afvaskning efter endt eksponering kan fjerne en del af det på hudendeponerede pesticid, eller om det fortsat skal henregnes som absorberet.1.2 MetodeProjektet gennemføres under anvendelse af en in vitro diffusionscellemodelved anvendelse af human hud. Den oprindelige model er beskrevet i OECD´sguidelines for undersøgelse af hudpenetration og er særdeles relevant fordenne type undersøgelser, idet hudens barrierefunktion overvejende erbestemt af det epidermale lag af døde celler, stratum corneum (Grandjean1990). Den eksperimentelle model tillader kvantitering og sammenligning afbåde transport igennem og temporær deposition i huden. Modellen har væretanvendt på Miljømedicins laboratorium i en årrække, og laboratoriet har i2002-2003 deltaget i en EU-finansieret valideringsrunde for modeller tilstudier af hudpenetration. Modellen har her såvel som i andre sammenhængevist en god overensstemmelse med in vivo hudpenetrationsforsøg påmennesker (Ramsey et al. 1994, van de Sandt et al. 2004). Modellen er denbedste eksperimentelle mulighed for at tilvejebringe systematisk viden.Der findes flere teoretiske modeller til beskrivelse af et molekyles transportgennem stratum corneum. En af de første brugbare modeller blev udviklet ogvisualiseret som ’brick and mortar’ modellen (Elias 1983). Senere ersvenskeren Bo Forslind fremkommet med en lidt mere udbygget model (’thedomain mosaic model’), der inddrog den seneste viden om stratum corneumsopbygning (Forslind et al. 1997). Disse modeller vil danne udgangspunkt foren diskussion af en model for hudoptagelse af pesticider baseret på de iprojektet opnåede resultater.Figur 2. Diffusionscelle af glas til penetrationsforsøg.1.3 In vitro modelDiffusionscellerne er af håndblæst glas og består af et donorkammer og etreceptorkammer (figur 2). Huden, der stammer fra abdominalplastikker ellerbrystreduktioner foretaget på Odense Universitets-hospitals plastikkirurgiskeafdeling, præpareres, monteres på et stålgitter og placeres mellem de to kamremed stratum corneum vendende mod donorkammeret. Udtørring af hudenved fordampning undgås og konstant luftfugtighed sikres ved at dækkedonorcellen med parafilm. Receptorvæsken (0,9% NaCl, 5% BSA, 0,1%18
hexamycin i vand), der fylder receptor-kammeret, omrøres konstant(magnetomrøring) for at undgå en koncentrationsgradient mellem top ogbund i receptorkammeret. Diffusionscellerne placeres i vandbad (35 o C) for atsikre en temperatur på omkring 32 o C på hudoverfladen, svarende til normalhudtemperatur. Efter opsætning af huden henstår cellerne 16-18 timer medtomt donorkammer men med receptorvæske, hvorved der sikres enekvilibrering i forhold til vandindhold i huden. Hudens integritet sikres vedkapacitansmåling før forsøg påbegyndes.1.4 Eksperimentelt designEt fast volumen af teststof appliceres på huden i donorkammeret. Der udtagesmed fastsatte intervaller prøver fra receptorkammeret af de appliceredestoffer. Det udtagne volumen erstattes med frisk receptorvæske, således atreceptorvolumen holdes konstant. Koncentrationen af teststof måles i deudtagne prøver. Ved gentagne udtagninger over tid vil fluxen af teststof kunnebestemmes. Under forsøgene er der udtaget prøver efter typisk 4, 6, 8, 10, 12,24, 30, og 48 timer afhængig af stoffernes forventede lag-time. I disse prøverbestemmes koncentrationen af de relevante teststoffer. Disse koncentrationerdanner basis for penetrationskurver ud fra hvilke, den totale penetration over48 timer samt den maksimale penetrationshastighed (fluxen) bestemmes.Kurveforløbene i nærværende forsøg kan beskrives ved en initiel periode (lagfase),hvor der endnu ikke kan observeres nogen penetration. Lag-fasensudstrækning er ikke et udtryk for, at der ikke trænger pesticid ind i huden,men et udtryk for hvor lang tid der går, før pesticidet trænger gennem huden.Efter lagfasen observeres en penetration resulterende i stadig stigendekoncentration af pesticid i receptorvæsken og dermed i de udtagne prøver. Enkurve over penetrationen over tid har et tilnærmelsesvis sigmoidt forløb.Hældningen på den kurve er udtryk for penetrationshastigheden og betegnesfluxen. Da lag-fasens udstrækning varierer både mellem donorer og mellempesticider, vil det kun sjældent være muligt at udtage prøver præcis ved denførste gennemtrængning af hudmembranen. Lag-fasens udstrækningestimeres ved at ekstrapolere den lineære del af penetrationskurverne baglæns.Den rapporterede flux er den maksimale flux observeret gennemforsøgsperioden.Alle tre mål har relevans i vurderingen af penetrationskarakteristika for et givetstof. Den totale mængde penetreret over en bestemt periodes eksponering, fx48 timer, anvendes ofte som basis for risikovurdering eller anbefalinger irelation til anvendelse af handsker i arbejdsmiljøsituationer. Tallet bør dog,som det fremgår af figur 1 ikke stå alene, men suppleres med de to kinetiskemål, flux samt lag-time. Figuren viser således, at samme totale penetration kanfremkomme på basis af to helt forskellige penetrationskurver. Iarbejdsmiljøsammenhænge vil der således ikke være tvivl om, hvilket stof manville foretrække ved en eksponeringstid under 4-5 timer, medens anbefalingenmuligvis ville ændres ved eksponeringstider omkring 6 timer eller længere.Til beregning af massebalance bestemmes ved forsøgsafslutning mængden afteststof, der resterer i donorkammeret samt i huden. Resterende donorvæskefjernes fra huden ved opsugning med pipette og overføres til glas medskruelåg. Huden aftørres herefter med 6 cotton swabs pr. celle (4-5 stk. vædetmed 50% AcCN, 1-2 stk. tørt), der overføres til et tælleglas; tilsættes 3 mlAcCN, hvorefter swabs henstår til ekstraktion i mindst 72 timer.19