I N F O R M A C J A O P R O D U K C I E - One Lambda

One Lambda, Inc.
21001 Kittridge Street, Canoga Park, CA 91303-2801 USA Tel: +1 (818) 702-0042 Faks: +1 (818) 702-6904
strona internetowa: www.onelambda.com
I N F O R M A C J A O P R O D U K C I E
ZESTAWY SUROWIC TERASAKI HLA KLASY I I KLASY II TISSUE TYPING - 100 µL
Do użycia w diagnostyce in vitro.
PRZEZNACZENIE
Do użycia w celu określenia techniką mikrolimfocytotoksyczną, zależną od dopełniacza, antygenów powierzchniowych komórek HLA, dla
laboratoriów wymagających odczynników do typowania podzielonych na części.
STRESZCZENIE I WYJAŚNIENIE
Zestawy Terasaki HLA klasy I i klasy II Tissue Typing Sera, zawierające antysurowice lub przeciwciała monoklonalne, są używane do
określenia obecności antygenów HLA klasy I lub II na limfocytach T i B. Każda probówka zawiera 100 mikrolitrów (100 µl) swoistej
antysurowicy. Każdy zastaw surowicy zawiera kontrolę pozytywną i negatywną.
REGUŁA
Zdolne do życia limfocyty są inkubowane z komplementarnie wiążącym przeciwciałem. Jeżeli limfocyty posiadają antygen rozpoznawalny
przez specyficzne przeciwciało, fragment Fab przeciwciała wiąże się z antygenem tworzącym kompleks antygen-przeciwciało. Po
utworzeniu tych kompleksów, dodany jest dopełniacz króliczy. C1q i jony Ca ++ dopełniacza wiążą się z fragmentem FC przeciwciała.
Wymagane jest jedno przeciwciało przeciw IgM do związania jednej cząsteczki C1q lub dwa przeciwciała przeciw IgG do związania jednej
cząsteczki C1q. Wiązanie C1q z kompleksami antygen-przeciwciało zapoczątkowuje kaskadę dopełniacza, która prowadzi do lizy
komórki. W reakcji negatywnej limfocyty są żywe. W reakcji pozytywnej limfocyty są martwe.
ODCZYNNIKI
A. Identyfikacja
Zestawy surowicy Terasaki HLA klasy I i klasy II zawierają znane alloantysurowice klasy I lub klasy II lub przeciwciała
monoklonalne. Każda mikroprobówka zawiera 100 µl przeciwciała. Źródłem przeciwciał monoklonalnych może być mysz lub
człowiek.
B. Uwagi lub ostrzeżenia
1. Do użycia w diagnostyce in vitro.
2. Ostrzeżenie: Wszystkie produkty krwiopochodne powinny być traktowane jako potencjalnie zakaźne. Materiał źródłowy, od
którego pochodzi ten product wykazał odczyn negatywny, gdy był testowany zgodnie z obecnie wymaganymi testami przez
Agencję do Spraw Żywności i Leków (FDA). Żadna ze znanych metod nie może dać pewności, że produkty pochodzące od
ludzkiej krwi nie będą czynnikami przenoszącymi zakażenie.
3. Ostrzeżenie: Bromek etydyny jest znanym karcynogenem. Obchodź się z nim z należytą uwagą. Może być szkodliwy w
przypadku wchłonięcia przez skórę. Unikaj rozpryskania do oczu lub na skórę czy ubranie. Przechowuj szczelnie zamknięty.
Umyj dokładnie miejsca kontaktu. Spłucz wyciek wodą ze spryskiwacza.
4. Aby zasięgnąć szczegółowych informacji, odnieś się do Arkusza charakterystyki bezpieczeństwa materiału.
C. Instrukcja użycia
Patrz “Wskazówki użycia”.
D. Informacje o przechowawaniu
Przechowuj odczynniki w temperaturze oznaczonej na opakowaniu. Użyj przed upłynięciem daty ważności. Zaleca się, żeby
odczynniki które zostały oznaczone były użyte w ciągu 6 miesięcy.
E. Oczyszczanie lub specjalne traktowanie wymagane przed użyciem
Patrz “Wskazówki użycia”.
F. Oznaki niestabilności
Zakażenie bakteryjne i/lub poddanie działaniu dwutlenku węgla spowoduje zmianę pH surowic. Ta zmiana pH jest wyrażona zmianą
koloru z różowego na żółty. Jeżeli taka zmiana nastąpi, wyrzuć płytki.
ZBIERANIE I PRZYGOTOWANIE PRÓBEK
Ponieważ do typowania serologicznego wymagane są limfocyty żywe, krew powinna być odebrana i przygotowana natychmiast po jej
dostarczeniu. Wydajność limfocytów zmniejsza się z czasem i w ekstremalnych temperaturach. Krew należy zbierać w rozworze dekstrozy
z kwasem cytrynowym (ACD) lub w heparynie z sodem. Przechowywać w pozycji poziomej w temperaturze pokojowej (20 - 25° C) i
przeprowadzić proces w ciągu 48 godzin, dla maksymalnej wydajności limfocytów T i B .
Korekta 0B: June 2004 Strona 1 z 5
SERA_SETS_PI_PL.doc

PROCEDURA
A. Dostarczone materiały
1. Siatka rozmieszczeń na płytce do typowania
2. Arkusze wzoru reakcji
3. Arkusze robocze, które identyfikują specyficzne cechy każdego odczynnika do typowania
4. Dopełniacz gotowy do użycia, składający się z nierozcieńczonej surowicy króliczej zsumowanej z dużej ilości, conajmniej 15
królików. Dostarczony dopełniacz nie może być rozcieńczony.
5. Wydrukowane etykiety na płytki
B. Materiały wymagane, ale nie dostarczone
1. Mikrostrzykawki
2. Insta-Seal (OLI Nr kat. TIS250U) i wazelina (Vaseline)
3. Odczynniki do barwienia i utrwalania:
a. Do testów na wykluczenie barwnika: eozyna Y (zasada sodowa) i formaldehyd lub Stain-Fix (OLI Nr kat. SF-500)
b. Do testów fluorescencyjnych: FluoroQuench AO/EB (OLI Nr Kat. FQAE-500) lub FluoroQuench EB (OLI Nr Kat.
FQEB-500) lub dodaj 1 ml roztworu zapasowego EB do 9 ml hemoglobiny lub 1% atrament (patrz poniższe
Materiały Nr 4 - 7 ).
4. Hemoglobin Quench
a. Liofilizowana wołowa
• Rozpuść 10 g hemoglobiny w 100 ml 5% roztworu EDTA PBS. Dodaj 1 ml 1% roztworu azydku sodu.
• Wiruj przez 45 minut z prędkością 1000 g. Przechowuj supernatant w temperaturze -20° C.
b. Z czerwonych ciałek krwi
• Roztwór zapasowy: Przemyj 3 razy roztworem soli zapakowane czerwone ciałka krwi. Przygotuj 70% hematokryt,
zamróź i rozmróź. Wiruj na ultrawirówce przez 45 minut, z prędkością 20,000 g. Dializuj przez 3 dni roztworem soli
fizjologicznej.
• Roztwór roboczy: Dodaj 10 ml 5% roztworu EDTA PBS. Dodaj 1 ml 1% roztworu ayzdku sodu do 89 ml
hemoglobiny. Przechowuj w temperaturze -20° C.
5. 1% Ink Working Quench
a. Rozpuść 1 gM albumenu surowicy krowiej (BSA) w 10 ml 5% roztworu EDTA PBS.
b. Do 9,8 ml roztworu BSA/5% EDTA/PBS dodaj:
• 100 µl 1% roztworu azydku sodu
• 100 µl Higgins Black Calligraphy Ink (e.g. czarnego tuszu kaligraficznego Higginsa)
6. 5% roztwór EDTA (dwusodowy) PBS
a. Rozpuść 5 gM roztworu EDTA w 90 ml PBS.
b. Przy użyciu 10M NaOH doprowadź do pH 7,2
c. Przy użyciu PBS doprowadź końcową objętość roztworu do 100 ml.
7. Bromek etydyny (EB) – roztwór zapasowy: Rozpuść 50 mg w 1 ml wody destylowanej. Dodaj 49 ml PBS. Ogrzewaj w łaźni
wodnej w temperaturze 56° C przez 30 minutes. Przechowuj w temperaturze -20° C.
8. Dwuoktan karboksyfluoresceiny (CFDA)
a. Roztwór zapasowy: W szklanej probówce rozpuść 10 mg CFDA w 1 ml acetonu . Przechowuj w temperaturze -20°C w
probówkach Beckmana.
b. Roztwór roboczy: Użyj jednego z podanych poniżej:
• Przygotowany w PBS o pH 7,2: Dodaj 30 µl roztworu zapasowego CFDA do 5 ml PBS (pH 7,2). Przechowuj w
temperaturze 2 - 5° C przez czas nie dłuższy niż 1 tydzień.
• Przygotowany w PBS o pH 5,5: Dodaj 30 µl roztworu zapasowego CFDA do 5 ml PBS (pH 5,5). Przechowuj w
temperaturze 2 - 5° C przez czas nie dłuższy niż 1 tydzień.
9. Ciężki olej mineralny (OLI Nr Kat. MO)
10. Jednostronna ostrze do usuwania zatyczek probówek do mikrowirówki.
11. 60- lub 72-studzienkowe płytki mikrotestujące
C. Procedura krok-po-kroku
Patrz poniższe “Wskazówki do użycia”.
Wskazówki użycia
Uwagi:
1. Dla wielu płytek testowych, odnieś się do arkusza roboczego po pozycje startowe próbek.
2. Dla metod izolacji limfocytów, odnieś się do Instrukcji procedur laboratoryjnych (ASHI
Laboratory Procedure Manual 5 ) , informacji o produkcie firmy One Lambda
FluoroBeads® lub metod izolacji limfocytów LymphoKwik®.
A. Przygotowanie do oznaczenia lub nakładania 100 µl surowicy na mikropłytki
1. Oznacz liczbę płytek (lub mikropłytek testujących) do użycia.
2. Umieść wydrukowane etykiety, które znajdują się w zestawie zawierającym 100 µl surowicy.
Korekta 0B: June 2004 Strona 2 z 5
SERA_SETS_PI_PL.doc

3. Aby zapobiec wyparowaniu surowicy, przed wprowadzeniem antysurowicy płytki należy naoliwić (5 µl ciężkiego oleju
mineralnego na studzienkę), używając pipety automatycznej lub ręcznej.
4. Przygotuj 400 µl probówki do mikrowirówki, które zawierają odczynniki do typowania na płytkach, zgodnie z siatką
rozmieszczenia i rozmrażania.
5. Dokładnie (ale nie energicznie) wymieszaj każdą antysurowicę .
6. Przy użyciu nożyka lub żyletki natnij i usuń zatyczki probówek do mikrowirówki.
7. Umieść każdą przeciwsurowicę w statywie na probówki. Statyw na probówki powinien mieć format na 60 lub 72 probówki
odpowiadający formatowi płytki do typowania, która będzie użyta.
8. Surowice lub odczynniki do typowania mogą być nakładane rzędami, przy użyciu sześcio-miejscowej pipety (1 µl na studzienkę)
lub przy użyciu automatycznego urządzenia, które nakłada surowice do całej naoliwionej płytki za jednym razem.
9. Sprawdź każdą studzienkę płytki na nieobecność surowicy po zakończeniu nakładania.
10. Użyj pojedynczej (1 µl) strzykawki, aby uzupełnić brakujące miejsca w studzienkach.
11. Umieść napełnione lub oznaczone płytki w plastykowych torebkach lub pojemnikach i przechowuj w zamrażalniku o minimalnej
temperaturze -60° C lub niższej, do czasu ich użycia. (Użyj wypełnione lub oznaczone płytki w ciągu 6 miesięcy.)
B. Testowanie
1. Rozmrażaj płytki w temperaturze 20 - 25° C przez 15 minutes i użyj w ciągu 30 minutes od rozmrożenia.
Uwaga: Nie zamrażaj ponownie.
2. Do każdej studzienki dodaj 1 µl zawiesiny limfocytów T lub B w stężeniu 2 x 10 6 komórek/ml do płytki klasy I lub limfocytów B
do płytki klasy II. Dla użycia CFDA w teście fluorescencji, patrz część “B” poniżej.
3. Wymieszaj mikrokrople używając elektrostatycznego miksera lub drutu.
4. Inkubuj płytki w temperaturze pokojowej (20 - 25° C) przez 30 minut.
5. Do każdej studzienki płytki testowej odmierz 5 µl of odpowiednienngo króliczego HLA-ABC lub dopełniacza DR (dostarczony).
6. Inkubuj płytki w temperaturze pokojowej (20 - 25° C) przez 1 godzinę.
7. Po inkubacji wybarw i utrwal komórki:
a. Do testów na wykluczenie barwnika, do każdej studzienki dodaj:
• 5 µl barwnika eozynowego, a następnie po odczekaniu 2 minut, 5 µl formaldehydu lub
• 10 µl roztworu Stain-Fix (OLI Nr Kat. SF-500).
b. Do testów fluorescencyjnych, dodaj 5 µl roztworu FluoroQuench AO/EB (OLINr Kat. FQAE-500). Do testów
CFDA (rozdział B poniżej), do każdej studzienki dodaj 5 µl roztworu FluoroQuench EB (OLI Nr Kat. FQEB-500)
lub 50 µl bromku etydyny na 1 ml hemaglobin quench lub 1% ink quench. Dodaj 5 µl na studzienkę.
8. Przykryj płytki Terasaki Insta-Seal (OLI Nr Kat. TIS250U). Jeżeli używasz szkiełka podstawowego, uszczelnij za pomocą
stopionej wazeliny. Pozostaw płytki w temperaturze pokojowej (20 - 25° C) przez 15 minut, aby umożliwić osadzenie się
limfocytów. Płytki do wykluczenia barwnika mogą być przechowywane w temperaturze 2 - 5° C przez czas nie dłuższy niż 2
tygodnie. Płytki fluorescencyjne mogą być przechowywane w temperaturze 2 - 5°C w zaciemnionym pomieszczeniu przez czas
nie dłuższy niż 2 dni. Płytki przykryte szkiełkami podstawowymi Terasaki Insta-Seal muszą być analizowane tego samego
dnia, którego zostały przygotowane do testowania.
C. Fluorescencja: Znakowanie preparatu limfocytów przy użyciu CFDA.
1. Inkubuj limfocyty w 500 µl CFDA o pH 7,2 w temperaturze 37° C przez 15 minut lub w CFDA o pH 5,5 w temperaturze 20 -
25° C przez 5 minut.
Uwaga: Dla limfocytów izolowanych przy użyciu perełek magnetycznych, inkubuj 500 µl CFDA o pH 5,5 w
temperaturze 20 – 25 °C przez 10 minut.
2. Wiruj przez 1 min. z prędkością 1000 g. Odbierz supernatant. Uwaga: W przypadku limfocytów izolowanych przy użyciu perełek
magnetycznych, umieść na magnesie na 1 minutę. Odbierz supernatant.
3. Zawieś ponownie w PBS.
4. Dwukrotnie powtórz krok 2 i 3.
5. Zawieś ponownie komórki w pożywce McCoy’s zawierającej 0.5% FCS i doprowadź komórki do stężenia 2 x 10 6 komórek/ml.
Chroń przed światłem.
6. Postępuj według kroków 2 - 8 powyższego paragrafu “Testowanie” .
WYNIKI
Śmierć komórki może nastąpić w każdej studzience testu, gdzie komórkowy antygen powierzchniowy HLA jest rozpoznawany przez
odpowiadające mu przeciwciało anty-HLA.
Stosując wykluczenie barwnika, negatywne (żywe) limfocyty są małe, jasne i załamują światło. Pozytywne (martwe) limfocyty barwione
eozyną są ciemne i nie załamują światła . Reakcje są oceniane poprzez określenie procentowej śmierci komórek.
Stosując testy fluorescencyjne z wykorzystaniem dwuoktanu karboksyflouresceiny (CFDA) lub oranżu akrydyny, negatywne (żywe)
limfocyty są zielone. Podczas użycia bromku etydyny lub jodku propidyny, pozytywne (martwe) limfocyty są czerwone.
OGRANICZENIA PROCEDURALNE
Trudności w izolacji komórek i zanieczyszczenie preparatu limfocytów czerwonymi ciałkami krwi, drożdżami, monocytami, płytkami krwi
lub granulocytami może powodować błędne wyniki. Ponadto, błędne wyniki mogą wystąpić kiedy stężenia komórek są wyższe lub niższe
od przyjętych poziomów.
Korekta 0B: June 2004 Strona 3 z 5
SERA_SETS_PI_PL.doc

Zanieczyszczenia bakteryjne lub zmiany pH antysurowic mogą powodować fałszywie negatywne reakcje. Niektóre antygeny HLA często
wykazują słabe reakcje na antysurowice o innych właściwościach. Są to antygeny reagujące krzyżowo, wyszczególnione przez antygen i
surowicę z każdej płytki w załączonym przewodniku charakterystyki reakcji. Na płytkach do typowania klasy II, kontrola limfocytów
anty-B musi być pozytywna, aby potwierdzić, że preparat komórkowy jest wzbogacony o limfocyty B. Test jest nieważny, jeżeli
ocena punktowa kontroli jest niższa niż 6.
SPODZIEWANE WARTOŚCI
Mikroskopowa analiza testów
Reakcje są oceniane poprzez określenie procentowej śmierci komórek. Jeżeli kontrola negatywna zawiera martwe limfocyty, procentowa
ilość martwych komórek w pozostałych studzienkach musi być odpowiednio dopasowana.
W poniższej tabeli jest zaprezentowany standardowy schemat odczytywania ASHI:
Punkty Śmierć komórek Interpretacja
1 0-10% Negatywny
2 11-20% Wątpliwie negatywny
4 21-50% Słabo pozytywny
6 51-80% Pozytywny
8 81-100% Silnie pozytywny
0 nie możliwe do
odczytania
Częstotliwości fenotypowe dla HLA klasy I i klasy II będą się różnić w zależności od populacji (np.: rasa biała, rasa czarna, rasa żółta itd.).
Patrz odnośnik 4.
CHARAKTERYSTYKA SPECYFICZNEGO PRZEBIEGU REAKCJI
A. Moc i specyficzność
Odczynniki testu były precyzyjnie scharakteryzowane poprzez odrębne serologiczne skryningi sekwencji. W dwóch odrębnych
skryningach są wykorzystywane zespoły odnośników do próbek zamrożonych limfocytów.
Dwie-trzecie wszystkich wyselekcjonowanych odnośników zawiera jasno zdefiniowaną specyficzną reaktywność na HLA (z 70%
wskaźnikiem mocy), pozwalając na nie więcej niż 10% fałszywie pozytywnych i 15% fałszywie negatywnych reakcji. Pozostała
jedna-trzecia antysurowic lub przeciwciał monoklonalnych nie spełnia tych kryteriów, ale jest przydatna do badań, kiedy jest używana
jako pomoc dla innych dobrze zdefiniowanych antysurowic. Multispecyficzne antysurowice są używane tylko, jeżeli monospecyficzne
antysurowice są dostępne o określonej swoistości.
Zostały wybrane multispecyficzne antysurowice o takiej samej jak w przypadku monospecyficznych antysurowic charakterystyce
przebiegu reakcji dla wszystkich swoistych własności. Skryning zbioru świeżo przygotowanych limfocytów jest używany w celu
potwierdzenia i zaakceptowania mocy antysurowicy i jej specyficzności. Analiza jest przeprowadzana przy użyciu technik
komputerowych przedstawionych w 1980 r. na Eighth International Histocompatibility Workshop (VIII.
MIĘDZYNARODOWYCH WARSZTATACH ZGODNOŚCI TKANKOWEJ). (Patrz odnośnik 4.)
B. Surowica kontroli negatywnej
Kontrola negatywna jest pobierana od zdrowych osobników płci męskiej, posiadających grupę krwi AB i nie wykazujących żadnej
cytotoksycznej reaktywności w testach z dowolnie wybranymi donorami limfocytów. Ta kontrola jest użyta w celu określenia
żywotności limfocytów.
C. Surowica kontroli pozytywnej
Kontrolą pozytywną jest przeciwciało monoklonalne, silnie cytotoksyczne dla ludzkich limfocytów. Ta kontrola jest używana w celu
określenia reaktywności dopełniacza.
D. Surowica Kontroli Limfocytów Anty-B
Surowicą Kontroli Limfocytów Anty-B jest przeciwciało monoklonalne, silnie cytotoksyczne dla limfocytów B i nie reagujące
przeciw granulocytom, limfocytom T, płytkom krwi, monocytom, ani czerwonym ciałkom krwi. Ta kontrola jest używana w celu
określenia czystości limfocytów B.
Korekta 0B: June 2004 Strona 4 z 5
SERA_SETS_PI_PL.doc

BIBLIOGRAPHY
1. Terasaki PI, Bernoco F, Park MS, Ozturk G, and Iwaki Y. Microdroplet testing for HLA A, B, C and D antigens. Am J. Clin Pathol
69: 103-120, 1978.
2. Danilovs J, Terasaki PI, Park MS, Ayoub G. B lymphocyte isolation by thrombin nylon wool. In Histocompatibility Testing.
Terasaki PI, Ed., UCLA Tissue Typing Laboratory, Los Angeles, CA 287-288, 1980.
3. ASHI Laboratory Manual, 2nd ed. Zachary, Andrea A. and Teresi, Gary, Ed., p. 199, 1990.
4. Terasaki, PI, Ed., Histocompatibility Testing. UCLA Tissue Typing Laboratory, Los Angeles, CA 1980.
5. Nikaein A, Ed., ASHI Procedure Manual, 3 rd Edition, ASHI, Lenexa, KS.
EUROPEJSKI PRZEDSTAWICIEL AUTORYZOWANY
MDSS GMbH, Burckhardstrasse 1, D-30163, Hannover, Germany
Korekta 0B: June 2004 Strona 5 z 5
SERA_SETS_PI_PL.doc