Antibiogramm - member

3H / BMb-Labor (Antibiotika) 4/5
30.08.08 © C.N.
2.5. Deckschicht (top-Agar, ~0,8%ig):
0,50 g Nährbouillon und 0,50 g Agar-Agar werden in 60mL
Wasser gelöst, in dem Mikrowellenherd aufgeschmolzen
und zu je 5mL in Eprouvetten mittels Abfüllbürette
portioniert. Durch Kapsenbergverschlüsse geschützt wird
15min bei 121°C autoklaviert. Nach dem Autoklavieren
temperiert man die noch flüssigen Medien in den Röhrchen
auf 60°C im Wasserbad. Vor dem Ausgießen wird das temperierte Deckschichtmedium mit
200µl der vorbereiteten Flüssigkultur (über Nacht) im Röhrchen beimpft, gut gemischt
(Vortex) und auf einer zuvor auf 37°C temperierten Platte mit Grundschicht-Agar
ausgegossen.
2.6. Penicillin Standardreihe:
Um die antibiotische Wirkung einer Substanz testen zu können, muss eine Vergleichsreihe
herangezogen werden. Jeder Charge oder Zubereitungsform wird dann eine bestimmte
Wirkung pro mg zugeordnet. Für das Penicillin-G von Sigma gilt z.B. 1595IE/mg. Für eine
Standardlösung mit 200.000IE/mL müssen daher 0,1254g/mL an Penicillin-G eingewogen
werden.
Internationale Einheiten sind nicht im SI-System und werden oft in der Medizin eingesetzt
um eine reproduzierbare Dosierung von Medikamenten anhand ihrer Wirkung zu
ermöglichen. Die World Health Organization definiert internationale Einheiten indem
entweder durch Referenzpräparate oder international vereinbarte Standards ein
bestimmtes Verhältnis zwischen IE und Masse oder Stoffmenge definiert wird
(http://www.who.int/en/). Für jeden Stoff ist dieses Verhältnis anders und man muss die
genaue Zahl auf der Packung nachsehen.
Für dieses Beispiel können 0,478 g Penicillin eingewogen auf 2mL mit entmineralisierten
Wasser aufgefüllt werden. Diese Stammlösung wird vor der Verwendung steril filtriert,
wobei das Filter zur Füllung etwa 0,5mL benötigt (Totvolumen). Verdünnt man nach
folgendem Schema ergibt sich eine Standardreihe:
IE/mL Penicillin-G [g/mL] Verdünnungsschritte
Standard 1 200 000 0,12 - (davon werden etwa 600µL benötigt) -
Standard 2 100 000 0,06 Std.1, 1:2 verdünnt (250µL Std1 + 250µL H2O)
Standard 3 50 000 0,03 Std.1, 1:4 verdünnt ( 50µL Std1 + 150µL H2O)
Standard 4 30 000 0,018 Std.1, 1:6,6 verdünnt ( 30µL Std1 + 170µL H2O)
Standard 5 10 000 0,006 Std.2, 1:10 verdünnt ( 50µL Std2 + 450µL H2O)
Standard 6 5.000 3,00mg/mL Std.2, 1:20 verdünnt ( 50µL Std2 + 950µL H2O)
2.7. Durchführung:
Von den Penicillin Standards gibt man jeweils 45µL
auf ein steriles Testscheibchen welches dann mit einer
sterilen Pinzette auf die erstarrte Deckschicht
aufgelegt wird (2 Scheibchen pro Standard/Probe).
Alternativ können die Testscheibchen in die Verdünnungslösung auch eingetaucht
werden, wobei man beachten muss, dass die Scheibchen alle von derselben Art und
Qualität sind.
Beim Auflegen sollte darauf geachtet werden, dass die zu
erwartenden Hemmhöfe sich nicht überschneiden, Plättchen mit
hohen Wirkstoffkonzentrationen dürfen also nicht nebeneinander
gelegt werden.
Für die 6 Verdünnungen der Standardreihe werden insgesamt 4
Platten benötigt, eine für den Standard mit der höchsten
Konzentration und 3 für die restlichen Standards. 3 weitere Platten