuse ont été ajoutés à chaque puits.
En plus d'un contrôle positif et négatif, les plaques LCT Classe I contiennent des lymphocytes T représentant les antigènes
HLA-A, -B et -C de donneurs sélectionnés. La plaque LCT1W30 permet de tester deux échantillons, dans les rangées 1 à 5
ou 6 à 10. Les plaques LCT1W60 et LCT1W72 permettent de tester un échantillon.
Des sérums contrôle positif et contrôle négatif doivent être testés avec chaque série de plaques LCT. Le sérum contrôle
positif permet de déterminer la réactivité cellulaire. Comme témoin positif, on peut utiliser un sérum antilymphocytaire de
lapins ou de souris (anticorps monoclonal antilymphocytaire) ou un sérum humain à PRA élevé. Le sérum contrôle négatif
permet de déterminer la viabilité des lymphocytes. L'antisérum de contrôle négatif doit provenir d'individus de sexe masculin
étant du groupe sanguin AB. En outre, il ne doit présenter aucune réactivité cytotoxique au cours des tests effectués sur des
lymphocytes de donneurs pris au hasard.
PRINCIPE(S)
Des lymphocytes portant des antigènes connus sont incubés avec un sérum inconnu et du complément de lapin. Si le sérum
contient des anticorps capables de se lier spécifiquement aux antigènes présents à la surface des lymphocytes, une cytolyse
médiée par le complément se produit. Si le sérum inconnu contient des anticorps anti-HLA, ces derniers peuvent être caractérisés.
RÉACTIFS
A. Identification
Chaque puits de la plaque contient environ 3 000 à 4 000 lymphocytes humains congelés. Pour empêcher l'évaporation, 5 µl d'huile
minérale visqueuse ont été ajoutés à chaque puits.
B. Avertissement et précaution
1. Uniquement pour le Diagnostic In Vitro.
2. Avertissement : Tous les produits à base de sang doivent être manipulés comme des produits potentiellement infectieux. Le
matériel source dont est dérivé ce produit s’est révélé négatif aux tests requis par la FDA. Toutefois, aucune méthode d’analyse
connue ne peut garantir que des produits dérivés du sang humain ne transmettront pas d’agents infectieux.
3. Se reporter à la fiche de sécurité pour des informations détaillées.
C. Mode d'emploi
Se reporter au « Mode d’emploi ».
D. Mode de conservation
1. Conserver les réactifs à la température indiquée sur l'emballage. Les utiliser avant la date de péremption imprimée sur
l’emballage.
2. LCT1W30, LCT1W60 et LCT1W72: : Ces plaques doivent être conservées au bas d'un congélateur, à une température égale
ou inférieure à -65 C, pendant toute la durée de vie du produit (environ six mois). Ne pas les conserver en phase vapeur d’azote
liquide.
3. Ne pas recongeler. Ne pas conserver dans la carboglace.
E. Purification ou traitement nécessaire
Les plaques LCT doivent être lavées avant utilisation. Se reporter au « Mode d’emploi » ci-dessous.
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F. Indications concernant l’instabilité
La contamination bactérienne et/ou l'exposition au gaz carbonique peuvent changer le pH des cellules en suspension. Cela se traduit
par une coloration jaune des cellules en suspension. Dans ce cas, jeter les plaques.
COLLECTE ET PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS
Le test nécessite 1 ml de sérum. Prélever 5 ml de sang dans un tube Vacutainer rouge (sans anticoagulant), vert (héparine de sodium),
violet (EDTA) ou jaune (ACD).
Préparation des échantillons de sérum et de plasma
A. Tubes à bouchon rouge : Comme ils ne contiennent aucun coagulant, un caillot de globules rouges doit se former. Enlever le caillot
avec un bâtonnet plat en bois et centrifuger le tube pendant 10 minutes à 1 000 g. Transférer le sérum dans un tube propre.
B. Tubes à bouchon vert : Centrifuger le tube pendant 10 minutes à 1 000 g. Prélever le plasma et le mettre dans un tube de taille
appropriée. Ajouter 2 gouttes de thrombine de bovins (1 000 unités internationales par ml) par ml de plasma.Bien mélanger et enlever
le caillot de fibrine. Centrifuger le tube pendant 10 minutes à 1 000 g. Transférer le sérum dans un tube propre.
C. Tubes à bouchon violet et jaune : Centrifuger l'échantillon pendant 10 minutes à 1 000 g. Prélever le plasma et le mettre dans un
tube de taille appropriée. Ajouter 1 goutte de chlorure de sodium (1% de solution par poids) par ml de plasma. Bien mélanger. Ajouter
2 gouttes de thrombine de bovins (1 000 unités internationales par ml) par ml de plasma. Bien mélanger et enlever le caillot de fibrine.
Centrifuger le tube pendant 10 minutes à 1 000 g. Transférer le sérum dans un tube propre.
PROTOCOLE
A. Matériel fourni
1. Lambda Cell Tray
2. Feuilles de travail avec les spécificités antigéniques
3. Mode d'emploi
B. Matériel nécessaire non fourni
1. Microscope à contraste de phase inversé avec objectif 40x.
2. Microseringues
3. Table lumineuse avec tube fluorescent
4. Lames de recouvrement ou de verre Insta-Seal (réf. cat. OLI TIS250U) et huile (Vaseline)
5. McCoy 5A avec 5% de Sérum de Veau Fœtal Inactivé
6. Réactifs de coloration et de fixation
a. Pour le test d'exclusion de colorant : Éosine Y (à base de sodium) et formaldéhyde ou Stain-Fix (réf. cat. OLI SF-500)
b. Pour le test de fluorescence : FluoroQuench AO/EB (réf. cat. OLI FQAE-500)
7. Contrôles positif et négatif
8. Complément de lapin
9. Solution de chlorure de calcium (CaC12)
10. Thrombine bovine, qualité U.S.P. (usage local)
11. Centrifugeuse Beckman TJ6 ou équivalente
12. Tubes de 5 ml
13. Pipettes
14. Poirettes
15. Tubes Beckman
16. Bâtonnets plats en bois
C. Protocole détaillé
Se reporter au « Mode d’emploi ».
MODE D’EMPLOI
Pour obtenir des résultats optimums, suivre scrupuleusement ce protocole. Utiliser les plaques avant la date de péremption imprimée
sur l'emballage.
A. Mode d’emploi pour le dépistage HLA Classe I
1. LCT1W30, LCT1W60 et LCT1W72 seulement : décongeler les plaques à 37 C pendant 5 minutes.
2. Dans chaque puits, ajouter 20 µl de milieu à 20 à 25 C de McCoy 5A + 5% de Sérum de Veau Fœtal Inactivé (on peut également
utiliser du RPMI) et flicker.
LCT1W30 et LCT1W60 et LCT1W72 seulement : Dans chaque puits, ajouter 20 µl de milieu à 37 C de McCoy 5A +5% Sérum de
Veau Fœtal Inactivé (on peut également utiliser du RPMI). Incuber pendant 5 à 10 minutes à 20 -25 C et flicker.
*Pour flicker, tenir la plaque horizontalement, face vers le haut, et la tourner d'un coup sec dans le sens contraire des aiguilles d'une
montre. Le DMSO résiduel risque d’entraîner des problèmes de viabilité.
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Remarque : Si le DMSO et le milieu ne peuvent pas être entièrement éliminés par la technique du flickage sans que cela
entraîne la perte de lymphocytes, centrifuger au préalable la plaque pendant 30 secondes à 850 - 1 000 g. Cela peut
occasionner l’adhésion de lymphocytes au fond du puits. Tapoter la plaque pour éviter la perte de cellules.
.
3. Ajouter environ 5 µl d'huile minérale à chaque puits pour empêcher l'évaporation.
4. Ajouter 1 µl de sérum à chaque puits. Ne pas ajouter de sérum aux puits contrôle, mais ajouter 1 l de milieu McCoy 5A +
5 % de Sérum de Veau Fœtal Inactivé.
5. Mélanger avec un mélangeur électrostatique ou un fil.
6. Incuber la plaque à température ambiante (20 à 25 C) pendant 30 minutes.
7. Ajouter 5 µl de complément ABC de lapin à chaque puits.
8. Incuber les plaques à température ambiante (20 à 25 C) pendant 1 heure.
9. Après incubation, colorer et fixer les cellules :
a. Pour les tests d'exclusion de colorant, ajouter à chaque puits :
5 µl de colorant éosine, puis, deux minutes plus tard, 5 µl de formaldéhyde, ou
10 µl de Stain-Fix (réf. cat. OLI SF-500)
b. Pour le test de fluorescence, ajouter 5 µl de FluoroQuench AO/EB (réf. cat. OLI FQAE-500) à chaque puits.
10. Couvrir les plaques avec des lamelles Terasaki Insta-Seal (réf. cat. OLI TIS250U) Laisser les plaques pendant 15 minutes à la
température ambiante pour permettre aux lymphocytes de se déposer. Les plaques d'exclusion de colorant peuvent être
conservées pendant 2 semaines maximum à 2 -5 C. Les plaques de fluorescence peuvent être conservées à l’abri de la lumière,
entre 2 et 5 C, pendant 2 jours maximum. Les plaques recouvertes de lamelles Terasaki Insta-Seal doivent être lues le jour du
test.
LIMITES DU PROTOCOLE
Ce test ne permet pas de détecter les anticorps non cytotoxiques. On peut aussi utiliser de l’Immunoglobuline de chèvre anti-humaine pour
augmenter la sensibilité de la cytotoxicité (réf. cat. OLI AHG1).
RÉSULTATS ET VALEURS ATTENDUES
Interprétation des résultats (de chaque échantillon) :
1. Sur la feuille de travail, enregistrer la viabilité cellulaire avec le sérum contrôle normal, et noter les réactions du sérum testé dans les
colonnes appropriées à côté des spécifications du panel.
2. Compter le nombre de réactions positives. Calculer le pourcentage de réactions positives et l’Indice de Force du sérum au moyen des
formules ci-dessous.
PRA (%Pos.) = Nombre de réactions positives x 100
Nombre de cellules du panel
Indice de Force = Nombre de réactions « 8 » x 100
Nombre de réactions positives
3. La méthode suivante permet de déterminer les spécificités HLA les plus probables présentes dans le sérum testé :
a. Marquer tous les antigènes présents des cellules positives pour obtenir un « sérogramme ».
b. Pour chaque antigène de la matrice, compter le nombre de réactions « positives » et l'inscrire sur la ligne « positive rxns. (++) »
sous la matrice. Si le nombre de réactions positives est supérieur à la moitié du nombre des antigènes présents dans le panel,
l’anticorps correspondant est très probablement présent dans le sérum.
c. Éliminer ensuite toutes les spécificités dont le schéma de réactivité est entièrement inclus dans le schéma de réactivité plus long.
Bien qu’une spécificité incluse puisse être présente, il sera nécessaire de tester ce sérum sur des cellules ne portant pas les
antigènes présents dans le schéma de réactivité plus long.
d. Les spécificités partiellement incluses doivent être contrôlées sur des cellules ne portant qu'un seul antigène reconnu par le
sérum, surtout si leur fréquence dans le panel est faible.
e. Pour chacune des spécificités probables restantes, compter le nombre de faux positifs (réactions positives qui n'incluent pas
l'antigène donné) et le noter sur la ligne « faux positifs (-/+) » au-dessous de la liste d’antigènes. Puis compter le nombre de faux
négatifs et le noter sur la ligne « faux négatifs (+/-) ».
f. Pour chaque spécificité, calculer le coefficient de corrélation r.
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r = (AD) - (BC) .
[(A+B)(C+D)(A+C)(B+D)] 1/2
A = Nombre de cellules portant l'antigène et positives avec le sérum
B = Nombre de cellules portant l'antigène et négatives (faux négatif)
C = Nombre de cellules ne portant pas l'antigène et positives (faux positifs)
D = Nombre de cellules ne portant pas l'antigène et négatives avec le sérum
Remarque : Un sérum avec une valeur r égale ou supérieure à 0,85 peut être utilisé comme réactif de typage.
g. Si le sérum contient plus d'une spécificité, calculer le pourcentage d'inclusion, c’est-à-dire le degré auquel une spécificité donnée
est incluse dans le sérum. La valeur abaissée du r n’est plus significative.
Indice d'inclusion pour une spécificité donnée =
Nombre de cellules positives portant l'antigène x 100
Nombre total de cellules portant l'antigène
h. Analyses facultatives - logiciel HLA Fusion
CARACTÉRISTIQUES DE PERFORMANCE SPÉCIFIQUE
Le typage HLA Classe I des lymphocytes T a été effectué sur des plaques de typage HLA ABC d’allosérum humains ainsi que sur des
plaques d’anticorps monoclonaux de Classe I. Le typage HLA Clase II des lymphocytes B a été effectué sur des plaques de typage HLA
d'allosérum humains ainsi que sur des plaques d’anticorps monoclonaux de Classe II. Chaque lot de plaques de cellules est contrôlé sur 5
antisérums connus et le sérum contrôle positif donne une lyse cellulaire de 80 % minimum.
BIBLIOGRAPHIE
Amos, D.B., Pool, P., and Grier, J.O. HLA Typing. In Manual of Clinical Immunology, Noel Rose and Herman Friedman, eds., Amer. Soc.
for Microbiology, Washington, D.C., 1980.
REPRÉSENTANT EUROPÉEN AUTORISÉ
MDSS GmbH, Schiffgraben 41, D-30175, Hanovre, Allemagne
Révision Date Description des révisions
12 2008/10 Clarification des unités de thrombine et spécification de la qualité USP de la thrombine de bovins.
13 2009/04 NPD148, suppression de LCT30ABC, LCT60ABC et LCT72ABC ; ajout de LCT1W72
14 2013/05
Addition du logiciel Fusion comme option d’Analyse. Suppression du LCT-30D. Suppression d'une phrase dans
les paragraphes Application, Conditions de conservation/étape 2, Mode d’emploi/étape 1 sous étape A/étape B,
et suppression d'une phrase dans la section Caractéristiques de performance spécifique. Mise à jour des entêtes
des pages 1 et 2.
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