Micro SSP HLA DNA Typing Trays, DANISH VERSION - One Lambda

21001 Kittridge Street, Canoga Park, CA 91303-2801 USA | Tlf.: (818) 702-0042 Fax: (818) 702-6904 | WEB:www.onelambda.com 

INDLÆGSSEDDEL 

MICRO SSP HLA DNA TYPING TRAYS 

(MICRO SSP HLA DNA-TYPEBESTEMMELSESBAKKER) 

Til in vitro-diagnostisk brug. 

VIGTIGT: Se Micro SSP produktreferencetabel (Dokument-id: MSSP_REF_TABLE_PI.DOC) til OLIproduktkatalognumre, 

specifikke produktkomponenter og krav 

TILSIGTET ANVENDELSE 

DNA typebestemmelse af HLA alleler, klasse I eller klasse II. 

SAMMENDRAG OG REDEGØRELSE 

Historisk har fastlæggelsesmetoden for bestemmelse af HLA-antigener været lymfocytotoksicitetstesten. 1 Ved fremkomsten 

af PCR-teknologier er DNA-baserede vævstypeteknikker imidlertid blevet rutine i laboratoriet. For de fleste DNA-baserede 

metodologier anvendes PCR-processen kun som et forstærkende trin til at opnå den nødvendige mål-DNA. HLAtypebestemmelsesprocessen 

kræver dernæst et efterforstærkende trin for at kunne skelne mellem de forskellige alleler (feks. 

RFLP, SSOP, omvendt punktdiagram). I modsætning til andre PCR-baserede metoder, skelner den anvendte SSP-metodologi 

i One Lambda, Inc., Micro SSP DNA-typebestemmelsestesten mellem de forskellige alleler under PCR-processen. 2 Dette 

forkorter efterforstærkningsprocestiden til et enkelt gel-elektroforese detektionstrin. I modsætning til 

lymfocytotoksicitetsreaktionsskalaen (1 = negativ til 8 = positiv), er Micro SSP testresultater enten positive eller negative. 

Dette afskaffer behovet for den komplicerede fortolkning af resultater. Yderligere kan enkelte nukleotide-ændringer være 

diskriminante i PCR-SSP, mens krydsreagerende grupper (CREG'er) giver større udfordringer til serologisk 

typebestemmelse. 3 Endelig, pga. DNA-typereagensernes syntetiske natur (feks. oligonukleotide-primere), er stabiliteten 

blevet tydeligt forbedret og lot til lot-varians reduceret. 

PRINCIP(PER) 

PCR-SSP-metodologien er baseret på princippet om, at fuldstændigt matchede oligonukleotide primere anvendes mere 

effektivt ved at forstærke en målsekvens, end en mismatchet oligonukleotid primer via rekombinant Taq-polymerase. 

Primerpar er designet til kun at have perfekte matcher med en enkelt allele eller gruppe alleler. Under strengt kontrollerede 

PCR-forhold, resulterer perfekt matchede par i forstærkelse af målsekvenser (dvs. et positivt resultat), mens mismatchede 

primerpar ikke resulterer i forstærkelse (dvs. et negativt resultat). Efter PCR-processen adskilles de forstærkede DNAfragmenter 

via agarose-gelelektroforese og visualiseres af farvning med ethidiumbromid og eksponering af ultraviolet lys. 

Fortolkning af PCR-SSP-resultater er baseret på tilstedeværelsen eller fraværet af et specifikt forstærket DNA-fragment. 

Eftersom forstærkning under PCR-reaktionen kan påvirkes uhensigtsmæssigt af forskellige faktorer (pipetteringsfejl, ringe 

DNA-kvalitet, tilstedeværelse af inhibitorer, osv.) er et internt kontrolprimerpar inkluderet i hver PCR-reaktion. 

Kontrolprimerparret forstærker et bevaret område af det humane -globin gen, som er til stede i alle humane DNA-prøver og 

anvendes til at verificere PCR-reaktionens integritet. Ved tilstedeværelsen af et positivt typebestemmelsesbånd (specifik 

forstærkelse af en HLA-allele) kan produktet af det interne kontrolprimerpar blive svag eller fraværende pga. forskellene i 

koncentrationen og smeltetemperaturer mellem de specifikke primerpar og det interne kontrolprimerpar. De forstærkede 

DNA-fragmenter af de specifikke HLA primerpar er mindre end produktet af det interne kontrolprimerpar, men større end det 

diffuse, ikke-inkorporerede primerbånd. Således visualiseres en positiv reaktion på en specifik HLA allele eller allele-gruppe 

på gel'en som et forstærket DNA-fragment mellem det interne kontrolproduktbånd og det ikke-inkorporerede primerbånd (se 

Forventede værdier/Gel-fortolkning). 

SSP-DNAT-PI-DA-00, Rev. 18 Side 1 af 9

One Lambda | Indlægsseddel: Micro SSP HLA DNA-typebestemmelsesbakker 

REAGENSER 

A. Identifikation 

Micro SSP DNA-typebestemmelsesbakker giver sekvensspecifikke oligonukleotide primere til forstærkelse af HLAalleler 

og det humane -globin-gen via polymerase kædereaktionen (PCR). Præ-optimerede primere er til stede (tørrede) 

i forskellige brønde på en 96-brøndglasbakke på 0,2 ml med tynde sider til PCR og er klar til tilføjelsen af DNA-prøver, 

rekombinant Taq-polymerase og specielt formulerede dNTP-bufferblanding (Micro SSP D-blanding). Hver 

typebestemmelsesbakke omfatter et negativt kontrolreaktionsglas, der detekterer tilstedeværelsen af det interne kontrol- 

PCR-produkt genereret af Micro SSP DNA-typebestemmelsesbakken. Det interne kontrol-PCR-produkt, forstærket af 

det humane -globin-gen, er det PCR-produkt, der efter størst sandsynlighed er kontaminerende pga. dets forstærkelse i 

hver brønd. Mængden af hver primer justeres til optimal forstærkelse af 100 ng prøve DNA, når anvendt sammen med 

Micro SSP D-blanding, den foreskrevne mængde rekombinant Taq-polymerase og PCR-reaktionsprofilen, beskrevet 

yderligere i dette dokument (side 2). Se det vedlagte arbejdsark for specifikke alleler, som kan forstærkes via hvert 

primersæt under de specificerede PCR-forhold for prøven. For at få mere at vide om lotspecifikke primerlokationer, se 

Primerinformationsdokumentet. 

B. Advarsel eller forsigtighed 

1. Til in vitro-diagnostisk brug. 

2. Pipetter anvendt til post-PCR-manipulationer bør ikke anvendes til præ-PCR manipulationer. 

3. Advarsel om biologisk fare: Ethidiumbromid, der anvendes til farvning af DNA er en mulig carcinogen. Der skal 

altid bæres handsker, når farvet gel håndteres. 

4. Advarsel om biologisk fare: Alle blodprodukter skal behandles som potentielt infektiøse. Kildematerialet, som dette 

produkt stammer fra, blev fundet negativt ved testning i overensstemmelse med de test, der i øjeblikket er påkrævet 

af FDA (Food and Drug Administration i USA). Ingen kendte testmetoder kan med sikkerhed fastslå, at produkter 

fra humant blod ikke transmitterer infektiøse stoffer. 

5. Forsigtig: Bær UV-blokerende øjenbeskyttelse og se ikke direkte ind i UV-lyskilden direkte, når der kigges på eller 

fotograferes gel. 

6. Se sikkerhedsdatabladet (MSDS) for at få yderligere oplysninger. 

C. Brugsanvisning 

Se Brugsanvisning. 

D. Opbevaringsanvisninger 

Opbevar reagenser ved den temperatur, der er angivet på emballagen. Skal anvendes før den påtrykte udløbsdato. 

E. Påkrævet rensning eller behandling før anvendelse 

Se Brugsanvisning. 

F. Indikationer for ustabilitet 

1. Primersætbakkerne må ikke anvendes, hvis der er revner i glas eller på tudene, da revner kan resultere i 

fordampningstab. 

2. Hvis der er udfældet salte af opløsningen i D-blandingsalikvoterne under forsendelse eller opbevaring, opløses disse 

igen vha. langvarig vortex ved stuetemperatur (20 til 25 C). 

3. D-blandingsalikvoter bør være lyserøde til lyselilla i farve ved optøning ved stuetemperatur (20 til 25C). Ethvert 

D-blandingsalikvot uden den specificerede farve bør betragtes som ubrugelig. 



INSTRUMENTKRAV 

A. Programmering af den termiske cycler 

96-brønds GeneAmp® PCR-system 9600, 9700 eller Veriti 96-brønds termisk cykler (Applied Biosystems). Indstil 

rampehastigheden til 9600 for 96-brønds GeneAmp® PCR-systemet 9700. Indstil rampehastigheden til 9600 

emuleringstilstand for Veriti 96-brønds termisk cykler. 

One Lambda PCR-program (OLI-1) 

Antal cykler Trin Temp. (C) Tid (sek.) 

1 1 96 130 

2 63 60 

9 1 96 10 

2 63 60 

20 1 96 10 

2 59 50 

3 72 30 

Slut 1 4 --- 

For specifikke oplysninger om den termiske cykler, se fabrikantens brugermanual. 

B. 2,5% agarose gelpræparat 

(til Micro SSP gel-system, OLI kat. nr. MGS108) 

1. Opsætning: 

a. Skub låsestiften på bundpladen til åben. 

b. Isæt gelboksen i bundpladen, der matcher de farvekodede sider for at sikre korrekt orientering. 

c. Lås gelboksen ind i bundpladen ved at skubbe låsestiften til den låste stilling. 

d. Anvend nivelleringsboblen og de tre højdejustérbare ben til nivellering af bundpladen. 

2. Vend og isæt de 14 gel-kamme helt ind i gelkammeholderen. 

3. Til 100 ml 1x tris-borat EDTA-buffer (1x TBE) med 0,5 g/ml ethidiumbromid (i en 500 ml glasflaske), tilføjes 2,5 

g agarose af elektroforesekvalitet. Varm indtil der dannes en homogen opløsning. 

4. Tilføj 30 ml gelopløsning i gelboksen. Sørg for, at agarosen dækker hele overfladen jævnt ved at hælde gelboksen frem 

og tilbage umiddelbart efter, at gelopløsningen er tilføjet. Anbring hurtigt gelkammeholderen på den fyldte gelboks ved 

at matche farvekodningen. Lad det stå i 15 minutter. 

5. Fjern gelkammene ved at løfte gelkammeholderen, mens der holdes i bundpladen. Tilsæt 10 ml 1xTBE, der 

indeholder 0,5 g/ml ethidiumbromim jævnt hen over gel'en, således at det fylder hver brønd. 

C. Gel-elektroforese 

(Til Micro SSP gel-system, OLI kat. nr. MGS108) 

1. Efter færdiggørelse af PCR-reaktionen: 

Orientér DNA-primersætbakken og gelboksen med den negative kontrolbrønd i øverste venstre hjørne. 

Fjern forsigtigt bakkeforseglingen uden at stænke på prøverne. 

2. Overfør hver PCR-reaktion (10 l) i sekvens med 2,5% agarose-gel'en. Sørg for at overføre alle prøver i den korrekte 

sekvens. (Ingen tilsætning af elektroforesefarve er nødvendig.) Anvendelse af en 8 – 12 kanals Pipetman ® anbefales. 

Bemærk: Prøvernes rækkefølge er (for at matche arbejdsarket) fra venstre til højre, oven fra og ned. 

3. Dæk gelboksen med gelbokslåget ved at matche de farvekodede sider. Elektroforesér prøverne ved 140 - 150 volts, indtil 

den røde sporingsfarve er trængt omkring 0,5 cm ind i gel'en (ca. 3 – 5 minutter, afhængig af den anvendte agarose. Fjern 

låget. 

4. Skub låsestiften på bundpladen til åben og fjern gelboksen. Overfør gelboksen til en UV-transilluminator. Fotografér den 

færdige gel. 

5. Orientér fotografiet med den negative kontrolreaktion i øverste venstre hjørne og mærk de tilsvarende positive allelegrupper 

på arbejdsarket, der var vedlagt bakken. 



PRØVETAGNING OG -FORBEREDELSE 

A. DNA kan oprenses af humane leukocytter vha. en hvilken som helst foretrukket metode. 

B. DNA-prøven, der skal anvendes til PCR-SSP-analyse bør resuspenderes i sterilt vand eller i 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 – 

9,0 ved en koncentration på 25 - 200 ng/l i A260/A280-forholdet på 1,65 – 1,80. 

C. Prøver bør ikke resuspenderes i opløsninger, der indeholder chelaterende agenter, såsom EDTA, over 0,5 mM i 

koncentration. 

D. DNA-prøver kan anvendes straks efter isolering eller opbevaret ved –20 C i længere tid (over 1 år) med ingen uheldige 

påvirkninger af resultater. 

E. DNA-prøver bør forsendes ved 4 C eller under for at bevare deres integritet under transport. 

PROCEDURE 

A. Leverede materialer 

1. Micro SSP DNA-primersætbakker 

2. Præ-alikvottede D-blandingsglas (korrekt antal til test) 

3. Bakkeforseglinger (korrekt antal til test) 

B. Påkrævede materialer, der ikke er vedlagte 

Rekombinant Taq-polymerase (5 enheder/l) 

Pipetteringsanordninger, såsom: Gilson ® P-20, Gilson ® P200 Pipetman ® 

Pipettespidser til engangsbrug 

Vortexmixer 

Mikrocentrifuge 

Mikroglasopbevaringsstativ til PCR-bakke og låg (Robbins Scientific, kat. nr. 1044-39-5) 

Trykpude til anvendelse sammen med bakke (OLI kat. nr. SSPPAD, SSPPAD384, SSPPADGRY). Anvend kun den 

trykpude, der specifikt passer til din termisk cykler. Se Micro SSP trykpudeprotokol (PCR_PAD_INS.DOC.) 

Bemærk: Trykpuden kan anvendes til maksimalt 300 PCR-kørsler. Bestil venligst en ny trykpude, hvis overfladen 

på puden, der kontakter bakkeforseglingen ikke længere er jævn. 

Termisk cykler til PCR med 96-brønde-format og bakke/holder til 0,2 ml tyndvæggede reaktionsglas 

Varmeplade eller mikroovn til opvarmning af agaroseopløsninger 

Elektroforeseanordning/strømforsyning (150V minimumskapacitet) 

UV-transilluminator (Eksempel: Fotodyne FOTO/UV 21) 

Fotografisk eller billeddokumentationssystem 

1x TBE buffer (89mM tris-borat; 2 mM dinatrium EDTA, pH 8,0) med 0,5 g/ml ethidiumbromid eller 5XTBE 

buffer med ethidiumbromid (OLI kat. nr. 5XTBE100) 

Agarose af elektroforesekvalitet (feks. FMC Seakem ® LE) 

C. Fremgangsmåde trin for trin. 

Der henvises til Brugsanvisning nedenfor. 

BRUGSANVISNING 

A. Tilberedelse af prøve 

1. Oprens genomisk DNA af leukocytprøve med den foretrukne metode. Endelig DNA-koncentration bør være 25 - 

200ng/l (100ng/l er optimalt) med A260/A280-forholdet mellem 1,65-1,80. 

2. For specifikke oplysninger om prøvetilberedelse og -opbevaring, se Prøvetagning og –forberedelse ovenfor. 

3. Udfør PCR på den oprensede DNA-prøve vha. en Micro SSP HLA DNA-typebestemmelsesbakke eller opbevar 

DNA-prøven ved –20C eller under indtil klar til typebestemmelse. 

B. Tilberedelse af reagens/udstyr 

1. Programmér en termisk cykler til at køre One Lambda PCR-programmet. (Se "Instrumentkrav" ovenfor.) 

2. Hav klar: rekombinant Taq-polymerase (5 enheder/l) Opbevar ved -20 C. 

3. Forbered elektroforesegel (2,5% agarose) vha. Micro SSP gel-systemet (kat. nr. MGS108) eller med mindst 96 

prøvebrønde (anbring rækker med brønde mindst 1 cm fra hinanden). 



C. Vejledning til pipettering af Taq-polymerase 

One Lambda's kvalitetskontroltests angiver, at den viste mængde på Taq-polymeraseetiketten er mere end rigelig til 

antallet af tests angivet på dette produkt. Hvis yderligere Taq er påkrævet, skal det bestilles direkte fra F. Hoffmann-La 

Roche eller deres repræsentant. 

For at undgå spild, følges de simple instruktioner angivet nedenfor til pipettering af Taq-polymerase. 

Bemærk: Taq-polymerase er meget viskøs og der skal udvises megen forsigtighed ved alikvoteringsprocessen. Hvis de 

nedenfor beskrevne trin ikke følges, kan det resultere i reagenstab. 

1. Pipettér langsomt vha. en kalibreret Gilson ® Pipetman ® . (En P10 Pipetman ® anbefales til øget nøjagtighed.) 

2. Pipettespidsen bør blot akkurat passere Taq's overfladelag. 

Advarsel: Pipettespidsen må ikke nedsænkes i Taq. 

3. Tør omhyggeligt overskydende Taq fra pipettespidsen på kanten af hætteglasset. 

D. Trinvis procedure 

1. Fjern fra den angivne opbevaringstemperatur: Mængden (glasset) af Micro SSP D-blanding, der matcher den 

valgte Micro SSP primersætbakke, primersætbakken(erne) og det behørige antal DNA-prøver. Optø ved 

stuetemperatur (20 til 25 C). 

Bemærk: Du kan skære bakke og bakkeforsegling op i det antal tests, der er nødvendige for en enkelt arbejdssession. 

Sæt straks de ubrugte portioner tilbage i den korrekte opbevaringstemperatur. 

2. Vortex DNA-prøver til blanding. 

3. Anbring primersætbakken i et mikroglasopbevaringsstativ til PCR-bakke (Robbins Scientific, kat. nr. 1044-39-5) og 

fjern bakkens etiket. 

4. Fjern rekombinant Taq-polymerase fra fryseren og opbevar på is, indtil det skal anvendes. 

5. Vha. en Pipetman® (eller tilsvarende) tilsættes 1 l DNA-fortynder til reaktionsglasset med den negative kontrol på 

primersætbakken. 

6. Vha. en Pipetman® (eller tilsvarende) tilføjes rekombinant Taq-polymerase (5 enheder/l) til Micro SSP Dblandingsglasset. 

(Se Micro SSP produkttabel vedrørende mængden.) 

7. Sæt hætten på glasset og vortex i 5 sekunder. Impulscentrifugér Micro SSP D-blandingsglasset i en 

mikrocentrifuge for at bringe al væske ned fra siderne af glasset. 

8. Vha. en P20 Pipetman® (eller lignende), pipettér 9 l Micro SSP D-blanding i det negative kontrolreaktionsglas. 

9. Vha. en Pipetman® (eller tilsvarende) tilføjes DNA-prøven til Micro SSP D-blandingsglasset. (Se Micro SSP 

produkttabel vedrørende mængden.) 

10. Sæt hætten på glasset og vortex i 5 sekunder. Impulscentrifugér Micro SSP D-blandingsglasset i en 

mikrocentrifuge. 

11. Vha. en P20 Pipetman® eller en elektronisk Pipetman® alikvoteres 10 l af prøve-reaktionsblandingen fra Micro 

SSP D-blandingsglasset i hvert reaktionsglas, med undtagelse af det negative kontrolreaktionsglas fra Micro 

SSP primersætbakken. 

Vigtigt: Sørg for at give ovenstående prøve primerne (tørret i bunden af hver reaktionsglas) for at undgå 

krydskontaminering mellem glas. Rør den indvendige side af glasset med pipettespidsen for at lade prøven glide ned 

til bunden af glasset. Tjek, at alle prøver er faldet ned til bunden af hvert glas. Hvis ikke, bankes der let på 

arbejdsbordet, således at alle prøver bundfælder sig, før du begynder PCR. 

12. Dæk reaktionsglassene med den vedlagte bakkeforsegling. Sørg for, at alle reaktionsglas er helt dækket af 

bakkeforseglingen for at sikre fuldstændig tætning og for at forhindre fordampningstab under PCR. 

13. Anbring Micro SSP primersætbakken i termisk cykler eller lignende model med en passende glasbakkeadapter. 

14. Anbring en trykpude oven på bakken med den teksturerede side op før termisk cyklerlåget lukkes. (Se Micro SSP 

trykpudeprotokol for vejledning vedrørende den specifikke pude, der skal anvendes sammen med din termisk 

cykler.) 

15. Indtast dit Micro SSP PCR-programnummer. Angiv en mulighed for 10 l reaktionsmængde. 

16. Start PCR-programmet. Programmet tager ca. 1 time og 16 minutter. Det sidste trin vil holde prøven på 4 C, indtil 

kørslen er stoppet. 

17. Fjern primersætbakken fra termisk cykler . Fjern forsigtigt bakkeforseglingen uden at stænke på prøverne. Eller 

opbevar prøverne i primersætbakken ved -20 C for senere gel-elektroforese. 

18. Overfør hver PCR-reaktion (10 l) i sekvens med en 2,5% agarose-gel i Micro SSP gelsystemet (OLI kat. nr. 

MGS108). (Anvendelse af en 8- eller 12-kanals Pipetman® eller af 96-brøndsoverførselsanordningen (OLI kat. nr. 

TRNDV96) anbefales kraftigt.) 



Bemærk: Sørg for at overføre alle prøver i den korrekte sekvens, og vend primersætbakken med den negative 

kontrolreaktionsbrønd i øverste venstre hjørne. Prøvernes rækkefølge er (for at matche arbejdsarket)fra venstre til 

højre, oven fra og ned. Ingen tilsætning af elektroforesefarve er nødvendig. 

19. Elektroforesér prøverne ved 140 - 150 volts indtil den røde sporingsfarve er trængt omkring 0,5 cm ind i gel'en (ca. 

3 – 5 minutter, afhængig af den anvendte agarose. 

20. Fotografér gel'en på en UV-transilluminator. 

21. Fortolk typebestemmelsesresultaterne vha. arbejdsarket, der var vedlagt bakkerne eller vha. HLA-softwaret, der fås 

fra One Lambda, Inc. 

Bemærk: Når One Lambda's DNA-typebestemmelsesbakker kun fylder nogle få rækker af elektroforesegel'en, er det muligt at 

anbringe adskillige prøver på én gel. Sørg for omhyggeligt at registrere gel'ens positioner. 

RESULTATER 

Allele-grupper DR 72 

serologi 

DRB1*01 12 12 

DRB1*15 24 24 

DRB1*16 2 2 

DRB1*0301, 0304 6 6 

DRB1*0302, 0303 6 6 

DRB1*04 14 14 

DRB1*11 23 a 

24 

DRB1*12 5 5 

DRB1*13 17 17 

DRB1*14 11 b 

Micro SSP 

10 

DRB1*07 16 16 

DRB1*08 7 7 

DRB1*09 5 5 

DRB1*10 5 5 

DRB5* 26 26 

DRB3* 57 c 

56 

DRB4* 32 d 

33 

DQB1*05 34 34 

DQB1*06 32 32 

DQB1*02 24 24 

DQB1*0301, 0304 22 22 

DQB1*0302, 0304 11 11 

DQB1*0303 3 3 

DQB1*04 11 11 

a, b) Afvigelserne på DRB1*11 og DRB1*14 er baseret på en prøve i 

hvilken serologi tildelte en DRB1*14 mens DNA-typebestemmelse 

tildelte DRB1*1117. DRB1*14 serologiske reagenser er 

monoklonale antistoffer, som forventes at detektere epitopen 

31 FHNQEEF 37 baseret på mønsteranalyse med DRB1*14 alleler. 

Denne aminosyresekvens deles også med DRB1*1117 (baseret på 

offentliggjorte aminosyresekvenser). 

c) Uoverensstemmelsen på DRB3 er baseret på en prøve, der blev 

tildelt en homozygous DRB1*08 både via serologi og DNAtypebestemmelse, 

men blev tildelt endnu en DRB3* via serologi. 

DRB1*08 og DRB3* deler aminosyresekvenser, som under 

dobbeltdosiseffekterne af DRB1*08 homozygositet kan generere 

falskpositive reaktioner. 6 

d) Den falsknegative uoverensstemmelse på DRB4 er baseret på en 

prøve i hvilken kun DNA-typebestemmelse tildelte en DRB4. 

Opgaver både via serologi og DNA-typebestemmelse viser, at 

denne prøve indeholder DR7-DQ9-haplotypen, som man ved 

mangler udtryk for DRB4-allelen ved proteinniveauet. 7 

Bemærk: Lotspecifikke præstationsdata fås på anmodning. 

PROCEDURENS BEGRÆNSNINGER 

A. PCR-SSP er en dynamisk proces, der kræver yderst kontrollerede forhold for at sikre diskriminantforstærkelse. Proceduren, 

der er vedlagt dette produkt, skal overholdes nøje. 

B. Den ekstraherede prøve-DNA giver skabelonen for den specifikke forstærkelsesproces og skal således have dens 

koncentration og renhed inden for værdiområderne, der er specificeret i denne procedure. 

C. Alle instrumenter (feks. PCR-maskine, pipetteringsanordninger) skal kalibreres i henhold til fabrikantens anbefalinger. For 

at få lotspecifikke oplysninger, se dokumentet vedrørende Opløsningsbegrænsninger. 

D. For at få lotspecifikke oplysninger, se dokumentet vedrørende Opløsningsbegrænsninger. 

FORVENTEDE VÆRDIER 

A. Data-analyse 

1. Et internt kontrolbånd (langsomtvandrende) bør altid være synligt i negative brønde (med undtagelse af negative 

kontrolbrønde) som en kontrol for vellykket forstærkelse. Ikke-forstærkelse af enhver brønd kan annullere testresultater. 

2. Et hurtigtvandrende, positivt typebestemmelsesbånd vil blive observeret på den elektroforetiske gel, hvis et specifikt 

HLA-gen blev forstærket under PCR. Dette angiver et positivt restresultat. 

3. Det interne kontrolbånd kan være svagt eller mangle i positive brønde. 



4. Match mønstret af positive brønde med oplysningerne på Micro SSP arbejdsarket for at opnå HLA-typebestemmelsen 

af prøve-DNA'en. 

5. Tilstedeværelsen af det interne kontrolbånd og/eller det positive typebestemmelsesbånd i negative kontrolbrønde 

ugyldiggør alle testresultater. 

6. Valgfri analyse – HLA Fusion software. 

B. Gelfortolkning* 

Positiv 

reaktion 

Negativ 

reaktion 

Ikkeforstærkelse 

Brønd 

Internt kontrolbånd 

Positivt 

typebestemmelsesbånd 

Primerbånd 

*Det interne kontrolbånd og brede uinkorporerede primerbånd tjener som størrelsesmarkører. Ethvert synligt bånd mellem 

de to markører i forskellige størrelse bør betragtes som positive typebestemmelsesbånd. 

SPECIFIKKE PRÆSTATIONSEGENSKABER 

En sammenligning mellem Micro SSP og serologiske HLA-typebestemmelsesmetodologier blev udført for at vurdere 

nøjagtigheden af Micro SSP HLA-typebestemmelsessystemet. I denne sammenligning blev 81 tilfældige fuldblodsprøver 

indsamlet og analyseret for deres HLA klasse II-typebestemmelse vha. One Lambda, Inc., HLA klasse II 

vævstypebestemmelsesbakke DR72F og Micro SSP generisk HLA klasse II DNA typebestemmelsesbakke. Resultaterne viser 

en 96% (78/81) overensstemmelse mellem de to metoder. Tabellen på næste side repræsenterer det samlede antal gange hver 

specificitet blev tildelt via de to forskellige metoder. (Fremhævede resultater angiver uoverensstemmelse mellem de to metoder.) 

BIBLIOGRAFI 

1) Terasaki, P.I., Bernoco, F., Park, M.S., Ozturk, G., and Iwaki, Y. Microdroplet testing for HLA-A, -B, -C and -D antigens. 

American Journal of Clinical Pathology 69:103-120, 1978. 

2) Newton, C.R., Graham, A., Heptinstall, E., Powell, S.J., Summers, C., Kalsheker, N., Smith, J.C., and Markham, A.F. 

Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS). Nucleic Acids Research 17: 

2503-2516, 1989. 

3) Slater, R.D. and Parham, P. Mutually exclusive public epitopes of HLA-A,B,C Molecules. Human Immunology 26: 85-89, 

1989. 

4) Bodmer J., Marsh S., Albert E., Bodmer W., Bontrop R., Charron D., Dupont B., Erlich H., Mach B., Mayr W., Parham P., 

Sasazuki T., Schreuder G., Strominger J., Svejgaard A. and Terasaki P. Nomenclature for factors of the HLA system, 1995. 

Human Immunology 43:149-164, 1995. 

5) Terasaki, P.I. Histocompatibility Testing, 1980. UCLA Tissue Typing Laboratory, Los Angeles, California. 

6) Savage, D.A., Bidwell, J.L., Cullen, C., Bidwell, E.A., and Middleton, D. Identification of HLA-DRw52 associated antigens 

using HLA class II allogenotyping. Tissue Antigens 32: 278-285, 1988. 

7) Sutton, V.R., Kienzle, B.K., and Knowles, R.W. An altered splice site is found in the DRB4 gene that is not expressed in 

HLA-DR7, Dw11 individuals. Immunogenetics 29: 317-322, 1989. 



FEJLFINDING 

Problem Mulige årsager Løsninger 

Ingen bånd eller 

svage bånd 

DNA Ikke anvendt nok 

Ikke ren nok (A260/A280 ikke inden for 

1,65 – 1,80) 

PCR-inhibitor til stede (feks. EDTA over 

0,5 mM) 

Rekombinant Taqpolymerase 

Ikke anvendt nok 

Enzym degraderet 

Gentag test; angiv mængde 

angivet i Micro SSP 

produkttabel. 

Gentag DNA-præparationen; 

kontrollér at A260/A280 er inden 

for 1,65 – 1,80, og gentag 

dernæst testen. 


resuspendér DNA i opløsning med 

EDTA < 0,5 mM, og gentag 




produkttabel. 

Gentag test; anvend frisk glas 

enzym. 

EtBr Ikke anvendt nok Klargør 1 X TBE med EtBr à 0,5 

g/ml. Gentag test. 

Trykpude Trykpude slidt op Udskift trykpude efter 300 PCRkørsler. 

Falske bånd DNA For meget anvendt 

Ikke ren nok (A260/A280 ikke inden for 

1,65 – 1,80) 

Kontamineret (andet DNA eller PCRprodukt) 

Bånd i negativ 

kontrol 

Rekombinant Taqpolymerase 

VAREMÆRKER ANVENDT I DETTE 

DOKUMENT/PRODUKT 

Micro SSP One Lambda Inc. 

GeneAmp Perkin-Elmer 



produkttabel. 


kontrollér at A260/A280 er inden 

for 1,65 – 1,80, og gentag 


Anvend nye alikvotter for alle 

buffere/reagenser til DNAekstraktion 

og PCR; gentag DNAekstraktion 

og test. 

For meget anvendt Gentag test; angiv mængde 


produkttabel. 

EtBr For meget anvendt Klargør 1 X TBE med EtBr à 0,5 

g/ml. Gentag test. 

Reagenser Kontamineret (andet DNA- eller PCRprodukt) 

Fotodyne FOTO/UV 21 FOTODYNE Incorporated 

Anvend nye alikvotter for alle 

buffere/reagenser til DNAekstraktion 

og PCR; gentag DNAekstraktion 

og test. 

FMC SeaKem FMC Corporation 

ARMS 

Gilson ® og Pipetman ® 

Zeneca Limited 

Rainin Instrument Co., Inc. 

Veriti Applied Biosystems 



ANVENDTE PATENTER I DETTE DOKUMENT 

Bemærkning til køber vedrørende licenseret produkt: Købsprisen af dette produkt inkluderer begrænsede, ikke-overførbare rettigheder under 

amerikanske patenter 4,683,202; 4,683,195 og 4,965,188 og deres udenlandske modparter, ejet af Roche Molecular Systems, Inc. og F. 

Hoffmann-LaRoche Ltd ("Roche"), som består i kun at anvende denne mængde af produktet til at praktisere polymerase kædereaktions- 

("PCR") processen beskrevet i nævnte patenter kun til HLA-typebestemmelsesanvendelser af køber udelukkende til organ, knoglemarv eller 

vævstransplantation og ekskluderer udtrykkeligt analyse af retslægeligt bevis eller faderskabskontrol. Retten til at anvende dette produkt med 

henblik på at udføre og tilbyde kommercielle tjenesteydelser mht. HLA-typebestemmelse til organ- eller vævstransplantation vha. PCR, 

herunder rapportering af resultaterne af købers aktiviteter mod et gebyr eller andet kommercielt vederlag, gives hermed også. Yderligere 

oplysninger vedrørende køb af licenser til at anvende PCR kan fås ved i USA at kontakte Director of Licensing, Roche Molecular Systems, 

Inc., 1145 Atlantic Avenue, Alameda, California 94501, og uden for USA, PCR Licensing Manager, F. Hoffmann-La Roche Ltd, 

Grenzacherstr.124, CH-4070 Basel, Schweiz. 

SSP-teknologi er licenseret af Zeneca Limited, gennem dets Zeneca Diagnostics-virksomhed, Blacklands Way, Abingdon Business Park, 

Abingdon, Oxfordshire, England OX14 IDY og dækket under følgende patenter tilhørende Zeneca Corporation: Europæisk patentnr. 0 332 435 

B1, amerikansk patentnr. 5,595,890, ved navn "Method of detecting nucleotide sequences," og canadisk patentnr. 1323592 samt tilsvarende 

patenter og patentansøgninger verden over. 

Micro SSP DNA-typebestemmelsesreagenser fremstilles og forhandles af One Lambda, Inc., 21001 Kittridge Street, Canoga Park, CA 

91303, U.S.A. Rekombinant Taq-polymerase fremstilles af F. Hoffmann-LaRoche. 

EUROPÆISK AUTORISERET REPRÆSENTANT 

MDSS GmbH, Schiffgraben 41, D-30175 Hannover, Tyskland 

REVISIONSHISTORIE 

Revision Dato Beskrivelse af revision 

16 2009/07 

17 2011/12 

Side 3, Vedlagte materialer; fjern reference til Micro SSP referencetabel. Flyt Taq-polymrase til 

Påkrævede materialer, der ikke er vedlagt. 

Tilføj fodnote sammen med 0197 (0197 gælder kun for produkter i Bilag II, Liste B). Tilføj 

yderligere CE-mærke for produkter, der ikke indgår i Bilag II, Liste B. 

18 2012/11 Tilføj Fusion-software som en valgmulighed. Ændret øverste overskrift. 

* 

*0197 Gælder kun for produkter i Bilag II, Liste B.

Micro SSP HLA DNA Typing Trays, DANISH VERSION - One Lambda

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?