Antibiogramm - member

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30.08.08 © C.N.
Antibiogramm
Antibiotika sind Stoffe, die entweder das Wachstum von Bakterien hemmen oder sie
abtöten. Entsprechend unterscheidet man bakteriostatische (= das Wachstum hemmende)
und bakterizide (Bakterien tötende) Antibiotika.
Ein Antibiogramm dient zur qualitativen und quantitativen Bestimmung der Wirkung
bestimmter Antibiotika. Meist wird dazu ein Agardiffusionstest durchgeführt, wobei ein
Teststamm dem zu testenden Wirkstoff ausgesetzt wird. Je nach Art des verwendeten
Bakterienstammes kann die Wirkung sehr unterschiedlich sein. In der Medizin werden
solche Tests durchgeführt, um festzustellen, mit welchem Antibiotikum ein bestimmter
bakterieller Krankheitserreger wirkungsvoll bekämpft
werden kann.
In diesem Beispiel wird zunächst ein Nähboden
gleichmäßig mit einem passenden Teststamm beschichtet
(Deckschichtagar mit Bakteriensuspension). Danach
werden Filterscheibchen, die mit einem Antibiotikum in
definierter Konzentration getränkt sind, auf diesem
Nährboden aufgelegt. Nach einer Inkubationszeit von 1-
1½ Tagen erkennt man den Bewuchs an der Bildung
eines gleichmäßigen Bakterienrasens, der rund um die
Filterscheibchen durch Hemmhöfe unterbrochen ist. Der
Hemmhofdurchmesser ist proportional dem Wirkungsgrad
des Antibiotikums (qualitative Bestimmung), in den
meisten Fällen ist dieser Wirkungsgrad auch proportional
der Konzentration des Antibiotikums (quantitative Bestimmung).
Agardiffusionstest auf Penicillin-G
Empfindlichkeit
In der Abbildung rechts ist ein Nährboden zu sehen auf dem eine Mischkultur aus Bacillus
subtilis und Escherichia coli ausgestrichen wurde. Die drei Plättchen enthielten
unterschiedliche Mengen an Antibiotikum. Wegen der unterschiedlichen Empfindlichkeit
Gram-negativer und Gram-positiver Bakterien gegenüber Penicillin-G sind zwei
Hemmhofgrenzen sichtbar.
1. theoretischer Hintergrund:
1.1. Das erste entdeckte Antibiotikum, Penicillin :
Dass Mikroorganismen sich gegenseitig im Wachstum behindern können war schon seit
Beginn der systematischen Mikrobiologie Ende des 19.Jahrhunderts bekannt. Es war aber
erst Alexander Fleming 1929, der den antibakteriellen Effekt von Penicillin anhand einer
Kontamination einer Staphylokokken-Kultur mit dem
Schimmelpilz Penicillium notatum genauer untersucht hat.
Bakterien konnten dort, wo der Schimmelpilz sich ausgebreitet
hatte, selbst nicht wachsen. Fleming teilte sich 1945 den
Nobelpreis für Medizin mit Chain und Florey, die wesentliche
HO
O
HO
O
O
NH
HO
O
O
O
HN
L-Alanin
D-Glutaminsäure
O
O
Arbeiten zur Aufklärung der biochemischen Funktionsweise und
meso-Diaminopimelinsäure
D-Alanin
der chemischen Modifizierung von Penicillin geleistet hatten. Die
Isolierung des reinen Penicillins gelang erst in den USA während
Peptidoglycan
des 2. Weltkrieges.
Penicillin verhindert die Verknüpfung der Peptidketten im Peptidoglycans, welches den
Großteil der Bakterienzellwand bildet. Von der Hemmung des Zellwandaufbaus sind zwar
bestehende Zellen nicht betroffen, sobald sich die Bakterienzellen aber teilen, wird die
Zellwand instabil und brüchig (Wachstumshemmung). Gram-positive Bakterien reagieren
auf Penicillin-Antibiotika empfindlicher als Gram-negative, da ihre Zellwand aus einer

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dickeren Schicht Peptidoglycan besteht und ihnen die zweite äußere Hülle der Gramnegativen
Bakterien fehlt (siehe Antibiogramm oben).
Alle Penicilline sind β-Lactame (rotes Ringsystem
in der Abbildung rechts ), die aus den
Aminosäuren Cystein und Valin zusammengesetzt
sind.
Der Rest (R) kann je nach Bedarf variiert
werden (Derivatisierungen), um dem Penicillin
Antibiotikum Organismus Anwendung Wirkungsweise
Bacitracin Bacillus subtilis G+ Bakterien Polypeptid-Komplex hemmt Zellwandaufbau
http://www.m-ww.de/pharmakologie/arzneimittel/
Cephalosporine Cephalosporium
acremonium
Breitband β-Lactam Antibiotika, Zellwandaufbau
Chloramphenicol Streptomyces Breitband
Typhus, Paratyphus, bakterieller Meningiten. Wirkt auf
venezulae bei schweren Infektionen bakterielle Ribosomen, Proteinsynthese
Erythromycin Streptomyces Gram-positive Bakterien Ef-G Hemmung bei der Proteinsynthese
erythreus
Gentamicin: Micromonospora
purpurea
Kanamycin Streptomyces
kanamyceticus
Neomycin
Streptomyces
(1mg = 1000 IE) fradiae
Penicillin-G
Penicillium
(1mg=1666 IE) chrysogenum
Streptomycin Streptomyces
griseus
Tetracycline Streptomyces
rimosus
Vancomycin Amycolatopsis
orientalis
; Pseudomonas aeruginosa;
Staphylococcus aureus
z.B. Augeninfektionen
Hemmung der Proteinsynthese, Breitband gegen G-
Stäbchen, Nebenwirkungen problematische
Breitband (Aminoglycosid) Proteinsynthese β-Lactam-Analogon
Zellwandaufbau
Gram-negative Bakterien Proteinsynthese
Breitband Proteinsynthese
Gram-positive Bakterien Proteinsynthese
R
HN
O
O
S
CH 3
CH 3
N N
COOH
Penicillin Penicillin-G
andere Eigenschaften zu verleihen (z.B. Löslichkeit, Stabilität gegenüber Magensäure).
Als Derivate sind z.B. Ampicillin, Amoxicillin Methcillin, Oxacillin im Handel.
Als Metabolit des Penicillium chrysogenum ist Penicillin-G ebenfalls ein natürliches
Penicillin, welches zur Beseitigung wundpathogener Keime dient.
Die Entwicklung von Antibiotika ist nach wie vor ein wichtiges pharmakologisches
Forschungsgebiet, weil Bakterien einerseits sehr rasch vermehrungsfähig sind und
andererseits vielfältige Möglichkeiten besitzen, neue genetische Varianten
hervorzubringen. Daher kommt es oft zur Entwicklung von Resistenzen. Sie beruhen meist
auf der Aktivität bestimmter Proteine, die antibiotischen Wirkstoffe zu spalten (z.B.
Penicillinase) oder sie aus den Zellen zu pumpen, bevor sie zu wirken beginnen.
1.2. Andere Antibiotika:
O2N
OH
HN
OH
O
Cl
Cl
O
HO
O
OH
O
O
O
O
O
OH
O
OH
N
HN
H 2N
O
H 2N
O O
NH2
OH
HO
NH
Chloramphenicol Erythromycin Gentamycin Kanamycin
HO
HO NH 2
NH 2
O
H 2N
O
OH
H2N HO
O O
Cl
HO
O
O
OH
NH2
O
O
OH
NH2 OH
OH
NH2 HO
HO
HO
HO
O
O
O H
N
NH
O
NH
H
O
OH N
HO
HO
NH
NH2 HO
OH O
OH
OH O
OH
NH2 O
HO
HO
O
NH
O
HO
O
Cl
O
H
N
N
H
O
OH
OH
O
O
N
H
O
NH2 H
N
O
Neomycin Streptomycin Tetracyclin Vancomycin
HO H2N
OH
O
O
OH
H2N HO
HO
O
OH
O
OH
NH 2
O
O
NH 2
HO
O
H
N
OH
NH
O
O
NH 2
OH
OH
S
NH 2
CH3
CH3
COOH

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Neben Antibiotika, die den Zellwandaufbau stören, gibt es Substanzen, die auf
verschiedene andere Stoffwechselleistungen der Bakterien wirken. So wird z.B. mit
Chloramphenicol die bakterielle Proteinsynthese gehemmt. Aufgrund der
unterschiedlichen Beschaffenheit der Bakterienribosomen (70S) im Gegensatz zu jener
der 80S-Ribosomen in Eukaryonten wird daher der eukaryotische Zellstoffwechsel durch
Chloramphenicol kaum beeinträchtigt.
2. mikrobiologische Untersuchungen:
2.1. Probennahme und Aufbewahrung:
Probenzubereitungen (z.B. von handelsüblichen Antibiotika) können in Tablettenform auch
über das Ablaufdatum hinaus für den Hemmhoftest verwendet werden, wenn sie
lichtgeschützt, trocken und kühl gelagert werden. Antibiotikasuspensionen sollten nicht
länger als einen Monat gelagert werden.
Sporensuspensionen (z.B. von Penicillium chrysogenum) sollten stets frisch zubereitet,
und auf den Platten in nur einem kleinen, klar begrenzten Bereich aufgebracht werden
(z.B. 20µL Suspension in markierten Bereich auftragen).
2.2. Materialien:
Übernachtkultur: Escherichia coli: JM 101 (in Nährbouillon)
Grundschicht: z.B. Plate Count Agar (1,5-2% Agar Agar)
Deckschicht: Nährbouillon-Agar (0,7%ig) + 200µL E.coli Vorkultur
Antibiotikum: Penicillin-G (Standardreihe Konzentrationen siehe Antibiogramm, 2.6.)
Testantibiotika: Chloramphenicol, Bacitracin, Gentamicin (vorgefertigte Testscheibchen)
Testscheibchen (Von Sensi-Disc)
Steriles Deionat, 30 Eprouvetten + Kapsenbergverschlüsse + Eprouvettengestell,
10 Eppendorfgefäße (steril), 10 Petrischalen, 2 Erlenmeyerkolben 500mL,
1 Erlenmeyerkolben 250mL, Abfüllbürette, 1 Kolbenhubpipette 20µL (verstellbar),
1 Kolbenhubpipette 1000µL (verstellbar), Tarawaage, Analysenwaage, Mirkowellenherd,
Brenner, Autoklav, Laminar Flow, Brutschrank: 37°C, Wasserbad, Pinzette, Spatel,
Impföse, Impfnadel, Geodreieck
2.3. Vorkultur (o/n-Kultur):
Für die Anzucht des Teststammes (z.B. E.coli JM101 oder E.coli HB101) wird von einer
Reinkultur in 5mL sterile Nährbouillon überimpft und über Nacht bei 37°C im
Schüttelbrutschrank bebrütet.
2.4. Platten mit Grundschicht (1,5%ig an Agar-Agar):
Zur Herstellung der Platten mit der Grundschicht werden für 200mL Nährboden (inklusive
Reserve ca.10 Platten) in einem 300mL Erlenmeyerkolben 1,6g Nährbouillon und 3g Agar-
Agar (1,5%) eingewogen und auf 200mL aufgefüllt. Es wird bei 121°C für 15min
autoklaviert und nach dem Abkühlen auf ca. 80°C im LF direkt aus dem Kolben in die
Petrischalen etwa 20mL Nährboden ausgegossen. Nach dem Erstarren lässt man das
Kondenswasser im Laminar-Flow (siehe Steriltechnik, 2.1.) abtrocknen und legt die Platten
vor dem Auftragen der Deckschicht (top-Agar) für ca. 15 min verkehrt in den Brutschrank,
damit die Deckschicht beim Ausgießen auf einen zu kalten Grundschichtagar nicht zu
schnell fest wird. Es ist auch möglich die Grundschicht früher zu gießen, allerdings muss
darauf geachtet werden, dass vor dem Aufbringen der Deckschicht das Kondenswasser
auch nach Lagerung im Kühlschrank getrocknet wird.

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2.5. Deckschicht (top-Agar, ~0,8%ig):
0,50 g Nährbouillon und 0,50 g Agar-Agar werden in 60mL
Wasser gelöst, in dem Mikrowellenherd aufgeschmolzen
und zu je 5mL in Eprouvetten mittels Abfüllbürette
portioniert. Durch Kapsenbergverschlüsse geschützt wird
15min bei 121°C autoklaviert. Nach dem Autoklavieren
temperiert man die noch flüssigen Medien in den Röhrchen
auf 60°C im Wasserbad. Vor dem Ausgießen wird das temperierte Deckschichtmedium mit
200µl der vorbereiteten Flüssigkultur (über Nacht) im Röhrchen beimpft, gut gemischt
(Vortex) und auf einer zuvor auf 37°C temperierten Platte mit Grundschicht-Agar
ausgegossen.
2.6. Penicillin Standardreihe:
Um die antibiotische Wirkung einer Substanz testen zu können, muss eine Vergleichsreihe
herangezogen werden. Jeder Charge oder Zubereitungsform wird dann eine bestimmte
Wirkung pro mg zugeordnet. Für das Penicillin-G von Sigma gilt z.B. 1595IE/mg. Für eine
Standardlösung mit 200.000IE/mL müssen daher 0,1254g/mL an Penicillin-G eingewogen
werden.
Internationale Einheiten sind nicht im SI-System und werden oft in der Medizin eingesetzt
um eine reproduzierbare Dosierung von Medikamenten anhand ihrer Wirkung zu
ermöglichen. Die World Health Organization definiert internationale Einheiten indem
entweder durch Referenzpräparate oder international vereinbarte Standards ein
bestimmtes Verhältnis zwischen IE und Masse oder Stoffmenge definiert wird
(http://www.who.int/en/). Für jeden Stoff ist dieses Verhältnis anders und man muss die
genaue Zahl auf der Packung nachsehen.
Für dieses Beispiel können 0,478 g Penicillin eingewogen auf 2mL mit entmineralisierten
Wasser aufgefüllt werden. Diese Stammlösung wird vor der Verwendung steril filtriert,
wobei das Filter zur Füllung etwa 0,5mL benötigt (Totvolumen). Verdünnt man nach
folgendem Schema ergibt sich eine Standardreihe:
IE/mL Penicillin-G [g/mL] Verdünnungsschritte
Standard 1 200 000 0,12 - (davon werden etwa 600µL benötigt) -
Standard 2 100 000 0,06 Std.1, 1:2 verdünnt (250µL Std1 + 250µL H2O)
Standard 3 50 000 0,03 Std.1, 1:4 verdünnt ( 50µL Std1 + 150µL H2O)
Standard 4 30 000 0,018 Std.1, 1:6,6 verdünnt ( 30µL Std1 + 170µL H2O)
Standard 5 10 000 0,006 Std.2, 1:10 verdünnt ( 50µL Std2 + 450µL H2O)
Standard 6 5.000 3,00mg/mL Std.2, 1:20 verdünnt ( 50µL Std2 + 950µL H2O)
2.7. Durchführung:
Von den Penicillin Standards gibt man jeweils 45µL
auf ein steriles Testscheibchen welches dann mit einer
sterilen Pinzette auf die erstarrte Deckschicht
aufgelegt wird (2 Scheibchen pro Standard/Probe).
Alternativ können die Testscheibchen in die Verdünnungslösung auch eingetaucht
werden, wobei man beachten muss, dass die Scheibchen alle von derselben Art und
Qualität sind.
Beim Auflegen sollte darauf geachtet werden, dass die zu
erwartenden Hemmhöfe sich nicht überschneiden, Plättchen mit
hohen Wirkstoffkonzentrationen dürfen also nicht nebeneinander
gelegt werden.
Für die 6 Verdünnungen der Standardreihe werden insgesamt 4
Platten benötigt, eine für den Standard mit der höchsten
Konzentration und 3 für die restlichen Standards. 3 weitere Platten

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werden mit Verdünnungen des zu testenden antibiotischen Wirkstoffes beschickt (z.B.
abgelaufene Präparate aus der Hausapotheke). Parallel dazu kann eine
Konzentrationsbestimmung einer ausgegeben Penicillin-G Probe erfolgen. Die Bebrütung
erfolgte 1-2 Tage bei 37°C.
3. Auswertungsrichtlinien
Durch Abmessung der Hemmhöfe und Interpolation einer
Standardgeraden (Ordinate: Hemmhofdurchmesser,
Abszisse: log(IE)) kann auf die Wirksamkeit (in IE) des
Testantibiotikums geschlossen werden.
Anhand der Standardreihe kann auch die
Probenkonzentration bestimmt werden ;
Aus einer früheren Untersuchung ist z.B. bekannt, dass ein
Testscheibchen getränkt mit Gentamicin ca. 11000 IE/mL
entspricht (gemessen an Penicillin G – Standardreihe bei
E.coli). Dies entspricht einer Penicillin-Konzentration von 6,6
mg/mL.
GM10: Gentamycin,10µg / AM10: Ampicillin 10µg /
P10: Penicillin-G 10µg / C30: Chloramphenicol 30µg
© Pearson 2006
Ein Testscheibchen getränkt mit Chloramphenicol entspricht ca. 70000 IE/mL (gemessen
an Penicillin G – Standardreihe bei E.coli). Dies entspricht einer Penicillin-Konzentration
von 42 mg/mL.
4. Protokollierung
Für alle getesteten Antibiotika ist eine tabellarische Auswertung (Hemmhofdurchmesser
gegen log IE) und eine entsprechende Graphik abzugeben! (Excel)
1) Untersuchungsobjekt (Name der Substanz oder Probe), Entnahme wann, wo, welche
Chargennummer.
2) Beobachtungen: Bewuchs und Zustand der Platten.
3) Beobachtungen und Tipps zur Durchführung, Abweichungen von der Standardprozedur
4) zeichnerische oder photographische Anleitung zur Durchführung falls notwendig
5) Vergleiche getesteter Antibiotika mit der Penicillin-Standardreihe
5. Literatur
Arbeitsunterlagen zu den BMb-Übungen (2008 / C.Neumann, MbaM/BMb/AMGt )
Mikrobiologisches Praktikum (Gerhart Drews), S.144
http://home.schule.at/member/neumann
http://www.wikipedia.de
http://www.who.int/en/
http://www.drak.de/Glossar/C.html