5.Charakterisierung von Pilzen - member

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5.1. Typische Merkmale aller Pilze
5. Identifizierung von Pilzen
Pilze gehören zur Domäne der Eukaryonten und besitzen daher einen Zellkern.
Die Pilze sind ein eigenes Reich, sie sind keine Pflanzen !
Pilze ernähren sich heterotroph und betreiben keine Photosynthese
Die meisten Pilze besitzen eine Zellwand aus Chitin (Cellulose bei den Oomycetes),
Phagocytose von Nahrungsstückchen kommt selten vor. Daher schleusen die Pilze
Enzyme aus, die eine Verdauung außerhalb der Zelle ermöglichen (deutlich beim
Abbau von Holz abgestorbener Bäume zu beobachten). Die zerkleinerten
(verflüssigten) Nährstoffe werden danach von den Zellen des Hyphengeflechts
aufgenommen.
Die meisten Pilzarten wachsen als Mycel, einem weit verzweigten Netz aus
fadenförmig aneinander gereihten Zellen, einem Hyphengeflecht.
Bei entsprechenden Umgebungsbedingen bilden sich arttypische Fruchtkörper die
der Produktion und Freisetzung von Sporen dienen.
Der Entwicklungszyklus kann zum Teil sehr komplex sein, ebenso die Formen
sexueller, oder vegetativer Vermehrung.
Pilze leben als Saprobonten, Symbionten, oder Parasiten
Abgrenzung zu den Pflanzen: Pilze betreiben keine
Photosynthese. Sie sind daher auf organisches Substrat
als Nährstoffgrundlage angewiesen. Pilze leben als
Saprobionten (auf Pflanzen und abgestorbenem
organischen Material) Manche von Ihnen sind Teil von
Flechten. In diesem Fall leben ein Pilz und Algen in
Symbiose.
Pilze besitzen, wie Pflanzen, eine Zellwand aus Chitin,
einem Polysaccharid aus N-Acetylglucosamin (wie das
Aussenskelett von Insekten). Pilze können Vakuolen
besitzen.
Abgrenzung zu den Tieren: Tierische Zellen haben
weder Zellwand noch Vakuole. Es gibt keine
mehrkernigen Lebensstadien. Tiere vermehren
sich nicht über Sporen
Querschnitt Flechte
5.2. Die systematische Einteilung von Pilzen
Es gibt unzählige verschiedene Pilzarten (Schätzungen gehen von mehr als 100 000 Arten
aus, die sich nicht nur in ihrem Aussehen, sondern auch in der Art ihrer Vermehrung
unterscheiden). Sogar für Mykologen (Mykologie=Lehre von den Pilzen) ist die eindeutige
Klassifizierung oft schwer. Eine wesentlich Hilfe dabei sind moderne molekularbiologische
Methoden, wie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR).

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Die meisten Pilze sind Vielzeller, es gibt aber auch einzellige Pilze, wie z.B. die Hefen,
oder Pilze, die während gewisser Stadien im Entwicklungszyklus einzellig leben
(Dictyostelium).
Eine erste einfache Unterscheidung lässt sich aufgrund des Wachstums als Plasmodium
treffen. Ein Plasmodium ist durch eine vielkernige Protoplasmamasse ohne Zellwände
gekennzeichnet. Die Ernährung erfolgt durch Phagozytose. Ein Pseudoplasmodium
entsteht durch die Ansammlung vieler, zuvor amöboider Zellen (Dictyostelium).
Man unterscheidet daher 2 Abteilungen:
Myxomycota (Schleimpilze; Plasmodium oder Pseudoplasmodium vorhanden)
Eumycota (alle anderen Pilze, meist als Mycel wachsend)
5.3.Myxomycota (Schleimpilze)
Die Myxomycota sind zellwandlose Organismen die sich in manchen Entwicklungsstadien
amöboid bewegen. Bei bestimmten Bedingungen bilden sie Sporangien, welche mit einer
Cellulose- oder Chitinwand umgebene Sporen enthalten.
Die Myxomycota lassen sich in vier Klassen gliedern:
Acrasiomycetes ; Hydromyxomycetes; Myxomycetes; Plasmodiophoromycetes
5.3.1.Acrasiomycetes
Die Acrasiomyceten (zelluläre Schleimpilze)
sind einkernige terrestrische Organismen, die
auf feuchten Böden vor allem von
Bakterien, aber auch von anderen
Nährstoffen leben. Die Bakterien werden
durch Phagozytose aufgenommen. Von der
etwa 20 Arten umfassenden Gruppe ist
Dictyostelium discoideum ein wichtiges
Objekt zur Erforschung der
Differenzierungsprozesse vom ein- zum
vielzelligen Organismus. Wie aus dem
Entwicklungszyklus zu ersehen ist,
aggregieren die amöboiden Zellen bei
Nahrungsmangel zu einem
Pseudoplasmodium. Die Aggregation wird
durch Zellen ausgelöst, die zuerst
Nahrungsmangel registrieren. Sie beginnen,
rhythmisch cAMP abzugeben, was bei den
Entwicklungszyklus bei Dictyostelium discoideum
benachbarten Zellen eine Bewegung auf dieses Zentrum hin auslöst und in der Folge auch
deren Stoffwechsel umstellt. An der Aneinanderlagerung der sind Lectine (Kohlenhydrate
bindende Proteine) beteiligt. Bei der weiteren Entwicklung kann sich das Pseudoplasmodium
(Name bedeutet, es besteht aus Einzelzellen und ist nicht vielkernig! ) wie eine Schnecke
weiterbewegen. Während der Aggregationsphase kann es zu einer Verschmelzung zu
diploiden Zygoten kommen, die eine Meiose durchlaufen noch bevor der Sorokarp
ausgebildet ist. Dieser Fruchtkörper ist etwa 2mm hoch er besteht aus einem
Cellulosestiel und einem Köpfchen, das mit Sporen gefüllt ist. Unter günstigen
Bedingungen keimen diese Sporen wieder zu Amöben aus.

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5.3.2. Myxomycetes
Myxomyceten (echte Schleimpilze) sind vielkernige nackte
Protoplasmakörper, es gibt also keine deutliche Trennung zwischen
einzelnen Zellen. Diese Pilze leben auf verrottendem Holz und Laub
und ernähren sich ebenfalls von Bakterien und anderen organischen
Stoffen durch Phagocytose. Das intensiv gelbe Physarum
polycephalum (nicht verwechseln mit Fusarium, einem Ascomyceten!)
bildet ein verzweigtes Fusionsplasmodium Bei Nahrungsmangel bildet
sich das Plasmodium zu einer schwarzen Sporangienmasse um.
Viele Vertreter der 400 Arten umfassenden Gruppe bilden
morphologisch differenzierter Fruchtkörper (2-3 mm Größe), in denen
die Sporen in einem netzartigen Capillitium liegen. Es besteht aus
einem Netzwerk von Cellulosefasern, in welche die Sporen eingelagert sind. Sie werden
durch Wind verbreitet und keimen zu Myxamöben aus. Die
Myxamöben durchlaufen vielfach ein begeißeltes Stadium
(Myxoflagellaten). Auf faulenden Pflanzenteilen fallen bei Feuchtigkeit
die großen schaumigen zitronengelb gefärbten Plasmodien der
Lohblüte (Fuligo septica) auf. Auf der dem Licht abgewandten Seite
umgestürzter Bäume findet man die braungefärbten bizarren
Fruktifikationsgebilde von Cribaria rufa.
Physarum
polycephalum
Arcyria cinerea
5.3.3. Plasmodiophoromycetes (parasitische Schleimpilze)
Der berüchtigste Vertreter dieser etwa 20 Arten umfassenden Gruppe ist Plasmodiophora
brassicae, der Erreger der Kohlhernie. An Kohl und anderen Cruciferen verursacht er
Wurzelanschwellungen, tumorartiges Wachstum. Die Wurzelhaare werden von zweifach
begeißelten Zoosporen (=Planosporen) infiziert, in der Zelle entwickelt sich ein Plasmodium.
Es zerfällt in Zoosporen, die erneute Infektionen verursachen. Zur Überwinterung wird ein
interzelluläres Sporangium mit Dauersporen gebildet. Im Frühjahr keimen diese mit einer
Chitinwand umgebenen Dauersporen (Aplanosporen) zu begeißelten Zoosporen aus.
5.4. Eumycota
Die Eumycota lassen sich in 5 Abteilungen gliedern:
Mastigomycotina bilden bewegliche Planosporen
Deuteromycotina (fungi imperfecti) haben keine sexuelle Vermehrung
Zygomycotina Mucor Rhizopus
Ascomycotina zu den Hemiascomycets gehört Hefe oder Candida.
Zur Klasse der Euascomycetes gehören typische Schimmelpilze wie Aspergillus,
Penicillium, Alternaria oder Fusarium
Basidiomycotina besitzen typische Fruchtkörper (“Schwammerl”) wie die Hutpilze

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Ascomycotina (Schlauchpilze)
Ascomyceten sind die formenreichste Klasse der
Pilze, sie leben in den verschiedensten Habitaten
als Saprobionten auf Pflanzen- und Tierresten,
als Krankheitserreger, im Süß- und Salzwasser.
Ihr charakteristisches Merkmal sind Sporen als
Folge eines Befruchtungsvorganges (perfekte
Sporen), die zu acht in einem Schlauch (Ascus)
entstehen.
Die vegetativen Strukturen sind entweder
einzellig, wie bei den Hefen, oder aus septierten
Ascomyceten © Fritsche Mikrobiologie 1998
(unterteilten) Hyphen aufgebaut, wobei jedes
Segment mehrere Kerne enthalten kann. Falls diese Kerne genetisch nicht identisch sind
spricht man von einem Heterokaryon.
Zahlreiche Schimmelpilze, wie Aspergillus und Penizilliumarten; dazu gehören aber auch
wichtige Hefen
Zygomycotina (Jochpilze)
Diese niederen Pilze pflanzen sich asexuell durch Aplanosporen
fort, die in Sporangien entstehen und aktiv abgeschleudert
werden können. Zahlreiche Schimmelpilze (z.B. Mucor- und
Rhizopusarten) gehören zu den Zygomycotina.
Mucor sp.
Schimmelpilze: gehören zu verschiedenen Abteilungen (siehe
oben). Ihnen gemeinsam ist, dass sie nur unter dem Mikroskop genauer untersuchbar sind
(keine großen Fruchtkörper wie die Basidiomyzeten). Zu erkennen sind sie an dem in
Regel weißen Pilzgeflecht (Myzel=Summe aller Hyphen; Hyphe = einzelner Pilzfaden).
Wenn Schimmelpilze lange genug kultiviert werden, verfärben sich viele von ihnen (grün,
braun, schwarz). Diese Färbung stammt meistens von den gebildeten Sporen
(Vermerhungsformen)
Hefen: gehören zu den Hemiascomycetes, leben meist
einzellig, manche können „Zellverbände“ bilden (da alle Zellen
die gleiche Aufgabe haben, spricht man nicht von
„Vielzellern“);
Die technologisch bedeutsamste Art ist Saccharomyces
cerevisiae: Brotherstellung (CO2 bildet Blasen und macht Brot
„locker“), Wein- und Bierherstellung (Alkoholbildung unter
anaeroben (O2-freien) Bedingungen
nach Webster/Pilze

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Basidiomycotina (dazu gehören z.B. die
Ständerpilze - „Schwammerln“): das
Pilzgeflecht befindet sich im Boden, die
„Schwammerln“ sind der Fruchtkörper
(Vermehrungsorgan).
Das Mycel der typischen Speisepilze stellt
zum Teil hohe Ansprüche an die
Symbiosepartner , daher können die
meisten von ihnen nicht gezüchtet werden
(außer z.B. Champignon).
Basidiomyceten © Fritsche Mikrobiologie, 1998
5.5. Pilze mit technologischer Bedeutung
Penicilliumarten: Herstellung von Penizillin und anderen ß-Lactamantibiotika („klassische
Antibiotika“; bestimmte Verbindungsklasse; klassische Antibiotika wirken nur gegen
Bakterien, und nicht gegen Viren und Pilze)
Aspergillus niger: Herstellung von Zitronensäure (Zusatz zu Getränken, Süßwaren,
Einsatz als Entkalkungsmittel für Kaffeemaschinen, etc.)
5.6. Pilze als Krankheitserreger
Pilze, die den menschlichen Körper besiedeln:
Vor allem an der Oberfläche der Haut (Nagelpilz, Fußpilz,..), aber auch an inneren
Oberflächen (Candida im Darmtrakt (Hefe); Aspergillus flavus in der Lunge)
Hinweis für die Laborarbeit:
Wenn man Pilze aus der Umwelt anzüchtet, weiß man – durch bloßes Betrachten – in der
Regel nicht, um welche Pilze es sich handelt. Aus diesem Grund ist jede Pilzkultur so zu
behandeln, als ob sie pathogen (krankheitserregend) wäre. Es ist daher strikt auf gute
sterile Arbeitstechnik zu achten!
Pilze, die Toxine (Gifte) bilden
Pilze können Gifte bilden, die vor allem über Lebensmittel in den menschlichen Körper
gelangen können, z.B. der Mutterkornpilz, der Getreide befällt; Fusarium-Arten, die
ebenfalls Getreide befallen, aber auch Schimmelpilze, die im Haushalt Früchte etc.
befallen.
Hinweis: Im Gegensatz zu Bakterien (die meist bei neutralem pH-Wert am besten
gedeihen, vertragen viele Pilze tiefere pH-Werte – sie wachsen deshalb z.B. an der
Oberfläche von Früchten (z.B. Hefe auf der Obefläche von Trauben – diese Hefen können
den Traubensaft zu Wein vergären). Nährmedien, auf denen Pilze (und keine Bakterien)
wachsen sollen, haben daher oft einen sauren pH-Wert
5.7. mikrobiologische Kultivierung
Verwendet man bei der Anreicherung von Luftkeimen Malzextrakt oder Würze als
Nähbodengrundlage, so bekommt man bei längerer Bebrütung bei Temperaturen bis max.
30°C vorwiegend Bewuchs durch niedere Pilze (Hefen, Ascomyceten )
Solche Pilze stellen in vielen Bereichen biotechnologischer Produktionsstätten ein
Problem dar, weil ihre Verbreitung durch Sporen sehr rasch und sehr weitreichend erfolgt.
In der Lebensmittel- und Futtermittelproduktion muss daher besonders drauf geachtet
werden, Kontaminationen durch Pilzsporen zu vermeiden !

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Durchführung:
Die Anreicherung von Pilzen und Schimmelpilzen erfolgt auf Nährböden aus
Malzextraktagar oder Würzeagar. Nach etwa 2-4 Tagen Bebrütung bei 30°C werden die
Platten begutachtet und versucht die verschiedenen Pilzarten zu unterscheiden.
Beimpfung fester Nährmedien
Luftinfektion: Pilzsporen sind ein Bestandteil von Staub; für die Beimpfung Petrischalen mit
Universalnährmedium für Pilze (z.B. Malzextraktagar, Würzeagar, Saboraudagar) 10
Minuten öffnen
Pilze an der Oberfläche von Gegenständen: zahlreiche Schimmelpilzsporen befinden sich
auf Kehrgeräten (Besen etc.); viele Pilze können von der Oberfläche von Früchten bzw.
anderen Pflanzenteilen angezüchtet werden; Universalmedium für Pilze (siehe oben),
Objekt kurz auflegen
5.8 Untersuchung von Pilzkolonien
Hefekolonien (Kolonie= Ansammelung einer größren Organismenzahl nach Vermehrung
auf einem festen Nährmedium) haben in der Regel eine glänzende Oberfläche, sind meist
gelblich, manchmal auch orange oder rot gefärbt; die Kolonien sind makroskopisch nicht
von Bakterienkolonien zu unterscheiden.
Schimmelpilzkolonien: wattiges Aussehen (Myzel), weiß bzw. von der Mitte der Kolonie
ausgehende Verfärbung (Hinweis auf Sproenbildung)
5.8.1. Präparation von Pilzen für die Mikroskopie
5.8.1.1. Untersuchung im Stereomikroskop
Pilzkulturen lassen sich in der Petrischale ohne Abheben des Deckels recht gut mit dem
Stereomikroskop untersuchen. Die Vergrößerung bleibt dabei allerdings auf etwa 20-fach
begrenzt. Es ist jedoch möglich die Pilzkultur in ihrer Gesamtheit zu untersuchen und vor
allem verschieden weite Entwicklungsformen (Alter) zu beobachten. Am äußersten Rand
der Kultur befinden sich die jüngsten Hyphen, die noch keine Fruchtkörper tragen. Weiter
in Richtung Zentrum kann man die verschiedenen Stadien der Fruchtkörperbildung sehen
und eventuell schon eine grobe Zuordnung treffen.
5.8.1.2. Lichmikroskopische Untersuchung
Präparation:
Die Platten sollen dabei möglichst wenig bewegt werden um die
Freisetzung von Sporen zu minimieren. Die Platten sollen daher auch
nur kurz zur Entnahme von Probenmaterial geöffnet werden.
Von glatten, klar abgegrenzten runden Kolonien, kann, wie bei
Bakterien, mit einer ausgeglühten Impföse etwas Material
entnommen und in physiologischer Kochsalzlösung auf dem
Objektträger suspendiert werden.
Von Schimmelpilzkulturen wird mit zwei abgeflammten Präpariernadeln ein Teil des
Myzels nach oben herausgezogen und auf einen Objektträger überführt. Die Probe wird in
1 Tropfen physiologischer Kochsalzlösung zerrupft, wobei man darauf achten sollte,
vorsichtig zu arbeiten um die empfindlichen Fruchtkörper (Sporangien) nicht vollkommen
zu zerstören (der Zusatz von etwas Spülmittel hilft bei dem Verteilen).

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Beobachtung:
Hefen: rund bis oval, viel größer als Bakterien (auch bei 400-facher Vergrößerung gut
sichtbar); die meisten Hefen vermehren sich durch „Sprossung“ indem sich die Zelle nicht
symmetrisch teilt, sondern an einer Stelle die Tochterzelle beginnt herauszuwachsen.
Sprosse sind charakteristisch für das Vorliegen einer Hefe; einige Hefen vermehren sich
durch Spaltung wie Bakterien („Spaltpilze“)
Schimmelpilze: Pilzfäden erkennbar (findet man nur „Kugeln“, wurden nur Sporen
überimpft, die Präparation muss wiederholt werden).
Folgende Merkmale sind für die Eingrenzung entscheidend: Form der Sporenträger
(Ansatz) und Art der Sporen-tragenden Fortsätze. Art der Hyphen, ob septiert (unterteilt)
oder nicht, Art der Verzweigungen.
Septierte Hyphen weisen auf Ascomyzenten oder Basidiomyzeten hin
(Septum=Querwand; die Zellen sind durch eine Zellwand voneinander getrennt)
Unseptierte Hyphen (Zellen nicht durch Querwand getrennt, die Zellen bilden einen langen
„Schlauch“, der viele Zellkerne hat) weisen auf Zygomyzeten hin
Klassifikaton mit Hilfe von Fruchtkörpern: für die Klassifikation braucht man viel Erfahrung.
Einige Pilze lassen sich aber von Nicht-Experten/innen grob klassifizieren: Die Gattungen
Penicillium, Aspergillus, Alternaria, Mucor und Rhizopus sind gut zu erkennen.
Penicillium sp.
“Pinselschimmel” (Ascomycetes)
Raster-EM Lichtmikroskop
Aspergillus sp. (Ascomycetes)
5.8.2. Färbungen
Hefe:
Methylenblaufärbung erlaubt Unterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen.
Lebende Zellen bauen den blauen Farbstoff ab, und sind daher farblos, tote Zellen blau
gefärbt. Durchführung: Zusatz von 1 Tropfen Methylenblaufärbelösung am Deckglasrand,
mit Küchenrolle durch das Präparat durchsaugen
Gramfärbung (Durchführung siehe Arbeitsblatt „Bakterienidentifikation“ – Hefen sind violett
gefärbt (wie Gram-positive Bakterien)
5.9. Lagerung von Pilzen
Lagerung als Sporensuspension oder in Schrägagar-Kulturröhrchen mit verringerter
Nährstoffkonzentration

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5.10. Literatur:
Campbell N.A.2006; Biologie;
Pearson-Studium; München, (Grundlagenwissen Pilze) Basiswissen Mikrobiologie 1998. ,
Brett, UZV, (mikroskopische Untersuchung von Schimmelpilzen)
Bast, Mikrobiologische Methoden; 1999, Spektrum-Verlag (Präparationstechnik,
Färbelösungen,..)
Webster, „Pilze“; Springer 1983
Glaubitz, Atlas der Gärorganismen,
Anhang: Typische Vertreter von Schimmelpilzen