Lambda Cell Tray, GERMAN VERSION - One Lambda

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PRODUKTINFORMATION
LAMBDA CELL TRAY
Best.-Nrn. LCT1W30, LCT1W60, LCT1W72
Für die In-vitro-Diagnostik.
VERWENDUNGSZWECK
Für die Verwendung beim Nachweis von HLA-Antikörpern mittels dem komplementabhängigen Mikrozytoxizitätstest.
ZUSAMMENFASSUNG UND ERLÄUTERUNG
Die Lambda Cell Trays (LCT) werden verwendet, um das Vorliegen HLA-zytotoxischer Antikörper nachzuweisen. Jede Vertiefung
auf dem Tray enthält ca. 1 µl Humanlymphozyten in einem firmeneigenen Gefriermediumgemisch, welches Dimethylsulfoxid (DMSO) in
McCoy-Medium enthält.Um eine Verdunstung zu verhindern, wird 5 µl schweres Mineralöl in jede Vertiefung gegeben.
Die Trays LCT Klasse I enthalten T-Zellenlymphozyten, die die Locusantigene HLA-A, -B und -C von ausgewählten
Personen zusätzlich zu negativen und positiven Kontrollen enthalten. LCT1W30 kann verwendet werden, um zwei Proben
mit jeder Probe zu verarbeiten, die entweder den Reihen 1-5 oder 6-10 zugeordnet sind. LCT1W60 und LCT1W72 können
zur Verarbeitung einer Probe verwendet werden.
Die Trays LCT Klasse II enthalten B-Zellen-Lymphozyten, die zusätzlich zu einer positiven und negativen Kontrolle die
Antigene HLA DR, DQ enthalten. Diese B-Zellen-Lymphozyten wurden von Personen mit chronischer lymphozytischer
Leukämie isoliert. LCT30D kann zur Verarbeitung von zwei Proben verwendet werden, wobei jede Probe entweder den
Reihen 1-5 oder 6-10 zum Testen zugeordnet ist.
Mit jeder Charge von getesteten LCT-Trays sollten positive und negative Kontrollseren gefahren werden. Das positive
Kontrollserum dient zur Bestimmung der Zellreaktivität. Die positive Kontrolle kann ein in Kaninchen oder Mäusen
hergestelltes Antilymphozytserum sein; es handelt sich um einen monoklonalen Antilymphozyt-Antikörper oder ein
Humanserum mit hohem PRA. Das Negativkontrollserum wird zur Bestimmung der Lebensfähigkeit der Lymphozyten verwendet.
Dieses Negativkontroll-Antiserum muss von einem gesunden Mann mit der Blutgruppe AB stammen und darf keine zytotoxische
Reaktivität in Tests mit irgendwelchen Lymphozytenspendern aufweisen.
PRINZIP(IEN)
Lymphozyten mit bekannten Antigenen werden mit einem unbekannten Serum und Kaninchen-Komplement inkubiert. Falls das Serum
Antikörper enthält, die speziell die auf der Lymphozytoberfläche befindlichen Antigene binden können, kann eine komplementvermittelte
Zytolyse auftreten. Wenn das unbekannte Serum HLA-Antikörper enthält, können diese charakterisiert werden.
REAGENZIEN
A. Charakterisierung
Jede Vertiefung auf dem Tray enthält ungefähr 3.000 – 4.000 gefrorene humane Lymphozyten pro Vertiefung. Um eine Verdunstung
zu verhindern, wird 5 µl schweres Mineralöl in jede Vertiefung gegeben.
B. Warnhinweise und Vorsichtsmaßnahmen
1. Für die In-vitro-Diagnostik.
2. Warnung: Alle Blutprodukte sind als potenziell infektiöses Material zu behandeln. Das Material, aus dem dieses Produkt
hergestellt ist, wurde bei Tests im Rahmen der derzeit von der FDA auferlegten Tests als negativ befunden. Es kann jedoch keine
Testmethode mit absoluter Sicherheit garantieren, dass aus menschlichem Blut hergestellte Produkte keine infektiösen
Substanzen übertragen.
3. Weitere Information entnehmen Sie bitte dem Sicherheitsdatenblatt.
C. Gebrauchsanleitung
Siehe „Gebrauchsanweisung“.
D. Lagerungshinweise
1. Reagenzien bei der auf der Verpackung angegebenen Temperatur lagern. Vor dem aufgedruckten Verfallsdatum verwenden.
2. Für LCT1W30 , LCT1W60, und LCT1W72: Die Trays müssen im unteren Fach des Gefrierschranks bei -65 C oder
niedriger für die gesamte Lagerungszeit des Produkts (ungefähr sechs Monate) aufbewahrt werden. Nicht in der Dampfphase von
flüssigem Stickstoff aufbewahren.
3. Nicht wieder einfrieren. Trays nicht in Trockeneis aufbewahren.
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One Lambda | Produktbeilage: Lambda Cell Tray
E. Reinigung und Vorbereitung
LCT-Trays müssen vor der Verwendung gewaschen werden. Siehe „Gebrauchsanweisung“ unten.
F. Anzeichen für Instabilität
Durch bakterielle Verunreinigung und/oder Exposition zu Kohlendioxid kann es zu veränderten pH-Werten der
Zellenaufschwemmungen kommen.Diese pH-Veränderung wird durch eine gelbe Farbe der Zellsuspension angezeigt. Tritt
eine solche Änderung ein, müssen die Trays entsorgt werden.
PROBENENTNAHME UND -VORBEREITUNG
Für Tests ist 1 ml Serum erforderlich. Dieses wird über die Entnahme von 5 ml Blut in ein rotes (ohne Antikoagulans), grünes
(Natriumheparin), violettes (EDTA) oder gelbes (ACD) Vacutainer-Röhrchen gewonnen.
Vorbereitung von Serum- und Plasmaproben
A. Röhrchen mit rotem Deckel: Da kein Antikoagulans vorhanden ist, sollte sich ein rotes Zell-Koagulum bilden. Das Koagulum mit
einem Holzapplikatorstäbchen entfernen. Das Röhrchen 10 Minuten lang bei 1000 g zentrifugieren. Das Serum in ein sauberes
Röhrchen geben.
B. Röhrchen mit grünem Deckel: Das Röhrchen 10 Minuten lang bei 1000 g zentrifugieren. Plasma in ein Röhrchen der
entsprechenden Größe pipettieren. Tropfen Rinderthrombin (1.000 internationale Einheiten/ml) pro ml Plasma hinzufügen. Gut
mischen und das Fibrin-Koagulum entfernen. Das Röhrchen 10 Minuten lang bei 1000 g zentrifugieren. Das Serum in ein sauberes
Röhrchen geben.
C. Röhrchen mit violettem und gelbem Deckel: Die Probe 10 Minuten lang bei 1000 g zentrifugieren. Plasma in ein Röhrchen der
entsprechenden Größe pipettieren. Dem Plasma 1 Tropfen Kalziumchlorid (1%ige Lösung nach Gewicht) pro ml Plasma zugeben.
Gründlich mischen. Tropfen Rinderthrombin (1.000 internationale Einheiten/ml) pro ml Plasma hinzufügen. Gut mischen und das
Fibrin-Koagulum entfernen. Das Röhrchen 10 Minuten lang bei 1000 g zentrifugieren. Das Serum in ein sauberes Röhrchen geben.
VERFAHREN
A. Mitgelieferte Materialien
1. Lambda Cell Tray(s)
2. Arbeitsblätter, die die Antigenspezifität identifizieren.
3. Gebrauchsanleitung.
B. Erforderliche, aber nicht mitgelieferte Materialien
1. Phasenkontrast-invertiertes Mikroskop mit 40x-Objektiv
2. Mikrospritzen
3. Leuchtkasten/Fluroeszierender Lichttisch
4. Insta-Seal (OLI Best.-Nr. TIS250U) Deck-Objektträger oder Glas-Objektträger und Petrolatum (Vaseline)
5. 5 % HIFCS McCoy 5A
6. Färbungs- und Fixierreagenzien
a. Für Farbstoffauschlusstests: Eosin Y (Natriumbasis) und Formaldehyd oder Stain-Fix (OLI Best.-Nr. SF-500).
b. Für Fluoreszenztests: FluoroQuench AO/EB (OLI Best.-Nr. FQAE-500)
7. Positiv- und Negativkontrollen
8. Kaninchen-Komplement
9. Kalziumchlorid-Lösung (CaC12)
10. Bovines Thrombin,Topische USP-Güte.
11. Beckman TJ6 Zentrifuge oder Äquivalent
12. 5 ml Röhrchen
13. Pipetten
14. Kolben
15. Beckman-Röhrchen
16. Holzapplikatorstäbchen
C. Arbeitsanleitung.
Siehe „Gebrauchsanweisung“.
GEBRAUCHSANWEISUNG
Für optimale Ergebnisse müssen diese Verfahren streng eingehalten werden. Trays vor dem auf der Verpackung aufgedruckten
Verfallsdatum verwenden.
A. Anweisungen für HLA-Klasse-I-Screening
1. Nur für LCT1W30, LCT1W60 und LCT1W72: Trays 5 Minuten bei 37 C auftauen.
2. 20 µl 20-25 C 5 % HIFCS McCoy 5A Medium (RPMI kann auch verwendet werden) in jede Vertiefung zugeben und
anschnippen.
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One Lambda | Produktbeilage: Lambda Cell Tray
Nur für LCT1W30, LCT1W60 und LCT1W72: 20 µl 37 C 5 % HIFCS McCoy 5A Medium (RPMI kann auch
verwendet werden) in jede Vertiefung zugeben und bei 20-25 C 5-10 Minuten lang inkubieren und anschnippen.
*
Zum Anschnippen eine Schale in ebener aufrechter Position halten und die Schale gegen die Uhrzeigerrichtung scharf schnippen (für
Rechtshänder). Wird nicht alles DMSO entfernt, kann dies einige Lebensfähigkeitsprobleme verursachen.
Hinweis: Ist es nicht möglich, mit der Schnipp-Methode alles DMSO und Medium zu entfernen, ohne Lymphozyten zu
verlieren, Schale bei 850 - 1000 g 30 Sekunden zentrifugieren. Hierdurch können Lymphozyten am Boden der
Vertiefung anhaften. Anstoßen des Trays kann keinen Zellenverlust verursachen.
3. Ungefähr 5 µl Mineralöl in jede Vertiefung zugeben, um eine Verdunstung zu verhindern.
4. 1 µl Serum in jede Vertiefung hinzufügen. Kein Serum in die Kontrollvertiefungen geben. 1 l 5 % HIFCS McCoy 5A
Medium in die Kontrollvertiefungen hinzufügen.
5. Die Mikrotröpfchen mit einem elektrostatischen Mischer oder Draht zusammenmischen.
6. Die Schale bei Raumtemperatur (20-25 C) 30 Minuten lang inkubieren.
7. 5 µl ABC-Kaninchen-Komplement in jede Vertiefung hinzufügen.
8. Die Trays bei Raumtemperatur (20-25 C) 1 Stunde lang inkubieren.
9. Nach der Inkubation die Zellen färben und fixieren:
a. Für Farbstoffausschlusstest in jede Vertiefung zugeben:
5 µl Eosin-Farbstoff, gefolgt von 5 µl Formaldehyd zwei Minuten später, oder
10 µl Stain-Fix (OLI Best.-Nr. SF-500).
b. Für Fluoreszenztests 5 µl FluoroQuench AO/EB (OLI Best.-Nr. FQAE-500) in jede Vertiefung zugeben.
10. Die Trays mit Terasaki Insta-Seal (OLI Best.-Nr. TIS250U) abdecken. Die Trays 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen
lassen, so dass sich die Lymphozyten absetzen können. Farbstoffausschluss-Trays können bei 2–5 C bis zu 2 Wochen
aufbewahrt werden. Fluoreszenz-Trays können im Dunkeln bei 2-5 C bis zu 2 Tage aufbewahrt werden. Mit Terasaki Insta-
Seal Deck-Objektträgern abgedeckte Trays müssen an dem Tag, an dem sie für den Test vorbereitet werden, gelesen werden.
GRENZEN DES VERFAHRENS
Dieser Test weist keine nicht-zytotoxischen Antikörper nach. Es kann jedoch Anti-Human-Globulin (AHG) von Ziegen verwendet werden,
um die Zytotoxizität anzuheben (OLI Best.-Nr. AHG1).
ERGEBNISSE UND ERWARTETE WERTE
Interpretation der Ergebnisse (für jede Probe):
1. Mit dem entsprechenden Arbeitsblatt die Ausgangs-Lebensfähigkeit für normale Serumkontrolle aufzeichnen und Serumreaktionen in
den entsprechenden Spalten entlang der Panelspezifikation testen.
2. Die Anzahl der aufgezeichneten Positivreaktionen zählen. Anhand der Formeln unten den Prozentsatz von Positivreaktionen und die
Stärke des Serums berechnen.
PRA (% Pos.) = Anzahl der Positivreaktionen x 100
Anzahl der Zellen im Panel
Stärkeindex = Anzahl der „8“-Reaktionen x 100
Anzahl der Positivreaktionen
3. Es folgt eine einfache Methode für die Bestimmung der wahrscheinlichsten, im Testserum vorliegenden HLA-Spezifitäten.
a. Alle Antigene, die in den positiven Zellen auf der Linie gegenüber jeder Zelle in der Matrix vorhanden sind, markieren, um ein
„Serograph“ zu erstellen.
b. Für jedes in der Matrix erscheinende Antigen die Anzahl der “positiven” Reaktionen zählen und die Gesamtanzahl auf der mit
“positive rxns. (++)” markierten Linie unter der Matrix aufzeichnen. Wenn die Anzahl der Positiven mehr als halb so groß wie
die Anzahl der Fälle ist, in denen ein Antigen auf dem Panel erscheint, dann wird angenommen, dass der entsprechende
Antikörper im Serum vorliegt.
c. Danach alle Spezifitäten, deren Reaktionsmuster vollständig innerhalb eines längeren Musters auftreten, eliminieren. Obwohl
eine enthaltene Spezifität vorliegen kann, wäre es notwendig, dieses Serum gegen Zellen zu testen, die keine Antigene tragen, die
von dem längeren Reaktionsmuster erkannt werden.
d. Teilweise enthaltene Spezifitäten sollten mit Zellen geprüft werden, die mehr als ein vom Serum erkanntes Antigen tragen,
besonders dann, wenn die Frequenz des/der Antigens/e im Panel niedrig ist.
e. Für jede der verbleibenden wahrscheinlichen Spezifitäten, die Anzahl der falsch Positiven in den Ausgangsdaten (positive
Reaktionen, die das betreffende Antigen nicht enthalten) zählen und in der Zeile unter der mit „falsch positiv (-/+)“ markierten
Antigenliste aufzeichnen. Dann die Anzahl der falsch Negativen zählen und in der mit „falsch negativ (+/-)“ markierten Zeile
aufzeichnen.
f. Für jede Spezifität den r-Wert oder Korrelationskoeffizient kalkulieren.
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r = (AD) - (BC) .
[(A+B)(C+D)(A+C)(B+D)] 1/2
A = Anzahl der Zellen mit dem Antigen und positiv mit dem Serum
B = Anzahl der Zellen mit dem Antigen, jedoch negativ (falsch negativ)
C = Anzahl der Zellen ohne das Antigen, jedoch positiv (falsch positiv)
D = Anzahl der Zellen ohne das Antigen und negativ mit dem Serum
Hinweis: Ein Serum mit einem r-Wert von 0,85 oder höher ist möglicherweise ein hilfreiches Typisierungsreagenz.
g. Für Seren, die mehr als eine Spezifität aufweisen, den Einschluss-Index, den Grad, in dem eine Spezifität im Serum enthalten ist,
kalkulieren, da ein niedriger r-Wert für eine Spezifität irreführend ist.
Einschluss-Index für die jeweilige Spezifität =
Anzahl der Zellen, bei denen das Antigen positiv ist x 100
Gesamtanzahl der Zellen mit Antigenen
h. Optionale Analyse - HLA Fusion Software.
SPEZIFISCHE LEISTUNGSMERKMALE
Die T-Lymphozyten im Zell-Tray sind für HLA-Klasse-I-Antigene unter Verwendung eines Panels mit Anti-HLA-Klasse-I-Allo- und
Murin-Antikörpern HLA ABC-Trays phänotypisiert. Die B-Lymphozyten im Zell-Tray sind für HLA-Klasse-II-Antigene unter
Verwendung eines Panels mit Anti-HLA-Klasse-II-Allo- und Murin-Antikörpern phänotypisiert. Jede Charge von Zell-Trays reagierte
korrekt mit 5 bekannten Antiseren. Jede Vertiefung im Zell-Tray hat eine Mindest-Lebensfähigkeit von 80 % Zelltod, wenn diese mit dem
Positivkontrollserum getestet werden.
LITERATURHINWEISE
Amos, D.B., Pool, P., and Grier, J.O. HLA Typing. In Manual of Clinical Immunology, Noel Rose and Herman Friedman, eds., Amer. Soc.
for Microbiology, Washington, D.C., 1980.
BEVOLLMÄCHTIGTER VERTRETER FÜR DIE EURPÄISCHE UNION
MDSS GmbH, Schiffgraben 41, D-30175, Hannover, Deutschland
Version Datum Versionsbeschreibung
12 2008/10 Thrombineinheiten geklärt und topische USP-Güte für Rinderthrombin spezifiziert.
13 2009/04 NPD148, Entfernung von LCT30ABC, LCT60ABC und LCT72ABC; Hinzufügung von LCT1W72
14 2013/05
Fusion-Software als Option hinzugefügt. LCT-30D gestrichen. Satz unter dem Bestimmungsgemäße
Verwendung, Anweisungen zur Aufbewahrung/Schritt 2, Gebrauchsanweisung/Schritt 1 unter Schritt A/Schritt B
gelöscht und Satz in Abschnitt „Spezifische Leistungsmerkmale“ gelöscht. Kopfzeile auf Seite 1 und 2 aktualisiert.
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