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3H / BMb-Labor (Antibiotika) 4/5 30.08.08 © C.N. 2.5. Deckschicht (top-Agar, ~0,8%ig): 0,50 g Nährbouillon und 0,50 g Agar-Agar werden in 60mL Wasser gelöst, in dem Mikrowellenherd aufgeschmolzen und zu je 5mL in Eprouvetten mittels Abfüllbürette portioniert. Durch Kapsenbergverschlüsse geschützt wird 15min bei 121°C autoklaviert. Nach dem Autoklavieren temperiert man die noch flüssigen Medien in den Röhrchen auf 60°C im Wasserbad. Vor dem Ausgießen wird das temperierte Deckschichtmedium mit 200µl der vorbereiteten Flüssigkultur (über Nacht) im Röhrchen beimpft, gut gemischt (Vortex) und auf einer zuvor auf 37°C temperierten Platte mit Grundschicht-Agar ausgegossen. 2.6. Penicillin Standardreihe: Um die antibiotische Wirkung einer Substanz testen zu können, muss eine Vergleichsreihe herangezogen werden. Jeder Charge oder Zubereitungsform wird dann eine bestimmte Wirkung pro mg zugeordnet. Für das Penicillin-G von Sigma gilt z.B. 1595IE/mg. Für eine Standardlösung mit 200.000IE/mL müssen daher 0,1254g/mL an Penicillin-G eingewogen werden. Internationale Einheiten sind nicht im SI-System und werden oft in der Medizin eingesetzt um eine reproduzierbare Dosierung von Medikamenten anhand ihrer Wirkung zu ermöglichen. Die World Health Organization definiert internationale Einheiten indem entweder durch Referenzpräparate oder international vereinbarte Standards ein bestimmtes Verhältnis zwischen IE und Masse oder Stoffmenge definiert wird (http://www.who.int/en/). Für jeden Stoff ist dieses Verhältnis anders und man muss die genaue Zahl auf der Packung nachsehen. Für dieses Beispiel können 0,478 g Penicillin eingewogen auf 2mL mit entmineralisierten Wasser aufgefüllt werden. Diese Stammlösung wird vor der Verwendung steril filtriert, wobei das Filter zur Füllung etwa 0,5mL benötigt (Totvolumen). Verdünnt man nach folgendem Schema ergibt sich eine Standardreihe: IE/mL Penicillin-G [g/mL] Verdünnungsschritte Standard 1 200 000 0,12 - (davon werden etwa 600µL benötigt) - Standard 2 100 000 0,06 Std.1, 1:2 verdünnt (250µL Std1 + 250µL H2O) Standard 3 50 000 0,03 Std.1, 1:4 verdünnt ( 50µL Std1 + 150µL H2O) Standard 4 30 000 0,018 Std.1, 1:6,6 verdünnt ( 30µL Std1 + 170µL H2O) Standard 5 10 000 0,006 Std.2, 1:10 verdünnt ( 50µL Std2 + 450µL H2O) Standard 6 5.000 3,00mg/mL Std.2, 1:20 verdünnt ( 50µL Std2 + 950µL H2O) 2.7. Durchführung: Von den Penicillin Standards gibt man jeweils 45µL auf ein steriles Testscheibchen welches dann mit einer sterilen Pinzette auf die erstarrte Deckschicht aufgelegt wird (2 Scheibchen pro Standard/Probe). Alternativ können die Testscheibchen in die Verdünnungslösung auch eingetaucht werden, wobei man beachten muss, dass die Scheibchen alle von derselben Art und Qualität sind. Beim Auflegen sollte darauf geachtet werden, dass die zu erwartenden Hemmhöfe sich nicht überschneiden, Plättchen mit hohen Wirkstoffkonzentrationen dürfen also nicht nebeneinander gelegt werden. Für die 6 Verdünnungen der Standardreihe werden insgesamt 4 Platten benötigt, eine für den Standard mit der höchsten Konzentration und 3 für die restlichen Standards. 3 weitere Platten
3H / BMb-Labor (Antibiotika) 5/5 30.08.08 © C.N. werden mit Verdünnungen des zu testenden antibiotischen Wirkstoffes beschickt (z.B. abgelaufene Präparate aus der Hausapotheke). Parallel dazu kann eine Konzentrationsbestimmung einer ausgegeben Penicillin-G Probe erfolgen. Die Bebrütung erfolgte 1-2 Tage bei 37°C. 3. Auswertungsrichtlinien Durch Abmessung der Hemmhöfe und Interpolation einer Standardgeraden (Ordinate: Hemmhofdurchmesser, Abszisse: log(IE)) kann auf die Wirksamkeit (in IE) des Testantibiotikums geschlossen werden. Anhand der Standardreihe kann auch die Probenkonzentration bestimmt werden ; Aus einer früheren Untersuchung ist z.B. bekannt, dass ein Testscheibchen getränkt mit Gentamicin ca. 11000 IE/mL entspricht (gemessen an Penicillin G – Standardreihe bei E.coli). Dies entspricht einer Penicillin-Konzentration von 6,6 mg/mL. GM10: Gentamycin,10µg / AM10: Ampicillin 10µg / P10: Penicillin-G 10µg / C30: Chloramphenicol 30µg © Pearson 2006 Ein Testscheibchen getränkt mit Chloramphenicol entspricht ca. 70000 IE/mL (gemessen an Penicillin G – Standardreihe bei E.coli). Dies entspricht einer Penicillin-Konzentration von 42 mg/mL. 4. Protokollierung Für alle getesteten Antibiotika ist eine tabellarische Auswertung (Hemmhofdurchmesser gegen log IE) und eine entsprechende Graphik abzugeben! (Excel) 1) Untersuchungsobjekt (Name der Substanz oder Probe), Entnahme wann, wo, welche Chargennummer. 2) Beobachtungen: Bewuchs und Zustand der Platten. 3) Beobachtungen und Tipps zur Durchführung, Abweichungen von der Standardprozedur 4) zeichnerische oder photographische Anleitung zur Durchführung falls notwendig 5) Vergleiche getesteter Antibiotika mit der Penicillin-Standardreihe 5. Literatur Arbeitsunterlagen zu den BMb-Übungen (2008 / C.Neumann, MbaM/BMb/AMGt ) Mikrobiologisches Praktikum (Gerhart Drews), S.144 http://home.schule.at/<strong>member</strong>/neumann http://www.wikipedia.de http://www.who.int/en/ http://www.drak.de/Glossar/C.html
Seite 1 und 2: 3H / BMb-Labor (Antibiotika) 1/5 30
Seite 3: 3H / BMb-Labor (Antibiotika) 3/5 30

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