Terasaki HLA Tissue Typing Trays - Polish Version - One Lambda
Terasaki HLA Tissue Typing Trays - Polish Version - One Lambda
Terasaki HLA Tissue Typing Trays - Polish Version - One Lambda
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
<strong>One</strong> <strong>Lambda</strong>, Inc.<br />
21001 Kittridge Street, Canoga Park, CA 91303-2801 USA Tel: +1 (818) 702-0042 Fax: +1 (818) 702-6904 WEB:www.onelambda.com<br />
INFORMACJA O PRODUKCIE<br />
TERASAKI <strong>HLA</strong> TISSUE TYPING TRAYS<br />
Do użycia w diagnostyce in vitro.<br />
NAZWA PRODUKTU Numery Katalogowe<br />
<strong>Terasaki</strong> <strong>HLA</strong> Class I <strong>Tissue</strong> <strong>Typing</strong> <strong>Trays</strong> T1-72, T2-72, T3-72, T3-72<br />
<strong>Terasaki</strong> <strong>HLA</strong> Class II <strong>Tissue</strong> <strong>Typing</strong> <strong>Trays</strong> DR-72<br />
<strong>Terasaki</strong> <strong>HLA</strong> Class I Race <strong>Trays</strong> OT-72<br />
<strong>Terasaki</strong> Supplement <strong>HLA</strong> <strong>Typing</strong> <strong>Trays</strong> AS72, BS72, BS740-72, C72, C722<br />
PRZEZNACZENIE<br />
Do użycia w celu określenia techniką mikrolimfocytotoksyczną, zależną od dopełniacza, antygenów zgodności tkankowej na powierzchni<br />
komórek (<strong>HLA</strong> cell surface antigens)<br />
STRESZCZENIE I WYJAŚNIENIE<br />
The <strong>Terasaki</strong> <strong>HLA</strong> Class I and Class II <strong>Typing</strong> <strong>Trays</strong>, które zawierają znane antysurowice lub przeciwciała monoklonalne są<br />
używane do określenia obecności antygenów <strong>HLA</strong> Klasy I lub Klasy II na limfocytach T lub B. Każda studzienka zawiera 1<br />
mikrolitr (1 µl) specyficznej antysurowicy i 5 mikrolitrów (5 µl) ciężkiego oleju mineralnego. Każda płytka zawiera kontrolę<br />
pozytywną i negatywną. Płytki do typowania klasy II zawierają także przeciwciała monoklonalne anty-B i anty-T.<br />
REGUŁA<br />
Zdolne do życia limfocyty są inkubowane z komplementarnie wiążącym przeciwciałem. Jeżeli limfocyty posiadają antygen<br />
rozpoznawalny przez specyficzne przeciwciało, fragment Fab przeciwciała wiąże się z antygenem tworzącym kompleks antygenprzeciwciało.<br />
Po utworzeniu tych kompleksów, dodany jest dopełniacz króliczy. C1q i jony Ca ++ dopełniacza wiążą się z fragmentem FC<br />
przeciwciała. Wymagane jest jedno przeciwciało przeciw IgM do związania jednej cząsteczki C1q lub dwa przeciwciała przeciw IgG do<br />
związania jednej cząsteczki C1q. Wiązanie C1q z kompleksami antygen-przeciwciało zapoczątkowuje kaskadę dopełniacza, która<br />
prowadzi do lizy komórki. W reakcji negatywnej limfocyty są żywe. W reakcji pozytywnej limfocyty są martwe.<br />
ODCZYNNIKI<br />
A. Identyfikacja<br />
The <strong>Terasaki</strong> <strong>HLA</strong> Class I and Class II <strong>Typing</strong> <strong>Trays</strong> zawierają znane alloantysurowice Klasy I lub Klasy II lub przeciwciała<br />
monoklonalne. Każda studzienka zawiera 1 µl przeciwciała i 5 µl ciężkiego oleju mineralnego. Źródłami przeciwciał monoklonalnych<br />
może być mysz lub człowiek.<br />
B. Uwagi lub ostrzeżenia<br />
1. Do użycia w diagnostyce in vitro.<br />
2. Ostrzeżenie: Wszystkie produkty krwiopochodne powinny być traktowane jako potencjalnie zakaźne. Materiał źródłowy, od<br />
którego pochodzi ten product wykazał odczyn negatywny, gdy był testowany zgodnie z obecnie wymaganymi testami przez<br />
Agencję do Spraw Żywności i Leków (FDA). Żadna ze znanych metod nie może dać pewności, że produkty pochodzące od<br />
ludzkiej krwi nie będą czynnikami przenoszącymi zakażenie.<br />
3. Ostrzeżenie: Bromek etydyny jest znanym karcynogenem. Obchodź się z nim z należytą uwagą. Może być szkodliwy w<br />
przypadku wchłonięcia przez skórę. Unikaj rozpryskania do oczu lub na skórę czy ubranie. Przechowuj szczelnie zamknięty.<br />
Umyj dokładnie miejsca kontaktu. Spłukaj wyciek wodą w aerozolu.<br />
4. Aby zasięgnąć szczegółowych informacji, odnieś się do Arkusza charakterystyki bezpieczeństwa materiału.<br />
C. Instrukcja użycia<br />
Patrz “Wskazówki użycia”.<br />
D. Informacje o Przechowawaniu<br />
Przechowuj odczynniki w temperaturze oznaczonej na opakowaniu. Użyj przed upłynięciem daty ważności.<br />
E. Oczyszczanie lub Specjalne Traktowanie Wymagane przed Użyciem<br />
Patrz “Wskazówki użycia”.<br />
F. Oznaki Niestabilności<br />
Zakażenie bakteryjne i/lub poddanie działaniu dwutlenku węgla spowoduje zmianę pH surowic. Ta zmiana pH jest wyrażona zmianą<br />
koloru z różowego na żółty. Jeżeli taka zmiana nastąpi, wyrzuć płytki.<br />
ZBIERANIE I PRZYGOTOWANIE PRÓBEK<br />
Ponieważ do typowania serologicznego wymagane są limfocyty żywe, krew powinna być otrzymana i przygotowana natychmiast po jej<br />
TTT-TTTT-PI-PL-00, Rev 6 Strona 1 z 5
dostarczeniu. Wydajność limfocytów zmniejsza się z czasem i w ekstremalnych temperaturach. Krew należy zbierać w rozworze dekstrozy<br />
z kwasem cytrynowym (ACD) lub w heparynie z sodem. Przechowywać w pozycji poziomej w temperaturze pokojowej (20 - 25ş C) i<br />
przeprowadzić proces w ciągu 48 godzin, dla maksymalnej wydajności limfocytów T i B .<br />
PROCEDURA<br />
A. Dostarczone materiały<br />
1. Płytka(-i) do typowania <strong>HLA</strong> Klasy I lub Klasy II , 60 lub 72 studzienek<br />
2. Arkusze robocze identyfikujące specyficzność każdego przeciwciała monoklonalnego<br />
3. Dopełniacz gotowy do użycia, składający się z nierozcieńczonej surowicy króliczej zsumowanej z dużej ilości, conajmniej 15<br />
królików. Dostarczony dopełniacz nie może być rozcieńczony.<br />
B. Materiały wymagane, ale nie dostarczone<br />
1. Mikrostrzykawki<br />
2. Szkiełka nakrywkowe lub szkiełka podstawowe Insta-Seal (OLI Nr Kat.TIS250U) i wazelina (Vaseline)<br />
3. Odczynniki do barwienia i utrwalania:<br />
a. Do testów na wykluczenie barwnika: eozyna Y (zasada sodowa) i formaldehyd lub Stain-Fix (OLI Nr Kat. SF-500)<br />
b. Do testów fluorescencyjnych: FluoroQuench AO/EB (OLI Nr Kat. FQAE-500) lub FluoroQuench EB (OLI Nr Kat.<br />
FQEB-500) lub dodaj 1 ml roztworu zapasowego EB do 9 ml hemoglobiny lub 1% atrament (patrz poniższe<br />
Materiały Nr 4 - 7 ).<br />
4. Hemoglobin Quench<br />
a. Liofilizowana wołowa<br />
Rozpuść 10 g hemoglobiny w 100 ml 5% roztworu EDTA PBS. Dodaj 1 ml 1% roztworu azydku sodu.<br />
Wiruj przez 45 minut z prędkością 1000 g. Przechowuj supernatant w temperaturze -20ş C.<br />
b. Z czerwonych ciałek krwi<br />
Roztwór zapasowy: Przemyj 3 razy roztworem soli zapakowane czerwone ciałka krwi. Przygotuj 70% hematokryt,<br />
zamróź i rozmróź. Wiruj na ultrawirówce przez 45 minut, z prędkością 20,000 g. Dializuj przez 3 dni roztworem soli<br />
fizjologicznej.<br />
Roztwór roboczy: Dodaj 10 ml 5% roztworu EDTA PBS. Dodaj 1 ml 1% roztworu ayzdku sodu do 89 ml<br />
hemoglobiny. Przechowuj w temperaturze -20ş C.<br />
5. 1% Ink Working Quench<br />
a. Rozpuść 1 gM Bovine Serum Albumen (BSA) w 10 ml 5% roztworu EDTA PBS.<br />
b. Do 9,8 ml roztworu BSA/5% EDTA/PBS dodaj:<br />
100 µl 1% roztworu azydku sodu<br />
100 µl Higgins Black Calligraphy Ink (e.g. czarnego tuszu kaligraficznego Higginsa)<br />
6. 5% roztwór EDTA (dwusodowy) PBS<br />
a. Rozpuść 5 gM roztworu EDTA w 90 ml PBS.<br />
b. Przy użyciu 10M NaOH doprowadź do pH 7,2<br />
c. Przy użyciu PBS doprowadź końcową objętość roztworu do 100 ml.<br />
7. Bromek etydyny (EB) – roztwór zapasowy: Rozpuść 50 mg w 1 ml wody destylowanej. Dodaj 49 ml PBS. Ogrzewaj w łaźni<br />
wodnej do 56ş C przez 30 minutes. Przechowuj w temperaturze -20ş C.<br />
8. Dwuoktan karboksyfluoresceiny (CFDA)<br />
a. Roztwór zapasowy: W szklanej probówce rozpuść 10 mg CFDA w 1 ml acetonu . Przechowuj w temperaturze -20C in<br />
probówkach Beckmana.<br />
b. Roztwór roboczy: Użyj jeden z podanych poniżej:<br />
Przygotowany w PBS o pH 7,2: Dodaj 30 µl roztworu zapasowego CFDA do 5 ml PBS (pH 7,2). Przechowuj w<br />
temperaturze 2 - 5ş C przez czas nie dłuższy niż 1 tydzień.<br />
Przygotowany w PBS o pH 5,5: Dodaj 30 µl roztworu zapasowego CFDA do 5 ml PBS (pH 5,5). Przechowuj w<br />
temperaturze 2 - 5ş C przez czas nie dłuższy niż 1 tydzień.<br />
C. Procedura krok-po-kroku<br />
Patrz poniższe “Wskazówki do użycia”.<br />
Wskazówki do użycia<br />
Uwaga: Dla wielu płytek testowych,odwołaj się do arkusza roboczego po pozycje startowe próbek.<br />
Uwaga: Dla metod izolacji limfocytów, odwołaj się do Instrukcji Procedur Laboratoryjnych (ASHI Laboratory Procedure Manual 5 ) ,<br />
informacji o produkcie firmy <strong>One</strong> <strong>Lambda</strong> FluoroBeads® lub metod izolacji limfocytów LymphoKwik®.<br />
A. Testowanie<br />
1. Rozmrażaj płytki w temperaturze 20 - 25ş C przez 15 minutes i użyj w ciągu 30 minutes od rozmrożenia.<br />
Uwaga: Nie zamrażaj ponownie.<br />
2. Do każdej studzienki dodaj 1 µl zawiesiny limfocytów T lub B w stężeniu 2 x 10 6 komórek/ml do płytki Klasy I lub limfocytów<br />
B do płytki Klasy II. Dla użycia CFDA w teście fluorescencji, patrz część “B” poniżej.<br />
3. Wymieszaj mikrokrople używając elektrostatycznego miksera lub drutu.<br />
4. Inkubuj płytki w temperaturze pokojowej (20 - 25ş C) przez 30 minut.<br />
5. Do każdej studzienki płytki testowej odmierz 5 µl of odpowiednienngo króliczego <strong>HLA</strong>-ABC lub dopełniacza DR (dostarczony).<br />
TTT-TTTT-PI-PL-00, Rev 6 Strona 2 z 5
6. Inkubuj płytki w temperaturze pokojowej (20 - 25ş C) przez 1 godzinę.<br />
7. Po inkubacji wybarw i utrwal komórki:<br />
a. Do testów na wykluczenie barwnika, do każdej studzienki dodaj:<br />
5 µl barwnika eozynowego, a następnie po odczekaniu 2 minut, 5 µl formaldehydu lub<br />
10 µl roztworu Stain-Fix (OLI Nr Kat. SF-500).<br />
b. Do testów fluorescencyjnych, dodaj 5 µl roztworu FluoroQuench AO/EB (OLINr Kat. FQAE-500). Do testów<br />
CFDA (rozdział B poniżej), do każdej studzienki dodaj 5 µl roztworu FluoroQuench EB (OLI Nr Kat. FQEB-500)<br />
lub 50 l bromku etydyny na 1 ml hemaglobin quench lub 1% ink quench. Dodaj 5 l na studzienkę.<br />
8. Przykryj płytki <strong>Terasaki</strong> Insta-Seal (OLI Nr Kat. TIS250U). Jeżeli używasz szkiełka podstawowego, uszczelnij za pomocą<br />
stopionej wazeliny. Pozostaw płytki w temperaturze pokojowej (20 - 25ş C) przez 15 minut, aby umożliwić osadzenie się<br />
limfocytów. Płytki do wykluczenia barwnika mogą być przechowywane w temperaturze 2 - 5ş C przez czas nie dłuższy niż 2<br />
tygodnie. Płytki fluorescencyjne mogą być przechowywane w temperaturze 2 - 5C w zaciemnionym pomieszczeniu przez czas<br />
nie dłuższa niż 2 tygodnie. Płytki przykryte szkiełkami podstawowymi <strong>Terasaki</strong> Insta-Seal muszą być analizowane tego<br />
samego dnia, którego zostały przygotowane do testowania.<br />
B. Fluorescencja: Znakowanie preparatu limfocytów przy użyciu CFDA.<br />
1. Inkubuj limfocyty w 500 µl CFDA o pH 7,2 w temperaturze 37ş C przez 15 minut lub w CFDA o pH 5,5 w temperaturze 20 -<br />
25ş C przez 5 minut.<br />
Uwaga: W przypadku limfocytów izolowanych przy użyciu perełek magnetycznych inkubację należy przeprowadzić w 500 µl<br />
CFDA o pH 5,5 w temperaturze 20 - 25ş C przez 10 minut.<br />
2. Wiruj przez 1 min. z prędkością 1000 g. Odbierz supernatant. Uwaga: W przypadku limfocytów izolowanych przy użyciu<br />
perełek magnetycznych, umieść na magnesie na 1 minutę. Odbierz supernatant.<br />
3. Zawieś ponownie w PBS.<br />
4. Dwukrotnie powtórz krok 2 i 3.<br />
5. Zawieś ponownie komórki w pożywce McCoy’s zawierającej 0.5% FCS i doprowadź komórki do stężenia 2 x 10 6 komórek/ml.<br />
Chroń przed światłem.<br />
6. Postępuj według kroków 2 - 8 powyższego paragrafu “Testowanie” .<br />
WYNIKI<br />
Śmierć komórki może nastąpić w każdej studzience testu, gdzie komórkowy antygen powierzchniowy <strong>HLA</strong> jest rozpoznawany przez<br />
odpowiadające mu przeciwciało anty-<strong>HLA</strong>.<br />
Stosując wykluczenie barwnika, negatywne (żywe) limfocyty są małe, jasne i załamują światło. Pozytywne (martwe) limfocyty barwione<br />
eozyną są ciemne i nie załamują światła . Reakcje są oceniane poprzez określenie procentowej śmierci komórek.<br />
Stosując testy fluorescencyjne z wykorzystaniem dwuoktanu karboksyflouresceiny (CFDA) lub oranżu akrydyny, negatywne (żywe)<br />
limfocyty są zielone. Podczas użycia bromku etydyny lub jodku propidyny, pozytywne (martwe) limfocyty są czerwone.<br />
OGRANICZENIA PROCEDURALNE<br />
Trudności w izolacji komórek i zanieczyszczenie preparatu limfocytów czerwonymi ciałkami krwi, drożdżami, monocytami, płytkami krwi<br />
lub granulocytami może powodować błędne wyniki. Ponadto, błędne wyniki mogą wystąpić kiedy stężenia komórek są wyższe lub niższe<br />
od przyjętych poziomów.<br />
Zanieczyszczenia bakteryjne lub zmiany pH antysurwic mogą powodować fałszywie negatywne reakcje. Niektóre antygeny <strong>HLA</strong> często<br />
wykazują słabe reakcje na antysurowice o innych właściwościach. Są to antygeny reagujące krzyżowo, wyszczególnione przez antygen i<br />
surowicę z każdej płytki w załączonym przewodniku charakterystyki reakcji. Na płytkach do typowania Klasy II kontrola<br />
limfocytów anty-B musi być pozytywna, aby potwierdzić, że preparat komórkowy jest wzbogacony o limfocyty B. Test jest<br />
nieważny, jeżeli ocena punktowa tej kontroli jest niższa niż 6.<br />
SPODZIEWANE WARTOŚCI<br />
Mikroskopowa analiza testów<br />
Reakcje są oceniane poprzez określenie procentowej śmierci komórek. Jeżeli kontrola negatywna zawiera martwe limfocyty, procentowa<br />
ilość martwych komórek w pozostałych studzienkach musi być odpowiednio dopasowana.<br />
W poniższej tabeli jest zaprezentowany standardowy schemat odczytywania ASHI:<br />
Punkty Śmierć komórek Interpretacja<br />
1 0-10% Negatywny<br />
2 11-20% Wątpliwie negatywny<br />
4 21-50% Słabo pozytywny<br />
6 51-80% Pozytywny<br />
8 81-100% Silnie pozytywny<br />
0 nie możliwe do<br />
odczytania<br />
Częstotliwości fenotypowe dla <strong>HLA</strong> Klasy I i Klasy II będą się różnić w zależności od populacji (np.: rasa biała, rasa czarna, rasa żółta<br />
itd.). Patrz pozycja 4 bibliografii.<br />
TTT-TTTT-PI-PL-00, Rev 6 Strona 3 z 5
CHARAKTERYSTYKA SPECYFICZNEGO PRZEBIEGU REAKCJI<br />
A. Moc i specyficzność<br />
Odczynniki testu były precyzyjnie scharakteryzowane poprzez odrębne serologiczne skryningi sekwencji. W dwóch odrębnych<br />
skryningach są wykorzystywane zespoły odnośników do próbek zamrożonych limfocytów.<br />
Dwie-trzecie wszystkich wyselekcjonowanych odnośników zawiera jasno zdefiniowaną specyficzną reaktywność na <strong>HLA</strong> (z 70%<br />
wskaźnikiem mocy), pozwalając na nie więcej niż 10% fałszywie pozytywnych i 15% fałszywie negatywnych reakcji. Pozostała<br />
jedna-trzecia antysurowic lub przeciwciał monoklonalnych nie spełnia tych kryteriów, ale jest przydatna do badań, kiedy jest używana<br />
jako pomoc dla innych dobrze zdefiniowanych antysurowic. Multispecyficzne antysurowice są używane tylko, jeżeli<br />
monospecyficzne antysurowice są dostępne dla określonej swoistości.<br />
Zostały wybrane multispecyficzne antysurowice o takiej samej jak w przypadku monospecyficznych antysurowic charakterystyce<br />
przebiegu reakcji dla wszystkich swoistych własności. Skryning zbioru świeżo przygotowanych limfocytów jest używany w celu<br />
potwierdzenia i zaakceptowania mocy antysurowicy i jej specyficzności. Analiza jest przeprowadzana przy użyciu technik<br />
komputerowych przedstawionych w 1980 r. na Eighth International Histocompatibility Workshop (np. VIII.<br />
MIĘDZYNARODOWYCH WARSZTATACH ZGODNOŚCI TKANKOWEJ). (Patrz pozycja 4 bibliografii.)<br />
B. Surowica Kontroli Negatywnej<br />
Kontrola negatywna jest pobierana od zdrowych osobników płci męskiej, posiadających grupę krwi AB i nie wykazujących żadnej<br />
cytotoksycznej reaktywności w testach z dowolnie wybranymi donorami limfocytów. Ta kontrola jest użyta w celu określenia<br />
żywotności limfocytów.<br />
C. Surowica Kontroli Pozytywnej<br />
Kontrolą pozytywną jest przeciwciało monoklonalne, silnie cytotoksyczne dla ludzkich limfocytów. Ta kontrola jest używana w celu<br />
określenia reaktywności dopełniacza.<br />
D. Surowica Kontroli Limfocytów Anty-B<br />
Surowicą Kontroli Limfocytów Anty-B jest przeciwciało monoklonalne, silnie cytotoksyczne dla limfocytów B i nie reagujące<br />
przeciw granulocytom, limfocytom T, płytkom krwi, monocytom, ani czerwonym ciałkom krwi. Ta kontrola jest używana w celu<br />
określenia czystości B limfocytów.<br />
BIBLIOGRAPHY<br />
1. <strong>Terasaki</strong> PI, Bernoco F, Park MS, Ozturk G, and Iwaki Y. Microdroplet testing for <strong>HLA</strong> A, B, C and D antigens. Am J. Clin Pathol<br />
69: 103-120, 1978.<br />
2. Danilovs J, <strong>Terasaki</strong> PI, Park MS, Ayoub G. B lymphocyte isolation by thrombin nylon wool. In Histocompatibility Testing.<br />
<strong>Terasaki</strong> PI, Ed., UCLA <strong>Tissue</strong> <strong>Typing</strong> Laboratory, Los Angeles, CA 287-288, 1980.<br />
3. ASHI Laboratory Manual, 2nd ed. Zachary, Andrea A. and Teresi, Gary, Ed., p. 199, 1990.<br />
4. <strong>Terasaki</strong>, PI, Ed., Histocompatibility Testing. UCLA <strong>Tissue</strong> <strong>Typing</strong> Laboratory, Los Angeles, CA 1980.<br />
5. Nikaein A, Ed., ASHI Procedure Manual, 3 rd Edition, ASHI, Lenexa, KS.<br />
TTT-TTTT-PI-PL-00, Rev 6 Strona 4 z 5
EUROPEJSKI PRZEDSTAWICIEL AUTORYZOWANY<br />
MDSS GmbH, Schiffgraben 41, D-30175, Hannover, Niemcy<br />
HISTORIA KOREKT<br />
KOREKTA DATA OPIS KOREKTY<br />
6 2009/12<br />
Usunięto produkty wyłączone: T3-60, 27-01, 27-03, 27-05, BL-72, HS72, DR60, T1-60, T2-60 i CHN-<br />
72.<br />
TTT-TTTT-PI-PL-00, Rev 6 Strona 5 z 5