Skriptum Pharmazeuten 2011

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Skriptum Pharmazeuten 2011

HYGIENE

Skriptum für Studierende der Pharmazie

WS 11 Mikrobiologie und Hygiene VU (3st)

652.202 (Mascher); 652.203 (Reinthaler)

SS 12 Hygiene und Mikrobiologie VU (3st)

652.200 (Reinthaler); 652.201 (Mascher)

Institut für Hygiene der Medizinischen Universität

Universitätsplatz 4

8010 Graz

Platzer S., G. Ruckenbauer, A. Melkes, F. Mascher, F.F. Reinthaler

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Inhaltsverzeichnis

1. Kultivierung von Bakterien …………..…………………………………………... 3

2. Spezielle Identifikationsverfahren ………………………………………………. 4

3. Färbemethoden ……………………………………………………….................. 5

4. Schnelltests zur Keimidentifizierung …………………………………….……… 7

5. Physiologische Besiedelung des Menschen …………………………………... 14

Praktische Übung - Handabklatsch ………………………………….………. 14

Praktische Übung - Rachenabstrich …………………………………………. 15

Praktische Übung - Interdentalabstrich ……………………………...…….... 16

6. Lebensmittelmikrobiologie …………………………………………………….... 17

Praktische Übung - Nahrungsmitteluntersuchung ……………………….… 19

Praktische Übung - Umgebungsabstrich ……………………………………. 20

Praktische Übung - Umgebungsabklatsch ………………………………….. 20

7. Chemotherapeutika ………………………………………………………….…… 21

Praktische Übung - Agardiffusionstest ………………………...……………. 23

8. Harnwegsinfekt ……………………………………...………………………….… 24

Praktische Übung - HWI / Uricult …………………………………………..... 24

9. Der bakteriologische Trinkwasserbefund ………………………..……............. 26

Chemische Analytik …………………………………………………………… 31

10. Blut ……………………………………………………………………………..…… 35

11. Ektoparasiten ……………………………………………………………………… 44

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1. Kultivierung von Bakterien

Definition: Bakterien außerhalb ihres natürlichen Standortes zur Vermehrung bringen.

Inokulation: Verbringung bakterienhältigen Materials in ein Kulturmedium

Inkubation: „Bebrütung“ der beimpften Kulturmedien

Kultur: die durch Vermehrung entstandene Bakterienpopulation

flüssige Kulturmedien: Nährbouillon (Fleischextrakt, Pepton, Glucose)

feste Kulturmedien: Nährbouillon + 2% Agar (Polysaccharid aus Seetang)

Minimalmedium: "Existenzminimum"

Optimalmedium: komplexe Universalmedien, die das Wachstum vieler Bakterien

fördern (Substrate im Überfluss)

Selektivmedium: selektiv für einzelne Keimgruppen wachstumshemmend; zur

Anreicherung „interessanter“ Keime, um sie von Begleitflora zu trennen

Differentialmedium: enthalten Stoffe, welche von einzelnen Bakterienarten

metabolisiert werden Stoffwechselprodukte werden zB durch Farbindikatoren

angezeigt („Bunte Reihe“)

Direkter Nachweis von Bakterien oder deren Produkten

Mikroskop: nativ - Einfachfärbungen - Differentialfärbungen

Form- und Größe der Zellen, Flagellen, Kapseln, Sporen usw.; Pseudozellverbände,

Färbeverhalten

Kultivierung: auf festen und flüssigen Nährmedien

Makroskopisch-morphologische Merkmale der Kolonien

Physiologische Merkmale

Wachstumsbedingungen (t°, C, pH, pO2, pCO2, osmot.Druck, Nährstoffe, Mineralien)

Stoffwechseleigenschaften (Verwertung von C- und N-Quellen, Nachweis von

Stoffwechselprodukten und Enzymen)

Chemische Merkmale (DNA-Struktur, Antigen-Struktur)

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2. Spezielle Identifikationsverfahren

Identifizierung von Bakterien heißt, sie mit so wenigen Eigenschaften wie möglich und so

vielen wie notwendig zu bestimmen, um einer unbekannten Kultur ihren Platz in der

Klassifikation zuzuordnen und damit auch benennen zu können. (zB Bestimmung

morphologischer Merkmale wie Gramverhalten, Form, Größe oder physiologischer Merkmale

wie zB den Nachweis verschiedener Enzyme wie Katalase oder Koagulase ...)

Anlegen einer Kultur:

In vielen Fällen sind in einer Untersuchungsprobe mehrere Bakterienarten enthalten. Da nur von

einer Reinkultur einer Bakterienspezies eine entsprechende Identifizierung möglich ist, ist eine

Trennung der unterschiedlichen Bakterienarten notwendig.

Man entnimmt das zu identifizierende Material mit einer sterilen Öse und bringt es im oberen

Drittel des Nährbodens auf. Danach wird die Platinöse ausgeglüht und abgekühlt. Mit der

sterilen Öse wird nun das Material im Winkel von 90° auf das darunterliegende Drittel gebracht.

Darauf folgt eine nochmalige Sterilisation der Öse. Das Material aus dem zweiten Drittel wird

wiederum im Winkel von 90° über den Rest der noch unbeimpften Nährbodenfläche verteilt.

Durch die Wahl eines entsprechenden Selektivnährmediums kann teilweise unerwünschtes

Keimmaterial („Begleitflora“) im Wachstum unterdrückt werden.

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3. Färbemethoden

Methylenblaufärbung:

1. kl.Tropfen NaCl-Lösung auf entfetteten Objektträger auftropfen

2. Untersuchungsmaterial einrühren (vom Abstrichtupfer oder Material von der Kultur)

3. Präparat lufttrocknen

4. Hitzefixieren (3x durch die Flamme ziehen)

5. 1-2 Minuten Methylenblau

6. mit Wasser abspülen

7. Lufttrocknen

8. Mikroskopieren (1000fach; Ölimmersion)

Gramfärbung:

1. 1 kl.Tropfen NaCl-Lösung auf entfetteten Objektträger auftropfen

2. Untersuchungsmaterial einrühren (vom Abstrichtupfer oder Material von der Kultur)

3. Präparat lufttrocknen

4. Hitzefixieren (3x durch die Flamme ziehen)

5. 2 Minuten Gentiana(Kristallviolett-)lösung mit Wasser abspülen

6. 2 Minuten Lugol`sche Lösung mit Wasser abspülen

7. ca. 20 Sekunden 96% - Alkohol mit Wasser abspülen

8. 2 Minuten Karbolfuchsin mit Wasser abspülen

9. Lufttrocknen

10. Mikroskopieren (1000fach, Ölimmersion)

Grampositiv: dunkelblau

Gramnegativ: rot

Neisserfärbung:

1. essigsaures Methylenblau (2 Teile) + Kristallviolett (1 Teil) - knapp vor Benützung mischen

2. 20 - 30 Sekunden auf hitzefixiertes Präparat auftragen

3. mit Wasser abspülen

4. 10 Sekunden Lugol´sche Lösung (mit 1% Milchsäure versetzt)

5. mit Wasser abspülen

6.. 5-7 Minuten Bismarckbraun

7. mit Wasser abspülen und lufttrocknen

8. Mikroskopieren (1000fach; Ölimmersion)

Diphtherie: Stäbchen hellbraun; Polkörperchen schwarzblau Lagerung oft V oder Y förmig

apathogene Corynebakterien: Stäbchen hellbraun; Polkörperchen wenige bis keine Lagerung,

oft palisadenartig (////)

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Ziehl-Neelsen-Färbung:

1. Ausstrich lufttrocknen und hitzefixieren

2. 10 Minuten Isopropanol

3. mit Wasser abspülen

4. Karbolfuchsin auftragen und erhitzen bis Dämpfe aufsteigen und 10 Minuten belassen

5. mit Wasser abspülen

6. 10 Minuten mit HCl-Alkohol entfärben

7. mit Wasser abspülen

8. 10 Minuten wässriges Methylenblau

9. mit Wasser abspülen, lufttrocknen und mikroskopieren (1000fach; Ölimmersion)

säurefeste Stäbchen: rot

übrige Strukturen: blau

Kapseldarstellung:

Kapseln oder Schleimhüllen von Bakterien sind im Lichtmikroskop nicht erkennbar, können

durch eine „Negativdarstellung“ mit Tusche aber sichtbar gemacht werden. Die Tuschepartikel

können nicht in die Schleimhülle oder Kapsel eindringen, wodurch diese Strukturelemente hell

auf dunklem Tuschehintergrund erscheinen. Die Bakterienzelle selbst wird mit Methylenblau

gefärbt.

Durchführung und Auswertung:

1. eine Impföse mit Bakterien in 1 ml HCl suspendieren und mit 1 ml Tusche mischen

2. Gemisch mit Impföse auf entfetteten Objektträger aufbringen, mit Objektträger dünn aus-

streichen und trocken lassen

3. Hitzefixieren (3x durch die Flamme ziehen)

4. 5 Minuten mit Methylenblaulösung bedecken

5. Methylenblau gut abspülen, lufttrocknen und mikroskopieren (1000fach; Ölimmersion)

Schleimhüllen oder Kapseln erscheinen hell auf dunklem Hintergrund,

Bakterienzellen blau

Sporenfärbung:

In gut sporulierenden Kulturen lassen sich die Sporen als stark lichtbrechende Körperchen

innerhalb der Bakterienzelle bzw. als freie Sporen mit dem Phasenkontrastmikroskop feststellen

(40er Objektiv oder 100er Objektiv mit Ölimmersion). Zur Einleitung der Sporulationsphase bei

endosporenbildenden Bakterien werden diese Organismen auf Sporulationsagar kultiviert. Die

Methode der Sporenfärbung beruht auf der Fähigkeit der Sporen, bestimmte Farbstoffe

wesentlich stärker zu binden als das Cytoplasma.

Durchführung und Auswertung:

1. Ausstrich lufttrocknen und hitzefixieren

2. Objektträger mit Malachitgrünlösung überschichten

3. Objektträger bis kurz vor Siedebeginn erhitzen, ca. 10 Minuten heiß halten, nicht ein-

trocknen lassen, eventuell Malachitgrünlösung nachgeben.

4. mit Wasser gut abspülen und zur Gegenfärbung 5 Minuten mit Safraninlösung bedecken

5. mit Wasser gut abspülen, lufttrocknen und mikroskopisch auswerten (40er Objektiv, oder

100er Objektiv - Ölimmersion)

Sporen sind grün, die übrigen Zellen rot gefärbt

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4. Schnelltests zur Keimidentifizierung

KOH-Lysis Test:

Die Auflösung von Zellwand und zytoplasmatischer Membran von Bakterien durch 3%ige KOH

liefert einen zuverlässigen Hinweis auf das Vorliegen von gramnegativen Organismen, die dabei

mit dem Reagenz eine zähflüssige, fadenziehende Masse bilden.

Dieser Test dient der Differenzierung grampositiver und gramnegativer Bakterien

Durchführung:

Reichlich Bakterienmasse von nicht-selektiven Festnährböden in 1 Tropfen KOH auf einem

Objektträger einrühren; nach 15 Sekunden Impföse mehrmals um einige Zentimeter vom

Tropfen abheben und auf die Bildung eines Fadens zwischen Tropfen und Öse achten. Im

negativen Fall noch einige Male innerhalb 1 Minute auf Fadenbildung prüfen, dann Test

abbrechen. Zur Kontrolle sollten je ein grampositiver und -negativer Stamm mitgeprüft werden.

Nach Durchführung der Tests Objektträger sofort in bereitgestellter Desinfektionsmittellösung

entsorgen!

Katalase:

Die Katalase ist ein Atmungskettenenzym und wird in der Routinediagnostik vorwiegend zur

Differenzialdiagnostik von Staphylokokken und Streptokokken

Durchführung:

Das zu untersuchende Keimmaterial wird mit der Öse auf einen Objektträger aufgebracht und

danach mit 1 Tropfen H2O2 überschüttet.

aufschäumen: Katalase positiv Staphylokokken

kein Aufschäumen: Katalase negativ Streptokokken

Achtung: Da diese Reaktion nur zur Unterscheidung zwischen Staphylokokken und

Streptokokken dient, ist es notwendig sich vorher zu vergewissern, dass es auch wirklich grampositive

Kokken sind. Auch andere Bakterien können Katalase-pos. bzw. -neg. sein!!!

Nach Durchführung der Tests Objektträger sofort in bereitgestellter Desinfektionsmittellösung

entsorgen!

Plasmakoagulase:

Dieses extrazellulär von S. aureus gebildete Enzym führt zu einer Verklumpung von Plasma. Die

Mechanismen sind denen der physiologischen Blutgerinnung ähnlich, aber nicht ident.

Der Test dient der Unterscheidung von Koagulase positiven (S. aureus) und Koagulase

negativen (S. epidermidis, S. saprophyticus, ...) Staphylokokken.

Durchführung:

Auf einem Objektträger wird 1 Tropfen Staphylokokkus aurex Kontrollreagenz (graue

Kappe) aufgetragen. In dieses wird die zu untersuchende Bakterienkolonie mit einer Platinöse

eingerührt und gleichmäßig verteilt. Danach wird der Objektträger etwa 30 Sekunden

geschwenkt. (Falsch positive Keime verklumpen bereits!)

Nachdem sich eine homogene Suspension gebildet hat, wird 1 Tropfen Testreagenz (gelbe

Kappe) dazugetropft und neuerlich mit einer Platinöse gleichmäßig verteilt. Danach wird der

Objektträger etwa 30 Sekunden geschwenkt.

Tritt eine Verklumpung auf: Koagulase positiv = Staphylokokkus aureus

Tritt keine Verklumpung auf: Koagulase negativ = Staphylokokken

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Oxidasetest

Der Oxidasetest weist das Vorhandensein von Cytochromen in der Atmung von Spezies nach,

die Sauerstoff als endgültige Elektronenakzeptoren im Energiestoffwechsel verwenden.

Cytochrome ermöglichen den Eintritt von atmosphärischem Sauerstoff in den Zellstoffwechsel,

indem sie durch molekularen Sauerstoff oxidiert werden. Unter dem Einfluss von Enzymen

werden sie durch oxidierbare Substanzen in der Zelle anschließend wieder reduziert. Beim

Oxidasetest bewirken künstliche Substrate anstelle natürlicher Elektronen-Akzeptoren die

Reduktion des Cytochromoxidase-Systems. Solche Substrate sind je nach ihrem aktuellen

Reduktions- oder Oxidasezustand farblos bzw. gefärbt. Die positive Oxidasereaktion ist

gekennzeichnet durch ein gefärbtes Produkt.

Durchführung:

Auf das Cytochromoxidase-Testkärtchen wird mit der Platinöse Material aufgetragen. Kommt

es nach spätestens 30 Sekunden zu einer Blauverfärbung ist das Ergebnis positiv.

Blauverfärbung: Oxidase positiv Pseudomonas sp. (aber auch Aeromonas u.a.)

keine Blauverfärbung: Oxidase negativ Enterobacteriacaeen u.a.

Streptex (Seroagglutination nach Lancefield)

Die Mehrheit der Spezies Streptokokkus besitzt gruppenspezifische Antigene, die im allgemeinen

Kohlenhydratbestandteile der Zellwand sind. Lancefield zeigte, dass diese Antigene in löslicher

Form extrahiert und durch Präzipitation mit homologen Antiseren nachgewiesen werden können.

Im Streptex-System kommt eine einfache Enzymextraktion zur Anwendung.

Testprinzip: Gruppenspezifische Antigene werden aus Streptokokken in einem einfachen

Inkubationsschritt extrahiert. Die Antigene werden mit Latexpartikeln identifiziert, die mit

gruppenspezifischen Antikörpern sensibilisiert sind. Diese Latexpartikel agglutinieren stark in

Anwesenheit des homologen Antigens und bleiben in homogener Suspension, wenn kein

Antigen vorhanden ist.

Der Test dient zur Identifikation (Serotypisierung) der ß-hämolysierenden Streptokokken.

Durchführung:

In ein entsprechend beschriftetes Teströhrchen 0,4ml Extraktionsenzym pipettieren.

Mit einer Platinöse Untersuchungsmaterial in das Teströhrchen einrühren. Liegt eine

Mischkultur vor, wird empfohlen, Streptokokkenkolonien von einem Bereich mit möglichst

wenig Fremdkeimen abzunehmen.

Die Suspension mindestens 20 Minuten bei 37°C im Brutschrank inkubieren.

Vor Gebrauch die Fläschchen der Latexsuspensionen kräftig schütteln. Die Tropfflasche

senkrecht halten und je einen Tropfen (20µl) jeder Latexsuspension (A-G) auf die Kreise

der Reaktionskarte (A-G) geben.

Hinweis: Es ist wichtig, dass die Tropfflaschen senkrecht gehalten werden und der Tropfen

sich an der Spitze der Auslassdüse bildet. Tritt Feuchtigkeit außen an der Auslassdüse auf,

entsteht ein inkorrektes Volumen um das Ende herum. In diesem Fall ist die Düse vor

Gebrauch abzuwischen.

Mit einer Pasteurpipette je einen Tropfen Testsubstrat auf jeden der sechs Kreise der

Reaktionsplatte geben.

Den Inhalt jedes Kreises der Reihe nach mit einem Rührstäbchen gut mischen um die

gesamte Kreisfläche zu bedecken. Für jeden Kreis ein eigenes Stäbchen verwenden und

anschließend in Desinfektionslösung entsorgen.

Die Reaktionskarte maximal 1 Minute leicht schwenken und auf Agglutination überprüfen.

Hinweis: Die Reaktionskarte sollte in einer normalen Lesedistanz (25-35cm) gehalten

werden. Die erhaltenen Reaktionsbilder treten sehr deutlich auf und können unter normalen

Lichtbedingungen leicht erkannt werden.

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Die Reaktionskarte nach Desinfektion vernichten.

Sicherstellen, dass die Reagenzien im mitgelieferten Aufbewahrungsgestell wieder in den

Kühlschrank zurückgestellt werden.

Ablesen der Ergebnisse: Eine positives Ergebnis wird durch eine Agglutination als deutlich

sichtbares Verklumpen der Latexpartikel angezeigt. Eine schnelle und intensive Agglutination

hängt von der Stärke des Antigenextrakts ab. Ein starker Extrakt liefert innerhalb weniger

Sekunden nach Durchmischen große Latexpartikel-Klumpen, dagegen ein schwacher Extrakt

eine verzögerte Reaktion mit kleinkörnigen Latexpartikel-Klumpen.

Formen der Hämolyse

α-Hämolyse: Vergrünung (gut erkennbar auf Kochblutagar); um die Kolonien findet man grüne

Höfe von unterschiedlicher Farbintensität, in deren Bereich der Blutfarbstoff zum

Methämoglobin umgewandelt ist, während die Erythrozytenmembran weitgehend erhalten ist.

ß-Hämolyse: (gut erkennbar auf Blutagar) relativ große scharf begrenzte Hämolysezone um die

Kolonien, die Erythrozyten sind aufgelöst und der Blutfarbstoff ist abgebaut, sodass eine klare

Zone im sonst undurchsichtigen Blutagar entsteht.

Achtung: auch andere Keime (zB. Staphylokokken, aerobe Sporenbildner, E. coli, Neisserien)

können eine ß-Hämolyse verursachen! Man muss wissen, dass Streptokokken vorliegen

(Gramfärbung!).

γ-Hämolyse: keine hämolytische Aktivität

Anwendung: dient der Differenzierung von Streptokokken

Bunte Reihe

Mikroorganismen sind mit einem sehr differenzierten Enzymsystem ausgestattet, wobei ein Teil

dieser Enzyme in der sog. „kleinen bunten Reihe“ nachgewiesen werden kann. Dabei werden

dem Keim verschiedene Nährmedien angeboten, bei deren Verbrauch es zu einem Farbumschlag

in den entsprechenden Nährmedien (durch Indikatoren) kommt. Bakterien unterscheiden sich

vielfältig in ihrer Enzymausstattung und damit in ihren Fähigkeiten, organische und

anorganische Verbindungen ab- oder umzubauen. In einem System aus verschiedenen festen und

flüssigen Medien können solche Stoffwechselleistungen durch verschiedene Indikatorreaktionen

sichtbar gemacht werden. Da bei dieser Testmethode mehrere Eigenschaften gleichzeitig in einer

Reihe von Reaktionsansätzen überprüft werden, entsteht wegen der unterschiedlichen

Farbreaktionen einzelner Indikatoren ein buntes Bild. Man spricht von einer „bunten Reihe“.

Anwendung: dient zur Differenzierung gramnegativer Stäbchen

Bunte Reihe - Erklärungen und Auswertung

Kligler-Röhrchen (Zweizucker-Eisen-Harnstoff-Schrägagar)

Der „Kligler“ ist ein kombinierter Nährboden, in dem folgende Reaktionen nebeneinander ablaufen:

a.) Dextrose-Abbau (durch alle Enterobakterien)

b.) Lactose-Abbau (durch die meisten „apathogenen“ Darmbakterien)

c.) H2S-Bildung (z.B. durch die meisten Salmonellen, Citrobacter, Proteus vulgaris &

mirabilis)

d.) Gas-Bildung (durch alle Enterobacterien; Ausnahmen: Shigellen, Salmonella typhi,

Proteus morganii & rettgeri)

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Durch den Indikator (Phenolrot) ist der unbeimpfte Kligler rot.

Die Beimpfung erfolgt im Stich und auf der Schrägfläche.

a.) Dextrose-Abbau: durch Dextrose-(Glucose)-Abbau entsteht Säure; der Indikator schlägt

um nach gelb. Da der Kliger nur sehr wenig Dextrose enthält, ist dieser Zucker nach

wenigen Stunden verbraucht. Danach kommt es durch den Sauerstoff der Luft auf der

Schrägfläche zu einer Realkalisierung mit Farbrückschlag nach rot.

Kligler nach 24 Stunden: rot/gelb

b.) Lactose-Abbau: durch Lactose-Spaltung entsteht Säure; der Indikator schlägt um nach

gelb. Da im Kligler zehnmal so viel Laktose wie Dextrose enthalten ist, wird Lactose in

24 Stunden nicht ganz aufgebraucht. Es tritt also keine Realkalisierung der Schrägfläche

auf.

Kligler nach 24 Stunden: gelb/gelb

c.) H2S-(Schwefelwasserstoff)-Bildung aus schwefelhaltigen Aminosäuren oder

anorganischen Sulfaten und Sulfiten erfolgt zB durch Salmonellen und Citrobacter. Die

im positiven Fall entstehende Schwarzfärbung ergibt sich aus der Verbindung von H2S

mit Eisensalzen (FeSO4).

d.) Gasbildung: entsteht beim Zucker-Abbau durch die meisten Enterobakteriaceaen

(Ausnahmen s.o.)

Zuckerspaltung

Die meisten Bakterien sind in der Lage, durch Fermente (Carbohydrasen) verschiedene Zucker

abzubauen. Zur Differenzierung der Enterobakterien eigenen sich besonders:

1.) Glucose (=Dextrose, Traubenzucker), ein Monosaccharid

2.) Lactose (=Milchzucker), ein Disaccharid aus einem Glucose- und einem

Galaktosemolekül

3.) Saccharose (=Rohrzucker), ein Disaccharid aus Glucose und Fructose

Bei der Zuckerspaltung entstehen saure Abbauprodukte, die den pH-Wert des Mediums

herabsetzen, sodass der zugesetzte Indikator (Bromthymolblau) von blaugrün nach gelb

umschlägt.

Glucose positiv: alle Enterobakterien

Lactose positiv: die meisten „apathogenen“ Enterobakterien

Darüber hinaus entsteht beim Zucker-Abbau durch Enterobakterien Gas (Ausnahmen: Shigellen,

Salmonella typhi, Proteus morganii & rettgeri).

Die Prüfung der Gasbildung erfolgt am einfachsten mit DURHAM-Röhrchen, das sind kleine

Eprouvetten von etwa 30 mm Länge und 8 mm Durchmesser, die im Dextrose-Röhrchen mit der

Öffnung nach unten versenkt werden. Bei der Bebrütung gasbildender Keime bildet sich im

Gärröhrchen eine mehr oder weniger große Gasblase.

Hinweis: Bei anaerober Bebrütung können Indikatorfarben reduziert werden. Deshalb empfiehlt

sich der Zusatz des Indikators erst nach abgeschlossener Bebrütung! Außerdem ist zu bedenken,

dass fast alle Farbstoffe auf empfindliche Keime hemmend wirken können.

Harnstoffspaltung

Proteusstämme (außer Prot. inconstans = Providentia) produzieren das Ferment Urease. Urease

hydrolisiert Harnstoff zu Ammoniumcarbonat: CO (NH2)2 + Urease und H2O (NH4)2CO3.

Ammoniumcarbonat verschiebt den pH-Wert des Mediums in den alkalischen Bereich, was

durch Zusatz eines geeigneten Indikators (Phenolphtalein) sichtbar gemacht werden kann:

Rotfärbung.

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Indolbildung

Zur Prüfung der Indolbildung verwendet man durch Trypsinverdauung weitgehend

aufgespaltene, tryptophanhältige, flüssige Eiweißsubstrate. Einige Bakterien (z.B. E.coli) bilden

das Ferment Tryptophanase, das Tryptophan zu Indol abbaut.

Tryptophan (+Tryptophanase) ⇒ Indol (+Indolreagenz = rot)

Nachweis: Einfach und spezifisch ist der Nachweis mittels p-Dimethylaminobenzaldehyd in

saurer Lösung. Etwa 5 ml der Kultur versetzt man mit 1 ml Indolreagenz. Schwenken, nicht

schütteln! Im positiven Fall entsteht ein roter Ring.

Citratausnutzung

Auch Mikroorganismen benötigen zum Leben und Wachsen mindestens Kohlenstoff (C),

Stickstoff (N) und verschiedene Salze. Sie können diese Grundsubstanzen dank ihres

Fermentsystems aus verschiedenen organischen und anorganischen Verbindungen herauslösen

und verwerten. Jedoch können z.B. nur bestimmte Bakterien, wie Salmonellen und Citrobacter,

Kohlenstoff aus dem Citratmolekül heraus lösen:

H2 – C – COOH


HO –C – COOH


H2 – C – COOH

Andere Keime, wie E.coli, können in einem Nährmedium, das Citrat als einzige Kohlenstoffquelle

enthält, nicht wachsen.

Nachweis: Das Citratmedium nach Koser (klare Flüssigkeit) enthält folgende Bestandteile:

als Kohlenstoffquelle: Citrat: C6H8O7

als Stickstoffquelle: Ammoniumphosphat: (NH4)2 HPO4) und Salze (MgSO4, K2HPO4)

Positiv: Trübung (Wachstum)

Negativ: Röhrchen bleibt klar

Nitratreduktion

Bilden Bakterien das Ferment Nitratreduktase, wird im Nährboden enthaltenes Nitrat zu Nitrit

reduziert. Das entstandene Nitrit lässt sich mit einer Mischung aus Sulfanilsäure, α-Naphtylamin

und Essigsäure nachweisen.

Nachweis: 5ml eines Testsubstrats der folgenden Zusammensetzung

KNO3 (nitritfrei) 0,2g

Pepton 5,0g

Aqua dest. 1000ml

werden mit dem zu prüfenden Keim beimpft und 2-4 Tage bebrütet. Dann wird eine Mischung

der folgenden Lösungen zu gleichen Teilen hergestellt:

Lösung A: Sulfanilsäure 1,0g

Essigsäure (5N) 125,0ml

Lösung B: α- Naphtylamin 1,0g

Essigsäure(5N) 200,0ml

und davon der Bouillon 0,1 ml zugesetzt. Im positiven Fall tritt in wenigen Minuten kräftige

Rotfärbung auf.

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Bleibt die Rotfärbung aus, kann dies zwei Ursachen haben:

1.) Nitrat wurde nicht abgebaut. Beweis: durch Zusatz von etwas Zinkstaub zum Testsubstrat

tritt Rotfärbung ein.

2.) Nitrat wurde zu Nitrit abgebaut, das Nitrit jedoch weiter reduziert zu Stickoxyd, Ammoniak

oder elementarem (gasförmigem) Stickstoff. In diesem Fall bleibt die Rotfärbung nach

Zusatz von Zinkstaub aus.

Chemismus:

NO3 → NO2 → NO → NH2OH → NH3 (Ammoniak)

(Nitrat) (Nitrit) (Stickoxyd)


N2O (Distickoxyd) → N2 (Stickstoff)

Auswerten der bunten Reihe:

Reduktionsvorgänge

1. Kligler (rot) ist ein kombinierter Nährboden (Schrägagar), in dem folgende Reaktionen

nebeneinander ablaufen:

Dextrose Abbau Indikator: Phenolrot reagiert auf Ansäuerung des Milieus

mit einer Gelbfärbung

H 2 S-Bildung positiv: schwarz

Gasbildung

2. Lactose (grünlich) positiv: gelb

negativ: grün

3. Trypsin (gelb) Zusatz: Indolreagenz

positiv: roter Ring

negativ: gelber Ring

4. Harnstoff (weiß) Zusatz: Phenolphtalein

positiv: rot

negativ: keine Farbveränderung

5. Citrat (grün) Indikator: Bromthymolblau reagiert auf Alkalisierung blau

positv: blau

negativ: grün

6. Nitrat (farblos) Zusatz: Jodzinktinktur + H 2 SO 4

positiv: blau

negativ: farblos

7. Beweglichkeitsagar: Wachstum nur beim Impfstrich: unbeweglich

Nährmedium diffus (trüb) durchsetzt: beweglich

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Röhrchen Nr. 1 2 3 4 5 6 7

Kligler Lactose Trypsin Harnstoff Citrat Nitrat Beweglichkeit

Dextrose H2S

Escherichia coli + - + + - - +

Klebsiella pneumonie + - + - - + + -

Klebsiella oxytoca + - + + - + + -

Enterobacter sp. + - + - - + + +

Citrobacter sp. + + + - - + +

Proteus vulgaris - + - + + - + +

Proteus mirabilis - + - + + + - +

Morganella morganii - - - + + - +

Salmonella sp. - + - - - + - +

Pseudomonas sp. - - - - - + +

Acinetobacter sp. - - - - - + -

Serratia sp. - - - + - - + +

API

Das Testsystem beruht auf dem Prinzip der Bunten Reihe.

In einem Teststreifen mit 20 Mikroröhrchen befinden sich verschiedene dehydrierte Testsubstanzen,

die mit einer Bakteriensuspension in Aqua dest. befüllt werden. Der Test wird

anschließend bei 37°C ca. 24 Std. bebrütet.

Ein meist Indikator bedingter Farbumschlag zeigt an, ob die getesteten Substanzen von Bakterien

umgesetzt wurden.

Fällt die erste Reaktion einer Dreiergruppe positiv aus, so wird dies mit einer 1 protokolliert, fällt

die zweite positiv aus, so wird dies mit einer 2 protokolliert, und ist die dritte Reaktion einer

Dreiergruppe positiv, so protokolliert man eine 4. Im negativen Fall wird eine 0 protokolliert.

Durch Addition der Zahlen jeder Dreiergruppe ergibt sich ein siebenstelliger Code, der zur

Identifizierung der Keime führt.

+ + + + +

QNPG ADH LDC ODC ‚CIT H 2S URE TDA IND VP GEL GLU MAN IND SOR RHA SAC MEL AMY ARA OX

5 1 4 4

Kodierungsprinzip des API-Systems

z.B.: Escherichia coli

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+ + + +

5 1 2


5. Physiologische Besiedelung des

Menschen

Haut und Schleimhäute des Menschen sind mit unzähligen Mikroorganismen besiedelt, die man

als Normalflora bezeichnet. Dabei ist eine generelle Trennung der Erreger in apathogen und

pathogen nicht möglich. Diese Mikroorganismen befinden sich im Gleichgewicht mit ihrem

Wirt, sodass es unter normalen Lebensumständen zu keiner Infektion bzw. Infektionskrankheit

kommt, es sei denn, die Keime werden aus ihrer angestammten Region in andere Körperregionen

bzw. in primär sterile Organsysteme verschleppt. Die Zusammensetzung dieser Normalflora

variiert und hängt von verschiedenen Faktoren, wie Allgemeinzustand, Alter und Geschlecht des

Menschen, Ernährung, Schwangerschaft, Grunderkrankung etc., ab.

5.1. Haut

Den wichtigsten Anteil der normalen Hautflora bilden Bakterien, die ein gewisses Haftvermögen

für dieses Organ besitzen = Residentflora. Aus dem ständigen Kontakt mit der Umwelt

resultiert die sog. Transientflora, Anflugkeime, die vorübergehend auf der Haut vorkommen,

aber bei einem intakten Makroorganismus keine Möglichkeit der Besiedelung finden.

Die Zusammensetzung der Residentflora wird auch durch äußere Einflüsse, wie starkes

Schwitzen oder häufiges Waschen nicht verändert. Die bakterielle Normalbesiedelung findet sich

vorwiegend in den äußeren Schichten der Haut (bis 10 6 Keime/ cm 2 ).

Keime der normalen Hautflora sind:

Staphylococcus epidermidis und andere koagulasenegative Staphylokokken, Mikrokokken,

apathogene Corynebakterien (aerobe und anaerobe), Streptokokken und Peptostreptokokken.

Praktische ÜBUNG - HANDABKLATSCH

Blut-Agar (B): festes Universalmedium („blutrot“)

1.) Beschriftung der Blutagarplatte (B): auf der Unterseite der Agarplatte wird mit einem Filzstift

in der Mitte ein Teilungsstrich gezogen und die beiden Hälften mit einem „V“ (= vorher)

bzw. „N“ (= nachher) und dem Namen beschriftet.

2.) Auf die Oberfläche eines festen Nährbodens werden nun 3 Fingerspitzen einer Hand unter

leichtem Druck auf die mit „V“ makierte Fläche aufgelegt

2.) Danach erfolgt eine hygienische Händedesinfektion:

1: Aus dem Desinfektionsmittelspender mittels Ellbogenbedienung ca. 3 ml alkoholisches

Desinfektionsmittel entnehmen (die Menge entspricht etwa einer hohlen Hand,

große Hände brauchen etwas mehr!)

2: Händedesinfektionsmittel über mind. 30 Sekunden gründlich auf den Händen

verreiben (am besten, bis sie trocken sind)

3.) Anschließend werden wiederum 3 Finger leicht auf die mit „N“ markierte Agarfläche gelegt

(Achtung: mit dieser Hand nichts angreifen!)

4.)Nach 24-stündiger Bebrütung bei 37° C das Resultat begutachten.

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5.2. Mund/Rachen

Die Mundhöhle bietet ein breites Spektrum verschiedenster Bakterien, Pilze und Protozoen.

Äußere Einflüsse, wie zB Alter, Ernährung oder z.B. die Einnahme von Antibiotika führen zu

einer dauernd wechselnden Transientflora. Aber auch die Residentflora ist vielgestaltig.

Keime der normalen Mund/Rachenflora sind:

vergrünende Streptokokken, apathogene Neisserien, diphtheroide Stäbchen, Bacteroides sp.,

Staphylococcus epidermidis.

In geringer Menge als normal zu betrachten sind Hämophilus influenzae, Streptococcus

pneumoniae und Candida sp.

Eine Sonderstellung im Mund/Rachenraum weisen ß-hämolysierende Streptokokken und

Neisseria meningitidis auf. Diese Bakterien können sich zur Normalflora gesellen, ohne dass es

zu einer Erkrankung kommt (asymptomatische Keimträger).

Ebenfalls eine Sonderstellung im Nasen/Rachenraum nimmt Staphylococcus aureus ein, der im

Gebiet von Nase bzw. Perineum (Damm) als Haftkeim vorkommen kann. Da S. aureus auch

häufig bei nosokomialen Infektionen beteiligt ist, werden beim Auftreten nosokomialer

Infektionen durch S. aureus bei Personal und Patienten Nasenabstriche durchgeführt, um Keimträger

zu erfassen und gegebenenfalls zu sanieren.

Praktische ÜBUNG - RACHENABSTRICH

Blut-Agar (B): festes Universalmedium („blutrot“)

Kochblut-Agar (KB): festes Nährmedium zum Nachweis sehr empfindlicher Keime

(„schokoladenbraun“)

1.) Die Probenentnahme erfolgt unter Zuhilfenahme eines Spatels mit einem sterilen Abstrichtupfer

durch eine drehende Bewegung am Ort der Infektion. Unbedingt notwendig ist eine gute

Lichtquelle. Eine Kontamination durch andere Strukturen im Mund- Rachenraum sollte dabei

vermieden werden. (Hinweis: vor der Probennahme sollte der Patient seinen Mund mit klarem

Wasser spülen Reduktion der Begleitflora)

2.) Das entnommene Material wird mit dem Abstrichtupfer auf die Nährmedien Blutagar (B)

und Kochblutagar (KB) übertragen, indem der Abstrichtupfer im oberen Drittel des Nährbodens

über die gesamte Fläche gleichmäßig verteilt wird. Mit einer sterilen Öse wird aus

diesem Areal Material in den unteren Anteil gebracht und in einer fortlaufenden Zick-Zack-Linie

aufgetragen. Dadurch kommt es zu einer kontinuierlichen Verringerung der Keimzahl, sodass die

Möglichkeit zur Bildung von Einzelkolonien nach der Bebrütung besteht.

3.) Die beimpften Platten werden beschriftet (Plattenboden!) und für 24h bei 37°C inkubiert.

Unterscheidung der verschiedenen Streptokokkenarten

Die Differenzierung der verschiedenen Streptokokkenarten basiert auf

a) Einteilung nach Lancefield (Einteilung nach antigenen Eigenschaften in der Zellmembran von

Streptokokken) und

b) Unterscheidung nach dem Hämolyseverhalten der Streptokokken auf Blut bzw. Kochblutagar.

15


Praktische ÜBUNG - INTERDENTALABSTRICH

Der Interdentalabstrich wird unter Zuhilfenahme eines sterilen Zahnstochers durchgeführt. Das

gewonnene Material wird auf einen Objektträger übertragen und eine Gramfärbung

durchgeführt.

Mikroskopisch lässt sich die Vielfalt einer normalen Rachen/Interdentalflora erkennen. Neben

zellulären Elementen (Plattenepithelzellen, Leukocyten), sieht man die bereits bekannten Formen

von Kokken- bzw. Stäbchenbakterien. Ebenfalls zu sehen sind aber auch spindelförmige, bzw.

unregelmäßig geformte gramnegative Stäbchen (Fusobakterien, Bacteroides sp.), sowie auffällig

gewellte Stäbchenbakterien (apathogene Spirochäten). Die Anzucht dieser Bakterien ist sehr

langwierig und gelingt zT. nur auf Spezialnährböden, was den Rahmen dieses Praktikums

sprengen würde.

5.3. Respirationstrakt

Im vorderen Abschnitt der Nase finden sich hauptsächlich Keime der normalen Hautflora

(koagulasenegative Staphylokokken, etc.). Durch die Verbindung mit der Mundhöhle können in

der Nase aber auch Keime der normalen Rachenflora gefunden werden. Normalerweise steril

sind die Nasennebenhöhlen, ebenso das Bronchialsystem und die Alveolen. Dafür zuständig sind

sowohl strukturelle (Flimmerepithel), wie auch immunologische Faktoren.

5.4. Magen und Duodenum

Durch die Wirkung des Magensaftes sind Magen und Duodenum keimarm bis keimfrei. Im

Dünndarm findet man Enterokokken, sowie milchsäurebildende Bakterien (Laktobazillen), erst

im unteren Dünndarm tritt E. coli auf.

5.5. Darm

Die normale Darmflora ist das größte Keimreservoir des Körpers (bis 300 Arten). Die

Zusammensetzung der Darmflora wird von verschiedenen Faktoren beeinflusst, wie Ernährung,

Alter, Darmsekretion, therapeutische Eingriffe, etc. Antibiotika können zur Reduktion der

Normalflora führen und gleichzeitig einen Anstieg antibiotikaresistenter Keime bewirken (zB

Clostridium difficile).

95% der Keime im Darm sind Anaerobier (Bacteroides Arten, Lactobacillus sp.,

Fusobakterien, Clostridien und Peptostreptokokken). Von den aeroben bzw. fakultativ anaerob

wachsenden Keimen sind die häufigsten Enterobacteriaceae (E. coli, Proteus sp., Enterobacter

sp., etc.), bzw. Enterokokken, transient Candida sp. und Pseudomonas sp.

5.6. Urogenitaltrakt

Nierenbecken, Ureter und Harnblase sind normalerweise keimfrei, nur der äußere Teil der

Harnröhre ist mit Keimen der umgebenden Haut bzw. transient mit Keimen des Darms besiedelt

(S. epidermidis, E. coli, Enterokokken).

5.7. Vaginalflora

Diese wechselt stark, je nach Entwicklungsstufe.

Kindesalter: keimarm, wenige Kokken und Stäbchen, fast keine Laktobazillen

Pubertät: reichlich Laktobazillen, daneben Streptokokken, Staphylokokken und E. coli

Menopause: die Laktobazillen gehen stark zurück, es besteht eine Mischflora aus Kokken und

Stäbchen.

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6. Lebensmittel-Mikrobiologie

6.1. Lebensmittelvergiftungen

Eine Lebensmittelvergiftung kann zahlreiche biologische und nicht biologische Ursachen haben.

Dazu gehört die Vergiftung durch

Arzneimittel oder wachstumsfördernde Substanzen im Fleisch und in Fleischprodukten

nach zu später Absetzung vor der Schlachtung

Pestizide, Schwermetalle, Chlorkohlenwasserstoffe und andere toxische Umweltstoffe,

die über Futtermittel, Wasser und Luft in Tier und Pflanze gelangen können

nicht erlaubte Zusatzstoffe, die über Futtermittel, Wasser und Luft in Tier und

Pflanze gelangen können

nicht erlaubte Zusatzstoffe zB zur Konservierung der Lebensmittel (Antibiotika,

Natriumazid im Wein, Monobromessigsäure in Bier u.a.)

Reinigungs- und Desinfektionsmittel

physiologische Gifte von Pflanzen und Tieren

Parasiten

Mikroorganismen(Bakterien, Pilze und Viren)

Ob ein Mikroorganismus eine Lebensmittelvergiftung verursachen kann, ist von zahlreichen

Faktoren abhängig. Dazu gehört die Fähigkeit im Lebensmittel infektiös zu bleiben bzw. sich im

Lebensmittel vermehren zu können, die Anwesenheit spezifischer Pathogenitätsfaktoren wie die

Fähigkeit zur Bildung von Toxinen (Toxizität) und/oder die Fähigkeit zur Ausbreitung im

Gewebe (Invasivität) sowie eine ausreichende Infektionsdosis. Beeinflusst wird die Erkrankung

auch von der momentanen Abwehrlage des infizieren Menschen.

Lebensmittelinfektionen werden von invasiven Mikroorganismen hervorgerufen, die in das

menschliche Gewebe eindringen und sich dort ausbreiten können. Häufig können sich diese

Mikroorganismen nicht im Lebensmittel vermehren, bleiben aber infektiös. Wichtige

epidemiologische Transportmittel für derartige Infektionserreger sind die Rohmilch und das

Wasser. Typische Mikroorganismen aus dieser Gruppe sind zB Mycobacterium tuberculosis,

Brucella, A-Streptokokken, Leptospira, Yersinia enterocolitica, Campylobacter jejuni, Viren und

Parasiten. Voraussetzung für die Invasivität ist die Anheftung (Adhäsion) der Erreger über

unspezifische oder spezifische Strukturen der Mikroorganismenzelloberfläche (zB Fimbrien bei

Escherichia coli) an die Zelloberfläche des Wirtes. Die Ausbreitung und Vermehrung im

menschlichen Gewebe ist abhängig von der Resistenz der Mikroorganismen gegenüber den

körpereigenen Abwehrmechanismen wie der Phagozytose und der Toxizität des Serums.

Lebensmittelintoxikationen werden durch toxinbildende Mikroorganismen ausgelöst, die sich

meistens im Lebensmittel vermehren können. Die Toxizität beruht auf der Bildung von Endo-

oder Exotoxinen.

6.2. Hygicult

Hygicult-TPC

Hygicult-TPC wurde zur schnellen Überwachung der mikrobiologischen Hygiene in verschiedenen

Materialien entwickelt. Es ist sowohl bei festen als auch bei flüssigen Materialien

anwendbar. Feste Stoffe werden untersucht, indem man beide Seiten des Trägers fest gegen die

Oberfläche drückt. Halbfeste oder flüssige Proben werden mit Hilfe eines sterilen Wattestäbchens

beimpft. Flüssigkeiten werden am besten untersucht, indem man den Träger 3-4

Sekunden in die Probe taucht. Nach der Beimpfung wird der Träger sorgfältig in das Trägergefäß

zurückgesteckt und bei 35-37°C einen Tag bebrütet.

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Praktische ÜBUNG - NAHRUNGSMITTELUNTERSUCHUNG

Hefeextrakt-Agar (YEAST): festes Universalmedium („farblos“)

Rambach-Agar (RA): festes Selektivmedium für Salmonellen („zuckerlrosa“)

Blut-Agar (B): festes Universalmedium („blutrot“)

Endo-Agar (E): festes Selektivmedium für gramnegative Stäbchen („hellrosa“)

Hygicult-TPC

(37°C, 24Std.)

Rambach

(37°C, 24Std.)

Nahrungsmittel homogenisieren

(Stomacher)

Probe zu 100ml Peptonwasser

(37°C, 24 Std.)

Bebrütung 24Std.

Blut

(37°C, 24Std.)

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0,1ml auf YEAST

(37°C, 24Std.)

Endo

(37°C, 24Std.)


Durchführung:

Die mitgebrachten Proben (Lebensmittel, Pharmazeutische Produkte, etc.) werden in 100ml

Peptonwasser (Glaskolben) mit Hilfe des STOMACHER’s (im Plastiksack) homogenisiert und

die homogenisierte Probe in den Glaskolben geleert.

0,1ml werden mit Hilfe einer Pipette auf YEAST-Agar aufgetragen und ausgespachtelt.

Parallel dazu wird ein HYGICULT-TPC 3-4 Sekunden in die homogenisierte Probe getaucht.

Anschließend erfolgt eine Bebrütung aller drei Medien für 24h bei 37°C.

Vom HYGICULT und YEAST-Agar wird die Gesamtkeimzahl bestimmt.

Peptonwasser (Glaskolben) auf Blut- Endo- und Rambach-Agar überimpfen und 24h bei

37°C bebrüten.

Makroskopische und mikroskopische Bestimmung und weitere Differenzierung

Praktische ÜBUNG - UMGEBUNGSABSTRICH

Thioglykolat: flüssiges Optimal-/ Anreicherungsmedium

Die Probenentnahme erfolgt mit einem sterilen Abstrichtupfer von einer beliebigen

Keimquelle (Fussboden, Schuhsohle, Toilette, Mülltonne, Kaffeeautomat… etc.).

Der Abstrichtupfer wird anschließend in ein flüssiges Anreicherungsmedium (Thioglycolat)

getaucht und für 24-48h bei 37°C bebrütet.

Danach wird das Keimwachstum im Thioglykolat makroskopisch beurteilt. Wenn eine

Trübung des Nährmediums zu beobachten ist erfolgt eine Überimpfung auf eine Blut- und eine

Endoagarplatte. Die Agarplatten werden dann für 24h bei 37°C bebrütet. Ist keine Trübung

vorhanden ist kein Keimwachstum erfolgt.

Beurteilung des Keimwachstums auf der Blut- bzw. Endoagarplatte.

Gramfärbung der makroskopisch unterscheidbaren Kolonien und weitere Differenzierung.

Praktische ÜBUNG - UMGEBUNGSABKLATSCH

Hygicult-TPC: festes Universalmedium („farblos“)

Die Probenentnahme erfolgt von einem festen-, halbfesten- oder flüssigem Material mittels

Hygicult-TPC von einer beliebigen Keimquelle (div. Oberflächen z.B.: von Maschinen,

Reinigungsgeräte,… etc.).

Der Hygicult-TPC wird am nächsten Tag für 24h bei 37°C bebrütet.

Danach wird das Keimwachstum an den Agarflächen makroskopisch beurteilt. Wenn ein

Wachstum zu beobachten ist erfolgt eine Überimpfung auf eine Blut- und eine Endoagarplatte.

Die Agarplatten werden dann für 24h bei 37°C bebrütet.

Gramfärbung der makroskopisch unterscheidbaren Kolonien und weitere Differenzierung.

20


7. Chemotherapeutika

Die Unwirksamkeit mancher Antibiotika auf gewisse Keime ist auf die Resistenzart

zurückzuführen:

1) primäre Resistenz: entspricht der natürlichen Resistenz

2) erworbene Resistenz: a) Mutation (chromosomal)

b) „infektiöse“ Resistenz (Plasmide)

diese Resistenzen können, wenn der Druck des Antibiotikums

ausbleibt, wieder verloren gehen.

Die Resistenzprüfung von Erregern in vitro, auch Empfindlichkeitsbestimmung genannt, ist

notwendig, weil die Empfindlichkeit vieler Bakterienarten von Stamm zu Stamm wechselt und

das Resistenzverhalten nicht im vor hinein zu erkennen ist. Daraus ergibt sich die zwingende

Notwendigkeit die Resistenztestung zur vollständigen Befunderstellung durchzuführen.

Durch die Testung erfolgt der Ausschluss jener Substanzen, die schon in vitro nicht wirksam

sind und damit für die klinische Anwendung nicht mehr in Frage kommen. Über die richtige

Auswahl aus den wirksamen Substanzen entscheiden dann andere Parameter (Bioverfügbarkeit,

Applikation, klinische Aspekte, etc.).

Die antimikrobiellen Chemotherapeutika unterscheiden sich in ihrem Wirkungsmechanismus,

bzw. Angriffsort:

Angriffsort Wirkmechanismus Chemotherapeutikum

Zellwand

Ribosomen

Nukleinsäure

Zellmembran

Folatsynthese

Muraminsäuresynthese

Pyruvyl-Transferase

Phospholipidsynthese

Glucansynthese

Peptidyl-Transferase

Ribosom A

Translokation

Peptidyl-Transferase

Elongationsfaktor G

Abbauende Enzyme

DNS-Gyrase

RNS-Polymerase

DNS-Stränge

Phospholipide

Ergosterolsynthese

Ergosterolsynthese

Pteroatsynthetase

Dihydrofolat-Reduktase

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Betalaktam-Antibiotika

Vancomycin

Teicoplanin

Fosfomycin

Bacitracin

Echinocandine

Chloramphenicol

Tetracycline

Makrolide

Clindamycin

Fusidinsäure

Aminoglykoside

Gyrase-Hemmer

Rifampicin

Nitroimidazole

Polymyxine

Amphotericin B

Azole

Sulfonamide

Trimethoprim


Einteilung der Antibiotika (Chemotherapeutika)

22


Wirkungstypen der Antibiotika

1) Bakteriostase: Hemmung der Bakterienvermehrung (zB durch Sulfonamide, Chloramphenicol

und Tetracycline), wobei die Keime nicht abgetötet werden. Die natürliche Absterberate

ruhender Bakterien wird dabei nicht beeinflusst.

2) Bakterizidie: Abtötung der Bakterienzelle (zB infolge Verhinderung der Zellwandsynthese

durch Penicillin). Penicilline und Cefalosporine wirken nur in der Vermehrungsphase der

Bakterien bakterizid, Aminoglykoside auch in der Ruhephase.

Nebenwirkungen:

Toxische Reaktionen (zB Nephrotoxisch, Ototoxisch)

Allergische Reaktionen

Biologische Nebenwirkungen (Beeinflussung der Normalbesiedelung)

Methoden der Resistenzbestimmung

• Agardiffusion: wirkstoffgetränkte Filterpapierblättchen werden auf den mit dem Keim

beimpften Agar aufgebracht. Die Hemmhöfe werden nach der Bebrütung abgelesen.

• Bouillondilution: Keim wird in die Antibiotikaverdünnungsreihe eingebracht und der

Wachstumsendpunkt ermittelt = MHK (Minimale Hemmkonzentration). Wird heute in

Mikrotiterplatten oder Automaten gemacht.

• Agardilution: Antibiotikaverdünnung wird mit festem Agar ausgegossen und dann mit Keim

beimpft (MHK).

Praktische ÜBUNG - AGARDIFFUSIONSTEST

Müller-Hinton-Agar (MH): festes Nährmedium („farblos“)

zur Durchführung des Agardiffusionstests (ANTIBIOGRAMM)

1.) Mit der Öse wird das zu untersuchende Keimmaterial (zB vom Uricult) abgenommen

und in physiologischer NaCl-Lösung eingerührt, sodass eine leicht trübe Suspension

entsteht.

2.) Die Keimsuspension wird mittels sterilem Wattetupfer flächendeckend auf einen

Nährboden aufgetragen.

3.) Mit dem Dispenser, der die Antiobiotika-Testblättchen enthält, werden die Testblättchen

auf den Agar gedrückt.

4.) Die Probe wird nun 24h bei 35-37°C bebrütet und dann ausgewertet.

Die Chemotherapeutika diffundieren von dem aufgelegten imprägnierten Filterpapierplättchen in

das Agargel und bewirken je nach Wirksamkeit eine Hemmung des Bakterienwachstums um das

Testplättchen (Hemmhof). Bei Unwirksamkeit der Testsubstanz kommt es zu einem ungehinderten

Bakterienwachstum. Der Hemmhofdurchmesser ist ein Maß für die Empfindlichkeit

eines Bakteriums gegen ein Antibiotikum

Abhängig von der Größe des Hemmhofes und der Wirkstoffkonzentration werden die Ergebnisse

in "sensibel" (oder empfindlich), "mäßig sensibel" und "resistent" (oder unempfindlich)

unterteilt. Die Interpretation der Ergebnisse basiert auf festgelegten Grenzwerten (siehe Tabelle).

23


empfindlich mäßig empf. resistent

wenn > als wenn von – bis wenn < als

Penicillin (P 10) 29 28

Augmentin (AMC) 20 18-19 17

Aminopenicillin (Am) 29 28

Cefoxitin (Fox) 18 15-17 14

Sulfonamid +

Trimethoprim (SXT) 16 11-15 10

Norfloxacin (Nor) 18 13-17 12

8. Harnwegsinfekt (HWI)

Praktische ÜBUNG – HWI / Uricult

Ziel der Übungen:

Beurteilung der Keimzahl anhand einer Vergleichstabelle (siehe Seite 25)

Identifizierung des Infektionserregers (MacConkey-Agar - Bunte Reihe)

Erstellen eines Antibiogramms (MacConkey-Agar)

Interpretation des Ergebnisses und Abgabe eines Therapievorschlags

Durchführung:

Jeder Arbeitsplatz bekommt aus dem bakteriologischen Routinelabor einen bereits

bebrüteten und bearbeiteten URICULT zur Verfügung gestellt.

Cled-Agar: durchgehende Agarfläche (Universalmedium) für aerobe Bakterien

MacConkey-Agar: auf der unterteilten Rückseite oben: Selektivagar für gram-negative

Bakterien

Slanetz-Agar: auf der unterteilten Rückseite unten: Selektivagar für Enterokokken

Die Beurteilung der Gesamtkeimzahl (Uricult-Cled-Agar):

Mittelstrahlharn: Signifikanzgrenze: ≥10 5 Keime/ml Harn

Katheterharn: die Signifikanzgrenze wird um den Faktor 10 tiefer angesetzt (≥10 4 )

Blasenpunktationsharn: jeder Keimnachweis gilt als signifikant

24


9. Der bakteriologische Trinkwasserbefund:

Interpretation und Maßnahmen

Trinkwasser ist unser wichtigstes Lebensmittel und daher unersetzlich.

Der heutige hohe Stand der Trinkwasserhygiene gehört zu den erfolgreichsten Umsetzungen

hygienischer Erkenntnisse in wirksame Präventionsmaßnahmen. Hierdurch konnten vor allem

Infektionskrankheiten wie Typhus, Paratyphus, Cholera, Shigellenruhr u.a. so nachhaltig

bekämpft werden, dass diese Erkrankungen ihre epidemiologische Bedeutung in Mitteleuropa

weitgehend verloren haben.

Sofern es sich um öffentliche Wasserversorgungsanlagen handelt, sorgen das

Lebensmittelsicherheits- und Verbraucherschutzgesetz sowie die Trinkwasserverordnung für die

gesundheitliche Unbedenklichkeit von Trinkwasser.

Anforderungen an ein Trinkwasser gemäß Österr. Lebensmittelbuch, IV. Auflage, Kapitel

B1 „Trinkwasser“ (Auszug)

„Trinkwasser ist Wasser, das in nativem Zustand oder nach Aufbereitung geeignet ist, vom

Menschen ohne Gefährdung seiner Gesundheit verzehrt zu werden und das geruchlich,

geschmacklich und dem Aussehen nach einwandfrei ist.“

„Grundsätzlich ist für den menschlichen Verzehr nativ einwandfreies Wasser einem

aufbereiteten Wasser vorzuziehen, auch wenn die Erschließungs-, Schutz- und Transportkosten

dadurch höher sind“

„Trinkwasser darf Bakterien, Viren und Parasiten, die durch Verschlucken eine Erkrankung des

Menschen verursachen können, nicht in Anzahlen enthalten, die eine potentielle Gefährdung der

menschlichen Gesundheit darstellen. Da deren umfassender Nachweis mit vertretbarem

Aufwand nicht möglich ist, wird Trinkwasser routinemäßig auf das Vorhandensein von

Indikatorbakterien untersucht, die auf eine Verunreinigung hinweisen. […] Stoffe jedweder Art

dürfen im Trinkwasser nur in Konzentrationen enthalten sein, die die menschliche Gesundheit

auch bei lebenslangem Verzehr des Trinkwassers nicht gefährden.“

Die Anforderungen des ÖLMB B1 gelten als erfüllt, wenn die nachstehend angeführten

Indikatorparameterwerte und Parameterwerte eingehalten werden (nicht desinfiziertes

Wasser):

Mikrobiologische Indikatorparameterwerte (Richtwerte)

KBE 22 (koloniebildende Einheiten

bei 22°C Bebrütungstemperatur) 100/ml

KBE 37 (koloniebildende Einheiten

bei 37°C Bebrütungstemperatur) 20/ml

Coliforme Bakterien 0/100ml

Clostridium perfringens (einschließlich Sporen) 0/100ml

Mikrobiologische Parameterwerte (Grenzwerte)

Escherichia coli 0/100ml

Enterokokken 0/100ml

Pseudomonas aeruginosa 0/100ml

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Kurze Charakterisierung der mikrobiologischen Parameter bzw.

Indikatorparameter:

Koloniezahl bei 22°C Bebrütungstemperatur:

Die niedrige Bebrütungstemperatur begünstigt jene Mikroorganismen, die bei kühlerer

Umgebungstemperatur gut gedeihen. Daher werden vor allem Bakterien, die im Wasser oder im

Boden vorhanden sind, erfasst.

Koloniezahl bei 37°C Bebrütungstemperatur:

Die höhere Bebrütungstemperatur begünstigt jene Mikroorganismen, die sich an oder in

lebenden warmblütigen Tieren oder Menschen vermehren.

Escherichia coli (E.coli):

Ist das bekannteste Bakterium aus der Gruppe der coliformen Bakterien. Es kommt im Darm von

Mensch und Tier in hohen Konzentrationen vor (bis zu einer Milliarde Bakterien pro Gramm

Stuhl oder Kot) und gilt aus diesem Grund als der bedeutendste Indikator für fäkale

Verunreinigung.

Coliforme Bakterien:

gehören zu den Enterobakterien, die vor allem im Darm von Tieren und Menschen vorkommen.

Coliforme Bakterien können sich aber auch in Böden, auf Pflanzen und in Oberflächengewässern

vermehren.

Enterokokken:

Sind ebenfalls Darmbakterien von Mensch und Tier, die jedoch in etwas geringerer

Konzentration im Stuhl bzw. Kot vorkommen. Da sie in der Umwelt eine längere

Überlebensdauer besitzen als coliforme Bakterien, können diese auf länger zurück liegende

Verunreinigungen hinweisen.

Pseudomonas aeruginosa:

Ist ein Bakterien, das in geringen Konzentrationen in allen natürlichen Wässern vorkommt. In

nicht gut gewarteten Wasserversorgungsanlagen, speziell in nicht gepflegten Filteranlagen, in

Leitungen oder Armaturen, in denen das Wasser längere Zeit steht, kann sich Pseudomonas

aeruginosa so stark vermehren, dass dieses Bakterium ein Gesundheitsrisiko darstellt. Hier sind

insbesondere Infektionen von Wunden und des äußeren Gehörganges zu nennen. Aufbereitetes

und desinfiziertes Wasser wird auf diesen Parameter untersucht.

Clostridium perfringens:

Ist ein Darmbakterium, das nur in sauerstofffreier Umgebung überleben kann. Unter für dieses

Bakterium ungünstigen Bedingungen bildet es widerstandsfähige Dauerformen (Sporen) und

kann dadurch lange Zeit überleben. Durch diese Widerstandsfähigkeit eigenen sich die Sporen

von Clostridum perfringens besonders gut zur Überprüfung der Wirksamkeit von

Aufbereitungsverfahren und Desinfektionsmaßnahmen.

Ein Beispiel nicht fäkaler Erreger mit dezentraler Vermehrung:

Legionellen: sind Bakterien, die als natürlicher Bestandteil der Mikroorganismenflora in

sämtlichen Süßwässern vorkommen. Sie gelangen in sehr geringen, mit den üblichen Verfahren

der Trinkwassermikrobiologie nicht nachweisbaren Konzentrationen in wasserführende Systeme,

wo sie ihre ökologischen Nischen und optimalen Vermehrungsbedingungen vorfinden. Sie

können Hausinstallationssysteme besiedeln (v.a. Duschköpfe, Wasserauslässe, Stagnationszonen

...) aber auch in Luftbefeuchtern u.a., wobei ihr Temperaturoptimum im Bereich von 25°C

bis 45°C liegt. Unter 20°C ist ihre Vermehrungsrate äußerst eingeschränkt, über 60°C werden

Legionellen abgetötet.

27


Kriterien für die Beurteilung der Untersuchungsergebnisse:

Grundsätzlich ist für die Gesamtbeurteilung einer Wasserversorgungsanlage ein

Lokalaugenschein und eine chemische sowie eine bakteriologische Wasseranalyse erforderlich.

Die seuchenhygienische Beurteilung einer Trinkwasserversorgungsanlage basiert auf die im

Zuge des Lokalaugenscheines vorgefundenen Gegebenheiten und dem Ergebnis der

bakteriologischen Untersuchung. Da der bakteriologische Befund nur einen Momentanzustand

erfasst, kann ein Vergleich mit den Ergebnissen der Vorbefunde aufschlussreiche Erkenntnisse

ergeben.

Auch die bei Beanstandungen zu treffenden Maßnahmen sind vom Ortsbefund und dem

Ausmaß der festgestellten Verunreinigungen abhängig. So wird bei massiven Verunreinigungen,

hervorgerufen durch eine Abwasserbeeinflussung eines Wasserspenders anders vorzugehen sein,

als bei geringfügigen Kontaminationen eines Endstranges.

Beurteilung:

Sicher und für den menschlichen Verzehr geeignet: Lokalaugenschein und chemischbakteriologische

Analysenergebnisse ergeben keinen Grund zu Beanstandungen.

Den Indikatorparameterwerten nicht entsprechendes Wasser bzw. bei Beanstandungen aufgrund

der Inspektion kann das Wasser bei umgehender Behebung der Mängel bzw. bei Umsetzung

vorgeschlagener Maßnahmen als sicher und geeignet beurteilt werden. Bei massiven

Überschreitungen der Indikatorparameterwerte bzw. bei gravierenden Mängeln ist jedoch zu

prüfen, ob eine Beurteilung als nicht sicher und nicht geeignet erforderlich ist.

Nicht sicher und für den menschlichen Verzehr nicht geeignet: Den Parameterwerten nicht

entsprechendes Wasser. Es sind Maßnahmen zu ergreifen um spätestens nach 30 Tagen den

Parameterwerten zu entsprechen. Der Erfolg der Maßnahmen ist durch Kontrolluntersuchungen

nachzuweisen. Auf weitere Bestimmungen der Trinkwasserverordnung wird verwiesen.

28


Wasserbeschaffenheit- Bakteriologische

Analysenverfahren

Plattengussverfahren (KBE 22°C, KBE 37°C)

Die Proben werden unter sterilen Bedingungen pipettiert, anschließend wird das entsprechende

Nährmedium (Hefeextraktagar) zugegeben; unter vorsichtigem Schwenken werden Probe und

Nährmedium vermischt. Die Platten werden unter Berücksichtigung der Bebrütungstemperatur

in die jeweiligen Brutschränke gegeben.

Auswertung: Auszählen der Koloniebildenden Einheiten KBE/1ml (Lupe!)

Membranfiltrationsverfahren (E.coli, Coliforme Bakterien..)

Die sterile Filtrationsanlage wird an ein Unterdruck erzeugendes Gerät angeschlossen. Sterile

Membranfilter mit der Gitternetzseite nach oben auf die poröse Scheibe der Filterhalterung

legen; dabei nur den äußeren Rand der Filtermembran (Porengröße 0,45µm) mit einer flachen,

sterilen Pinzette anfassen. Den sterilen Filtrationsaufsatz sicher auf der Filterhalterung befestigen

und ein entsprechendes Volumen (100ml) in den Filtrationsaufsatz gießen. Das Ventil zum

Unterdruckerzeuger öffnen und Unterdruck anlegen, um das Wasser durch die Membran zu

filtrieren. Den Filtrationsaufsatz entfernen (sicherstellen, dass der Verschlusshahn vorher

geschlossen wurde) und die Membran auf eines der folgenden Medien übertragen, dabei

sicherstellen, dass keine Luftblasen zwischen der Membran und dem Nährmedium

eingeschlossen sind:

Coliforme Bakterien (incl. E.coli) Chromocult (37°C, 48h)

Enterokokken Slanetz-Bartley (37°C, 48h)

Pseudomonas aeruginosa Cetrimid (37°C, 48h)

Auswertung: Auf selektivem oder differenzierendem Nährmedium (z.B. Chromocult) nur die

Kolonien, die ein für den gesuchten Organismus charakterisitisches Aussehen haben, zählen. Für

eine genauere Charakterisierung sind Bestätigungstests notwendig.

29


Zählung durch Beimpfen von Flüssigmedium (E.coli, Coliforme Bakterien..)

Untersuchungsvolumina einer Wasserprobe werden in flüssiges Medium eingeimpft um das

Wachstum eines bestimmten Mikroorganismus oder einer Gruppe von Mikroorganismen

sicherzustellen. Die Anzahl der mit höchster Wahrscheinlichkeit (en: MPN: most probable

number) in der Originalprobe vorhandenen Mikroorganismen und die Präzision der Berechnung

können über statistische Verfahren auf der Basis der Anzahl positiver und negativer

Testvolumina nach der Inkubationszeit berechnet werden.

Colilert- 18 Testkit (MPN)

Colilert-18 ist zum gleichzeitigen Nachweis von Gesamtcoliformen und E.coli im Wasser

bestimmt.

Testprinzip: Gesamtcoliforme, die den Nährstoff-Indikator ONPG metabolisieren, verfärben die

Probe gelb. E.coli, die den Nährstoff-Indikator MUG metabolisieren, zeigen sich durch eine

Fluoreszenz der Probe.

Anwendung: Den Inhalt einer Packung (Colilert-Testkit) mit 100ml Wasserprobe mischen, in ein

Behältnis (Quanti-Tray) überführen, versiegeln und inkubieren.

Auswertung: Auf Gelbfärbung und Fluoreszenz prüfen, auszählen und die wahrscheinlichste

Zahl (MPN) anhand der dem Testkit beiliegenden Tabelle ermitteln.

30


Chemische Analytik

Bestimmung der Gesamthärte (Summe Ca, Mg) durch

komplexometrische Titration

Allgemeines:

Ca und Mg-Ionen kommen in allen natürlichen Wässern vor und werden oft als Härtebildner

bezeichnet.

Als „Härte“ eines Wassers wird seine Eigenschaft bezeichnet, aus Seifenlösungen unlösliche

Calcium- und Magnesiumsalze der höheren Fettsäuren auszufällen.

Beurteilung der Gesamthärte : 0° dH - 3,9 ° dH: sehr weich

4° dH - 7,9 ° dH: weich

8° dH - 17,9 ° dH: mittelhart

18,0° dH - 30 ° dH: hart

> 30 ° dH: sehr hart

Reagenzien:

Na-EDTA 0,05 mmol

Triethanolamin

Indikatorpuffertabletten (Eriochromschwarz T)

Ammoniak-Lösung conc.

Geräte:

Vollpipette 50 ml

Plastikbecher 100 ml

Digitalbürette Brandt 25 ml

Magnetrührer + Rührknochen

Durchführung:

50 ml der titrierten Wasserprobe (Karbonathärte mit 0,1 N HCL) werden mit einer

Indikatorpuffertablette sowie einigen Tropfen Triethanolamin und einem Milliliter

Ammoniaklösung conc. versetzt.

Nach ca. 10 min. Standzeit (bis sich die Indikatorpuffertablette gelöst hat) wird mit 0,05 mmol

Na-EDTA bis zum Endpunkt titriert. (Farbumschlag von rot auf graugrün).

Auswertung:

Summe Erdalkalionen in mmol = axMx1000

V

a: Verbrauch EDTA-Lösung in ml

M: Molarität der EDTA-Lösung. (0,05 mmol)

V: Probevolumen in ml (50 ml)

Umrechnung in ° dH:

° dH = mmol Erdalkali x 5,6

Ergebnis auf eine Kommastelle genau angeben.

(Festlegung: 1° dH ^ 10 mg ( Ca 0 und Mg 0)

31


Bestimmung der Karbonathärte (+m-Wert) durch

Titration

Allgemeines:

Die Karbonathärte ist ein Teil der Gesamthärte. Sie entspricht dem Anteil der Erdalkaliionen,

meist Ca und Mg-Ionen, der den im Wasser gelösten Hydrogencarbonat. (HCO 3 -) und

Karbonationen (CO 3 2-) äquivalent ist. Das Verfahren ist für Trink-und Oberflächenwasser, bei

denen der pH-Wert größer als 4,3 ist, anwendbar.

Reagenzien:

HCl 0,1N

Methylorange

Geräte:

Vollpipette 50 ml

Plastikbecher 100 ml

Digitalbürette Brandt 25 ml

Magnetrührer + Rührknochen

Durchführung:

50 ml Wasserprobe werden mit einer Vollpipette in einen 100 ml Plastikbecher überführt und

mit 0,1 N HCL gegen Methylorange (3 Tropfen) bis zum Endpunkt titriert. Farbumschlag von

gelb auf Zwiebelschalenfarben (entspricht pH 4,3).

Auswertung:

°dH KH = + m-Wert x 5,6

+ m - Wert ist bezogen auf 50 ml Wasserprobe.

Diese Berechnung gilt im pH-Bereich 4,3 - 8,3 Ergebnis auf eine Kommastelle genau angeben.

Literatur:

DEV H 7 ( Bestimmung der Säurekapazität )

Hütter S 247 ff, 307, 207, 71

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Bestimmung des pH-Wertes im Trink- und

Oberflächengewässer

Allgemeines:

Der pH-Wert ist der negativ dekadische Logarithmus der Wasserstoffionen - Aktivität H+ (mol/l)

und ist temperaturabhängig.

pH = - log H +

(gilt für Lösungen, in denen die H+ - Ionen 100 % dissoziiert vorliegen)

In natürlichen Wässern liegen die pH-Werte meist zwischen 6,5 und 8,5.

Reagenzien:

Boratpufferlösung pH 9,22

Phosphatpufferlösung pH 6,88

KCl-Lösung 3 M

Gerät:

pH-Elektrode: Hamilton-Gelplast

WTW pH 521

Magnetrührer + Rührknochen

Plastikbecher 100 ml

Durchführung:

Die Routinemessung erfolgt mittels WTW pH 521 im Eichbereich 6,88-9,22 bei Raumtemperatur

(20°C).

Die Eichung ist routinemäßig 1 mal wöchentlich durchzuführen und täglich durch geeignete

Kontrollen (Puffer) zu prüfen.

Der pH-Wert der Probe muss im Eichbereich liegen, ansonsten ist ein anderer Bereich neu einzueichen

(zB 2,00 - 6,88).

50 - 80 ml werden in den Plastikbecker überführt. Die pH-Elektrode wird in die Probe eingetaucht

(ca. 3-4 cm) und die Messung erfolgt unter langsamen Rühren , bis sich ein konstantes

Messsignal eingestellt hat. Die Elektrode wird nach der Messung in 3 M KCl aufbewahrt.

Angabe der Ergebnisse :

Das Ergebnis wird auf 2 Stellen nach dem Komma angegeben. Die Bezugstemperatur ist

Raumtemperatur (20°C).

Bei vielen Untersuchungen (Badewässer, Oberflächenwässer) ist es notwendig, den pH-Wert vor

Ort zu messen.

Literatur:

DEV, C 5

ÖNORM M 6244

ÖNORM M 6259/55

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Bestimmung der elektrischen Leitfähigkeit

Allgemeines:

Die elektrische Leitfähigkeit ( LF ) ist der reziproke Wert des elektrischen Widerstandes ( R ).

Die elektrische Leitfähigkeit von Wässern beruht ganz allgemein auf deren Gehalt an Ionen

(abhängig von Konzentration und Dissoziationsgrad der Elektrolyte, Wertigkeit, Ionenbeweglichkeit

in Feldrichtung und Temperatur).

Im Wasser sind die Wertigkeit und die Wanderungsgeschwindigkeit der Ionen konstant, daher ist

bei konstanter Temperatur die elektrische Leitfähigkeit eine Funktion der Ionenkonzentration.

Reagenzien:

KCl 0,01 N ( ^ bei 25°C 1413 µS/cm)

Geräte:

Plastikbecher 100 ml

Messzelle WTW LTA 1 (LF-Elektrode)

Temperaturfühler WTW TFK 530

WTW LF 530

Magnetrührer + Rührknochen

Durchführung:

Vor jeder Messserie muss die Zellenkonstante mit einer 0,01 N KCL-Lösung (^1413 µS/cm)

überprüft werden, wenn nötig, ist eine Korrektur der Zellkonstante erforderlich.

In den Plastikbecher werden 60 - 80 ml Wasserprobe eingefüllt und mittels Elektrode und

Temperaturfühler wird unter langsamen Rühren, bis sich ein konstantes Messsignal eingestellt

hat, die elektrische Leitfähigkeit bestimmt.

Auswertung:

Angabe der Ergebnisse in µS/cm bei einer Bezugstemperatur von 25°C ohne Kommastelle. Der

Wert erlaubt Rückschlüsse auf den Gesamtsalzgehalt und zur weiteren Kontrolle kann die

Mindestleitfähigkeit aus ( Kappa ) dem + m-Wert berechnet werden.

Kappa = + m-Wert . 80 (µS/cm)

Bei technischen Untersuchungen muss die elektrische Leitfähigkeit vor Ort bestimmt werden.

Literatur:

DEV, C 8

ÖNORM M 6241

ÖNORM M 6259

Bedienungsanleitung des Geräteherstellers (WTW)

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10. BLUT

Differentialblutbild

Zur Herstellung von brauchbaren Ausstrichpräparaten des Blutes ist die Verwendung exakt

gereinigter Objektträger wesentlich. Ausgestrichen wird im Allgemeinen mit einem zweiten

Objektträger. Es muss auf eine optimale Schichtdicke des Ausstrichs geachtet werden, da

Ausstrichpräparate mit zu großer Schichtdicke grundsätzlich überfärbt werden und eine Analyse

zellulärer Feinstrukturen dadurch unmöglich ist, während bei Ausstrichpräparaten mit zu

geringer Schichtdicke mehr oder minder viele weiße Zellelemente in lädiertem Zustand gefunden

werden.

Die am häufigsten angewandte Färbung der Blutausstriche nach Pappenheim beginnt mit einer

3-5 minütigen Einwirkung der Farblösung nach May-Grünwald, wobei gleichzeitig eine

Alkoholfixierung des Präparates stattfindet. Danach wird mit Aqua dest. abgespült. Hierauf

erfolgt eine 15-20 minütige Färbung mit verdünnter Giemsa-Lösung. Entscheidend ist dabei

der pH-Wert, der möglichst neutral sein sollte, wobei die Färbezeit bei gering saurem pH etwas

verlängert, bei gering alkalischem pH etwas verkürzt wird. Anschließend wird das Präparat

getrocknet.

Physiologisches Differentialblutbild

Stabkernige neutrophile Granulozyten 0 - 4%

Segmentkernige neutrophile Granulozyten 50 - 70%

Basophile Granulozyten 0 - 1%

Eosinophile Granulozyten 1 - 4%

Monozyten 2 - 8%

Lymphozyten 25 - 45%

Pathologisches Differentialblutbild

• Bakterieller Infekt: Bei einer bakteriellen Infektion ist der prozentuelle Anteil der

Granulozyten erhöht. Zusätzlich findet sich eine mehr oder minder ausgeprägte Vermehrung

der Stabkernigen (=Linksverschiebung). Bei Abklingen der bakteriellen Infektion kann oft

eine Zunahme der Eosinophilen (=eosinophile Morgenröte) beobachtet werden.

• Viraler Infekt: Bei einer viralen Infektion kommt es zu einer reaktiven Vermehrung der

Lymphozyten.

• Infektiöse Mononukleose: Bei der infektiösen Mononukleose kommt es zum Auftreten von

lymphatischen Reaktionsformen (Lymphoidzellen). Sowohl Kerngröße als auch

Zytoplasmadurchmesser können mehr als das Doppelte eines normalen Lymphozyten

erreichen. Besonders charakteristisch ist der weite Plasmasaum von unterschiedlich starker

Basophilie.

• Infektanämie: Bei schweren Infektionen kann man im Erythrozytenbild anämische

Veränderungen beobachten. Dabei treten eine Anisozytose (=Größenunterschiede der

Erythrozyten) und eine mehr oder minder stark ausgeprägte Poikilozytose

(=Formunterschiede der Erythrozyten) auf. Viele Infektanämien sind lange normochrom,

daher treten Anulozyten (=Ringformen der Erythrozyten) meist erst bei chronischen

Infektionen auf.

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Blutvolumen

Beim erwachsenen Menschen beträgt das Blutvolumen etwa 6-8% des Körpergewichts. Das

entspricht ca. 5-6 Litern Blut.

Männer haben im Durchschnitt mehr Blut als Frauen.

Funktionen des Blutes

I. Transportfunktionen

1. Respiratorische Funktion: - Sauerstofftransport durch Erythrocyten,

- Kohlendioxydtransport im Blutplasma

2. Ernährungsfunktion: Nährstoffe werden zu Organen transportiert

3. Entschlackung: Transport der Stoffwechselendprodukte zu Ausscheidungsorganen

4. Humorale Funktion: Transport von Hormonen zu Erfolgsorganen

5. Regulationsfunktion: Verteilung von Wasser und Salzen im Körper (osmotische Regulation)

II. Wärmeregulation

Eine mehr oder weniger starke Blutversorgung eines Körperteils führt zu einer mehr oder

weniger starken Erwärmung.

III. Eigenfunktion des Blutes

1. Pufferung: Säure-Basen-Gleichgewicht im Körper muss konstant gehalten werden.

(Kohlensäure-Bicarbonat-Puffer, Hämoglobin)

2. Blutgerinnung: Fibrin und Thrombocyten

3. Abwehrfunktion: γ-Globuline, weiße Blutkörperchen

Zusammensetzung des Blutes

Blutplasma

Das Blut setzt sich aus zu 55% aus flüssigen Bestandteilen (=Blutplasma) und zu 45% aus festen

Bestandteilen (=Blutzellen) zusammen.

Blutplasma besteht zu 90% aus Wasser und zu 10% aus darin befindlichen Substanzen wie

gelösten Salzen und Eiweißkörpern.

Bluteiweiße: Albumin

α-Globuline

β-Globuline

μ-Globuline

Fibrinogen

Blutserum: Blutplasma ohne Fibrinogen

Blutzellen

45% der Blutvolumens sind feste Bestandteile (=Blutzellen)

Erythrocyten: rote Blutkörperchen: 4,5-5,5 Millionen / mm³

Leukocyten: weiße Blutkörperchen: 6.000-8.000 / mm³

Thrombocyten: Blutplättchen: 150.000-300.000 / mm³

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ERYTHROCYTEN

Anzahl: 4,5-5,5 Millionen / mm³

Anzahl steigt bei dauernder vermehrter Muskelaktivität und bei längerem Aufenthalt in größen

Höhen

Lebensdauer: 110-130 Tage

Regeneration erfolgt im roten Knochenmark

Abbau erfolgt bereits im Blut, in der Milz und in der Leber

Form: bikonkave, runde Scheiben, kernlos, sehr formellastisch; zentrale Eindellung dient der

Oberflächenvergrößerung; die Gesamtoberfläche aller Erythrozyten eines Menschen beträgt

3.000-4.000 m².

Funktion: Sauerstofftransport durch reversible Bindung an das zentrale Eisenatom des

Hämoglobins. Kohlendioxid wird als Kohlensäure hauptsächlich im Blutplasma transportiert.

LEUKOCYTEN

Anzahl: 6.000-8.000 / mm³

Anzahl kann stark schwanken. Bei akuten Erkrankungen kommt es zu einer Vermehrung der

Leukocytenanzahl (spez. neutrophile Granulocyten). Leukämie: bis zu 500.000 / mm³

Form: kernhältige Blutzellen, Zellen mit stark granuliertem Cytoplasma:

Granulocyten: neutrophile Granulocyten: 56-75%

eosinophile Granulocyten: 2-4%

basophile Granulocyten: 0-1%

Lymphocyten: 20-35%

Monocyten: 4-8%

Lebensdauer: Granulocyten: 1-10 Tage

Lymphocyten: wenige Tage bis mehrere Jahre

Bildung erfolgt im Knochenmark, Lymphocyten werden zusätzlich im Thymus, der Milz und

den Mandeln gebildet. Abbau erfolgt teils im Blut, im Gewebe und der Milz.

Eigenschaften:

Granulocyten: amöboid beweglich, können ins Gewebe einwandern.

Phagocytose von Bakterien und kleinen Fremdstoffen

Lymphocyten: verschiedene Formen: B- und T-Lymphocyten wichtige

Rolle bei humoraler Abwehr und spezifischer Immunantwort.

Monocyten: "Freßzellen", Phagocytose

GRANULOCYTEN

Durchmesser : 9-12μm

Neutrophile Granulocyten

Zellkern: stabkernige Granulocyten: Jugendformen

segmentkernige Granulocyten: stark gelappter Zellkern

Granula: feine Granula im Cytoplasma, färbt sich blau an (Giemsa)

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Eosinophile Granulocyten

meist etwas größer als neutrophile Granulocyten

Zellkern: besteht meist aus 2 Segmenten

Granula: relativ große Granulation, färbt sich rot an (Giemsa)

Basophile Granulocyten

Zellkern: verhältnismäßig groß, meist kugelig

Granula: große Granula, färbt sich blau an

LYMPHOCYTEN

Form: kugelige Zellen, nicht granuliert

Zellkern: relativ großer Kern, mehr oder weniger kugelig aber nie segmentiert, färbt sich stark

an

MONOCYTEN

Form: große vielgestaltige Zellen, Durchmesser: 12-20µm, Cytoplasma ist nicht granuliert

Zellkern: grobmaschig strukturiert, meist nierenförmig

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11. Ektoparasiten

Parasiten, die Menschen und Haustiere befallen und sich von ihrem Blut ernähren.

LÄUSE

Läuse können den Kopf, die Kleidung und den Genitalbereich des Menschen befallen. Man

unterscheidet Kopfläuse (2-3mm lang), Filzläuse (ca. 2mm, rundlich, flach) und Kleiderläuse

(ca. 4mm lang). Die Eier der Läuse nennt man Nissen.

Kleiderläuse

Sitzen meist in den Falten und Nähten der Kleidung. Es kommt zu starkem Juckreiz und roten,

durch die Läusebisse hervorgerufenen Pünktchen auf der Haut. Kleiderläuse kommen meist

unter schlechten hygienischen Bedingungen vor. Da sie auch Überträger fiebriger Erkrankungen

sein können, sollte ein Arzt aufgesucht werden.

Filzläuse

Filzläuse sitzen in den Scham-, Brust-, Achselhaaren oder an den Wimpern und werden durch

intensiven Körperkontakt, z.B. beim Geschlechtsverkehr, übertragen. Es kommt zu Juckreiz,

ekzemartigen Veränderungen und kleinen blauen Flecken an den Einstichstellen. Die Stiche

jucken nicht immer.

Manchmal können sie auch über Bettwäsche übertragen werden (können bis zu 4 Tage

überleben).

Kopfläuse

Sitzen in den Kopfhaaren und kleben ihre weißlichen Nissen am Haaransatz nahe der Kopfhaut

fest. Die Nissen lassen sich im Gegensatz zu Schuppen kaum abstreifen. Es kommt zu starkem

Juckreiz auf der Kopfhaut. Läuse können nicht springen. Die Übertragung von Mensch zu

Mensch erfolgt durch direkten Kontakt, durch ausgefallene, mit Nissen behaftete Haare oder

durch gemeinsamen Gebrauch von Kämmen, Mützen etc. Oft sind Schul- oder

Kindergartenkinder betroffen, da die Ansteckung dort sehr leicht von Kind zu Kind erfolgt.

Kopfläuse haben nicht unbedingt etwas mit schlechten hygienischen Bedingungen zu tun.

Biologie und Entwicklung der Kopflaus:

Die Kopflaus (Pediculus capitis) ist ein spezifischer Ektoparasit des Menschen, der fast

ausschließlich im Bereich des Kopfhaares lebt.

Die 2,4-4,2 mm großen Weibchen legen nach der Begattung durch die Männchen (Körperlänge

2,0-3,0 mm) Eier (Nissen) an den Kopfhaaren, meist in Nähe des Haaransatzes, ab und werden

dort mittels eines schnell härtenden und widerstandsfähigen Klebesekretes fest angekittet. Bei

sehr starkem Befall können Nissen gelegentlich auch an anderen behaarten Stellen des

Oberkörpers angetroffen werden, unter Umständen sogar an Stofffasern von Kopfbedeckungen,

Halstüchern und Schals. Aus den Eiern schlüpfen nach etwa 8,5 Tagen Larven, die sich über 3

Larvenstadien innerhalb von 9-14 Tagen zu adulten Läusen entwickeln.

Die erste Eiablage ist bereits 1-2 Tage nach Häutung des letzten Larvenstadiums möglich. Ein

Weibchen kann bis zu 3 Wochen leben und in dieser Zeit täglich 2-9 (im Durchschnitt 4) Eier

absetzen, so dass eine Gesamtzahl von maximal 90 Eiern zu erreichen ist. Die Generations-dauer

beträgt mindestens 18 Tage. Sie ist von der Temperatur und Luftfeuchtigkeit abhängig. Beide

Geschlechter sowie die Larven saugen Blut, wobei die adulten Läuse mehrmals am Tage

stechen.

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Erkennen eines Befalls:

In der Regel halten sich Kopfläuse in Nähe der Kopfhaut auf. Bei einer Überpopulation weichen

sie auch auf das Deckhaar aus, so dass sie dann äußerlich sichtbar werden. Zu beachten ist, dass

der durch den Stich hervorgerufene Juckreiz nicht bei jedem Befallenen zur Ausprägung kommt.

Ein sicheres Befallzeichen sind die an den Kopfhaaren festgekitteten Läuseeier (Nissen). Nach

ihnen ist bei einer Kontrolle systematisch zu suchen. Als bevorzugte Stellen der Eiablage

kommen vor allem die Schläfen- und Ohrenregion, sowie der Nackenbereich und obere

Haarwirbel in Betracht. Bei starkem Befall wird der gesamte behaarte Kopf erfasst. Um die

Nissen zu finden, ist das Kopfhaar strähnchenweise auseinander zu kämmen. Eine Leselupe

erleichtert das Erkennen.

Die Eier fühlen sich wie kleine Sandkörnchen an und können nur schwer vom Haar abgestreift

werden. Sie bleiben selbst als leere Eihüllen und auch nach einer Behandlung mit einem

Läusemittel am Haarschaft haften. Allmählich wachsen sie mit den Haaren aus. Bei

gewissenhafter Kontrolle und Zuhilfenahme einer Lupe lässt sich ein gewesener von einem

frischen Befall unterscheiden. Intakte, lebensfähige Eier sind perlmuttglänzend, anfangs

weißlich, später gelblich und dann bräunlich-gelblich. Der Inhalt ist durchscheinend und füllt

mehr oder weniger das ganze Ei aus (Ei prall mit glatter Schale).

Übertragung:

Die Übertragung erfolgt durch direkten Kontakt von Mensch zu Mensch, oder indirekt über

gemeinsam benutzte bzw. eng beieinander liegende und mit Läusen behaftete Kämme,

Haarbürsten, Kopfbedeckungen, Schals, Handtücher, Kissen, Decken, Bettwäsche, textiles

Spielzeug u.a.

Maßnahmen:

Ein Kopflausbefall muss unverzüglich behandelt werden.

Um eine Weiterverbreitung möglichst zu unterbinden, sind Personen mit engem Kontakt zum

Betroffenen (Familienangehörige, Kinder und Erwachsene in Einrichtungen des gemeinschaftlichen

Zusammenlebens usw.) einer Kontrolle auf Kopflausbefall zu unterziehen und bei

Feststellung von Läusen sofort zu behandeln.

weitere Maßnahmen:

• Wechsel von Handtüchern, Leib- und Bettwäsche

• Handtücher, Leib- und Bettwäsche bei einer Mindesttemperatur von 60°C waschen. Unter

Einhaltung dieser Temperatur sind 15 Min ausreichend.

• Bei Oberbekleidung, Kopfbedeckungen und Schals ebenso verfahren oder sie in einem gut

schließbaren Plastikbeutel bzw. -sack mindestens 3 Wochen aufbewahren (Zimmertemperatur,

optimal wären Temperaturen > 24°C).

• Läuse in Kleidungsstücken können auch mit feuchter Hitze (Dampf 50°C über 15 Min) oder

trockener Hitze (Heißluft 45°C über 60 Min) abgetötet werden.

• Ein Besprühen der Oberbekleidung mit läusetötenden Mitteln wäre eine weitere Variante.

• Nicht waschbare textile Gegenstände (z.B. textiles Spielzeug) können auch in Kälteboxen

eingebracht und bei Temperaturen unter -1°C eingefroren werden. Sie sollten dann

mindestens 24 Stunden diesem Temperaturniveau ausgesetzt sein.

• Matratzen, Rückenlehnen an Stühlen, Sofas und Sesseln sollten mit dem Staubsauger

gründlich abgesaugt werden. Ggf. wäre auch ein Besprühen mit läusetötenden Mitteln

denkbar.

• Entwesen von Kämmen, Haar- und Kleiderbürsten durch Einlegen in mindestens 60°C

heißes Seifenwasser über 15 Minuten.

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FLÖHE

Flöhe erkennt man leicht an ihrer seitlichen abgeplatteten Form. Tote Flöhe erwecken den

Eindruck sie seien gewaltsam platt gedrückt worden. Lebende Flöhe bewegen sich sehr schnell

mit ihren langen Sprungbeinen zwischen Haaren oder Federn. Die Bewegung wird ihnen dabei

durch die Körperform erleichtert. Die kurzen, keulenförmigen Antennen können in seitlich am

Kopf vorhandene Gruben gelegt werden. Ein Zurückrutschen wird durch die schräg nach hinten

gerichtete Beborstung, vor allem durch die, aus Reihen dicker Borsten, gebildeter Kämme,

verhindert. Im „freien Gelände“ kann sich der Floh durch große Sprünge fortbewegen, vor allem,

wenn es um das Erreichen eines Wirtes geht.

Vögelflöhe erreichen dabei bis zu 25 cm Weite; vom Menschenfloh, Pulex irritans, wurden

Sprungweiten bis zu 35cm und Sprunghöhen bis zu 20cm beobachtet.

Alle Flöhe sind flügellos; ihre Färbung ist gelbbraun bis schwarzbraun.

Die Flöhe sind in beiden Geschlechtern Blutsauger an Warmblütern, an Vögeln (etwa 6%) und

vor allem Säugetieren (etwa 94%). Sie sind wenig wirtsspezifisch. Der sog. Menschenfloh, Pulex

irritans, saugt auch bei Haustieren (Hund, Schwein), Fuchs, Dachs und Mardern. Der sog.

Hühnerfloh, Ceratophyllus gallinae, kommt in Wirklichkeit an zahlreichen Vogelarten vor und

saugt auch am Menschen. Am Menschen oder in deren Wohnungen wurden bereits insgesamt 20

Säugerfloh- und Vogelfloharten angetroffen.

Bei der Artbestimmung muss man daher sehr gründlich vorgehen und kann nicht einfach das

Vorkommen bei einer Wirtsart für die „Namensgebung“ verwenden.

Stichwirkung:

Der Floh ist beim Blutsaugen leicht zu stören, sticht aber rasch wieder an einer anderen Stelle.

Bei jedem erneuten Einstich jucken auch die früheren Stichstellen, so dass ein Floh den Eindruck

erwecken kann, man habe es mit zahlreichen Flöhen zu tun. Flohstiche sind erkennbar als

kleiner, dunkler, eventuell tagelang sichtbarer Punkt, umgeben von einem Hof geröteter und

geschwollener Haut. Die Rötung geht im allgemeinen rasch zurück. Das Jucken hingegen kann

tagelang anhalten. Im einzelnen sind die Reaktionen auf Flohstiche, wie bei allen Insektenstichen

und allergischen Erscheinungen, individuell sehr verschieden.

Bekämpfung:

Die Bekämpfung der Flöhe und ihrer Brut erfolgt mit Insektiziden.

Katzen, Hunde oder andere Kleintiere als Mitbewohner im Haus sind ideale Wirte für Flöhe.

Man muss daher vor allem die Tiere entflohen, die Brut mittels Staubsauger aus Fugen und

Ritzen entfernen, und anschließend Boden und Mobiliar (einschließlich der Schlafstellen der

Tiere) mit einem unbedenklichen Sprüh- oder Nebelmittel (Naturpyrethrum) behandeln.

Bewährte Mittel sind u.a. Streupuder, Waschshampoos und Sprays auf Pyrethrum-Basis.

ZECKEN (Waldzecken: Ixodes ricinus = Holzbock)

Der gewöhnliche Holzbock produziert zwar kein Gift, kann aber Überträger verschiedener

Krankheitserreger sein. Einerseits können Zecken das FSME-Virus weitergeben, andererseits

führen sie durch Übertragung des Bakteriums Borrelia burgdorferi zu der sogenannten Zecken-

Borreliose.

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Vorkommen/Verbreitung:

Borrelien übertragende Zecken kommen überall in Mittel-, Ost-, und Nordeuropa, außerdem in

Nordamerika und Australien vor. Für Zecken die eine Frühsommer-Meningoenzephalitis

übertragen können sind sogenannte Endemiegebiete bekannt.

Typische Lebensräume aller Zecken sind hohes Gras und lichte Wälder und Büsche, in denen sie

auf Blättern und Zweigen sitzen. Sie lassen sich von Menschen und Tieren abstreifen und suchen

an ihnen feuchtwarme Körperpartien auf.

Typische Merkmale:

Eiförmiger rot- bis hellbräunlicher Körper mit hartem Rückenschild von 1-2 mm Größe, in

vollgesogenem Zustand bis zu 1 cm. Am kleinen dunkler gefärbten Kopf befinden sich

Mundwerkzeuge, die speziell zum Stechen und Saugen ausgebildet sind. Bei Larven findet man

drei Beinpaare, bei den etwas größeren Nymphen und Adulten jeweils vier. Zwischen den

einzelnen Entwicklungsabschnitten muss eine Blutmahlzeit aufgenommen werden. Diese dauert

bei den Larven zwei bis vier, bei weiter entwickelten Nymphen drei bis fünf Tage.

Symptome:

Zecken hinterlassen nach ihrer Blutmahlzeit eine kleine juckende Einstichstelle, die durch

sekundäre Infektion mehr oder weniger stark gerötet und empfindlich sein kann. Etwa die Hälfte

aller Zeckenbisse bleibt unbemerkt.

Zecken sollten sofort aus der Haut entfernt werden. Nach Möglichkeit sollte dies mit einer

speziellen Zeckenzange (aus der Apotheke) erfolgen. Die Zecke wird damit gefaßt und unter

vorsichtigem Drehen entfernt. Quetschen ist bei der Entfernung unbedingt zu vermeiden. Keine

Anwendung von Öl oder Klebstoff! Sorgfältige Wunddesinfektion!

Bei Auftreten von Symptomen, die zur Frühsommer-Meningoenzephalitis oder Lyme-Borreliose

passen, ist ein Arzt aufzusuchen.

Vorbeugende Maßnahmen:

Schutz vor Zeckenbissen durch geeignete Kleidung die möglichst viel Hautfläche bedeckt. Nach

Waldspaziergängen den Körper nach Zecken absuchen.

Anwendung von Repellent Produkten.

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