Mechanismen und On-line Dosimetrie bei selektiver RPE Therapie

Aus der Medizinischen Laserzentrum GmbH
Wissenschaftliche Einrichtung der Medizinischen Universität zu Lübeck
Forschungsleiter und Geschäftsführer
Prof. Dr. phil. nat. Reginald Birngruber
Mechanismen und On-line Dosimetrie bei
selektiver RPE Therapie
Inauguraldissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Medizinischen Universität zu Lübeck
Aus der Technisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
vorgelegt von
Georg Schüle
aus Pforzheim
Lübeck 2002

Schüle, Georg:
Mechanismen und On-line Dosimetrie bei selektiver RPE Therapie / Georg Schüle.
Als Ms. gedr.. – Berlin : dissertation.de – Verlag im Internet GmbH, 2003
Zugl.: Lübeck, Univ., Diss., 2003
ISBN 3-89825-593-X
1. Berichterstatter: Prof. Dr. R. Birngruber
2. Berichterstatter: Prof. Dr. J. Roider
Tag der mündlichen Prüfung: 31.01.2003
Zum Druck genehmigt, Lübeck den 28.01.2003
Bibliografische Information Der Deutschen Bibliothek
Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen
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dissertation.de - Verlag im Internet GmbH
Pestalozzistraße 9
10 625 Berlin
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Inhaltsverzeichnis_________________________________________________________________1
1 Einleitung.............................................................................. 5
2 Anatomie und Autofluoreszenz des Fundus ...................... 9
2.1 Die Retina.................................................................................... 9
2.2 Das retinale Pigmentepithel (RPE) ........................................... 10
2.2.1 Melanosomen des RPE..................................................................... 11
2.2.2 Lipofuszin und Melanolipofuszin des RPE..................................... 11
2.3 Retinale Autofluoreszenz (AF) ................................................. 12
2.4 Krankheitsbilder der Makula..................................................... 14
3 Laserbestrahlung des Fundus ........................................... 15
3.1 Wechselwirkung okularer Medien mit Laserlicht ..................... 15
3.2 Die Photokoagulation................................................................ 16
3.3 Die selektive RPE Therapie (SRT) ........................................... 17
4 Mechanismen und Detektion selektiver RPE-Schädigung 21
4.1 Thermische RPE Schädigung.................................................... 23
4.1.1 Autofluoreszenz basierter Nachweis von RPE-Schädigung ........... 23
4.2 Thermomechanische RPE Schädigung ..................................... 24
4.2.1 Optoakustischer Nachweis von RPE-Schädigung........................... 26
4.2.2 Reflexbasierter Nachweis von RPE-Schädigung ............................ 27
5 Material und Methoden..................................................... 29
5.1 Laser.......................................................................................... 29
5.1.1 Frequenzverdoppelter Nd:YLF-Laser ............................................. 29
5.1.2 Frequenzverdoppelter klinischer Nd:YAG-Laser............................ 32
5.1.3 Frequenzverdoppelter experimenteller Nd:YAG-Laser .................. 32
5.1.4 Argon-Laser..................................................................................... 33
5.1.5 Spekle-Werte bei verschiedenen Lasersystemen............................. 34
5.2 Optoakustik ............................................................................... 35
5.2.1 Piezoelektrischer Effekt................................................................... 36
5.2.2 Schallwandler in vitro (PIN-Transducer) ........................................ 37
5.2.3 Schallwandler in vivo (OA-Kontaktglas)........................................ 38
5.2.4 Kalibrierung der Schallwandler....................................................... 39
5.2.5 Schallfeldsimulationen zur Empfangscharakteristik des OA-
Kontaktglases 39
5.3 Organmodell Schweine-RPE .................................................... 41
5.3.1 Probenpräparation ........................................................................... 41
5.3.2 Vitalitätsassay CalceinAM .............................................................. 42

2 ___________________________________________________________ Inhaltsverzeichnis
5.4 Fluoreszenzbasierte On-line Dosimetrie.................................... 44
5.4.1 Thermische Denaturierungsmessung an A2E................................. 44
5.4.2 On-line Fluoreszenzdetektion an der Spaltlampe............................ 44
5.4.3 Postoperative Autofluoreszenz nach selektiver RPE Behandlung .. 46
5.5 Optoakustische On-line Dosimetrie........................................... 47
5.5.1 Optoakustische Dosimetrie an der Spaltlampe in vitro ................... 47
5.5.2 Optoakustische Dosimetrie bei Patientenbehandlung ..................... 48
5.6 Reflexbasierte On-line Dosimetrie ............................................ 49
5.6.1 Reflexdetektion an der Spaltlampe in vitro..................................... 49
5.6.2 Reflexdetektion bei der Bestrahlung von Kaninchen...................... 50
5.7 Mikroblasenbildungs- und Zellschadensschwellen bei
Lichtexposition von RPE-Proben im µs- bis ms-Zeitbereich......51
5.8 Parameterstudien in vivo am Kaninchen ................................... 52
5.8.1 Tiere................................................................................................. 54
5.8.2 Laserbestrahlung.............................................................................. 54
5.8.3 Datenauswertung der Parameterstudie ............................................ 55
5.8.4 Schadensschwellenbestimmung mit Probit ..................................... 55
5.8.5 Morphologische Untersuchungsmethoden ...................................... 56
5.9 Patientenbehandlungen .............................................................. 57
5.10 Temperaturbestimmung mit optoakustischen Methoden ........... 58
5.10.1 Grundlagen zur OA-Temperaturbestimmung ................................. 59
5.10.2 Bestimmung der Materialkonstante für RPE.................................. 63
5.10.3 Umsetzung bei selektiver RPE Behandlung ................................... 63
5.11 Modellrechnungen ..................................................................... 65
5.11.1 Wärmeleitung lichtabsorbierender Strukturen ................................ 65
5.11.2 Temperatur- und thermische Denaturierungsberechnungen im µs bis
ms-Zeitbereich ................................................................................. 69
5.11.3 Berechnungen der Grundtemperaturerhöhung im RPE bei gepulster
Bestrahlung ...................................................................................... 70
6 Ergebnisse und Diskussion................................................ 73
6.1 Spekle-Werte der Lasersysteme................................................. 73
6.2 Empfindlichkeit der Schallwandler............................................ 75
6.3 Empfangscharakteristik des OA-Kontaktglases ........................ 76
6.4 Temperaturmessung mit Optoakustik ........................................ 80
6.4.1 Temperaturabhängigkeit der Druckamplitude für Schweine RPE.. 80
6.4.2 Temperaturmessungen an Schweine-RPE bei gepulster Bestrahlung 81
6.4.3 Temperaturbestimmung bei Patientenbehandlungen....................... 83
6.4.4 Temperaturgenauigkeit der OA-Temperaturmessung...................... 87
6.4.5 Grundtemperaturerhöhung bei repetitiver Bestrahlung in
Abhängigkeit des Bestrahlungsdurchmessers 88

Inhaltsverzeichnis_________________________________________________________________3
6.5 Retinale Schadensmechanismen und -schwellen...................... 90
6.5.1 Mikroblasenbildungs- und RPE-Zellschadensschwellen bei
Lichtexposition im µs- bis ms-Zeitbereich...................................... 90
6.5.2 Temperatur- und Arrheniusberechnungen im Melanosomenfeld.. 102
6.5.3 Schadensschwellen in vivo am Kaninchenauge............................ 106
6.5.4 Histologische Ergebnisse................................................................ 116
6.6 Fluoreszenzbasierte On-line Dosimetrie................................ 123
6.6.1 A2E Fluoreszenz und thermische Stabilität .................................. 123
6.6.2 AF-Messung bei Bestrahlung von Schweine-RPE........................ 126
6.6.3 AF-Messung bei Bestrahlung von Kaninchen............................... 129
6.6.4 AF-Messung bei Patientenbehandlung.......................................... 130
6.6.5 Spektral aufgelöste AF-Messungen bei Patientenbehandlung ...... 135
6.6.6 Postoperative Autofluoreszenz nach selektiver Patientenbehandlung136
6.7 Optoakustische On-line Dosimetrie ........................................ 138
6.7.1 Optoakustische Transienten bei Bestrahlung von Schweine RPE 138
6.7.2 Datenauswertung der optoakustischen Transienten ...................... 142
6.7.3 Ergebnisse der OA-Dosimetrie bei in vitro Bestrahlungen........... 143
6.7.4 OA-Dosimetrie bei Patientenbehandlung...................................... 146
6.7.5 Vergleich zwischen Fluoreszenzangiographie und OA-Wert........ 151
6.7.6 Vergleich ICG-Angiographie Intensität und OA-Wert.................. 152
6.7.7 Transienten verschiedener OA-Werte ........................................... 153
6.7.8 Vergleichbarkeit der OA-Ergebnisse............................................. 155
6.7.9 Fehlerquellen bei der OA On-line Dosimetrie .............................. 157
6.8 Reflexbasierte On-line Dosimetrie im Tiermodell.................. 157
6.8.1 Reflexmessungen bei Kaninchen-Bestrahlung.............................. 158
7 Folgerungen und Ausblick .............................................. 161
7.1 RPE-Schadensmechanismus ................................................... 161
7.2 Behandlungsparameter............................................................ 163
7.3 On-line Dosimetrie.................................................................. 164
8 Zusammenfassung............................................................ 167
9 Literatur............................................................................ 171
10 Anhang A: “Thermoelastische Druckentstehung” ....... 187

4 ___________________________________________________________ Inhaltsverzeichnis

Kapitel:1 Einleitung _______________________________________________________________5
1 Einleitung
Die selektive Behandlung des retinalen Pigmentepithels (RPE) ist eine neue Therapiemethode
für verschiedene Erkrankungen des Augenhintergrunds. Im Gegensatz zu der konventionell
verwendeten Photokoagulation der Retina mit kontinuierlichen (~50 ms)
Lasern kann durch Applikation einer Serie von µs-Laserpulsen das RPE selektiv geschädigt,
die Photorezeptoren aber gleichzeitig geschont werden. Dies wurde in den grundlegenden
Arbeiten von Roider und Birngruber am Kaninchenmodell [1, 2] und bei der
Behandlung von Patienten [3, 4] gezeigt. Da die am RPE gesetzten Schäden für den
behandelnden Ophthalmologen nicht sichtbar sind, muß die Behandlung quasi blind
durchgeführt werden. Erst nach der Bestrahlung kann durch eine Fluoreszenzangiographie
der Schaden des RPE invasiv nachgewiesen werden.
Obwohl die selektive RPE Therapie (SRT) schon seit nunmehr fünf Jahren klinisch
erprobt wird, ist der genaue RPE-Schadensmechanismus bei repetitiver µs-Bestrahlung
noch unklar. Die grundlegende Idee basiert auf der Annahme eines rein thermischen Schadenmodells,
bei dem eine Reduzierung der RPE-Schadensschwelle durch die Additivität
der gesetzten thermischen Schäden mittels multipler Pulse gegeben ist. Die Laserpulsdauer
wird so gewählt, dass man eine selektive Erwärmung des RPEs erreicht, wobei die
direkt angrenzenden Photorezeptorschichten nur gering erwärmt werden. Mit einem thermischen
Modell des RPEs, das die Granularität der absorbierenden Melaningranula
berücksichtigt, ließ sich eine selektive Erwärmung mittels µs-Laserpulsen nachweisen
[2]. Eine mechanische Disruption, wie sie mit ns-Laserpulsen beschrieben war [5], galt es
zu vermeiden.
Die ersten experimentellen Ergebnisse am Kaninchen zeigten den Effekt der Additivität
der applizierten 5 µs Laserpulse [2]. Bei der Bestrahlung von Kaninchen mit repetitierenden
200 ns Nd:YAG-Laserpulsen wurden oberhalb der ophthalmologischen Schwelle
auch kleine, stationäre und intraretinal lokalisierte Blasen entdeckt [6, 7], und ein möglicher
thermomechanischer Schadensmechanismus diskutiert.
Die Entstehung von Mikroblasen durch Verdampfung an den stark lichtabsorbierenden
Melanosomen und der damit verbundene thermomechanische RPE-Schaden wurde von
Kelly für die Bestrahlung mit ns- bis ps-Laserpulsen beschrieben [8, 9, 10]. In der Arbeit
von Rögener zeigte sich, dass einerseits die Schwelle für Mikroblasenbildung um Einzelmelanosomen
und für RPE-Zellschaden für 8 ns Laserpulse übereinstimmen, andererseits
bei 3 µs Laserpulsen die Schwelle für Mikroblasenbildung 40 % höher lag als die
RPE-Schadensschwelle [11, 12]. Der Unterschied der Schwellen bei 3 µs Laserpulsen
konnte durch Wärmediffusion benachbarter Melanosomen innerhalb einer RPE-Zelle
erklärt werden. Ein experimenteller Nachweis wurde nicht gegeben [11]. Der Übergang
von der bekannten rein thermischen RPE-Denaturierung mit ms-Laserpulsen [13] zu

6 _________________________________________________________ Kapitel:1 Einleitung
einem thermomechanischen Schaden durch Mikroblasenbildung bei ns-Laserpulsen [11]
kann aus den Daten zur Lasersicherheit [16] bei 50 µs vermutet werden. Bei dieser Pulsdauer
ergibt sich eine Änderung der Steigung der Schadensschwellenkurve.
Ziele der vorliegenden Arbeit waren:
I.) Untersuchungen zum RPE-Schadensmechanismus bei SRT: Für den Nachweis
Mikroblasenbildung bei SRT wurden zwei physikalisch voneinander getrennte Detektionsmechanismen
eingesetzt. Einerseits wurde gezeigt, dass bei der Entstehung und Kollaps
von Kavitationsblasen akustische Transienten emittiert werden [17], andererseits läßt
sich die bei Blasenbildung entstehe Rückreflexion von Licht an der Blasenoberfläche
nachweisen [18]. Beide Nachweismethoden wurden in dieser Arbeit sowohl in vitro als
auch in vivo eingesetzt. Den Schwerpunkt bildete dabei der akustische Nachweis der
Mikroblasen.
Um den bisher undefinierten Übergang von einem thermischen Schaden im ms-Zeitbereich
zu einem Schaden mit Mikroblasenbildung bei kürzeren Laserpulsen zu untersuchen,
wurde ein Schweine-RPE Organmodell mit Einzelpulsen von 5 µs, 50 µs, 500 µs
und 3 ms Pulslänge bestrahlt und die akustischen Transienten und die Reflexionssignale
gemessen. Der RPE-Zellschaden kann durch den Vitalitätsmarker CalceinAM nachgewiesen
werden. Es wurden die RPE-Schadensschwellen und die Schwellen für Mikroblasenbildung
gemessen und statistisch ausgewertet. Die experimentellen Ergebnisse
wurden an einem mathematischen Modell nach Arrhenius zur thermischen Denaturierung
innerhalb eines Melanosomenfeldes mit den gemessenen Schwellenparametern analysiert.
II.) Analyse weiterer Behandlungsparameter: Vergleichend zu den ersten tierexperimentellen
Untersuchungen zur SRT [1, 2, 6, 7], bei denen eine rein thermische
RPE-Schädigung angenommen wurde, konnten basierend auf dem gemessenen
RPE-Schadensmechanismus in tierexperimentellen Untersuchungen verschiedene Laserparameter
analysiert werden. Im Vergleich zu anderen Arbeiten [1, 2, 6, 7] sind vor allem
kürzere Pulslängen von 8 ns, 200 ns, 1.7 µs in Abhängigkeit von der Anzahl der Pulse und
der Pulswiederholrate untersucht worden. Diese ermöglichen einen fundierten Überblick
über den gegebenen Parameterraum, führen zu Verbesserungen und einem erweitertem
Verständnis dieser Methode.
III.) Entwicklung eines On-line Dosimetriesystems zum nichtinvasiven Nachweis
der RPE-Schädigung bei SRT: Zwei voneinander unabhängige On-line Dosimetriesysteme
wurden entwickelt, die auf den beiden möglichen Schadensmechanismen beruhen.
Beide Systeme wurden sowohl am RPE-Organmodell als auch bei Patientenbehandlungen
eingesetzt. Somit bestand die Möglichkeit die am Organmodell entwickelten Methoden,
in der Praxis bei Patientenbehandlungen zu testen und zu verifizieren.
Als eine nichtinvasive Methode zum Nachweis des RPE-Schadens bei einer thermischen
Denaturierung wurde die retinale Autofluoreszenzänderung bei Bestrahlung untersucht.
Die retinale Autofluoreszenz geht von dem im RPE enthaltenen Lipofuszin aus [19].

Kapitel:1 Einleitung _______________________________________________________________7
Natürliche Fluorophore sind meistens thermisch instabil und ändern ihre Fluoreszenzeigenschaften
bei Erwärmung. Da Lipofuszin in der RPE-Zelle vorliegt [20], kann somit
auch räumlich aufgelöst untersucht werden, ob sich aus einer thermischer Denaturierung
und der damit verbundenen Änderung der retinalen Autofluoreszenz auf eine Schadensschwelle
geschlossen werden kann. Es wurde sowohl die Änderung der Fluoreszenzlichtleistung
als auch die spektrale Verteilung der Fluoreszenz während der Bestrahlung
gemessen und analysiert.
Als zweiter nichtinvasiver Ansatz zum Nachweis von thermomechanischer RPE-Schädigung
wurden die akustischen Signale, die bei der Mikroblasenbildung entstehen gemessen.
Dafür wurde ein Schallempfänger entwickelt, der in ein ophthalmologisches
Kontaktglas integriert war. Seine Empfindlichkeit von 5 V/bar erlaubt es, die schwachen
Transienten direkt während der Patientenbehandlung zu messen. Schallfeldsimulationen
zur Empfangscharakteristik des Kontaktglases zeigten eine hohe Variabilität der akustischen
Transienten in Abhängigkeit von der jeweiligen Lokalisation im Auge. Zur Auswertung
der akustischen Transienten wurde deshalb ein stabiler Algorithmus entwickelt,
der es erlaubte die Daten On-line zu analysieren und ein klares Schwellenkriterium zu liefern.
Beide Systeme wurden mit den klinischen Ergebnissen der RPE-Effekte verglichen und
zuletzt ein kompaktes, rechnergestütztes On-line Dosimetriesystem aufgebaut, das
erlaubt, den RPE-Schaden bei der SRT nichtinvasiv nachzuweisen.

8 _________________________________________________________ Kapitel:1 Einleitung

Kapitel 2: Anatomie und Autofluoreszenz des Fundus_____________________________________9
2 Anatomie und Autofluoreszenz des Fundus
In diesem einleitenden Kapitel sollen die anatomischen Strukturen des Augenhintergrundes
und die im Rahmen dieser Arbeit vorkommenden Krankheitsbilder erklärt werden.
2.1 Die Retina
Die Retina enthält die Sinneszellen, die den Lichtreiz aufnehmen. Durch Weiterverarbeitung
entstehen Signale, welche die Sehinformation an das Sehzentrum des Gehirns weiterleiten.
Die Netzhaut besteht aus drei hintereinander geschalteten Neuronen, den
Photorezeptoren, den Bipolarzellen und den Ganglienzellen (Abb. 2.1).
Das erste Neuron sind die Kerne der Photorezeptoren. Sie setzen sich aus 6 Mio. Zapfen
und 120 Mio. Stäbchen zusammen. Diese tauchen mit ihren Außensegmenten in das
dahinterliegende retinale Pigmentepithel (RPE) ein. Zapfen und Stäbchen unterscheiden
sich in Aufbau und Funktion. Die Stäbchen liegen in der Peripherie und sind für das Dämmerungssehen
und bei Helligkeit für die Wahrnehmung von Bewegungen in der Peripherie
verantwortlich, während sich die Zapfen in der Netzhautmitte befinden und für das
Sehen bei Tage und das Farbsehen zuständig sind. Im Zentrum befindet sich die Stelle des
schärfsten Sehens, die als Makula lutea, "gelber Fleck", bezeichnet wird. Die Fovea centralis,
die sich im Zentrum der Makula befindet, besteht nur aus Zapfen. Im Zentrum der
Fovea centralis, der Foveola, mit einem Durchmesser von 100 Mikrometern ist die Sehschärfe
am größten. Zwischen dem ersten und dem zweiten Neuron liegen die Horizontalzellen,
die mit ihren Enden quer zu den übrigen Zellschichten liegen, sowie die
Amakrinzellen. Das zweite Neuron bilden die bipolaren Zellen. Ihre Fortsätze sind mit
dem dritten Neuron verbunden, der Ganglienzellschicht. Die Neuriten der Ganglienzellschicht
bündeln sich in der Papille, dem Sehnervenkopf ("blinden Fleck"), und verlaufen
in Sehnerven weiter bis in die Sehrinde im Gehirn. Zum strukturellen und funktionellen
Zusammenhalt der Zellschichten dienen die Gliazellen bzw. Müller-Stützzellen.

10______________________________ Kapitel 2: Anatomie und Autofluoreszenz des Fundus
Abbildung 2.1 :Schnitt durch die Netzhaut (1 innere Gliagrenzmembran, 2 Optikusnervenfaserschicht,
3 drittes Neuron, 4 innere plexiforme Schicht, 5 zweites Neuron,
6 äußere plexiforme Schicht, 7 erstes Neuron, 8 Innensegmente der
Photorezeptoren, 9 retinales Pigmentepithel, 10 Bruchsche Membran,
11 Chorioidea); aus [24]
2.2 Das retinale Pigmentepithel (RPE)
Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine 10 µm dicke einzellige Schicht. Die Tight
junctions zwischen den Zellen stellen die äußere Blut-Netzhaut-Schranke zwischen der
Aderhaut und der neuronalen Netzhaut dar. Das RPE regelt den Transport von Nährstoffen
aus dem Blut zur Retina und Stoffwechselabbauprodukte von der Retina zum Blut. Es
sorgt außerdem für den Transport von Flüssigkeit und Elektrolyten zwischen den Blutgefäßen
und der Retina. Ferner phagozytiert das RPE Abbauprodukte, neben Membranfragmente
vor allem alte Membranscheiben die sich im Photorezeptoraußensegment befinden
und abgeschilfert werden. Die lichtempfindlichen Außenglieder der Photorezeptoren
bestehen aus dicht aufeinander gestapelten Lipoproteinmembranen. Die Photorezeptoren
minimieren den Effekt der Zellalterung und der Lichteinstrahlung durch konstante
Erneuerung ihrer Membranscheibchen [25]. Eine menschliche RPE-Zelle phagozytiert
täglich 10 - 15 % der vorhandenen Außensegmente der 30 - 50 Photorezeptoren die an
eine RPE-Zelle anschließen [26].
Es gibt drei verschiedene Pigmente die in der RPE-Zelle eingelagert sind. Die Melanosomen
werden nur während der embryonalen Entwicklung gebildet und bleiben das ganze
Leben erhalten. Das Lipofuszin entsteht durch unvollständige Phagozytose der Photorezeptoraußensegmenten.
Die Melanolipofuszine sind eine Verschmelzung von Melanosomen
und Lipofuszinen.

Kapitel 2: Anatomie und Autofluoreszenz des Fundus____________________________________11
2.2.1 Melanosomen des RPE
Die Melanosomen dienen einerseits als Radikalfänger und vermindern so eine zellschädigende
Lipidperoxidation [20]. Andererseits verhindern sie, dass das von den Photorezeptoren
transmittierte Licht wieder diffus von der Chorioidea und der Sklera zurückgestreut
wird. Die Melanosomen sind leicht elliptisch geformt und haben beim Menschen einen
Durchmesser von ungefähr 1 µm. In einer einzelnen RPE-Zelle sind ca. 100 Melanosomen
oberhalb des Zellkernes eingelagert (Abb. 2.2). Das einfallende Licht durchdringt
alle Retinaschichten, bis es die Photorezeptoren erreicht. Dort werden nur 5 % des Lichtes
absorbiert und zu Sehinformationen umgewandelt. Das transmittierte Licht wird beim
Menschen zu 50 - 60 % von den Melanosomen des RPE absorbiert [28,29] und in Wärme
umgewandelt [30].
Abbildung 2.2 :Schnitt durch die RPE-Zelle: (PAußensegmente der Photorezeptoren,
M Melanosom, ZK RPE-Zellkern, B Bruchsche Membran, C Chorioidea);
aus [28]
2.2.2 Lipofuszin und Melanolipofuszin des RPE
Im RPE entspricht Lipofuszin hauptsächlich einem Endprodukt der Phagozytose, der von
den Photorezeptoraußensegmenten abgegebenen Membranscheibchen und, in geringerem
Maß, der Autophagie zelleigener Organellen.
In den RPE-Zellen wird das von den Membranscheibchen stammende Material von einer
Grenzmembran umgeben, es entsteht ein Phagosom. Die anschließende Verbindung von
Lysosomen und Phagosomen führt zur Bildung von Phagolysosomen, die über die hydrolytischen
Enzyme zum Abbau des aufgenommenen Zellmaterials verfügen [31]. Dieser
Abbauprozeß der Membranscheibchen der Außensegmente führt zu verschiedenen Pro-

12______________________________ Kapitel 2: Anatomie und Autofluoreszenz des Fundus
dukten, die einerseits zur Weiterverwertung an die Photorezeptoren zurückgeführt werden.
Andere nicht abbaubare Substanzen werden andererseits an der basalen Zellseite
ausgeschieden und nach der Diffusion durch die Bruchsche Membran durch das Gefäßsystem
der Aderhaut abtransportiert. Die verbleibenden Abbauprodukte wie Lipofuszin
werden im RPE eingelagert. Dabei bildet das intrazelluläre Lipofuszin selbst Granula
(Lipofuszingranula) mit Größen bis zu 1 µm, oder es lagert sich direkt um die Melanosomen
(Melanolipofuszingranula) der RPE Zelle an (Abb. 2.3) [20].
Abbildung 2.3 :Lipofuszingranula (L) und Melanolipofuszin (Dreieck) im RPE einer 70jährigen
Frau; aus [20].
2.3 Retinale Autofluoreszenz (AF)
In der Retina des menschlichen Auges ist eine Vielzahl natürlicher Fluorophore vorhanden.
Durch die optischen Transmissionseigenschaften des Auges ist die Anregung der
Fluorophore auf den Spektralbereich zwischen 400 nm und 1200 nm beschränkt. Dadurch
lassen sich nur noch zwei Klassen von Farbstoffen durch das Auge hindurch anregen. Es
sind Flavine und Lipofuszin. Die Flavine kommen in den Mitochondrien der Zellen vor
und sind somit Indikatoren für den zellulären Metabolismus [35]. Deren Fluoreszenz ist
deutlich kleiner als die des Lipofuszins [35]. Deshalb sind im Folgenden nur die Fluoreszenzeigenschaften
des Lipofuszins genauer dargestellt.
Die Fluoreszenzeigenschaften von Lipofuszin wurden bereits in vitro [36] und in vivo
[19] untersucht. Lipofuszin selbst besteht aus 10 einzelnen autofluoreszierenden Komponenten
[33] dessen Hauptbestandteil A2E, ein Pyridium bis-retenoid, ist [34]. Die Fluoreszenzeigenschaften
der 10 autofluoreszenten Einzelkomponenten sind breitbandig und
reichten bei der Exzitation von 260-520 nm und bei der Emission von 400-700 nm [33].
Ähnlich breitbandige Spektren ergeben sich auch bei spektral aufgelösten Fluoreszenzuntersuchungen
am gesunden Menschenauge [19]. Die Emission reicht, abhängig von der
Exzitation, von 500 nm bis 780 nm (Abb. 2.1).

Kapitel 2: Anatomie und Autofluoreszenz des Fundus____________________________________13
Abbildung 2.4 :Exzitationsspektrum und dazugehörige Emissionsspektren des Augenhintergrundes
in vivo; aus [19].
In zeitaufgelösten Autofluoreszenzmessungen an extrahiertem humanen Lipofuszin zeigen
sich in vitro vier wesentliche Abklingzeiten von 0.2 - 6.7 ns [36]. Am gesunden Menschenauge
kann eine resultierende Abklingzeit von 2 ns gemessen werden [35], wobei
diese Messungen systembedingt nur auf ein Zeitbereich von 0.75 - 6 ns beschränkt waren.
Auch konnte aufgrund der geringen Photonenausbeute nur eine Abklingzeit bestimmt
werden.
Da Lipofuszin ein Produkt unvollständiger Phagozytose ist, erhöht sich dessen Konzentration
im RPE mit dem Alter. Untersuchungen zeigen, dass die Lipofuszindichte nahezu
linear mit dem Alter ansteigt (Abb. 2.5) [32]. Um das 40. Lebensjahr sind etwa 8 - 10 %
des zytoplastischen Zellvolumens damit ausgefüllt, um das 80. Lebensjahr nimmt Lipofuszin
ca. 20 % des Zellvolumens ein [25]. Interpoliert man diese Daten zurück auf die
Fluoreszenzintensität bei Geburt, so ergibt sich selbst da eine Intensität von ca. 3% der
maximal erreichbaren Fluoreszenz.
Abbildung 2.5 :Retinale Autofluoreszenzintensität in Abhängigkeit des Alters; aus [32].

14______________________________ Kapitel 2: Anatomie und Autofluoreszenz des Fundus
2.4 Krankheitsbilder der Makula
Bei mehreren Krankheitsbildern der Makula ist bekannt, dass pathologische Veränderungen
des RPEs eine Rolle bei der Pathogenese spielen. Hierzu gehören unter anderen die
altersbedingte Makuladegeneration (AMD) und die Retinopathia centralis serosa (RCS).
Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist die häufigste Ursache einer Erblindung
in der westlichen Welt bei Patienten älter 50 Jahre [38]. Die Pathogenese der AMD
ist komplex. Ein Faktor ist eine Überbelastung des RPEs im fortgeschrittenen Alter. Häufig
entsteht zunächst durch unvollständige Phagozytose durch das RPE eine Ansammlung
hyalinen Materials im Bereich der Bruchschen Membran[27]. Diese Materialansammlungen
werden auch Drusen genannt. Diese sogenannte Drusenmakulopathie ist ein Vorstadium
der AMD [27]. Von der aus können sich zwei Formen der AMD entwickeln [26]:
1. Die trockene AMD, die sich durch einen schleichend verlaufende RPE Atrophie
mit langsamen Visusverlust gekennzeichnet ist, und
2. Die feuchte, neovaskuläre AMD: Durch Lücken in der Bruchschen Membran können
chorioidale Gefäße unter das RPE und später auch in die Netzhaut einwachsen.
Derartige Neovaskularisationen können innerhalb von Monaten zu einem Verlust des
zentralen Sehvermögens führen.
Die Retinopathia centralis serosa (RCS) ist eine Erkrankung, die vor allem junge
Erwachsene zwischen 20. und 45. Lebensjahr betrifft und sich mit Metamorphopsien,
Visusverschlechterung, Zentralskotom oder Mikropsie bemerkbar macht. Dabei treten
eine oder mehrere fokale Leckagen im RPE auf. Durch die durchbrochene Blut-Retina
Schranke des RPE kann somit mehr Flüssigkeit in den subretinalen Raum einströmen, als
in Richtung Choriokapillaris herausgepumpt wird [40]. Es kommt zum Netzhautödem
und damit verbunden zu den oben genannten funktionellen Veränderungen.
Die diabethische Makulopathie (DMP) entsteht primär durch eine Pathogenese des retinalen
Gefäßsystems. Es kommt zu einer Mikroangiopathie, die vor allem die präkapillaren
Ateriolen, die Kapillaren und die Venolen betrifft. Die Verdickung der Basalmembran
des Gefäßendothels führt zu einer frühzeitigen Gefäßsklerose mit Kapillarverschlüssen
und Ischämie. Durch den Versuch einer Revaskularisation der minderversorgten Netzhaut
kommt es zu Gefäßneubildungen. Die erhöhte Gefäßpermeabilität führt zu Netzhautödemen
und exsudativer Parenchymzerstörung. Bei der diffusen diabetischen Makulopathie
kommt es zu einer Leckage aus den delateralen retinalen Kapillaren am hinteren Augenpol.
Die verringerte Wirkung schadhaften RPEs auf die subretinale Flüssigkeitsresorption
scheint zusätzlich ein wesentliches Element bei der Entstehung des diffusen diabetischen
Makulaödems zu sein [39]. Eine Anregung des Transportsystems des RPEs ist somit ein
wesentlicher therapeutischer Faktor, da man die Mikroangiopathie bisher nicht beeinflussen
kann.

Kapitel 3: Laserbestrahlung des Fundus _______________________________________________15
3 Laserbestrahlung des Fundus
3.1 Wechselwirkung okularer Medien mit Laserlicht
Die in den absorbierenden Strukturen des Fundus deponierte Energie wird je nach Leistungsdichte,
Expositionszeit und Absorber in photochemische, mechanische oder thermische
Energie umgewandelt. Zu verschiedenen physikalischen Wirkmechanismen der
primären Schädigungsmechanismen bei minimaler Schädigungsleistungsdichte lassen
sich unterschiedliche Bestrahlungszeiten zuordnen.
Bei extrem langen Bestrahlungszeiten von Stunden bis zu mehreren Minuten, und vor
allem im blauen Spektralbereich lassen sich photochemische Effekte an der Netzhaut
erzeugen. In diesem Zeitbereich wird die im RPE durch Absorption entstandene Wärme
sehr effektiv durch Wärmekonvektion aufgrund der starken retinalen Durchblutung abgebaut
[42]. Es stellt sich ein thermischer Gleichgewichtsprozeß ein. Bei Reduzierung der
Expositionszeit in den Sekundenbereich ist ein Abtransport der Wärme durch Konvektion
nicht mehr gegeben. Die induzierte Wärme wird während der Bestrahlungszeit akkumuliert
und nur durch Wärmediffusion lokal reduziert [42]. In diesem Zeitbereich entsteht
zuerst ein rein thermischer Schaden, die Koagulation, dessen Zeit-Schadensabhängigkeit
sich durch einen Arrheniusprozeß beschreiben läßt [13]. Bei Bestrahlung im Nanosekunden
(ns) Zeitbereich wurde die Bildung von Mikrodampfblasen um die stark
absorbierenden Melanosomen im RPE als primärer Fundusschaden nachgewiesen [8].
Aufgrund der kurzen Bestrahlungszeit kommt es durch einen thermischen Einschluß der
absorbierten Energie innerhalb des Melanosoms zur effektiven Erwärmung und Bildung
von Mikroblasen. Die Mikroblasen haben einen minimalen Durchmesser unterhalb eines
Mikrometers, und sind somit noch klein gegenüber der RPE-Zelle und auch kleiner als
Kavitationsblasen bei denen der akustische Einschluß maßgebend für deren Entstehung
ist. Durch die Mikroblasenbildung kommt es zu einer Volumenvergrößerung innerhalb
der RPE-Zelle, was wahrscheinlich zu einer Überdehnung und Schädigung der Zellmembran,
und somit auch einer RPE-Zellschädigung führt. Der genaue Zellschädigungsmechanismus
bei Mikroblasenbildung ist nicht eindeutig geklärt. Bei Pikosekunden (ps) ist
neben dem thermischen auch ein akustischer Einschluß der absorbierten Energie innerhalb
des Melanosoms gegeben. Hierbei kommt es zur Bildung von druckinduzierten
Kavitationsblasen [8]. Bei kürzeren Bestrahlungszeiten in Femtosekunden (fs) Bereich
kommt es in der Netzhaut zu einem optischen Durchbruch [43, 44, 45]. In diesem Fall
spielt die Absorption des RPE eine untergeordnete Rolle [46]. Für den sichtbaren Spektralbereich
ist in der Norm ANSIZ-136.1 die maximal zulässige corneale Bestrahlung für
alle Bestrahlungszeiten zusammengefaßt dargestellt [16].
Die zu den jeweiligen biophysikalischen Effekten bei Laserbestrahlung entstehenden
histologischen Befunde sind nicht immer genau einem Schadensmechanismus zuzuordnen.
In den ersten Stunden nach Exposition kommt es in Abhängigkeit der retinalen
Gewebezerstörung zu einer “biologischen Verstärkung” des Gewebedefekts durch Bil-

16__________________________________________Kapitel 3: Laserbestrahlung des Fundus
dung eines unspezifischen retinalen Ödems. Dadurch ist es nicht möglich, aus histologischen
Befunden zu schließen, ob der primäre Schadensmechanismus rein thermisch ist,
oder ob noch zusätzliche Faktoren wie mechanische oder photochemische Mechanismen
beteiligt sind. Ein histologischer Nachweis des primären Schadensmechanismuses ist
aber auch wegen des transienten Charakters der Primäreffekte, wie z.B. ein Aufschwingen
von Mikroblasen im ns-Zeitbereich, nicht möglich.
In Abhängigkeit von der eingestrahlten Lichtwellenlänge kommt es durch unterschiedliche
spektrale Absorption der einzelnen Fundusschichten zu verschiedenen Energieverteilungen.
Die maßgebenden Chromophore des Fundus sind Wasser, Hämoglobin und
Oxyhämoglobin in den Gefäßen, Melanin im RPE und tieferliegenden Schichten der Chorioidea
und Xanthophyll, was nur im Bereich der Fovea in der neuralen Netzhaut eingelagert
ist (Abb. 3.1).
Abbildung 3.1 :Absorptionskoeffizienten verschiedener im Fundus vorkommenden Chromophore
in Abhängigkeit der Wellenlänge; aus [30]
3.2 Die Photokoagulation
Die Photokoagulation stellt heute bei zahlreichen Netzhauterkrankungen ein Behandlungsverfahren
dar, das aus der täglichen ophthalmologischen Praxis nicht mehr wegzudenken
ist. Die Ursprünge gehen auf Meyer-Schwickerath zurück [47]. Dabei wurde in
den ersten Arbeiten Sonnenlicht als Energiequelle verwendet. Diese Energiequelle stellte
aber wegen der komplizierten Handhabung als ungeeignet heraus. Deswegen wurden
zunächst Hochintensitätskohlebogen, Anfang der 50er Jahre dann Xenonhochdrucklampen
verwendet, die eine hinreichend hohe Leistungsdichte am Fundus zur Erzeugung
einer Koagulation erreichten. Zahlreiche Arbeiten wurden veröffentlicht, die die therapeutische
Anwendbarkeit und Wirkung zeigten [48]. Mit der Erfindung des Lasers durch

Kapitel 3: Laserbestrahlung des Fundus _______________________________________________17
Mainman stand eine neue, vielversprechende Lichtquelle zur Verfügung, die durch die
geringe Strahldivergenz sehr einfach durch Fokussierung eine hohe Leistungsdichte
erreichte, die zur Koagulation verwendet werden konnte [49]. Histologische Untersuchungen
zeigten, dass die Effekte des Laserlichts an der Netzhaut durch die Absorption
an unterschiedlichen Strukturen erklärt werden können. Mit der Einführung des Argonlasers
stand Anfang der 70er Jahre ein Laser zur Verfügung, der aufgrund seiner wählbaren
Wellenlänge (514 nm, 488 nm) und bis zu einigen Watt cw-Leistung
(cw = continous wave) einen breiten klinischen Einsatz ermöglichte. Die Durchführung
der “Diabetic Retinopathy Study”, einer groß angelegten prospektiven, randomisierten
und multizentrischen klinischen Studie zeigte klar, dass die Behandlung der diabetischen
Retinopathie durch Laserkoagulation deutliche Vorteile bringt und so das Risiko eines
massiven Visusverlustes halbiert werden kann [50]. Mit der Weiterentwicklung der Lasertechnik
kamen neue Lasertypen hinzu, die sich generell nur in ihrer emittierten Wellenlänge
unterschieden. Wegen der unterschiedlichen Wellenlänge der Lasertypen sind
aufgrund der unterschiedlichen Absorptionsverhältnisse theoretisch zunächst geringe
Unterschiede bezüglich des histologischen Effektes zu erwarten. Bei längeren Wellenlängen
nimmt die Absorption von Blut zu, gleichzeitig sinkt die Absorption des RPE
(Abb. 3.1). Bei 800 nm kommt es zu einer effektiven Erwärmung chorioidealer Gefäße,
was zu einer ungewollten Schädigung dieser Strukturen führt [30]. Deshalb wird heutzutage
hauptsächlich der grüne Spektralbereich mit maximaler Absorption im RPE für die
Laserphotokoagulation verwendet.
Bei der Photokoagulation wird die Laserleistung oder die Expositionszeit so variiert, dass
eine ophthalmoskopisch sichtbare, weiß-gräuliche Läsion entsteht. Der Durchmesser des
Bestrahlungsareals wird dabei je nach Anwendung zwischen 50 - 500 µm eingestellt. Die
Expositionszeiten sind länger als 50 ms, typischerweise 100 - 200 ms. Histologisch zeigt
sich nach einer Laserkoagulation ein irreversibler Gewebeschaden, wobei bei milden ophthalmoskopisch
sichtbaren Läsionen die Choriokapillaris, das RPE und die Photorezeptoren
einschließlich der äußeren Körnerschicht zerstört werden [51]. Bei stärkeren
Läsionen, wie sie klinisch üblicherweise verwendet werden, zeigen sich zusätzliche Schäden
in den inneren Netzhautanteilen. Unabhängig von der verwendeten Wellenlänge
ergibt sich bei allen histologischen Untersuchungen, dass bei der Photokoagulation die
Schädigung des RPEs auch immer mit einer Destruktion der Photorezeptoren einhergeht.
Die damit verbundenen Gesichtsfelddefekte sind nicht erwünscht, lassen sich aber bei
Bestrahlung im Millisekunden (ms) Bereich nicht verhindern.
Die cw-Photokoagulation geht immer einher mit massiven Nebeneffekten wie lokale Skotome
durch die Zerstörung der Photorezeptoren.
3.3 Die selektive RPE Therapie (SRT)
Bei der Drusenmakulopathie und der RCS wird, wie in Kap. 2.4 näher dargelegt, davon
ausgegangen, dass ihnen eine pathologischen Veränderung des RPE zugrunde liegt. Eine
selektive Schädigung der RPE-Zellen und der damit verbundene Proliferation neuer RPE-

18__________________________________________Kapitel 3: Laserbestrahlung des Fundus
Zellen erscheint hinreichend für die Induzierung einer Heilreaktion sowohl bei der DMP,
RCS und Drusenmakulopathie zu sein [3, 1]. Gleichzeitig kann der massive Nebeneffekt
der lokalen Skotome vermieden werden [3]. Vor diesem Hintergrund wurde von Roider
und Birngruber die selektive RPE Behandlung mit repetierenden µs-Laserpulsen entwikkelt.
Die grundlegende Idee der SRT basiert auf der Annahme eines rein thermischen Schädigungsmodells,
bei dem eine Reduzierung der RPE-Schadensschwelle durch die Additivität
der gesetzten Schäden mittels multipler Pulse gegeben ist. Die Laserpulsdauer wurde
so gewählt, dass man eine selektive Erwärmung des RPEs erreicht, wobei die direkt
angrenzenden Photorezeptorschichten nur gering erwärmt werden. Eine mechanische
Disruption wie sie mit ns-Laserpulsen beschrieben war galt es zu vermeiden [5]. Mit
einem thermischen Modell des RPE, welches die Granularität der absorbierenden Melaningranula
berücksichtigt lies sich eine selektive Erwärmung mittels µs-Laserpulsen
nachweisen [2]. In Abb. 3.2 ist die axiale Temperatur-Ortsverteilung im RPE und der
angrenzenden Netzhaut zu verschiedenen Zeitpunkten nach Applikation eines 1 µs Laserpulses
(5.5 µJ, gausscher Spot mit 1/e² = 110 µm, 63 % Absorption, 95 % optische Transimission
des Auges) dargestellt. Es kommt zu einer selektiven Erwärmung des RPEs
während des Laserpulses mit Temperaturspitzen bis zu 80°C, wobei gleichzeitig schon
2 µm entfernt, in der Netzhaut, nur 2-3 °C Erwärmung erreicht werden.
Abbildung 3.2 :Axiale Temperatur-Ortsverteilung im RPE und der angrenzenden Netzhaut
zu verschiedenen Zeitpunkten nach Applizierung eines 1 µs Laserpulses;
aus [2].
In tierexperimentellen Untersuchungen an Kaninchen wurde histologisch gezeigt, dass
mit repetitierenden µs-Laserpulsen das RPE selektiv geschädigt werden kann und gleichzeitig
die Photorezeptoren geschont werden [1, 2]. Es ergab sich auch eine Additivität der
Lasereffekte, was als Hinweis auf einen thermischen RPE-Schadensmechanismus gewertet
wurde [2]. Die angiographischen ED 50 Schadensschwellen bei 500 Hz Pulswiederhol-

Kapitel 3: Laserbestrahlung des Fundus _______________________________________________19
rate und 5 µs Laserpulse lagen für 1 / 25 / 500 Pulse bei bei 57 / 27 / 16 mJ/cm² und die
opthalmoskopischen ED 50 Schwellen (> 100mJ/cm²) konnten aufgrund der begrenzten
Laserleistung nicht bestimmt werden. Die angiographische ED 50 Schadensschwelle bei
ebenfalls 500 Hz Pulswiederholrate und 200 ns Pulslänge wurde bei 10 und 500 Pulsen
auf 43 mJ/cm² und 26 mJ/cm², die ophthalmoskopische ED 50 Schadensschwellen mit
110 mJ/cm² und 105 mJ/cm² bestimmt. Wichtig ist zu beachten, dass die gemessenen
Schwellen die mittlere Bestrahlung im Spot wieder geben, und nicht auf die maximale
Bestrahlung durch Spekelbildung bei der fasergeführte Applikation normiert wurden.
Bei dem ersten klinischen Einsatz an Patienten konnte mit Hilfe der Mikroperimetrie
gezeigt werden, dass die Photorezeptoren im Laserareal intakt und funktionsfähig sind
[3]. In einer klinischen Pilotstudie wurden in den Augenkliniken Lübeck und Regensburg
bereits über 160 Patienten mit DMP, RCS und die Drusenmakulopathie behandelt.
Abschließende Ergebnisse konnten bisher von 70 Patienten dokumentiert werden, die alle
eine Nachbeobachtungszeit von mehr als einem halben Jahr, in Einzelfällen bis zu zwei
Jahren besaßen. Die angiographische ED 50 Schadensschelle bei den Patientenbehandlungen
mit 1.7 µs Nd:YLF (527 nm) Laserpulsen bei 500 Hz Pulswiederholrate und 100
applizierten Pulsen lag bei 450 mJ/cm². Die ophthalmoskopische ED 50 Schwelle wurde
nicht erreicht und lag somit oberhalb der maximal applizierten Bestrahlung von
650 mJ/cm². Die angiographische ED 50 Schadensschwelle lag beim Menschen somit um
den Faktor 10 höher wie in den Kaninchenversuchen. Der Grund für diese Differenz ist
unklar, da die Absorptionseigenschaften des menschlichen und Kaninchen-RPEs sich nur
um 10 % bei den verwendeten Wellenlängen unterscheidet [28].
Die primären Zielkriterien beim diabetischem Makulaödem waren die Veränderung von
harten Exsudaten und Veränderungen des Flüssigkeitsaustrittes in die Netzhaut. Das Zielkriterium
bei AMD war eine Änderung der Zahl der Drusen und bei RCS eine Reduktion
des Flüssigkeitsaustritts aus dem retinalen Pigmentepithel. Klinisch zeigte sich bei ca.
einem Drittel der Patienten (38 %) mit Drusenmakulopathie ein Rückgang der Drusen,
was deutlich geringer ist als nach konventioneller Bestrahlung. Die Ursache mag in der
geringen Anzahl der applizierten Laserläsionen liegen. Weiterhin ist auch nicht klar, ob
ein Rückgang der Drusen mit einem verringerten Risiko der Ausbildung von chorioidealen
Neovaskularisationsmembranen - also den Übergang in eine feuchte Form der AMD
mit schwerwiegenden schnellen Visusverlust - einhergeht. Dies kann aber nur durch eine
langfristig angelegte Placebo kontrollierte Studie geklärt werden. Bei der diabetischen
Makulopathie konnten Verbesserungsraten von über 57 % erzielt werden, die derjenigen
mit konventioneller Bestrahlung nahezu gleich kommt. Bei Patienten mit RCS konnte
meistens ein therapeutischer Effekt erzielt werden. Die punktuelle Leckage war in der
Regel nach spätestens 2 Wochen geschlossen und der Visus stieg schnell wieder auf 1.0 .
Dieses ist insbesondere deshalb wichtig, da es sich bei diesem Krankheitsbild meistens
um junge männliche Erwachsene handelt, die im Arbeitsleben stehen und auf gutes beidäugiges
Sehen angewiesen sind, und daher in besonderem Maße vom Ausbleiben der
Laserskotome profitieren.

20__________________________________________Kapitel 3: Laserbestrahlung des Fundus
Insgesamt konnten für die SRT therapeutische Effekte bei der Behandlung von makulären
Erkrankungen bei gleichzeitiger Schonung der Photorezeptoren und Vermeidung von
Laserskotomen gezeigt werden.

Kapitel 4: Mechanismen und Detektion selektiver RPE-Schädigung __________________ 21
4 Mechanismen und Detektion selektiver RPE-Schädigung
Bei ophthalmologischer cw-Laserphotokoagulation der Retina wird eine Dosimetrie bei
jedem Patienten individuell durchgeführt. Es wird schrittweise die Leistung erhöht bis
sich eine weißlich-graue Färbung der Netzhaut durch eine thermische Denaturierung
ergibt (Abb. 4.1). Mit dieser Leistung wird dann die zu behandelnde Stelle bestrahlt. Es
wird eine Dosimetrie gemacht, bei der das Kriterium eine ophthalmologische Sichtbarkeit
der Läsionen ist. Dadurch werden interindividuelle Unterschiede wie optische Transmission
der Augenmedien und vor allem Absorption im RPE berücksichtigt. Der behandelnde
Arzt hat zusätzlich noch einen guten Überblick über die bereits behandelten
Areale, da sie sichtbar sind.
Abbildung 4.1 :Sichtbare, durch thermische Denaturierung der Netzhaut entstandene
Läsionen einer panretinalen cw-Photokoagulation, aus [26].
Bei der selektiven RPE Behandlung ist aufgrund der auf das RPE begrenzten Schäden ein
erfolgreich gesetzter RPE-Schaden ophthalmoskopisch nicht sichtbar (Abb. 4.2 A). Daraus
ergibt sich direkt das Problem einer individuellen Dosimetrie für den behandelnden
Arzt. Um den Erfolg der Behandlung verifizieren zu können, muß derzeit postoperativ
immer eine Fluoreszenz-Angiographie durchgeführt werden. Ein Schaden auf RPE-
Ebene führt zu einem Durchtritt von Fluoreszein aus der Choriokapillaris in den subretinalen
Raum und damit zu einer Leckage im bestrahlten Areal, wodurch der Schaden
angiographisch sichtbar wird (Abb. 4.2 B). Bei Patienten mit diabetischer Makulopathie,
die erfahrungsgemäß mit zahlreichen krankheitsbedingten Leckage-Arealen, Makulaödem
und verdickter Netzhaut einhergeht, ist ein Nachweis der Laserherde mit der Fluoreszenzangiographie
nicht möglich. Hier wird die, durch die Laserkoagulation induzierte
Leckage, von der pathologische Leckage überdeckt. In diesen Fällen muß auf die Indiocyanidgreen-Angiographie
(ICG) zurückgegriffen werden, die im Gegensatz zur konventionellen
Angiographie mit Fluoreszein, die Laserläsionen eindeutig nachweisen läßt, da
ICG nicht an den pathologisch erkrankten Stellen durchtreten kann (Abb. 4.2 C).

22 _________________ Kapitel 4: Mechanismen und Detektion selektiver RPE-Schädigung
Abbildung 4.2 :Fundusbild (A), FLA- (B) und ICG-Angiogramm (C) nach einer selektiven
RPE Behandlung. Im Fundusbild sind die am RPE gesetzten Schäden nicht
sichtbar. Erst in der FLA und im ICG zeigen sich die Läsionen durch poolen
des jeweiligen Kontrastmittels durch die in dem bestrahlten Spot
geschädigte Blut-Retina Schranke.
Der Nachteil der Angiographie allgemein besteht in ihrem invasivem Charakter. Mit der
angiographischen Nachweismethode ist die selektive RPE Behandlung auf den Einsatz in
einem klinischen Umfeld beschränkt, da in einer normalen augenärztlichen Praxis ein
Angiograph nicht zur Verfügung steht.
Eine On-line Dosimetrie, die direkt während der Bestrahlung eine Dosimetrie zuläßt, ist
für den Praxiseinsatz sehr wünschenswert. Dabei ist eine nichtinvasive Methode von großem
Vorteil, da sie die oben beschriebenen Nebenwirkungen der Angiographie vermeidet,
und somit eine breite Akzeptanz des neuen Therapieverfahrens unterstützt.
Zu Beginn dieser Arbeit war der RPE-Schadensmechanismus bei der SRT noch nicht eindeutig
geklärt. Bei der Fundusbestrahlung mit µs-Laserpulsen liegt man zwischen den
schon vielfach untersuchten Mechanismen einer rein thermischen RPE Schädigung bei
langer Bestrahlungszeit im ms-Bereich [13] und einer thermomechanischer Schädigung
durch Mikroblasenbildung im ns-Zeitbereich [8]. Deshalb wurde für beide retinalen Schädigungsmechanismen
ein dazu passender On-line Dosimetrieansatz verfolgt und sowohl
in in vitro Experimenten als auch bei Patientenbehandlungen angewandt. Die jeweiligen
Ansätze sind zusammengefaßt in Abb. 4.3 prizipiell dargestellt, und im Folgenden nach
den Schadensmechanismen getrennt beschrieben. Ist eine Detektion des Schadensmechanismus
möglich, ergibt sich daraus auch die Möglichkeit einer On-line Dosimetrie.

Kapitel 4: Mechanismen und Detektion selektiver RPE-Schädigung __________________ 23
Autofluoreszenz:
spektrale oder
Intensitätänderung
thermische Denaturierung
Schallsignal:
thermoelastische
Transiente
Reflexsignal:
konstante diffuse
Rückstreuung
Abbildung 4.3 :Prinzipskizze der in dieser Arbeit verwendeten Methoden zur On-line Dosimetrie
und zum Nachweis des RPE-Schadensmechanismus bei Laserbestrahlung.
4.1 Thermische RPE Schädigung
Laserpuls
RPE-Zellschädigung
Mikroblase
Schallsignal:
thermoelastische
Transiente
Mikroblasentransiente
Für thermische Schäden ist die Temperatur im Gewebe von entscheidender Bedeutung.
Für thermisch induzierte Netzhautschäden war deshalb zuerst die Hypothese einer kritischen
Temperatur vorgeschlagen worden [52]. Es zeigte sich schon sehr schnell, dass
gerade für kurze Bestrahlungszeiten diese Hypothese nicht zu halten war [21]. Vassiliadis
griff dann als erster die von Arrhenius quantitativ beschriebene thermisch induzierte
Reaktionskinetik für die Anwendung bei Netzhautschäden auf [21]. Dieser Ansatz wurde
durch ein Wärmeleitungs- und thermisches Schädigungsmodell erweitert, womit Schadenschwellen
im Zeitbereich 1 ms bis 300 ms erklärt werden konnten [13]. Bei thermisch
induzierten Schäden ergibt sich eine Additivität multipler einzelner Schäden. Erste Tierversuche
an Kaninchen mit repetierenden µs-Laserpulsen stützten die Hypothese der thermischen
Denaturierung, da sich auch hier ein additiver Effekt multipler Pulse zeigte [1].
So verringerte sich die ED 50 Schwellenenergie um den Faktor 3.6 von 5.5 µJ bei Einzelpulsen
zu 1.5 µJ bei 500 applizierten Pulsen (514 nm, 5 µs Puls, 500 Hz, 116 µm Spot)
[1].
Eine auf der thermischen Denaturierung beruhende nichtinvasive On-line Dosimetriemöglichkeit
basiert auf der retinalen Autofluoreszenz.
4.1.1 Autofluoreszenz basierter Nachweis von RPE-Schädigung
Eine nichtinvasive Methode zur Verifikation des Behandlungserfolges bei einer thermischen
Denaturierung könnte die Erfassung der Fundus-Autofluoreszenz darstellen. Die
retinale Autofluoreszenz geht von dem im RPE enthaltenen Lipofuszin aus. Die genaue
Lokalisation und Zusammensetzung wurden bereits in Kapitel 2.3 detailliert dargestellt.
Natürliche Fluorophore sind meistens thermisch instabil und ändern ihre Fluoreszenzeigenschaften
bei Erwärmung. Da Lipofuszin direkt im RPE liegt ist, kann auch räumlich
+
Reflexsignal:
konstante diffuse
Rückstreuung
+
transiente Rückstreuung
durch Mikroblasen

24 _________________ Kapitel 4: Mechanismen und Detektion selektiver RPE-Schädigung
gut aufgelöst untersucht werden, ob sich aus einer thermischer Denaturierung und der
damit verbundenen Änderung der retinalen Autofluoreszenz auf eine Schadensschwelle
des RPE schließen läßt.
Abbildung 4.4 :Verdeutlichung der Temperaturverteilung um die lichtabsorbierenden Melanosomen
bei Laserbestrahlung im RPE. Die Lipofuszin- und Melanolipofuszingranula
werden hohen Temperaturen ausgesetzt und möglicherweise
auch das Lipofuszin thermisch denaturiert. (ursprüngliches Bild Abb. 2.3).
Dabei kommen zwei technische Möglichkeiten in Frage. Einerseits wird versucht die
Änderung der Autofluoreszenz direkt während der Bestrahlung nachzuweisen und somit
ein wirkliches On-line System zu entwickeln, andererseits wurde in Kooperation mit
Herrn Prof. Dr. H. Roider und Dr. C. Framme von der Augenklinik Regensburg die Möglichkeit
untersucht, den selektiven RPE-Schaden über retinale Autofluoreszenzbilder mit
einem Laser-Scanning Retina-Angiographen nach erfolgter SRT-Behandlung nachzuweisen.
In diesem Fall wird die Änderung der Autofluoreszenz erst nach der Behandlung
ebenfalls nichtinvasiv nachgewiesen. Jedoch limitiert der Einsatz eines Laser Scanning
Retina-Angiographen zum Nachweis des RPE-Schadens die selektive RPE Behandlung
wiederum auf ein universitäres Umfeld mit den entsprechenden technischen Geräten.
4.2 Thermomechanische RPE Schädigung
Bei der selektiven Schädigung von RPE-Zellen, oder auch weiter gefaßt, stark pigmentierter
Zellen, ist bei einer Bestrahlungszeit im ns-Bereich eine thermomechanische Schädigung
durch die Bildung nur einiger µm großer Mikroblasen bereits in mehreren
Arbeiten dargestellt. Bei der Anwendung am RPE wurde in der Arbeit von Kelly die
Bestrahlung von ns bis ps-Laserpulsen untersucht [8]. Als primärer Schadensmechanismus
wird darin die um die Melanosomen gebildeten Mikroblasen nachgewiesen. Wie in
Abb. 4.5 dargestellt, zeigte sich Mikroblasenbildung an Einzelmelanosomen bei 55 mJ/
cm² für 20 ns und 30 ps (523 nm) [8]. RPE-Schaden trat bei ebenfalls 55 mJ/cm² für 20 ns
und 50 mJ/cm² für 30 ps auf [8]. Ob eine Zerreißung der RPE-Zellmembran, oder andere

Kapitel 4: Mechanismen und Detektion selektiver RPE-Schädigung __________________ 25
Effekte wie eine Schädigung der Zellorganellen zum Zellschaden führt, konnte nicht
geklärt werden. Die Bildung von Schockwellen konnte nur bei ps-Laserpulsen und einer
vierfachen Bestrahlung der Mikroblasenbildungsschwelle nachgewiesen werden. Die
Arbeiten wurden mit Hilfe von fast-flash Photographie und transmittierter Lichtstreuung
durchgeführt.
Bereits Roider wies auf die mögliche Bildung von Mikroblasen bei der selektiven
Bestrahlung von Kaninchen mit 200 ns Nd:YAG-Laserpulsen hin [6]. Dabei wurde nur
die ophthalmoskopisch sichtbare Blasenbildung ab 250 mJ/cm² (532 nm, 200 ns,
500 Pulse 500 Hz) beschrieben, was schon zweifach über der Schwelle von 120 mJ/cm²
für ophthalmoskopische Sichtbarkeit und beinahe ein zehnfaches über der angiographischen
Schwelle von 30 mJ/cm² für diesen Parameter lag [7]. Diese “Makroblasen” mit
minimalen Durchmesser von 20 µm waren intraretinal lokalisiert und nicht transient, bleiben
also über einen längeren Zeitraum erhalten.
Abbildung 4.5 :Mikroblasenbildung um Melaningranula bei Bestrahlung mit 20 ns Laserpulsen;
A: Aufnahme vor Bestrahlung / B: 125ns nach Laserpuls mit
55mJ/cm² / C: 125ns nach Laserpuls mit 77 mJ/cm² / D: 125ns nach
Laserpuls mit 121 mJ/cm² ; Strich 10 µm, aus [8].
Im µs-Zeitbereich wurde in der Arbeit von Rögener gezeigt, dass die RPE-Schadensschwelle
von 140 mJ/cm² für Schweine-RPE für einzelne 1 µs Laserpulse unterhalb der
Schwelle von 285 mJ/cm² für Mikroblasenbildung um einzelne isolierte Melanosomen ist
[11,12]. Dieser Unterschied konnte aber durch die Wärmeleitung der nahe aneinander liegenden
Melanosomen im RPE während des Laserpulses erklärt werden. In der selben Versuchsreihe
mit ns-Laserpulsen, bei denen ein thermischer Einschluß der Melanosomen
vorliegt, ergaben sich gleiche Schwellen von 95 mJ/cm² für Zellschaden wie für Blasenbildung
an isolierten einzelnen Melanosomen. Ein direkter Beweis für einen thermomechanischen
Zellschaden durch Mikroblasen bei Bestrahlung von µs-Laserpulsen wurde
der Arbeit von Rögener [11] nicht erbracht.
Der Begriff der Kavitation wird klassisch zur Beschreibung kurzlebiger, durch Unterdruck
erzeugter Gasblasen verwendet [53]. Durch die Bestrahlungszeiten im µs-Bereich
und dem dadurch fehlenden akustischen Einschluß ist es nur möglich, Drücke im mbar-
Bereich zu erzeugen [12]. Eine Blasenentstehung durch Kavitation ist somit ausgeschlossen.
Deshalb wurde für die durch Verdampfung an der Melanosomenoberfläche entstehenden
Blasen der Begriff der Mikroblasen eingeführt, auch um sich von den mit
Kavitationsblasen assoziierten Effekten abzugrenzen [8].

26 _________________ Kapitel 4: Mechanismen und Detektion selektiver RPE-Schädigung
Im Folgenden werden nun zwei in dieser Arbeit eingesetzten Techniken zum nichtinvasiven
Nachweis einer mechanischen RPE-Schädigung vorgestellt. Den Schwerpunkt bildete
der optoakustische Nachweis der Mikroblasen. Der optisch basierte Reflexnachweis
wurde nur als zweite, von der Optoakustik physikalisch unabhängige Nachweismethode
bei in vitro Messungen und am Tiermodell eingesetzt.
4.2.1 Optoakustischer Nachweis von RPE-Schädigung
Verdampft an der Oberfläche eines Melanosoms durch die Laserbestrahlung das
umschließende Wasser, so wird eine Mikroblase anwachsen, solange der Druck im Innern
der Blase größer ist als der Umgebungsdruck. Die umgebende Flüßigkeit wird radial
beschleunigt, und es entsteht eine akustische Transiente. Dies ist analog zur Emission
akustischer Transienten bei der Entstehung von Kavitationsblasen [17]. Wenn keine
Druckdifferenz mehr vorliegt, schwingt die Blase aufgrund der Massenträgheit der
beschleunigten Flüßigkeit noch über. Sobald der Umgebungsdruck größer als der Blaseninnendruck
ist, wird das Aufschwingen verlangsamt und die Blase beginnt schließlich zu
kollabieren. Die beim Kollaps frei werdende kinetische Energie wird mit bis zu 70 % in
eine akustische Transiente umgesetzt [54]. Es sollte somit auch prinzipiell möglich sein,
die Entstehung von Mikroblasen mit optoakustischen Techniken zu verifizieren. Bei
gepulster Bestrahlung von absorbierendem Gewebe wird immer eine thermoelastische
Transiente gebildet. Kommt es zusätzlich zur Mikroblasenbildung, so überlagert sich die
thermoelastische Transiente mit der optoakustischen Transiente der Mikroblase
(Abb. 4.3). Eine Veränderung der Transiente sollte meßbar sein.
Wie in der Prinzipskizze Abb. 4.6 dargestellt, ist bei der Entstehung der optoakustischen
Schallwellen davon auszugehen, dass die von den Mikroblasen emittierten Schallwellen
jedes einzelnen Melanosoms nur als Superposition aller Schallwellen am Wandler gemessen
werden. Einerseits werden in den Experimenten bei den verwendeten Spotgrößen bis
zu 100 RPE-Zellen, also ca. 10.000 Melanosomen gleichzeitig bestrahlt, andererseits ist
der Schallwandlerabstand als auch die Wandlerausdehnung experimentell bedingt immer
zwei bis drei Größenordnungen größer ist als der Abstand der einzelnen Melanosomen.

Kapitel 4: Mechanismen und Detektion selektiver RPE-Schädigung __________________ 27
Schallwelle
Mikroblase
rein thermoelstische Transiente
4.2.2 Reflexbasierter Nachweis von RPE-Schädigung
thermoelstische und Blasentransiente
RPE Zellwand
Melanosomen
Abbildung 4.6 :Prinzipskizze der Schallentstehung bei Laserbestrahlung von Melanosomen
im RPE. Mit einem Schallwandler kann nur die Superposition aller Schallwellen
gemessen werden, da seine Detektionsfläche um das 1000-fache
größer ist als der Durchmesser des einzelnen Melanosoms.
Der Nachweis von Mikroblasen um Melaningranula während der Bestrahlung mit einem
Laser ist auch optisch möglich. So wurde von Kelly einerseits an einzelnen isolierten
Melanosomen Mikroblasen durch die Ablenkung eines Probelasers in Transmission
detektiert [8]. Damit konnte der zeitliche Verlauf der Mikroblasen gemessen werden.
Andererseits wurden Mikroblasen auch direkt bei Bestrahlung von Kälber-RPE-Zellen
mit Fast-Flash Fotografie nachgewiesen [8]. Damit konnte nur die Blasenverteilung und
-größe zum Zeitpunkt der Belichtung aufgenommen werden. Eine Aussage über die zeitliche
Dynamik der Blasen war nicht möglich.
Es ist auch möglich die Entstehung der Mikroblasen in Reflexion nachzuweisen [22, 23].
Dabei wird zusätzlich zu dem Bestrahlungslaser ein Probelaser eingekoppelt der vor dem
Bestrahlungspuls eingeschaltet, und mehrere µs nach dem Puls wieder ausgeschaltet wird.
Somit ist es möglich eine Änderung der Reflektivität der RPE-Probe durch die Entstehung
einer Grenzfläche der Mikroblasen um die Melaningranula nachzuweisen (Abb. 4.3). Mit
einem Aufbau für den reflexbasierten Nachweis von Mikroblasen, bei dem die hohe
numerische Apertur von 0.42 verwendet wurde, konnte in Schweine-RPE Proben für
12 ns Laserpulse (1 Puls, 532 nm) die gleiche Blasenbildungs- und RPE-Schadensschwelle
von 71 µJ/cm² gemessen werden [22]. Für längere 6 µs Einzelpulse lag die Blasenbildungsschwelle
mit 456 mJ/cm² 10 % über der Schadensschwelle von 412 mJ/cm² .
In den Experimenten gilt es, zwischen der konstanten diffusen Rückstreuung durch das
RPE und einer Rückstreuung mit transientenhalften Blasenrückstreuung zu unterscheiden
(Abb. 4.3).
Ein Überblick über die angiographischen, ophthalmoskopischen Schwellen im Tierversuch
und über Blasenbildungsschwellen, sowie mit Vitalitätsmarkern nachgewiesen RPE-
Schaden bei Laserbestrahlung ist in Tab. 1 gegeben.

28 _________________ Kapitel 4: Mechanismen und Detektion selektiver RPE-Schädigung
spot]µm]
ED 50 calcein
ED 50 bubble
ED 50 opht
ED 50 ang
Zitat
110
110
110
110
102
102
110
110
110
110
160
160
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
-
-
-
-
-
-
16mJ/cm²
21mJ/cm²
27mJ/cm²
59mJ/cm²
26mJ/cm² 105mJ/cm²
42mJ/cm² 110mJ/cm²
253W/cm² 421W/cm²
165W/cm² 358W/cm²
126W/cm² 284W/cm²
116W/cm² 210W/cm²
298mJ/cm²
348mJ/cm²
84mJ/cm²
131mJ/cm²
140mJ/cm²
223mJ/cm²
83mJ/cm²
99mJ/cm²
114mJ/cm²
83mJ/cm²
175mJ/cm²
260mJ/cm²
520mJ/cm²
210mJ/cm²
210mJ/cm²
360mJ/cm²
520mJ/cm²
55mJ/cm²
55mJ/cm²
25mJ/cm²
26mJ/cm²
55mJ/cm²
50mJ/cm²
Probe Wellenlänge [nm] Pulslänge [s] PulszahlPulswiederholrate
[Hz]
[2] Kaninchen in vivo 514 5µ 500 500
[2] Kaninchen in vivo 514 5µ 100 500
[2] Kaninchen in vivo 514 5µ 25
500
[2] Kaninchen in vivo 514 5µ 1
500
[2] Kaninchen in vivo 532 200n 500 500
[2] Kaninchen in vivo 532 200n 10
500
[2] Kaninchen in vivo 514 50m 1
-
[2] Kaninchen in vivo 514 100m 1
-
[2] Kaninchen in vivo 514 500m 1
-
[2] Kaninchen in vivo 514
1 1
-
[3] Mensch
527 1.7µ 500 500
[3] Mensch
527 1.7µ 100 500
[11] Schweine-RPE in virto 532 8n 1
-
[11] Schweine-RPE in virto 527 200n 1
-
[11] Schweine-RPE in virto 527 1µ 1
-
[11] Schweine-RPE in virto 527 3µ 1
-
[11] Schweine-RPE in virto 527 200n 500 500
[11] Schweine-RPE in virto 527 1µ 500 500
[11] Schweine-RPE in virto 527 3µ 500 500
[11] Schweinemelanosomen 532 8n 1
-
[11] Schweinemelanosomen 527 200n 1
-
[11] Schweinemelanosomen 527 1µ 1
-
[11] Schweinemelanosomen 527 3µ 1
-
[11] humane Melanosomen 527 8n 1
-
[11] humane Melanosomen 527 8n 1
-
[11] humane Melanosomen 527 200n 1
-
[11] humane Melanosomen 527 1µ 1
-
[8] Rindermelanosomen 532 20n 1
-
[8] Rindermelanosomen 532 30p 1
-
[8] Graphit
532 20n 1
-
[8] Graphit
532 30p 1
-
[8] Schweien-RPE 532 20n 1
-
[8] Schweine-RPE 532 30p 1
-
Tabelle 1: Überblick über die angiographischen, ophthalmoskopischen Schwellen im Tierversuch
und über Blasenbildungsschwellen, sowie mit Vitalitätsmarkern nachgewiesen
RPE-Schaden bei Laserbestrahlung.

Kapitel 5: Material und Methoden _____________________________________________ 29
5 Material und Methoden
5.1 Laser
Im Rahmen dieser Arbeit wurden vier verschiedene Laser verwendet. Dieser Abschnitt
soll eine zusammenfassende Charakterisierung der Systeme geben. In der jeweiligen Verwendung
bei verschiedenen Aufbauten werden sie nur noch als geschlossenes System
dargestellt.
Die Bestimmung der maximalen Bestrahlung ist bei den Experimenten von großer Bedeutung.
So wurde auch für die verschiedenen Lasertypen die Speklebildung nach einer fasergeführten
Abbildung gemessen. Mit Hilfe dieser Werte können die gemessenen mittleren
Bestrahlungen in die maximale Bestrahlung umgerechnet werden.
5.1.1 Frequenzverdoppelter Nd:YLF-Laser
Ein bogenlampengepumpter, intrakavitär frequenzverdoppelter Nd:YLF-Laser (Quantronix
Inc., model 527DP-H) wurde mit einer aktiven Pulsverlängerung erweitert (Abb. 5.1)
[58]. Dies erlaubt eine Variation der Pulslänge von 200 ns bis zu 5 µs (Abb. 5.2). Um den
im “normalen” Q-switch Mode emittierten 250 ns Laserpuls zu verlängern, wird während
der Pulsemission die Güte des Laserresonators verändert. Dies erreicht man durch eine
dynamische Änderung der Pockels-Zellenspannung [59]. Wenn die Verluste des Resonators
gleich der Verstärkung des Laserstrahls durch das Lasermedium sind, so wird ein Puls
konstanter Leistung emittiert, solange eine Inversion des Lasermediums gegeben ist. Die
am Medizinischen Laserzentrum entwickelte elektronische Rückkopplung der Pockelszelle
wird einerseits mit einer einstellbaren Hochspannungsrampe und einer dynamischen
Steuerung über eine schnelle Photodiode mit nachfolgender schneller Verstärkung in den
Hochspannungsbereich betrieben. Die Photodiode erlaubt es während der Emission des
Laserpulses einzelne Pulsfluktuationen, die gerade am Ende des Laserpulses auftreten
auszugleichen. Durch die aktive Rückkopplung sind die Schwankungen der Pulsenergie
bei aktiver Verlängerung gering. Sie schwankt um 8 % vom Minimum zu Maximum
(Peak to Peak).

30 ____________________________________________ Kapitel 5: Material und Methoden
Abbildung 5.1 :Skizze des Nd:YLF Lasers und der Behandlungssteuerung.
A B C
Abbildung 5.2 :Typische Pulsformen des Nd:YLF Lasers und der entsprechenden Pulsenergie
bei 500 Hz Wiederholrate und 25A Lampenstrom; A: 250 ns, B: 1.7 µs,
C: 4.5 µs.
Die Frequenzverdopplung wird mit einem LBO-Kristall umgesetzt. Dabei wird die Phasenanpassung
zur Frequenzverdoppelung über die LBO-Kristalltemperatur eingestellt.
Da durch die Variation der Temperatur eine Änderung der Verdopplungseffizienz gegeben
ist, kann darüber die unverlängerte Pulsdauer im Bereich 200 ns bis 1 µs (bei 20A Lampenstrom)
eingestellt werden. Eine typische Messung ist in Abb. 5.3 dargestellt. Die Pulslänge
reduziert sich wenn man den Laser bei höheren Strömen betreibt (Abb. 5.4).

Kapitel 5: Material und Methoden _____________________________________________ 31
Pulsdauer [ns]
Pulsenergie [µJ]
1000
100
10
1
Nd:YLF mit 20 mm LBO
20A, 100Hz
100
157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168
157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168
Temperatur [°C]
Abbildung 5.3 :Pulsdauern (HWFM) und Pulsenergien in Abhängigkeit der LBO-Kristalltemperatur
bei 20A und 100 Hz Wiederholrate.
Pulslänge [ns]
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
Pulsenergie
Pulslänge
16 18 20 22 24 26 28
Lampenstrom [A]
Abbildung 5.4 :Pulsdauern (HWFM) und Pulsenergien in Abhängigkeit des Lampenstroms
bei 164.4 °C LBO-Kristalltemperatur und 100 Hz Wiederholrate.
Der Laser kann sowohl für Einzelpulse als auch bei konstanten Pulswiederholraten bis
10 kHz betrieben werden. Die Anzahl der gewünschten Laserpulse wird über die Öffnungszeiten
der externen Lasershutter gesteuert. Durch Rotation eines λ/2 Plättchens mit
anschließendem Polarisationswürfel als Analysator kann die Pulsenergie beliebig eingestellt
und mit einer kalibrierten Photodiode vor dem Lasershutter gemessen werden. Die
Lasershutter und das λ/2 Plättchen können vom räumlich getrennten Behandlungsraum
aus durch den behandelnden Arzt angesteuert werden (Abb. 5.1).
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
Pulsenergie [µJ]

32 ____________________________________________ Kapitel 5: Material und Methoden
5.1.2 Frequenzverdoppelter klinischer Nd:YAG-Laser
Bei Behandlungen in der Augenklinik Regensburg kam ein longitudinal diodengepumpter,
frequenzverdoppelter Nd:YAG-Laser der Fa. Carl Zeiss Jena zum Einsatz [60]. Die
Laserparameter des klinischen Nd:YAG-Prototypen sind 800 ns FWHM Pulsdauer,
500 Hz Laserwiederholrate und bis 200 µJ Pulsenergie. Der Nd:YAG-Laser wird durch
Diodenlaser cw gepumpt. Die Anzahl der applizierten Pulse kann zwischen 25 und 100
eingestellt werden. Das Prinzip der Pulsverlängerung ist ähnlich dem des Nd:YLF Lasers
(Kap. 5.1.1). Wenn die Verluste des Resonators gleich der Verstärkung des Laserstrahls
durch das Lasermedium sind, so wird ein Puls konstanter Leistung emittiert, solange eine
Inversion des Lasermediums gegeben ist. Die transiente Änderung der Resonatorgüte
wird durch den akusto-optischen Modulator (AOM) realisiert [60].
Abbildung 5.5 :Prinzipskizze des klinischen Zeiss Nd:YAG-Laser, nach [60].
5.1.3 Frequenzverdoppelter experimenteller Nd:YAG-Laser
Zur Erzeugung von Laserpulsen im ns-Bereich wurde ein gütegeschalteter, frequenzverdoppelter
Nd:YAG der Firma MBB Medizintechnik verwendet. Der blitzlampengepumpte
Laser hat 75 cm Resonatorlänge und wird mit einer Pockelszelle geschaltet. Der
Laser kann mit maximal 20 Hz Wiederholrate betrieben werden. Der emittierte 8 ns
Laserpuls der Grundwellenlänge wird extern mit einem KTP-Kristall frequenzverdoppelt
und anschließend mit einem Quarzprismenensemble durch die Dispersion in 1064 nm und
532 nm getrennt (Abb. 5.6). Die Effizienz der Frequenzverdoppelung liegt bei 15 % der
eingestrahlten Laserenergie. Die Pulsschwankungen liegen bei 20 % Paek-to-Peak. Bei
532 nm werden bis zu 1.5 mJ emittiert. Über einen dichroitischer Strahlteiler wird ein
Ziellaser (633 nm, 0.5 mW) mit in dem Nd:YAG-Laser zusammengeführt und über eine
Linse in eine Glasfaser (Ceram Optec, UV50/125P, 50 µm Kern, NA 0.2, 50 m) eingekoppelt.

Kapitel 5: Material und Methoden _____________________________________________ 33
Abbildung 5.6 :Prinipskizze des experimentellen Nd:YAG-Laser Aufbaus.
5.1.4 Argon-Laser
Der Argon-Laser der Firma Spectra Physics (model 2030-15s) kann mit einem Dispersionsprisma
innerhalb des Resonators auf die Wellenlänge 514,5 nm festgelegt werden. Bei
dieser Wellenlänge emittiert er 7 Watt linear polarisiert und annähernd TEM 00. Mit einem
AOM (OEM-Produkt ohne Kennung) werden aus dem kontinuierlichen Laserstrahl Pulse
herausgeschnitten. Die erste Ordnung des AOM wird nach einer Blende mit einer Linse
in eine Faser (Coherent, 50 µm, NA 0.1, 2 m) eingekoppelt (Abb. 5.7). Zur zeitlichen Verringerung
des Streulichtanteils des AOM von 0.01 % in der ersten Ordnung ist vor dem
AOM ein Shutter eingebaut, dessen minimale Öffnungszeit bei 20ms liegt. Der AOM
schaltet seinen Puls 20 µs nach Öffnen des Shutters durch. Somit kann eine Erwärmung
des Bestrahlungsareals durch Streulicht zeitlich auf 20 ms minimiert werden.
Es lassen sich Pulsdauern von 5 µs bis cw-Bestrahlung realisieren. Die Schaltzeit des
AOM beträgt 40 ns. Es kommt bei Bestrahlungszeiten >100 ms zu Leistungsschwankungen.
Aufgrund der langen Schallwandlerbeanspruchung bildet sich eine thermische Linse
im AOM-Kristall mit einer damit einhergehenden Drift des Laserspots bei der Fasereinkopplung
aus. Die maximale Transmission des gesamten Aufbaus lag bei 15 % .

34 ____________________________________________ Kapitel 5: Material und Methoden
0. Ordnung
Strahlfalle
Blende
AOM
Shutter
1. Ordung
Abbildung 5.7 :Argon-Laser mit AOM. Es können Pulsdauern von 5 µs bis 100 ms realisiert
werden.
5.1.5 Spekle-Werte bei verschiedenen Lasersystemen
Bei der Lichtleitung durch Multimode-Fasern kommt es durch die Weglängendifferenz
der verschiedenen Moden bei Einkopplung kohärenter Strahlung zu Interferenz
(Abb. 5.8). Um ein möglichst homogenes Intensitätsprofil am Faserende zu erhalten, muß
der Weglängenunterschied ∆L
der miteinander interferierenden Moden über der Kohärenzlänge
des Lasers liegen. Der maximale Weglängenunterschied kann durch
∆L
abgeschätzt werden, wobei L der Faserlänge entspricht. Für den Winkel der Totalreflexion
β gilt das Brechungsgesetz:
NA = numerische Apertur der Faser
n = Brechungsindex des Faserkernmaterials
NA
β
Argon Laser
AOM-Treiber
L
= ---------------- – L
cos(
β)
sin( β)
=
NA
-------n
Abbildung 5.8 :Weglängenunterschied bei einer Multimodefaser.
L
Kern
L(NA)
Cladding
(1)
(2)

Kapitel 5: Material und Methoden _____________________________________________ 35
Die Intensitätsmuster am Faserende mit statistisch verteilten Phasen bezeichnet man als
Spekle. Der Kontrast K und der Speklefaktor F des Speklefeldes ist definiert als [61]:
H max
H min
H mean
= maximale Bestrahlung im Speklefeld
= minimale Bestrahlung im Speklefeld
= mittlere Bestrahlung im Speklefeld
Mit Hilfe der Speklefaktoren lassen sich die gemessenen ED50 Werte, also die mittlere
Bestrahlungen Hmean bei denen mit 50 % Wahrscheinlichkeit das Schwellenkriterium
erfüllt ist, auf ihre maximale Bestrahlung Hmax korrigieren. Dies ist für einen genauen
Vergleich der Schwellenwerte, und für eine grundlegende Diskussion der Werte miteinander
notwendig. Die korrigierte maximale Bestrahlung Hmax errechnet sich aus Gl. (4)
durch:
Für die in den verschiedenen Aufbauten dieser Arbeit verwendeten Lasersysteme wurden
der Speklekontrast und der Speklefaktor bestimmt. Dazu wurde das durch die Spaltlampe
erzeugte Abbild des Faserendes über ein Mikroskopobjektiv auf eine CCD-Kamera vergrößert.
Es wurde darauf geachtet, dass die CCD ihre Intensitätsauflösung von 8 bit ausschöpft
aber nicht übersteuert wird. Auch war die Größe der Speklegranula größer als die
CCD-Einzelelemente. Die Laser wurden mit ihren Arbeitsleistungen betrieben. Das Speklefeld
wurde mit einem Laser Beam Analyzer (Spiricon Inc.) gespeichert. Die maximale,
minimale und die mittlere Bestrahlung wurden mit der Spiricon-LBA-300PC Software
(Spiricon Inc.) bestimmt. Für alle Parameter wurde über 25 Messungen gemittelt.
5.2 Optoakustik
K
Hmax – Hmin = ------------------------------
Hmax + Hmin F
H max
=
H max
--------------
H mean
=
HmeanF In diesem Abschnitt sollen die Detektion und die grundlegenden Möglichkeiten der Optoakustik
und deren Anwendung am Auge geklärt werden. Die theoretische Herleitung der
thermoelastischen Druckentstehung aus Grundlagen der Akustik, der Hydrodynamik, der
Elastizitäts- und der Thermodynamik wird ausführlich in Anhang A: “Thermoelastische
Druckentstehung” dargestellt. Die dort abgeleiteten Ergebnisse werden im folgenden
Kapitel verwendet.
(3)
(4)
(5)

36 ____________________________________________ Kapitel 5: Material und Methoden
5.2.1 Piezoelektrischer Effekt
Zur Detektion von Drucktransienten wird in den meisten Wandlern der piezoelektrische
Effekt ausgenützt. Eine Asymmetrie im Kristallaufbau führt dazu, dass bei einer elastischen
Deformation des Kristalls positiv geladene Ionen derart gegenüber den negativ
Geladenen verschoben werden, dass ein elektrisches Dipolmoment entsteht. Verschiedene
wichtige Piezomaterialien sind polykristallin. Das bedeutet, dass sie oberhalb einer
bestimmten Temperatur, der Curie-Temperatur (bei PTZ 328 °C [62]), ein hohes Maß an
Symmetrie aufweisen. Bei Unterschreiten der Curie-Temperatur verzerrt sich das Kristallgitter
spontan und es bilden sich Domänen dielektrisch gleichsinniger Polarisation.
Die wichtigsten Werkstoffe sind dabei Bariumtitanat (BaTiO 2) und Bleizirkonattitanat
(PbNb 2O 6, oder auch PZT genannt). Allerdings lassen sich diese Stoffe nicht in Form von
Einkristallen, sondern nur als Pulver herstellen. Es werden aus ihnen piezoelektrische
Keramiken hergestellt, deren Form dem Verwendungszweck angepaßt werden kann. Da
die einzelnen Kristalle in so einem Verbund regellos polarisiert sind, hebt sich deren Piezoelektrizität
nach außen hin auf. Der Wandler entsteht durch einen zusätzlichen Polarisationsvorgang.
Dabei wird die Keramik über die Curie-Temperatur erwärmt, und unter
Anlegung eines äußeren elektrischen Feldes von der Größenordnung mehrerer 10 kV/cm
allmählich abgekühlt. Durch das äußere Feld werden die elektrischen Momente ausgerichtet.
Unterhalb der Curie-Temperatur bleibt dieser Zustand erhalten.
Die Eigenschaften dieser anisotropen, piezoelektrischen Materialien werden durch verschiedene
polarisations- und deformationsabhängige Parameter beschrieben. Es wird
konventionsgemäß das in Abb. 5.9 angegebene Koordinatensystem verwendet.
Piezokeramik
Elektroden
1
Deformationsrichtung
Abbildung 5.9 :Definition von Polarisation und Deformationsrichtung einer piezoelektrischen
Ringkeramik
Die Materialkonstante, die den Zusammenhang zwischen der senkrecht zur Oberfläche
wirkenden Druck pzt ( , ) und erzeugter elektrischer Flußdichte φz ( , t)
bei den hier vorliegenden
Geometrie beschreibt, ist die piezoelektrische Konstante g33 [63]:
φ( z, t)
= g33
⋅
pzt ( , )
3
Polarisation
h 2
(6)

Kapitel 5: Material und Methoden _____________________________________________ 37
Die durch diese Flußdichte auf den Elektrodenoberflächen induzierte Ladung qt () ergibt
sich durch eine Mittelung des Drucks über die Höhe h des Wandlers sowie über eine Multiplikation
mit der Wandlerfläche AWandler zu [64]:
qt () = g33
⋅ AWandler ⋅ ( 1 ⁄ h)
⋅ pzt ( , ) dz = g33 ⋅AWandler ⋅ pt ()
Die Ladung ist somit dem auf den Wandler wirkenden räumlich gemittelten Druck proportional.
5.2.2 Schallwandler in vitro (PIN-Transducer)
h
�
0
Die optoakustischen Messungen bei den in vitro Experimenten wurden mit einem
PIN-Transducer der Firma Valpey-Fisher (VP-1093, 0 - 10 MHz) durchgeführt. Der Piezokristall
hat einen Durchmesser von 1.3 mm, der gesamte Wandler 2.4 mm. Auf der Vorderseite
des Piezokristalls ist eine akustische Anpassunggsschicht gegenüber Wasser
aufgeklebt (Abb. 5.10). Durch die für einen Schallwandler kleinen Abmessungen kann er
bei den Versuchen bis auf wenige Millimeter an die bestrahlte Probe herangeführt werden.
Durch die kleinen Bestrahlungsareale die hier als Schallquelle fungieren befindet man
sich aber auch bei diesen Abständen immer im akustischen Fernfeld. Der Druck p(r) fällt
mit dem Abstand r nach
pr ()
=
1
-- ⋅ p0 ( )
r
ab [65]. Aufgrund des geringen Abstandes können sehr empfindlich Druckamplituden
gemessen werden.
Goldbedampfung
Piezzokristall
λ/4 Anpassung Backing
Kontakt
seitliches Backing
Edelstahlrohr
Abbildung 5.10 :Prinzipieller Aufbau und Bild des PIN-Transducer von Valpey-Fisher.
(7)
(8)

38 ____________________________________________ Kapitel 5: Material und Methoden
5.2.3 Schallwandler in vivo (OA-Kontaktglas)
Um während der Behandlungen am Menschen optoakustischen Signale zu detektieren,
wurde ein in ein Kontaktglas (Haag-Streit, 903L) eingebetteter piezoelektrischer Ringwandler
entwickelt (Abb. 5.11,5.12). Da das Kontaktglas mit einem optischen Kontaktgel
(Novartis, Methocel 2 %) direkt auf dem Auge aufgesetzt wird, ist ein guter
akustischer Kontakt an das Auge sichergestellt. Die Verwendung einer Ringgeometrie
erlaubt relativ große Wandlerflächen bei gleichzeitig uneingeschränktem Blickfeld durch
das Kontaktglas. Der Ringwandlerkristall hat die Resonanzfrequenz 1MHz (Innendurchm.
16 mm, Außendurchm. 20 mm). Die aktiven Kristallflächen sind beidseitig mit
Aluminium als elektrischer Leiter bedampft.
piezoelektrischer
Ringwandler
Kontaktglas
Haag-Streit
laser-lens 903L
Abbildung 5.11 :Aufbau des OA-Kontaktglases: Der Ringwandler wird in das Kontaktglas
eingebettet.
Abbildung 5.12 :Bild des OA-Kontaktglases (Haag-Streit, 903L) in verschiedenen Ansichten.
Der Kontaktbereich mit dem Patientenauge bleibt bei der Erweiterung
unverändert.

Kapitel 5: Material und Methoden _____________________________________________ 39
5.2.4 Kalibrierung der Schallwandler
Das OA-Kontaktglas und der ebenfalls verwendete PIN-Transducer (Valpey-Fisher,
VP 1093) wurden mit einem kalibrierten Hydrophon (Ceram, Modell No. 118,
15 mV/bar) abgeglichen. Das Hydrophon weist den Kalibrierungsdaten zufolge einen
konstanten Frequenzgang von 50 kHz bis 50 MHz auf. Zur Erzeugung der Schallwellen
wurde schwarz eloxiertes Aluminium mit 150 ns Nd:YLF Laserpulsen (20 - 100 µJ), die
über eine Spaltlampe appliziert wurden, in einem Wasserbad bestrahlt. Die Wandler wurden
zur Schallquelle ideal ausgerichtet. Das kalibrierte Hydrophon wurde mit dem Vorverstärker
(Panametrics, Model 5663, 54 dB), die beiden anderen Wandler mit dem
Vorverstärker (Panametrics, Model 5676, 40 dB) verstärkt. Die Schallsignale wurden und
mit einem Oszilloskop (Tek, TDS 224) aufgenommen und auf einen PC zu weiteren Auswertung
übertragen. Der Aufbau ist in Abb. 5.13 dargestellt.
Absorber
Hydrophon
Valpey Fisher VP-1093
Hydrophon
Ceram No.118
Wasserbad
OA- Kontaktglas
Abbildung 5.13 :Versuchsaufbau zur Schallwandlerkalibrierung.
Vorverstärker
Panametrics 5663
Vorverstärker
Panametrics 5676
Vorverstärker
Panametrics 5676
Oszilloskop
Tek TDS 224
Spaltlampe
Da das Frequenzmaximum der generierten Schallwellen (Abb. 6.2) bei 0.5 MHz lag, ist
eine lineare Schallausbreitung gegeben [65]. Die Verringerung der Druckamplitude über
den Abstand r ist durch Gl. (8) gegeben. Die Abstände r der Schallwandler zur Schallquelle
wurden durch die Schallaufzeiten bestimmt. Mit Hilfe der Gleichung (8) kann die
absolute Durckamplitude errechnet werden.
5.2.5 Schallfeldsimulationen zur Empfangscharakteristik des OA-Kontaktglases
Trifft die zu detektierende Drucktransiente in schrägem Einfall auf den Ringwandler, so
kommt es in dem Wandler zu jedem Zeitpunkt zu einer Integration über unterschiedliche
Phasenflächen der einzelnen Frequenzkomponenten [66]. Dies hat den Effekt einer Mittelung,
wodurch es zu einer Verzerrung des zu detektierenden optoakustischen Signals
kommt. Dieser Effekt tritt bei der Verwendung des OA-Kontaktglases bei Patientenbehandlung
auf, da der behandelnde Arzt das Glas nach seinen Anforderungen ausrichtet.

40 ____________________________________________ Kapitel 5: Material und Methoden
Einerseits verkippt er das Glas um sich selbst mit dem an der Kontaktglasoberfläche
reflektiertem Licht des Beleuchtungsspaltes nicht zu blenden, andererseits werden auch
verschiedene Areale des Augenhintergrundes bestrahlt. Eine zusätzliche akustische Ausrichtung
auf die ausgezeichnete Mittelachse des Kontaktglases ist unpraktikabel.
Es wurde mit einer numerischen Simulation untersucht, in wieweit sich die Verkippung
des Kontaktglases oder eine Änderung der Bestrahlungssituation wie in Abbildung 5.14
auf die Signalform auswirkt.
Abbildung 5.14 :Mögliche Entstehungsorte der optoakustischen Transiente. Durch die
Laufzeitunterschiede auf dem Ringwandler kommt es zur Signalverzerrung.
Eine besonders einfache Art einer Schallquelle ist die Punktschallquelle. Diese führt zur
Abstrahlung einer Kugelwelle. Zur Bestimmung von Schallfeldern stehen prinzipiell zwei
Möglichkeiten zur Verfügung. Einerseits die Lösung des Greenschen Integrals durch Integration
über die Schallabstrahlungsfläche [67]:
un( rt , )
c
r
= Geschwindigkeitspotential,
= Schallgeschwindigkeit,
= Aufpunkt.
prt ( , )
=
��
S
∂un ρ ( r0, t– r⁄ c)
∂t
---------------------------------------- dS
2πr
, (9)

Kapitel 5: Material und Methoden _____________________________________________ 41
oder andererseits die Summation nach dem Hygenschen Prinzip. Dabei wird die Schallabstrahlungsfläche,
in unserem Fall die bestrahlte Fläche im Auge, in mehrere Punktwandler
unterteilt die Kugelwellen aussenden. Es muß darauf geachtet werden, dass der
Abstand der einzelnen Punktwandler auf der Wandlerfläche klein gegenüber der abzustrahlenden
Wellenlänge ist.
Am Aufpunkt der Schallfeldbestimmung werden dann die Amplitude und Phase der Einzelwandler
numerisch addiert. Mit dem Computer ist sowohl die numerische Integration
der Gleichung (9)[68], als auch die Parametrisierung der Wandlerfläche in viele Punktwandler
mit anschließender Summation möglich [69].
Die Simulationen wurden mit dem Softwarepaket ULTRASIM durchgeführt. Es ist ein
GUI-Projekt der Universität Oslo zur Simulation von Schallfeldern medizinischer Ultraschallwandler
[70]. Es basiert auf dem Programm MATLAB [72] und wurde in Unterroutinen
mit Bedienoberfläche umgesetzt. Es simuliert nach dem Hygenschen Prinzip die
Schallabstrahlung beliebiger Schall abstrahlender Flächen.
5.3 Organmodell Schweine-RPE
Die in vitro Experimente wurden an Schweine RPE-Präparaten durchgeführt: Die
Schweineaugen wurden vom Schlachthof der Norddeutschen Fleischzentrale Lübeck
(NFZ) zur Verfügung gestellt. Die vorwiegende Rasse war “Deutsche Pig” die beim
Schlachten in etwa 24 Monate alt war. Die Tiere werden mit CO 2 narkotisiert und per Bolzenschuß
getötet. Die Augen werden direkt nach dem Schlachten vom Personal des
Schlachthofes entnommen und in feuchter Umgebung zum Transport gelagert. Innerhalb
von 4 Stunden wurden die Experimente mit Präparation, Bestrahlung und Färbung abgeschlossen.
Da die RPE-Pigmentierung der Mastschweine teilweise sehr gering war, bis
hin zu Albinismus, wurden für die Experimente ausschließlich stark pigmentierte Schweineaugen
verwendet. Diese zeigten bei Beleuchtung des Auges von hinten kein, oder nur
wenig Lichttransmission durch die Pupille.
5.3.1 Probenpräparation
Für die Präparation werden die Augen äquatorial eröffnet und der Glaskörper entfernt.
Aus dem hinteren Augensegment wird ein etwa 1 cm² großes Präparat ausgeschnitten.
Die Netzhaut kann leicht abgezogen werden, so dass das Präparat nur noch aus RPE,
Bruchscher Membran und Chorioidea auf der Sklera besteht. Die Präparate werden in
einen Probenhalter gelegt, mit PBS (Phosphate Buffered Solution) benetzt und mit einem
verschraubbaren Deckel gesichert (Abb. 5.15). Um eine Lichttransmission in optischer
Qualität zu erreichen und um das Präparat vor dem austrocknen zu sichern wird das Probenvolumen
mit einem Deckglas, welches durch Adhäsion selbst haftet, verschlossen.

42 ____________________________________________ Kapitel 5: Material und Methoden
5.3.2 Vitalitätsassay CalceinAM
CalceinAM
Metallring Deckglas
Deckel
Probe
Petrischale Schrauben
Abbildung 5.15 :Probenhalter mit Präparat. Der Metallring dichtet den Probenraum ab
und begrenzt das Probenvolumen (aus [73]).
Zum Nachweis des RPE-Zelltodes wird der Farbstoff CalceinAM verwendet [74]. Er
besteht aus einer mit Calcein veresterten Acetoxymethylgruppe (AM) (Abb. 5.16).
Abbildung 5.16 :Strukturformel von CalceinAM, (aus [74]).
CalceinAM fluoresziert nicht und ist unpolar. Es kann aufgrund dieser Unpolarität gut in
die Zellen des RPE diffundieren und wird dort durch Enzyme aus der Gruppe der Esterasen
in Calcein umgesetzt. Calcein ist ein Derivat von Fluoreszein und stellt den eigentlichen
Fluoreszenzmarker dar. Calcein ist im Milieu der Zellen 4-fach negativ geladen. Als
polares Molekül verliert es die Fähigkeit, die Zellmembran zu passieren. Calcein wird nur
in Zellen gebildet die durch Esterasen die Acetoxymethyl-Gruppe (AM) von CalzeinAM
abspalten können. CalzeinAM weist also sowohl Enzymaktivität der Esterasen nach, die
notwendig ist, um die Fluoreszenz zu aktivieren, als auch die Integrität der Membran, die
notwendig ist damit sich der Farbstoff akkumuliert. In einem Zeitraum von 30 Minuten
ist genügend Calcein in vitalen Zellen akkumuliert, um vitale und abgetötete Zellen durch
Fluoreszenz voneinander unterscheiden zu können. Bei der Auswertung der Fluoreszenz
erscheinen lebende Zellen fluoreszierend, tote Zellen dunkel (Abb. 5.17). Calcein besitzt
ein Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von 490 nm und hat eine maximale Fluoreszenz
bei 520 nm (Abb. 5.18).

Kapitel 5: Material und Methoden _____________________________________________ 43
Abbildung 5.17 :Mit CalceinAM angefärbte RPE-Probe mit geschädigten Zellen im
Bestrahlungsareal.
Absorption [a.u.]
100
80
60
40
20
Absorption
Emission
0
0
400 450 500 550 600
Wellenlänge [nm]
Abbildung 5.18 :Absorptions- und Emissionsspektrum von Calcein; aus [74].
Wird das CalceinAM vor der Bestrahlung aufgetragen, wird lediglich eine Beschädigung
der Zellmembran nachgewiesen. Das in der Zelle akkumulierte Calcein strömt nach der
Zerstörung der Zellmembran durch die Bestrahlung in den interzellulären Raum und die
Zellen erscheinen unter dem Fluoreszenzmikroskop dunkel. Ist die Zellmembran durch
die Bestrahlung nicht geschädigt worden, verbleibt das akkumulierte, fluoreszierende
Calcein aufgrund seiner Polarität in den Zellen. Der Nachweis einer Schädigung des
Stoffwechselhaushaltes der Zelle kann so nicht erbracht werden. Die Folge hieraus kann
sein, dass Zellen, die zwar tot sind, aber noch eine intakte Zellmembran besitzen, nicht als
tot erkannt werden.
Darum wurden die RPE-Proben erst nach der Bestrahlung mit CalceinAM inkubiert.
Dann erscheinen alle geschädigten Zellen dunkel, unabhängig davon, ob der Zelltod
durch eine Beschädigung der Zellmembran oder fehlende Esterasen hervorgerufen wurde.
100
80
60
40
20
Fluoreszenzintensität [a.u.]

44 ____________________________________________ Kapitel 5: Material und Methoden
Die Auswertung der inkubierten RPE-Präparate erfolgte mit einem Fluoreszenzmikroskop
(Aristoplan, Leitz) über den Filterblock I3 der Firma Leitz. Es konnten die Präparate
nur betrachtet, und mit einer Slow-Scan-Kamera (Scientific Instruments) aufgenommen
werden.
5.4 Fluoreszenzbasierte On-line Dosimetrie
5.4.1 Thermische Denaturierungsmessung an A2E
Eines der Fluorophore des Lipofuszin wurde als A2E identifiziert. Es ist ein Pyridium
bis-retenoid das durch eine Schiff-Basen Reaktion entsteht [37]. Da es ein Hauptbestandteil
des Lipofuszin ist und synthetisch hergestellt werden kann, wurde untersucht ob sich
dieser Teil des Lipofuszin thermisch denaturieren läßt. Für diese Untersuchungen wurde
A2E freundlicherweise von PD Dr. Holz (Augenklinik Heidelberg) für Messungen zur
Verfügung gestellt. A2E wird durch die Anbindung von all-trans-retinal und Ethanolamin
im Verhältnis 2:1 gebildet [37]. Danach wird es durch Vakuum konzentriert und mit einer
sequentielle Dünnschicht-Chromatographie aufgereinigt [34]. Das in Methanol gelöste
A2E (1.22 mM) wurde in DMSO auf 1 µM verdünnt. Eine weitere Verdünnung in Methanol
hätte nur Temperaturen bis zum Verdampfungspunkt von 64 °C zugelassen. Der Verdampfungspunkt
von DMSO liegt bei 189 °C. Somit konnten auch Versuche bei höheren
Temperaturen gemacht werden.
Die Messungen wurden mit einem Fluoreszenzspektrometer SPEX 2 (Jobin Yvon Instruments)
durchgeführt. In der Probenkammer wurde ein temperierbarer Küvettenhalter eingesetzt.
Damit ließen sich Temperaturen im Bereich 2 °C bis 80 °C realisieren. Die
Probentemperatur wurde mit einem Thermoelement Typ J in der Küvette gemessen und
der zeitliche Verlauf mit einem PC aufgenommen. Die Probentemperatur konnte auf
0.01 °C Genauigkeit gemessen werden. Während der Messungen wurde die Probe laufend
mit einem Mikrorührer umgewälzt.
5.4.2 On-line Fluoreszenzdetektion an der Spaltlampe
Die zur Bestrahlung verwendete Wellenlänge des Nd:YLF-Laser von 527 nm liegt im
Fluoreszenzanregungsmaximum des Augenhintergrundes (Abb. 2.4). Das ermöglicht,
den Bestrahlungslaserpuls bereits als Exzitationspuls zur Fluoreszenzdetektion zu nützen.
Während des Bestrahlungspulses wird eine Pulsleistung von ca. 60 W, was bei dem verwendeten
Spotdurchmesser 246 kW/cm² entspricht, für 1,7 µs eingestrahlt. Das sind 6
Größenordnungen mehr, als für eine diagnostische cw-Fluoreszenzanregung üblich ist.
Das Faserende der Spaltlampenfaser mit den Kerndurchmesser von 160 µm wird mit der
Spaltlampe 1:1 auf den Augenhintergrund abgebildet. Das Fluoreszenzlicht der
RPE-Probe, das in den Laserstrahlengang der Spaltlampe (NA = 0.1) zurückfällt wird

Kapitel 5: Material und Methoden _____________________________________________ 45
durch einen dichroitischen Strahlteiler ausgekoppelt. Der Strahlteiler wurde so dimensioniert,
dass das Fluoreszenzlicht zu nahezu 100 % von 570 nm bis 750 nm ausgekoppelt,
das Laserlicht zu 80 % transmittiert wird (Abb. 5.19).
Transmission [%]
100
80
60
40
20
0
527nm
500 600 700 800 900
Wellenlänge [nm]
Abbildung 5.19 :Transmissionsspektrum der dichroitischen Strahlteilers zur AF-Detektion.
Der Strahlteiler ist in einem Zusatzmodul, das zwischen dem Pankrat (Faserauskopplung)
und Spaltlampe eingesetzt werden kann, untergebracht (Abb. 5.20). Über eine Linse
(f = 25) und einen Farbglasfilter (Schott, KV550) wird das Fluoreszenzlicht in eine Glasfaser
(600 µm, NA 0.22) eingekoppelt und auf einen Photomultiplier (Heidelberg Instruments/Hamamatsu,
Typ R1463) geführt. Mit dem Farbglasfilter direkt vor der
Fasereinkopplung wird das Laserlicht, das an den optischen Bauteilen der Spaltlampe
reflektiert wird herausgefiltert. Am Pankrat wird auf eine Photodiode (Laser Components,
FND 100) ein Teil des Laserlichtes ausgekoppelt. Die Messdaten des PMT und der Photodiode
werden mit einem Transientenrekorder (Sony/Tek, RTD710) gespeichert und mit
einem PC weiterverarbeitet. Zusammengefaßt dargestellt ist der Aufbau in Abb. 5.20.

46 ____________________________________________ Kapitel 5: Material und Methoden
RPE-Probe
Spaltlampe
SL 30, Zeiss
Fluoreszenzauskopplung
Bestrahlungslaser Nd:YLF
Fluoreszenzlicht der RPE-Probe
Photomultiplier
dichroidischer Strahlteiler
Pankrat
Photodiode
Transientenrekorder
Abbildung 5.20 :Meßaufbau zur Detektion der RPE-Autofluoreszenz bei Bestrahlung;
(siehe auch Erweiterung mit optoakustischer Detektion in Abb. 5.22).
Da bei Patientenbehandlung genügend Fluoreszenzlicht zur Verfügung stand, wurde auch
statt des Photomultiplier mit einem OMA (optical multichannel analyzer, S2000,
Ocean-Optics) das AF-Spektrum bei Behandlung gemessen werden. In dem OMA wird
das einfallende Fluoreszenzlicht über eine Spiegelanordnung und ein Reflexionsgitter
spektral aufgelöst auf eine CCD-Zeile projiziert. Dadurch erhält man die Möglichkeit, zu
einem Zeitpunkt das gesamte Spektrum zu erfassen. Die spektrale Auflösung ist dabei
durch die Anzahl der CCD-Zeilenelemente (2048), der spektralen Breite des Spektrometers
(350-850 nm) und der Glasfaserdicke (100 µm) bestimmt. Für den Aufbau ergab sich
eine spektrale Auflösung von 5 nm, was für das Emissionsspektrumsbreite von 250 nm
ausreichend war. Die minimale Integrationszeit der CCD-Zeile lag bei 4.4 ms. Damit
konnte sichergestellt werden, dass nur das Fluoreszenzlicht eines Laserpulses aufgenommen
wurde die bei 100 Hz Laserwiederholrate alle 10 ms folgen. Jedoch benötigte die
Ausleseelektronik 27 ms um die Daten vom Spektrometer auf den PC zu übertragen.
Dadurch konnte nur jeder dritte Fluoreszenzpuls gemessen werden. Der ganze Aufbau
wurde spektral mit einer Kalibrationslampe (Oriel) kalibriert, so dass Aussagen über
absolute spektrale Fluoreszenzleistungen möglich sind.
5.4.3 Postoperative Autofluoreszenz nach selektiver RPE Behandlung
Wie in Kap. 4.1.1 näher beschrieben, wurde in Kooperation mit Herrn Prof. Dr. H. Roider
und Dr. C. Framme von der Augenklinik Regensburg die Möglichkeit untersucht, den
selektiven RPE-Schaden über retinale AF-Bilder mit einem Laser Scanning
Retina-Angiographen postoperativ nachzuweisen.
Bei thermischer Denaturierung kann es nach selektiver Bestrahlung zur Verringerung der
retinalen Autofluoreszenz kommen. Dieser Effekt sollte mit der bildgebenden Darstellung
der retinalen Autofluoreszenz nachweisbar sein. Auch bei einer thermomechanischen
Zerstörung der RPE-Zellen durch Mikroblasen kann es zu einer Abnahme der
PC

Kapitel 5: Material und Methoden _____________________________________________ 47
Lipofuszin-Konzentration am Ort der Bestrahlung durch Abtransport der geschädigten
RPE-Zellen und deren Fragmente kommen. Dieser Prozeß sollte wie eine Oedembildung
einen Zeitraum von mindestens 30 Minuten haben. Auch hierbei kommt es zu einer Intensitätsreduktion
der Autofluoreszenz.
Insgesamt wurden 26 Patienten in Regensburg mit verschiedenen makulären Erkrankungen
behandelt. Die Behandlung wurde mit einem Zug von repetitiven Laserpulsen des klinischen
Zeiss Nd:YAG-Lasers (Kap. 5.1.2, Spotgröße: 200 µm; Repetitionsrate: 500 und
100 Hz, Anzahl der Pulse: 100 und 30) durchgeführt. Die Autofluoreszenz wurde mit
einem Retina-Angiographen postoperativ bei 488 nm angeregt und über einen Filter
(Transmission > 500 nm) detektiert (Heidelberg Engineering, HRA II). Es wird eine Serie
von 20 Autofluoreszenzbilder aufgenommen, und nachträglich zueinander ausgerichtet
und gemittelt. Die Patienten wurden zu verschiedenen Zeitpunkten postoperativ untersucht
(10 Minuten, 1 Stunde, 1 Woche). Zusätzlich wurde eine Stunde nach Behandlung
ebenfalls eine Fluoreszenz- gegebenenfalls eine ICG-Angiographie zur Verifikation des
Lasererfolges durchgeführt.
5.5 Optoakustische On-line Dosimetrie
5.5.1 Optoakustische Dosimetrie an der Spaltlampe in vitro
Für die optoakustische Dosimetrie bei RPE-Präparatbestrahlung wurden die RPE-Probenhalter
(Kap. 5.3.1) in der mit isotonischer Kochsalzlösung gefüllte Probenküvette befestigt.
Der Schallwandler (PIN-Transducer, Kap. 5.2.2) wurde auf 1-2 mm an das
Bestrahlungsareal herangeführt, ohne den Laserstrahl abzuschatten oder die Probe zu
berühren. Die mit einem Laserpuls induzierte Transiente wird mit dem Schallwandler
gemessen. Die Wandlersignale wurden mit einem Vorverstärker (Panametrics,
Model 5676, 40 dB, 50 k - 20 MHz) verstärkt und mit einem Transientenrekorder
(Sony/Tek, RTD710, 100 MHz sampelrate) gespeichert. Am Pankrat wird ein Teil des
Laserlichtes ausgekoppelt und auf eine Photodiode gegeben. Somit können alle applizierten
Laserpulse auch mit dem Transientenrekorder gespeichert werden. Die Daten wurden
auf einen PC übertragen und ausgewertet.
Für die Experimente zur optoakustischen Temperaturbestimmung wird noch zusätzlich
ein Thermoelement (Typ J) nahe der Probe plaziert um die langsamen Temperaturänderungen
Probenküvette durch das Wasserbad bestimmen zu können. Das Signal des Thermoelement
wird verstärkt (Greisinger, GTH 1200) und mit ein Oszilloskop (Tektronics,
Tek 220) ausgelesen.

48 ____________________________________________ Kapitel 5: Material und Methoden
Photodiode
Spaltlampe
Zeiss 30 SL/L
Schallwandler
Probenküvette
Wasserbad
Vorverstärker
Transientenrekorder
Nd:YLF Laser
Abbildung 5.21 :Meßaufbau zur optoakustischen Detektion bei Bestrahlung von
Schweine-RPE.
5.5.2 Optoakustische Dosimetrie bei Patientenbehandlung
Um während den Patientenbehandlungen OA-Messungen durchführen zu können, wurde
ein Aufbau konzipiert, der es ermöglichte die OA-Transienten zu erfassen, abzuspeichern
und in Echtzeit zu analysieren. Die OA-Transienten wurden mit dem in Kap. 5.2.3
beschrieben OA-Kontaktglas gemessen und mit einem Vorverstärker (Panametrics,
Model 5676, 40 dB) verstärkt. Für eine schnelle Datenerfassung wurde ein PC mit einer
4 Kanal PCI Transientenrekorderkarte mit integriertem digitalem Signalprozessor (DSP
on board) der Firma Datel verwendet (Datel PCI 431, 10 MHz sample rate). Diese Karte
erlaubt es, durch die Anbindung an das Rechnersystem über eine PCI Schnittstelle, die
Daten zwischen den einzelnen Laserpulsen auf den Arbeitsspeicher des Rechners zu
transferieren. Somit war gewährleistet, dass die Datenauswertung wirklich On-line
erfolgte.
Als weitere Signale wurden noch die Fluoreszenzintensität als auch die Laserpulsleistung
mit dieser Karte erfaßt. Die Kontrolle der Karte, als auch die komplette Auswertung
wurde unter LabView [75] realisiert. Zur Dokumentation wurde eine Farb-CCD Kamera
(Imaging Source, DHC 1003, autogain im zentralen Bildbereich) mit SVHS Ausgang verwendet.
Diese wurde über einen teildurchläßigen Spiegel an das Spaltlampenmikroskop
angekoppelt. Die Behandlung wurde mit einem SVHS Videorecorder aufgenommen, um
so später den Fluoreszenzangiographien einzelne Läsionen zuordnen zu können. Zusammengefaßt
ist der Aufbau in Abb. 5.22 dargestellt.
PC
Thermoelement
RPE-Probe

Kapitel 5: Material und Methoden _____________________________________________ 49
OA Kontaktglas
Bestrahlungslaser Nd:YLF
Fluoreszenzlicht der RPE-Probe
Photodiode
Spaltlampe
SL 30, Zeiss Fluoreszenzauskopplung
Abbildung 5.22 :Kombinierter Meßaufbau für optoakustische und AF-Detektion (siehe
Abb. 5.20) bei Patientenbehandlung.
5.6 Reflexbasierte On-line Dosimetrie
Spaltlampen-
mikroskop mit
CCD Kamera
SVHS Videorekorder
Pankrat
5.6.1 Reflexdetektion an der Spaltlampe in vitro
dichroidischer Strahlteiler
Photodiode
PC mit PCI-
Messkarte
Nd:YLF Laser
Eine weitere Möglichkeit zur Detektion von Mikroblasen ist die Reflexion und Brechung
von Licht an der entstehenden Wasser-Blasen Grenzfläche in der RPE-Zelle (Kap. 4.2.2).
In mehreren Arbeiten wurde diese Methode zur Untersuchung der Blasendynamik von
Kavitationsblasen verwendet [76, 10]. Dabei wurde die Blase in Transmission betrachtet,
was zu einer Abschwächung des Detektionsstrahles führt. Zum Nachweis von Mikroblasen
bei der Bestrahlung von RPE-Proben ist nur eine Anordnung in Reflexion, also die
Rückstreuung des Lichtes, denkbar, da die Chorioidea und vor allem die Sclera stark
streuende Medien sind.
Der optisch basierte Reflexnachweis wurde nur als zweite, von der Optoakustik physikalisch
unabhängige Nachweismethode eingesetzt. Der zeitliche Rahmen zur Ausarbeitung
des Aufbaus war daher beschränkt.
Bei der Bestrahlung von RPE-Proben mit Einzelpulsen von 5 µs bis 3 ms Pulsdauer des
Argonlasers (Kap. 5.1.4) wurden Reflexmessungen durchgeführt. Der Aufbau wurde mit
in eine Spaltlampe integriert. Dadurch kommt es zu einer Begrenzung der numerischen
Apertur auf 0,1. Dies ist eine wesentlicher Verringerung im Vergleich zu den Aufbau von
Rögener [22]. Ein teilweise reflektierend bedampfter Spiegel wurde in den kollimierten
Strahl des Spaltlampenmikroskopes integriert (Abb. 5.23). Reflektiertes Licht der
RPE-Probe wird über eine Linse konfokal auf einen Photomultiplier (Heidelberg Instru-
Faser
Behandlungssteuerung

50 ____________________________________________ Kapitel 5: Material und Methoden
ments/Hamamatsu, Typ R1463) geleitet. Die zeitliche Auflösung des Photomultiplier
wurde auf 250ns bestimmt [77]. Durch die konfokale Anordnung wird erreicht, dass
reflektiertes Licht außerhalb der Bestrahlungsebene, wie z.B. die Vorderfläche der Probenküvette,
ausgeblendet wird.
RPE-Probe
Spaltlampe
Zeiss Visulas
reflektiertes Licht
Bestrahlungslaser
Linsen
Spaltlampenmikroskop
Abbildung 5.23 :Meßaufbau für Reflexionsmessungen an der Spaltlampe.
Bei der Bestrahlungen von Schweine-RPE Proben mit dem Argonlaser Aufbau aus
Kapitel 5.1.4 wurde bei den Reflexionsmessungen der Bestrahlungspuls selbst als Probepuls
verwendet. Da mit diesem Laseraufbau lange Pulsdauern appliziert wurden, konnte
auf die zusätzliche Einkopplung eines Probe-Lasers verzichtet werden. Jedoch können
Mikroblasen, die genau am Ende des Bestrahlungspulses entstehen, nicht detektiert werden.
5.6.2 Reflexdetektion bei der Bestrahlung von Kaninchen
Im Rahmen der Tierversuchsstudie wurde bei der Bestrahlung mit verschiedenen Laserparametern
die Reflexion eines Probe-Lasers während des Bestrahlungspulses gemessen.
Dafür wurde in die Laserfaser noch das Licht einer gepulst betriebenen Laserdiode (Coherent,
f690-400, 690 nm) eingekoppelt. Die Laserdiode wurde in einem Zeitfenster von
20µs betrieben und emittierte dabei maximal 20 mW. Da der Diodentreiber
(SLD, SLD-820) eine Anstiegsflanke von 15 µs hatte mußte ein Teil des Laserdiodenlichtes
mit einer Photodiode (Laser Components, FND 100, 50 Ohm Abschluß) als Referenzsignal
gemessen werden. Das Licht der fasergekoppelten Laserdiode wurde über einen
dichroitischen Strahlteiler mit dem Bestrahlungslicht in die Spaltlampenfaser eingekop-
Photomultiplier
Blende
Filter teilbedampfter
Spiegel
Pancrat
Transientenrekorder
Argon Laser
PD
PC

Kapitel 5: Material und Methoden _____________________________________________ 51
pelt. In diesem Aufbau wurde das Bestrahlungslicht mit einem Filter (Schott, KV550) vor
dem PMT-Pinhole ausgeblendet, da das Licht der Laserdiode als Reflexionssignal genommen
wurde.
Spaltlampenfaser,
160µm,
NA 0.1
Laserdiode
Lasertreiber
Trigger
dichroidischer Strahlteiler
KV550
Laserfaser
105µm, NA 0.1
Signal des PMT
Transientenrekorder
Fotodiode
Abbildung 5.24 :Fasergeführte Einkopplung des gepulsten Laserdiodenlichts für Reflexionsmessungen
bei Kaninchenbestrahlung.
5.7 Mikroblasenbildungs- und Zellschadensschwellen bei Lichtexposition
von RPE-Proben im µs- bis ms-Zeitbereich
Die Schwellen für Mikroblasenbildung und RPE-Zellschädigung bei Laserbestrahlung
mit Einzelpulse mit Pulslängenbereich vom 5 µs - 3 ms wurde an präpariertem
Schweine-RPE für untersucht. Mit Hilfe der optoakustischen Detektion (Kap. 5.5.1) und
der Reflexdetektion (Kap. 5.6.1) wurde Mikroblasenbildung bei der Bestrahlung nachgewiesen.
In der Prinzipskizze (Abb. 5.25) sind die Zusammenhänge zusammenfassend
dargestellt. Wird ein Laserpuls appliziert und es entstehen Mikroblasen so sollte einerseits
eine Mikroblasentransiente wie auch eine transiente Rückstreuung des bestrahlten Lichtes
meßbar sein. Werden beide Signale gemessen, so wurde mit zwei physikalisch unabhängigen
Systemen Mikroblasenbildung nachgewiesen. Entsteht keine Mikroblase, so sollte
nur diffuse Rückstreuung von der RPE-Probe ohne transiente Änderungen gemessen werden.
Es wurden Schweine-RPE Proben wie in Kap. 5.3 präpariert und zum genauen Nachweis
einer RPE-Schädigung wurde erst nach der Bestrahlung eine Färbung mit CalceinAM
durchgeführt.
Es wurden für alle Pulsdauern die RPE-Schadensschwellen und die Schwelle für die Bildung
von Mikroblasen bestimmt und statistisch mit Probit (Kap. 5.8.4) ausgewertet.

52 ____________________________________________ Kapitel 5: Material und Methoden
Für die Versuche wurde der in Kap. 5.1.4 beschrieben Argon Laseraufbau verwendet. Es
wurden einzelne Laserpulse mit Pulslängen 5 µs, 50 µs, 500 µs und 3 ms bei verschiedenen
Pulsenergien appliziert. Während der Bestrahlung wurden die optoakustischen
Signale mit dem in Kap. 5.5.1 beschriebenen Aufbau gemessen und simultan Reflexmessungen
mit dem in Kap. 5.6.2 erläuterten Spaltlampenaufbau gemacht.
Durch die Wahl eines kleinen Spotdurchmessers von 50 µm (ca. 8 RPE-Zellen) und der
damit verbundenen niedrigen Pulsenergien, aber vor allem der Verwendung langer Laserpulse
können die bei Bestrahlung entstehenden sehr schwachen thermoelastischen Transienten
nicht detektiert werden. Im Vergleich zu einer verwendeten Pulslänge von 1.7 µs
mit gleicher Bestrahlung und 178 µm Bestrahlungsdurchmesser reduziert sich die thermoelastische
Druckamplitude um 96 % [78] bei der Applizierung von 5 µs Laserpulsen
in einen 50 µm Spot.
keine
Mikroblase
diffuse
Rückstreuung
Nachweis: keine
Mikroblasenbildung
Laserpuls
Mikroblasentransiente
Mikroblase
Abbildung 5.25 :Prinzipskizze der Einzelpulsuntersuchungen zum Nachweis des RPE-Schadensmechanismus
im µs- bis ms-Zeitbereich.
5.8 Parameterstudien in vivo am Kaninchen
transiente Rückstreuung
durch Mikroblasen
Nachweis:
Mikroblasenbildung
Die ersten Versuche zur selektiven Schädigung des RPEs wurden von Roider und Birngruber
an Kaninchen durchgeführt [2]. Dabei wurde mit einem Argonlaser (5 µs, 500 Hz,
100 Pulse) und einem Nd:YAG (200 ns, 500 Hz, 100 Pulse) bestrahlt [2]. Es wurde von
einem thermisch induzierten RPE-Schaden ausgegangen. Im schwellennahen Bereich
zeigten sich in den histologischen Ergebnissen keine entscheidenden Unterschiede zwischen
beiden Lasersystemen. Erst bei vierfach überschwelliger Bestrahlung mit dem
Nd:YAG wurden Schäden an den Außensegmenten der Photorezeptoren sichtbar. Der
direkte Vergleich mehrfach überschwelliger Bestrahlung, z.B. bei Einzelpulsen mit 5µs
Pulsdauer, war aus technischen Gründen nicht möglich.
Da sich im Rahmen dieser Arbeit zeigte, dass es bei Einzelpulsen mit 5µs Bestrahlungsdauer
(Kap 6.5) zu Mikroblasenbildung bei der Schädigung der RPE-Zellen kommt,
wurde in Tierexperimenten untersucht, ab welcher kürzeren Pulsdauer es zu einer signifikant
anderen Schädigungszone um das RPE herum kommt. Auch galt es die Additivität
multipler Laserpulse bei bekanntem Schadensmechanismus zu untersuchen.

Kapitel 5: Material und Methoden _____________________________________________ 53
In den Tierversuchsstudien wurden zwei Schädigungsmerkmale ausgewertet. Als Kriterium
für eine erfolgte Schädigung des RPE wurde die fluoreszenzangiographische Leckage,
mit Durchtritt des chorioidealen Fluoreszein durch die geschädigte
Blut-Retina-Schranke festgelegt. In diesem Fall müssen mindestens die Tight-Junctions
zwischen den RPE-Zelle geschädigt, oder die RPE-Zellmembran ganz zerstört sein, um
ein hindurchdiffundieren des Fluoreszein zu ermöglichen. Als Kriterium für einen sicheren
Schaden an den Photorezeptoren wurde die ophthalmoskopische Sichtbarkeit der
Läsionen festgelegt. Jedoch ist bei diesem Kriterium nicht ausgeschlossen, dass unterhalb
der ophthalmoskopischen Sichtbarkeit ein Schaden an den Photorezeptoren entsteht. Deshalb
wurden ebenfalls Histologien angefertigt um das Ausmaß des gesetzten Schadens
genauer beurteilen zu können.
Die Kaninchenbestrahlungen wurden mit allen drei oben aufgeführten experimentellen
Lasern durchgeführt. Es konnten Pulslängen zwischen 8ns (Nd:YAG, 532 nm) bis
cw-Bestrahlung (Argon, 514 nm) realisiert werden. Dabei blieb die Wellenlänge auf
einem kleinen Bereich von 18 nm (514 nm - 532 nm) begrenzt. Da die Absorption von
Melanin und anderen retinalen Chromophoren in dieser spektralen Region als konstant
angesehen werden kann (Abb. 3.1) sind Effekte durch unterschiedlich hohe retinale
Lichtabsorption ausgeschlossen [30].
In der ersten Studie wurden mit dem Nd:YLF-Lasersystem Pulse von 5 µs, 1.7 µs und
200 ns Pulslänge (je 100 Pulse, 500 Hz) und als Vergleich mit dem Argon-Laser bei 5 µs
und 200 ms appliziert. In der zweiten Studie wurden mit dem Nd:YLF-Laser Experimente
mit weiter abgestufter Anzahl der Pulse (100 Pulse, 10 Pulse bei 100 Hz sowie Einzelpulse)
mit jeweils 1.7 µs und 200 ns Pulsdauer als auch mit dem experimentellen
Nd:YAG 1 und 10 Pulse (10 Hz) bei 8 ns durchgeführt. Zusammengefaßt sind alle Parameter
in Tabelle 2.
Studie No Laser Wellenlänge Pulsdauer Pulszahlen Pulswiederholrate
I Nd:YLF 527nm 200ns 100 500Hz
I Nd:YLF 527nm 1.7µs 100 500Hz
I Nd:YLF 527nm 5µs 100 500Hz
I Argon 514nm 5µs 100 500Hz
II Nd:YAG 532nm 8ns 1, 10 10Hz
II Nd:YLF 527nm 200ns 1, 10, 100 100Hz
II Nd:YLF 527nm 1,7µs 1, 10, 100 100Hz
Tabelle 2: Experimentelle Parameter der Tierversuchsstudien

54 ____________________________________________ Kapitel 5: Material und Methoden
In Zusammenarbeit mit Herrn Dr. C. Framme von der Augenklinik Regensburg wurden
die Parameterstudien durchgeführt. Der Tierversuchsantrag wurden von der Ethikkomission
der Medizinischen Universität zu Lübeck genehmigt. Die Versuche wurden nach den
Bestimmungen der Association for Research in Vision and Ophthalmology (Resolution
on the Use of Animals in Research, 1995) durchgeführt.
5.8.1 Tiere
Die Versuche wurden an Chinchilla Bastard Kaninchen durchgeführt. Die Kaninchen
wurden mit Ketamin-Hydrochlorid (35 mg/kg KG) und Xylazin-Hydrochlorid (5 mg/kg
KG) anästhesiert und in einem Halteapparat plaziert, der Bewegungen in alle Richtungen
zuließ. Ein plankonkaves Kontaktglas (Haag-Streit, 903L) wurde auf das Auge dessen
Pupillen aufgeweitet wurden aufgesetzt. Als Kontaktgel wurde Methylcellulose (Novartis,
Methocel 2 %) verwandt. Das Kontaktglas wurde am Halteapparat arretiert, um unerwünschte
Bewegungen während der Bestrahlung zu vermeiden.
5.8.2 Laserbestrahlung
Die Laserbestrahlungen wurden an einer ophthalmologischen Spaltlampe (Zeiss, SL/L30)
durchgeführt. Das Licht der verschiedenen Laser wurde über deren Glasfasern in die
Spaltlampenfaser (Zeiss, 160 µm, NA 0.1) eingekoppelt, so dass der Bestrahlungsdurchmesser
in Luft durch die 1:1 Abbildung der Spaltlampe ebenfalls 160 µm betrug. Aufgrund
der optischen Eigenschaften des Kaninchenauges ergibt sich durch die Verwendung
eines Kontaktglases für ein Menschenauge eine Verkleinerung des Laserspots um den
Faktor 0.66 [13]. Das verwendete Kontaktglas Haag-Streit 903L macht noch eine Vergrößerung
um den Faktor 1.1 beim menschlichen Auge. Daraus ergibt sich für alle Kaninchenbestrahlungen
ein retinaler Spotdurchmesser von 116 µm.
Zur Orientierung wurden in allen Augen Markerläsionen gesetzt. Dazu wurden sechs bis
acht Läsionen in die Regio macularis in einem Gebiet von etwa 3x3mm mit 60-120µJ
und verschiedenen Laserparametern appliziert. Diese Herde wurden zeichnerisch dokumentiert.
Die Pulsenergie dieser Orientierungsmarkerläsionen wurde dabei so hoch eingestellt,
dass sich ophthalmoskopisch sichtbare Läsionen ergaben. Die eigentlichen
Testläsionen wurden zwischen die Markerläsionen gesetzt und wiederum in Relation zu
den Markerläsionen zeichnerisch dokumentiert (Abb. 5.26). Zwischen 30 und 70 Testläsionen
mit unterschiedlichen Energien konnten in ein Auge appliziert werden. Insgesamt
wurden in allen Versuchen zusammen 1095 Läsionen gesetzt.

Kapitel 5: Material und Methoden _____________________________________________ 55
Abbildung 5.26 :Fundusbild und Fluoreszenzangiographie am Kaninchenauge mit Anfärbung
der ophthalmoskopisch nicht sichtbaren, aber angiographisch überschwelligen
selektiven Laserherde.
5.8.3 Datenauswertung der Parameterstudie
Außer bei den Soforthistologien wurde immer eine Stunde nach Laserbehandlung der
Fundus fotografisch mit einer Funduskamera (Carl Zeiss, Oberkochen) dokumentiert.
Anschließend wurde eine Fluoreszenzangiographie mit Injektion von 10 % Fluoreszein-Lösung
in eine Ohrvene durchgeführt. Nach Injektion des Farbstoffes färben sich alle
Läsionen, bei denen die Blut-Retina Barriere durch einen Schaden des RPEs nicht mehr
gegeben ist, die sogenannte angiographische Sichtbarkeit (Abb. 5.26). So wurden auch
die während der Bestrahlung ophthalmoskopisch nicht sichtbaren selektiven RPE-Schäden
nachgewiesen.
5.8.4 Schadensschwellenbestimmung mit Probit
Nach Auswertung der ophthalmoskopischen Dokumentation und der Angiogramme wurden
die dichotomen Werte statistisch ausgewertet. Dichotom bedeutet, dass die Ergebnisse
in die Werte 0 und 1 aufgeteilt werden (0 = keine angiographische
/ ophthalmoskopische Läsion, 1 = sichtbare angiographische / ophthalmoskopische
Läsion). Bei der Definition einer ophthalmoskopischen Sichtbarkeit wurde dadurch nur
die Erkennbarkeit registriert, nicht aber die Farbnuancen des Laserherdes bewertet.
Die statistischen Berechnungen werden unter der Voraussetzung durchgeführt, dass
sowohl die angiographische, als auch die ophthalmoskopische Schwellenenergie eine logarithmische
normalverteilte Zufallsgröße ist. Die Richtigkeit dieser Hypothese gilt erfahrungsgemäß
bei sehr vielen Zufallsgrößen, die keine negativen Werte annehmen können,
vor allem aber bei den meisten biologischen Zufallsgrößen. Dies wird auch standardmäßig
zur Bestimmung von Laserschadensschwellen am Augenhintergrund angenommen
[81]. Mit Hilfe des Statistikalgorithmus Probit [79] des Programmpakets SPSS wurde die
logarithmische Normalverteilung an die dichotomen Datenwerte angepaßt [80]. Dabei
wird sowohl die bei Schwellenuntersuchungen übliche effektive Dosis bei 50-prozentiger
Schädigungswahrscheinlichkeit (ED 50 ), als auch die Steigung (slope) und die Fiduzialin-

56 ____________________________________________ Kapitel 5: Material und Methoden
tervallgrößen bestimmt. Dieser Algorithmus wird in SPSS mit der Fortranroutine NPSOL
umgesetzt [82]. Ein typisches Ergebniss der Analyse ist in Abb. 6.21 für den RPE-Zellschaden
und in Abb. 6.20 für Mikroblasenbildung bei 50 µs Einzellaserpulse an
Schweine-RPE in vitro dargestellt (Kap. 6.5.1).
Typischerweise wird die slope der Verteilungskurve durch die ED 84 und ED 16 Werte charakterisiert.
Diese Werte entsprechen der Standardabweichung der angepaßten Normalverteilung
mit logarithmischer Kovariantenbasis. Die verwendete Software SPSS gibt nur
die angepaßten Werte für die Schwellen ED 15 und ED 85 an. Diese wurden hier für weitere
Auswertung verwendet, da die minimalen Abweichungen die Ergebnisse in ihrer grundsätzlichen
Aussage nicht beeinflussen.
Der Bereich zwischen der angiographischen ED 85 und der ophthalmoskopischen ED 15
Schwelle wurde als die therapeutische Breite gewertet. Je größer der Unterschied zwischen
beiden Schwellen ist, desto sicherer sollte eine selektive Behandlung mit diesem
Parameter sein, weil inter- und intraindividuelle Unterschiede in der Energieabsorption
eher kompensiert werden können.
In den bereits abgeschlossenen Tierversuchsstudien zur SRT wurde bisher immer nur das
“therapeutische Fester” als Bereich zwischen der angiographischen ED 50 und der ophthalmoskopischen
ED 50 Schwelle betrachtet [2, 4]. Die teils erhebliche Breite der angepaßten
logarithmischen Normalverteilung, also die Streuung der Schwellenwerte, wurde
nicht berücksichtigt. Bei den Ergebnissen der hier durchgeführten Studie (Kap. 6.5.3)
wurde der Wert ED 50 ophth zu ED50 ang zum besseren Vergleich zwar noch mit angegeben,
aber in der Diskussion mit mehr berücksichtigt.
5.8.5 Morphologische Untersuchungsmethoden
Zur Beurteilung der Gewebeeffekte nach Laserexposition wurden die Läsionen lichtmikroskopisch
Untersucht. Für die Soforthistologien ist sofort nach Exposition ein Fundusbild
als auch eine Fluoreszenzangiographie gemacht worden, anschließend die Augen
enukleiert und für die histologischen Untersuchungen aufgearbeitet worden. In die Bulbi
wurde zunächst eine Fixierlösung nach Karnovski [83] injiziert und danach der gesamte
Bulbus darin für 30 Minuten fixiert. Anschließend wurden die Bulbi limbusparallel an der
Pars Plana eröffnet, der Glaskörper entfernt und weitere 30 Minuten fixiert. Zwei Tage
wurden sie in einer 4 % igen Glutaraldehydlösung immersionsfixiert und anschließend in
0.2 M Kakodylatpuffer gespült. Nach mehrmaligen Waschen konnte das Gewebe in
1 % iger Osmiumtetroxydlösung in 1 % igem Kakodylatpuffer über Nacht nachfixiert
und anschließend mit Kakodylatgepuffer gespült werden. Nach Entwässerung in einer
aufsteigenden Alkoholreihe und Propylenoxid inkubierten die Proben in Araldidpropylenoxid
1:1 über Nacht. Nach weiterem 2 stündigen Bad in Araldid wurden die Proben in
Formen ausgegossen, orientiert und drei Tage lang bei 59 °C polymerisiert. Es wurden
Semidünnschnitte mit Glasmessern an einem Leica Ultramikrotom mit einer Dicke von

Kapitel 5: Material und Methoden _____________________________________________ 57
0.5 - 1 µm angefertigt und anschließend mit Toluidinblau gefärbt. Dadurch werden alle
Strukturen angefärbt, die als basophil und osmiophil bekannt sind. Neutralfett färbt sich
im osmierten Material grünlich, als metachromatisch bekannte Strukturen rotviolett [83].
5.9 Patientenbehandlungen
Die Behandlungen am Medizinischen Laserzentrum Lübeck wurden in Kooperation mit
Herrn Dr. Ch. Wirbelauer, Frau Dr. E. Joachimmeyer, Herrn Dr. H. Elsner unter der
Koordination von Herrn Dr. H. Hoerauf von der Klinik für Augenheilkunde der medizinischen
Universität zu Lübeck durchgeführt. In Zusammenarbeit mit Herrn
Prof. Dr. J. Roider und Herrn Dr. C. Framme von der Augenklinik der Universität
Regensburg wurden Patienten auch dort behandelt. Die Ethikanträge für diese Studien
wurden von den Ethikkomissionen der medizinischen Universität zu Lübeck und der Universität
Regensburg genehmigt. Die Patienten wurden aufgeklärt und willigten für die
Behandlung ein. Wie in Kapitel 2.4 dargelegt, wurden die drei Krankheitsbilder, diabetischen
Makulopathie (DMP), Retinopathia centralis serosa (RCS) und die Drusenmakulopathie
behandelt.
Am Medizinischen Laserzentrum Lübeck wurden 70 Patientenbehandlungen mit dem frequenzverdoppeltem
Nd:YLF Laser (1.7 µs, Kap. 5.1.1) mit den Parametern 500 Hz und
100 Pulse als auch 100 Hz und 30 Pulse mit 50-150 µJ Pulsenergie durchgeführt. Da die
Laserfaser durch die Spaltlampe abgebildet wurde ergab sich durch die Verwendung des
Haag-Streit Kontaktglases mit der Vergrößerung von 1.1 ein retinaler Spotdurchmesser
von 176 µm. Es wurde jeweils die Änderung der Autofluoreszenz (Kap. 6.6) als auch die
optoakustischen Transienten (Kap. 6.7) gemessen und analysiert. Bei 100 Hz Wiederholrate
wurden auch spektral aufgelöste AF-Messungen mit einem angekoppeltem OMA
durchgeführt (Kap. 6.6.5). Bei jeder Behandlung wurden zuerst am unteren Gefäßbogen
des Auges Probeläsionen gesetzt. Dabei wurde mit 50 µJ Pulsenergie begonnen und die
Energie ab 70 µJ in 10 µJ - Schritten erhöht bis ein Effekt mit der optoakustischen
On-line Dosimetrie (Kap. 6.7) nachweisbar war. Mit dieser Schwellenenergie wurde dann
begonnen Zentral zu behandeln. Während der Behandlung mußte noch je nach Areal die
Energie um bis zu 20 µJ variiert werden. Dabei wurde auf die Ergebnisse der optoakustische
On-line Dosimetrie (Kap. 6.7) zurückgegriffen. Nach den Behandlungen wurden
Fluoreszenzangiographien und teilweise ICG-Angiographien des behandelten Auges aufgenommen
um die Schädigung des RPE nachzuweisen und zu dokumentieren.
An der Augenklinik Regensburg wurden 50 Patienten mit dem klinischen Nd:YAG Prototypen
(800 ns, Kap. 5.1.2) der Firma Zeiss mit den Parametern 500 Hz und 100 Pulse
als auch 120 Hz und 30 Pulse mit 80 - 200 µJ Pulsenergie behandelt. Der retinale Spotdurchmesser
war 200 µm. Bei jeder Behandlung wurden zuerst am unteren Gefäßbogen
des Auges Probeläsionen gesetzt und anschließend eine Fluoreszenzangiographie durchgeführt.
Mit der dabei bestimmten Schwellenenergie wurde anschließend behandelt.

58 ____________________________________________ Kapitel 5: Material und Methoden
Danach wurden Fluoreszenzangiographien und ICG-Angiographien des behandelten
Auges aufgenommen um die Behandlung zu dokumentieren. Bei 5 Patienten wurden die
bei der Behandlung entstehenden optoakustischen Transienten gemessen.
5.10 Temperaturbestimmung mit optoakustischen Methoden
Während der Bestrahlung mit Laserlicht bei den verschiedenen Therapieformen der Ophthalmologie
kommt es immer zu einer Erwärmung des bestrahlten Gewebes durch
Absorption des Lichtes und der Umwandlung in Wärme. Da gerade an der Retina mit
ihren Photorezeptoren eine thermische Schädigung durch eine Bestrahlung in vertretbaren
Grenzen bleiben sollte, ist die laserinduzierte Temperaturerhöhung ein kritischer Faktor.
In den meisten Fällen werden die induzierten Temperaturen über Berechnungen
abgeschätzt. Zur Verifizierung der Berechnungen wurden Temperaturmessungen der
Retina während der cw-Koagulation mit invasiven Verfahren durchgeführt. Dabei wurde
einerseits ein Mikro-Thermoelement nahe der Retina plaziert [42]. Damit konnte mit
guter thermischer und zeitlicher Auflösung gemessen werden. Diese Methode ist durch
ihren höchst invasiven Charakter nur in Tierversuchen durchführbar.
Andererseits konnte mit einem fluoreszierenden temperaturempfindlichen Liposome-Dye
ebenfalls Temperaturerhöhungen an der Retina gemessen werden [84]. Diese Methode
erlaubt keine zeitliche, dafür aber eine räumliche Temperaturauflösung des bestrahlten
Areals. Die Temperaturauflösung ist deutlich geringer als bei [42] und der Messbereich
ist auf ein Detektionslimit des Dyes von 42 °C bis 65 °C beschränkt. Diese Methode
wurde bisher nur in Tierversuchen verifiziert, ist aber durch den weit weniger invasiven
Charakter auch am Menschen vorstellbar.
Ebenfalls wäre eine Temperaturmessung mittels Ultraschall durchführbar [85, 86]. Dabei
wird die Temperaturabhängigkeit der Schallgeschwindigkeit ausgenützt. Dies führt zu
einer Laufzeitverschiebung der unterhalb des erwärmten Bereichs liegenden Gewebestrukturen.
Durch zurückrechnen auf das Ausgangsbild läßt sich damit die Temperaturerhöhung
nachweisen. Diese Methode wird bereits zum Monitoring bei der LITT (Laser
Induced Thermo Therapy) eingesetzt [85, 86]. Die an der Retina benötigte Ortsauflösung
von mindestens 100 µm würde Schallfrequenzen von ca. 40 MHz zur Folge haben. Aufgrund
der hohen Schallabsorption von Wasser und okularen Medien in diesem Frequenzbereich
ist eine Transmission des Schallwelle durch die dicke des Augapfels von 25 mm
nicht realisierbar. Eine reale Umsetzung erscheint aus physikalischen Gründen schwierig.
Mit einem auf optoakustischen Methoden basierenden System zur nichtinvasiven Temperaturbestimmung
konnte die Temperaturverteilung während der LITT gemessen werden
[87, 88, 89]. Es konnte eine gute Übereinstimmung der räumlichen und zeitlichen Verteilung
der Temperaturen mit Thermoelementen nachgewiesen werden. Zur Erzeugung der
optoakustischen Transiente wurden mehrere Joule Pulsenergie verwendet, was für eine
Anwendung im Auge nicht tragbar ist. Da das RPE mit seiner Absorptionsdicke von ca.
10 µm eine viel effektivere Umsetzung der Laserenergie in Schallwellen zuläßt, sollte am

Kapitel 5: Material und Methoden _____________________________________________ 59
Auge eine niedriger Pulsenergie zur Temperaturbestimmung ausreichen. Es soll im Folgenden
die Entwicklung der Methode zur optoakustischen Temperaturbestimmung dargestellt
werden.
5.10.1 Grundlagen zur OA-Temperaturbestimmung
Wie in Anhang A: “Thermoelastische Druckentstehung” gezeigt, kann für die gegebenen
Behandlungsparameter am Auge der maximale Druck der optoakustischen Transiente mit
Gleichung (84) abgeschätzt werden. Dabei wird von einer homogen absorbierenden
Schicht ausgegangen, deren laterale Ausdehnung groß gegenüber der Schichtdicke ist
[65]. Dies ist bei der SRT erfüllt, da der retinale Spotdurchmesser von 176 µm (Kap. 5.9)
groß gegenüber der Schichtdicke des RPE von 10 µm ist. Weitere Randbedingung ist kein
akustischer aber ein thermischer Einschluß [65]. Für das 10 µm dicke RPE ergibt sich eine
akustische Transitzeit von 6.6 ns, was deutlich kürzer der verwendeten 1.7 µs Laserpulse
ist. Die thermische Relaxationszeit einer 10 µm dicken Sicht ist mit über 100 µs [92]
deutlich länger als die verwendete Laserpulszeit.
Führt man den aus Gleichung (68) definierten Grüneisenparameter ein, so erhält man für
minimale Variationen der Laserspitzenintensität I 0 :
Pmax Γ I0 =
⋅ ----
(10)
Das Druckmaximum ist also direkt proportional zum Grüneisenparameter. Dieser Parameter
ist temperaturabhängig. Die Abhängigkeit ist für Wasser bis in den metastabilen
Zustand bis 300 °C bekannt [95]. Im Bereich von 35 -80 °C kann diese Funktion noch als
linear angesehen werden (Abb. 5.27). Da auch das Gewebe in Durchschnitt zu 70 -80 %
aus Wasser besteht [96], kann auch hierfür eine Linearität angenommen werden. Dies ist
für die hier verwendete absorbierende Struktur, das RPE, mit Messungen zu zeigen.
c 0

60 ____________________________________________ Kapitel 5: Material und Methoden
Grüneisenkoeffizient [1/m]
0.4
0.3
0.2
40 50 60 70 80
Temperatur [°C]
Abbildung 5.27 :Grüneisenkoefizient für Wasser im Bereich 37 - 80 °C ; nach [95]. In diesem
Temperaturbereich kann der Grüneisenkoeffizient in Näherung als
linear angenommen werden.
Im Temperaturbereich von 0 °C bis 80 °C ist der thermische Expansionskoeffizient die
Größe die den Grüneisenparameter am stärksten ändert [65]. Die Wärmekapazität ändert
ihren Wert nur um 1 % in diesem Bereich. Daraus folgt:
Pmax( T)
∼ ΓT ( ) ⋅ I0 (11)
Aufgrund der angenommen Linearität von Γ( T)
mit der Temperatur folgt, dass das Druckmaximum
linear zur Temperatur ist. Durch eine lineare Approximation erhält man:
Pmax( T)
I 0
= ----- ⋅ ( T– TRPE) B 0
(12)
Es ergibt sich noch eine Verschiebung um T , der Temperatur, bei der Γ( T)
= 0
RPE
ist.
Bei dieser Temperatur wird bei infinitesimaler Erwärmung keine optoakustische Transiente
gebildet. Bei Wasser ist diese Temperatur T = 4 °C. Sie stellt bei infinitisimaler
H2O Erwärmung den Achsenschnittpunkt für den P = 0 bei der Auftragung Druckamplitude
über Probentemperatur dar. Dies ist Beispielhaft aus der Arbeit von Sigrist [65] für eine
Messung an Wasser in Abb. 5.28 dargestellt.

Kapitel 5: Material und Methoden _____________________________________________ 61
Abbildung 5.28 :Maximaldruck der thermoelastischen Transiente über der Wassertemperatur.
(CO2-Laser (9P(20)), 90 ns, Wasser) aus [65]. Um 4 °C kommt es bei
Erwärmung durch den Laserpuls zu einer Druckamplitudenumkehr.
Im experimentellen Fall, bei dem zur Druckgenerierung immer erwärmt wird, zeigt sich
ein Vorzeichenumkehr der Druckamplitude [65]. TRPE ist eine gewebespezifische Materialkonstante
und muß durch Messungen für RPE bestimmt werden.
Der Wert B0 hat die Funktion einer Normierungskonstante des Druckes. Diese enthält
die experimentell wichtigen Werte wie Wandlerempfindlichkeit, Signalverstärkung und
die Amplitude der akustischen Übertagungsfunktion. Für jede Messung, bei der die akustische
Übertagungsfunktion unbekannt ist, muß diese Konstante experimentell bestimmt
werden, z.B. durch einen Probepuls. Bei bekannter Probentemperatur T0 , welche bei
0
Patientenbehandlung ist die Körpertemperatur, und gemessenem Pmax des Probepulses
wird der Normierungswert durch
B 0
B 0
( T0 – T ) ⋅ I
RPE 0
= -------------------------------------
0
Pmax (13)
bestimmt. Dieser Wert für B0 kann verwendet werden, solange sich die akustische Übertragungsfunktion
nicht ändert. Dies ist im Fall kurzer Bestrahlungszeiten bis zu 300 ms
gegeben, da in diesem Zeitraum nur minimale Augenbewegungen möglich sind.

62 ____________________________________________ Kapitel 5: Material und Methoden
Die absolute Temperatur des Absorbermediums T i beim i-ten Laserpuls ist nach Gl. (12)
gegeben durch:
T i i
B0 ⋅ Pmax ( Pmax) = TRPE + ----------------------
I0 (14)
Wichtig für die Anwendung bei der Patientenbehandlung ist, dass es für eine Temperaturbestimmung
hinreichend ist, die thermisch induzierten relativen Druckänderungen zu
bestimmen. Es muß keine absolute Druckmessung gegeben sein, wenn der Wert B0 vor
der Temperaturmessung bei gegebenen durch z. B. einen Probepuls bestimmt wird.
T 0
Das Meßprinzip ist in Abb. 5.29 graphisch dargestellt. Bei bekanntem TRPE und bekannter
Probenstarttemperatur
0
T0 wird mit dem ersten Probepuls das Druckmaximum Pmax 0
erzeugt und gemessen. Somit sind die Punkte A0 (, T0 Pmax) und A1 (,0), TRPE durch die
i
die Gerade festgelegt wird, gegeben. Für alle folgenden Druckwerte Pmax die bei gleicher
Pulsenergie appliziert werden kann der korrespondierende Temperaturwert Ti bestimmt
werden. Daraus ist auch ersichtlich, dass bei bekannter Probenstarttemperatur T0 und
Materialkonstante TRPE sind.
absolute Druckmessung zur Temperaturbestimmung nicht nötig
Aus Abb. 5.29 ist auch ersichtlich, dass bei einer nichtlinearen Abhängigkeit der Druckamplitude
von der Temperatur eine genaue Temperaturbestimmung nicht unbedingt äquivalent
möglich ist. Eventuell kann man mit einem Probepuls nicht den weiteren Verlauf
der Funktion erfassen. Dies ist aber genau für eine Temperaturmessung nötig.
Die Datenauswertung wurde unter LabView [75] programmiert und liefert in Echtzeit den
Temperaturverlauf.

Kapitel 5: Material und Methoden _____________________________________________ 63
A 1
Druck
P i
max
P 0
max
T RPE
A 0
Abbildung 5.29 :Meßprinzip der optoakustischen Temperaturmessung.
T 0
5.10.2 Bestimmung der Materialkonstante für RPE
Zur Bestimmung der Materialkonstante TRPE wird bei konstanter gepulster Bestrahlung
das Druckmaximum für verschiedene Schweine-RPE-Probentemperaturen gemessen.
Dafür wird der in Abb. 5.21 skizzierte Aufbau verwendet. Die Schweine-RPE Proben
werden wie in Kap. 5.3.1 beschrieben präpariert. Es wird 45 °C warme physiologische
Kochsalzlösung in die Probenküvette gefüllt. Während des Abkühlens wird die Probe mit
konstanten Nd:YLF Laserpulsen (50 mJ/cm², 250 ns, rep. rate 1 Hz) bestrahlt. Die emittierten
Transienten werden mit dem Schallwandler empfangen und mit einem PC gespeichert.
Zur Bestimmung der Druckamplitude wird ein Peakfind-Algorithmus von LabView
verwendet [75]. Er basiert auf einem Algorithmus, der ein quadratisches Polynom an
sequentielle Datenwertgruppen anpaßt. Die Temperatur der RPE-Probe wird durch ein
Thermoelement Typ J, welches direkt neben dem Bestrahlungsort plaziert wird,
bestimmt. Es waren nur Messungen bis 45 °C möglich, da sich oberhalb dieser Temperatur
eine optische Änderung der RPE-Probe durch thermische Denaturierung ergab.
5.10.3 Umsetzung bei selektiver RPE Behandlung
Temperatur
Durch die Verwendung von repetitiver Laserbestrahlung kommt es bei hohen Wiederholraten
und großen Bestrahlungsdurchmessern zu einer Adaption der einzelnen Temperaturerhöhungen
des RPE. Es bildet sich, ähnlich wie bei der cw Bestrahlung eine
Grundtemperatur aus, die durch Wärmediffusion auch die Photorezeptoren schädigen
kann. In Abb. 5.30 ist schematisch die Grundtemperatur dargestellt. Durch die langen
T i

64 ____________________________________________ Kapitel 5: Material und Methoden
Bestrahlungszeiten eines Laserpulszuges von 200 - 300 ms diffundiert die Wärme ebenfalls
in die Schicht der Photorezeptoren und kann durch eine mögliche thermische Schädigung
die Selektivität der Behandlung negativ beeinflussen.
Temperatur [a.u.]
Temperatur
RPE
Temperaturspitze
0 4 8 12 16 20 0 4 8 12 16 20
Zeit [ms] Zeit [ms]
Abbildung 5.30 :Temperaturverlauf bei repetitiver Bestrahlung (500Hz) mit Ausbildung
einer Grundtemperatur. Diese ist aufgrund der langen Zeitkonstanten in
der Schicht der Photorezeptoren ebenfalls stark ausgebildet.
Im Falle der selektiven RPE Behandlung können die bei der Bestrahlung mit den Behandlungslaserpulsen
entstehenden thermoelastischen Transienten zur Bestimmung der
Grundtemperaturerhöhung verwendet werden. Dabei wird der notwendige Normierungs-
0
wert B0 für jeden Bestrahlungsort mit der Druckamplitude Pmax des ersten Behandlungspulses
und der Körpertemperatur als T0 nach Gleichung (13) bestimmt. Mit den
i
folgenden Laserpulsen werden aus den jeweiligen Durckamplituden Pmax mit dem
bestimmten Normierungswert B0 aus Gleichung (14) die jeweilige Temperaturerhöhung
bestimmt.
T i
Es ist wichtig zu beachten, dass nicht die Temperaturspitzen gemessen werden die mit
dem Laserpuls im RPE erzeugt werden. Durch die vorgenommene Normierung der ersten
0
Druckamplitude Pmax auf die Probenstarttemperatur, beim Menschen die Körpertemperatur,
wird aus den folgenden relativen Druckamplitudenänderungen nur die Temperaturänderungen
relativ zu dieser Probenstarttemperatur bestimmt.
Da es bei Patientenbehandlungen nur möglich ist relative Drücke zu messen kann nur aus
der Änderung der relativen Druckamplituden die nur Grundtemperaturerhöhung
bestimmt werden. Die Bestimmung der Temperaturspitzen ist nur mit einer absoluten
Druckmessung möglich.
Grundtemperatur
Temperatur
Photorezeptor

Kapitel 5: Material und Methoden _____________________________________________ 65
5.11 Modellrechnungen
5.11.1 Wärmeleitung lichtabsorbierender Strukturen
Um die Temperaturverteilung lichtabsorbierender Strukturen beschreiben zu können muß
die räumlich und zeitliche Entwicklung Temperatur T( r, t)
beschrieben werden. Sie kann
als Lösung der Wärmeleitungsgleichung (54) beschrieben werden. Dabei ist t die zeitliche,
und r die räumliche Koordinate, ρ die Dichte, CP die spezifische Wärmekapazität
und k die Diffusifität des Mediums. Da durch die Lichtabsorption Wärme hinzugeführt
wird, muß Gl. (54) um einen Quellterm q( r, t)
erweitert werden. Dieser Quellterm q( r, t)
entspricht der durch die Laserstrahlung extern zugeführten Wärmeenergiedichte pro Zeiteinheit.
Man erhält:
Zur Lösung der inhomogener Wärmeleitungsgleichung homogener Medien für einen
komplizierten Quelltern kann das Superpositionsprinzip angewendet werden. Es erlaubt
somit die Aufspaltung des Quellterms in einzelne separate Berechnungen. Die Lösung
ergibt sich aus des Summe der Einzelergebnisse. Der Green-Funktionen-Formalismus
gestattet die Rückführung der inhomogenen Wärmeleitungsgleichung für einen allgemeinen
Quellterm auf die Lösung für einen Quellterm, der in Ort und Zeit durch die
Dirac-Funktion δ( r– r')
δt ( – t')
gegeben ist. Die Lösung von Gl. (15) mit diesem Quellterms
ergibt mit den Randbedingungen
die Green-Funktion
g( r, t, r' t' , )
∂T(
r, t)
ρCP ------------------ – k∆T( r, t)
= q( r, t)
∂t
lim g( r, t, r' t' , ) = 0 ∀(
r≠r') t → t'
lim g( r, t, r' t' , ) = 0
r → ∞
1
3 2
8ρCp [ πkt ( – t')
] ⁄
r– r'
= ----------------------------------------------- exp – �--------------------- �
�4k( t – t')
�
(15)
(16)
(17)
. (18)
Damit läßt sich die Lösung von Gl. (15) für beliebige Quellterme q( r, t)
als Faltung mit
der Green-Funktion berechnen.
t
�
T( r, t)
= dt'
dr'g(
r, t, r' t' , )q( r', t')
0
∞
�
– ∞
2
(19)

66 ____________________________________________ Kapitel 5: Material und Methoden
Punktquelle
Eine besonders einfache Geometrie mit der sich die laserinduzierte Erwärmung granulärer
Strukturen beschreiben lassen ist die instantane Punktwärmequelle [112]. Sie ergibt
sich direkt aus Gl. (18) und erzeugt eine Temperaturverteilung nach
homogene Kugel
T( r, t)
q
2 3
8ρC p( πkt)
⁄
= ---------------------------------- exp – -------
4kt
(20)
Eine weiter, noch analytisch lösbare Geometrie die zur laserinduzierten Erwärmung granulärer
Strukturen verwendet werden kann ist die homogen erwärmte Kugelgeometrie mit
unterschiedlichen thermischen Eigenschaften. Bei inhomogenen Medien, mit unterschiedlichen
thermischen Materialeigenschaften im betrachteten Volumen ist das Superpositionsprinzip
für die Raumkoordinaten nicht mehr gültig. Der Green-Formalismus
kann aber weiterhin für die zeitliche Temperaturentwicklung angewendet werden. Goldenberg
löste die Kugelwärmequelle unter den folgenden Randbedingungen [56].
T 1
T1 = T2 = 0
T 1
=
T 2
, für t = 0 für alle r (21)
, für r = R für alle t (22)
�
δ
-------- �
δT2
K1 = � , für r = R für alle t (23)
� δr
� �
-------- �K2 δr
�
wobei T die Temperaturen des umgebenden Mediums (2) und der Kugel (1), K die Wärmeleitfähigkeit
und R der Radius der Kugelgeometrie ist. Die Temperatur außerhalb der
Kugel (r > R) ist gegeben durch [56]:
F 2
=
∞
�
0
T2() r
=
AR 3
---------rK1
K1 2F2 --------- – --------
3K2 π
ν 2 – t
exp--------a ν 3
( sinν–
νcosν) [ bνsinνcosσν– ( gsinν– νcosν) sin σν]
-------------------------
( gsinν– νcosν) 2
b 2 ν 2 2 ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- dν
[ + sin ν]
r 2
(24)
(25)

Kapitel 5: Material und Methoden _____________________________________________ 67
wobei: a = ----κ1
; b ------
K2 ; ;
r der Abstand vom Kugelmittelpunkt und die Integrationvariable ist. A ist die Heizrate
des im Volumen absorbierten Lichtes. Innerhalb der Kugel (r < R) ergibt sich
κ =
1
---κ2
g 1 K2 = – ------
K1 σ � r
�
--- – 1�
R �
κ =
1
---κ2
ν
R 2
F 1
=
(26)
(27)
Die homogene Erwärmung kann jedoch nur in so fern übertragen werden, wenn die
Absorptionseigenschaften und die thermischen Eigenschaften der Kugel eine homogene
Wärmeentstehung zulassen.
rechteckige Schicht
K 1
T1() r
∞
�
0
=
AR 2
----------
K1 K1 ---------
3K 2
1 r
-- 1
6
2 � � 2R
� – ----- �
� �
2
+ – --------- F
rπ 1
Der Übergang von einer absorbierenden granulären Schicht zu einer homogen absorbierenden
Schicht kann in vielen Fällen, bei denen das einzelne Granulum keine entscheidende
Eigenschaften als Punkt oder Kugelquelle mehr besitzt, eine signifikante
Reduzierung des Rechenaufwandes bedeuten, da keine einzelnen Superpositionierungen
durchgeführt werden müssen.
Das infinite Medium in der Umgebung der absorbierenden Schicht sei optisch transparent
und besitze homogene thermischen Eigenschaften. Für die absorbierende Schicht werden
die selben thermischen Eigenschaften wie das umgebende Medium angenommen. Die
Absorption des Laserstrahls in der Schicht wird durch das Lambert-Beer-Gesetz beschrieben.
Die Dicke der absorbierenden Schicht in Einfallsrichtung des Laserstrahls wird mit
h bezeichnet und muß von der Dimension her größer der lateralen Ausdehnung des mit
dem Laser bestrahlten Rechtecks mit der Kantenlänge 2 e und 2 f sein ( h« e, h« f ). Der
Quellterm q( r', t')
wird in in die räumliche und zeitliche Funktion aufgeteilt.
R 2
ν 2 – t
exp--------a ν 2
( sinν
– νcosν) sin(
rν ⁄ R)
-------------------------
( gsinν– νcosν) 2
b 2 ν 2 2 ----------------------------------------------------------------------------------- dν
[ + sin ν]
q( r', t')
=
q( r')
⋅ qt' ( )
(28)

68 ____________________________________________ Kapitel 5: Material und Methoden
Der räumliche Quellterm wird durch die Absorption im rechteckigen Bereich der Laserbestrahlung
durch das Lambert-Beer-Gesetz mit dem Absorptionskoeffizien α beschrieben
durch:
wobei die räumlich limittierende Stufenfunktion
ist. Nach einsetzten in Gl. (19) und räumlicher Integration erhält man nach Freund [98]:
wobei
q( r')
= αI0Ψ( e– x')
⋅ Ψf ( – y')
⋅ exp(
– αz')
∀0≤
z'≤h T( r, t)
(29)
(30)
(31)
(32)
Zzt' ( , , h α, k,
) ( – αz)
kt'α (33)
2 z
z h
( ) erf ------------ – α kt' erf
2 kt'
–
� �
= exp exp � – ------------ – α kt' �
� 2 kt' �
Das zeitliche Integral in Gl. (32) entspricht einer Faltung der räumlichen Integration mit
der Laserpulsform Ψ( t')
.
numerische Lösungen
Ψξ ( )
q( r')
= 0 ; sonst
�
� 1 ∀ξ
> 0
= � 1⁄ 2 ∀ξ=
0
�
� 0 ∀(
ξ < 0)
αI0 e x
------------ Ψ( t – t')
erf
8ρCp + x e
------------ erf
2 kt'
–
t � �
= � � – ------------ �
0 � 2 kt'�
f + x x f
erf ------------ erf
2 kt'
–
� �
⋅� – ------------ �⋅Zzt'
( , , h α, k,
)
� 2 kt'�
Alle hier vorgestellten Ergebnisse wurden in eine Softwarebibliothek für das Mathematik-Softwarepaket
Mathematica [97] von Herrn Dr. G. Hüttmann vom Medizinisches
Laserzentrum Lübeck umgesetzt. Dabei werden die nötigen Integrationen mit numerischen
Methoden gelöst. Da bei den Berechnungen hauptsächlich Gewebestrukturen
betrachtet werden, die bis zu 80 % aus Wasser bestehen [96], wurde für alle Medien die
thermischen Eigenschaften für Wasser angenommen. Bei den Temperaturberechnungen
von Melanosomen wurden ebenfalls die thermischen Eigenschaften von Wasser angenommen.
Dadurch ist das raum-zeitliche Superpositionsprinzip nicht verletzt und kann
angewendet werden.

Kapitel 5: Material und Methoden _____________________________________________ 69
5.11.2 Temperatur- und thermische Denaturierungsberechnungen im µs bis
ms-Zeitbereich
Für thermische, als auch für thermomechanische Schäden, ist die laserinduzierte Temperaturänderung
im Gewebe von entscheidender Bedeutung. Bei einer rein thermischen
Denaturierung hängt das Ausmaß des thermischen Schadens dabei direkt von der freien
Energie im geschädigten Volumen ab. Dadurch ist auch eine Additivität der Schäden bei
Mehrfachpulsen gegeben. Bei der Denaturierung als Reaktion erster Ordnung führt das
Arrheniusintegral zu einem Maß für den thermischen Schädigungszustand [13].
wobei
E a
κ
=Aktivierungsenergie,
(Unterschied der inneren Energie zwischen dem aktiviertem Zustand und dem
Anfangszustand)
= Bolzmannkonstante
ist und der Frequenzfaktor A0 durch
gegeben ist, wobei:
R G
N A
h
T
∆S
= Gaskonstante
= Avogadro Konstante
= Plancksches Wirkundquantum
= Temperatur
= Aktivierungsentropie
t
Ω() t A0 e Eg ⁄ κT() t
= ⋅ dt
�
0
A0 e RT
= ⋅ ---------- ⋅ e
NAh S ⁄ RG (34)
(35)
Die Temperaturabhängigkeit des Frequenzfaktors kann gegenüber der starken Abhängigkeit
von kT t in Gl. (34) vernachlässigt werden.
() ⁄
e E g
Mit dem hier beschriebenen Modell werden die Temperaturverläufe und Arrheniusintegrale
bei verschiedenen relevanten Aufpunkten in einem Melanosomenfeld mit den in
vitro Versuchen gemessen Schwellenbestrahlungen berechnet.
∆

70 ____________________________________________ Kapitel 5: Material und Methoden
Zur Berechnung wurden drei Lagen kugelförmiger Melaninpartikel im Abstand von
1.5 µm auf einem regelmäßigen Gitter angeordnet (Abb. 3.1). Im inneren Bereich wurden
61 Kugelwärmequellen (nach Gl.(24) und Gl. (26)) mit Durchmesser 1 µm verwendet.
Zur Reduzierung der Rechenzeit wurden im äußeren Bereich Punktwärmequellen (nach
Gl. (20)) als Melanosomen verwendet. Der gesamte Bestrahlungsdurchmesser lag bei
50 µm. Die einzelnen Melanosomen absorbieren 53 %, was einem Absorptionskoeffitient
von 8.000 cm-1 entspricht, der in Experimenten an Schweine-RPE bestimmt wurde [12].
Die unteren beiden Melanosomenlagen erwärmen sich durch die Abschattung der oberen
Lage entsprechend weniger stark. Die gesamte Schicht absorbiert 56 % der eingestrahlten
Laserleistung was der Absorption von humanen RPE entspricht. Die Temperaturen wurden
an verschiedenen Stellen, an der Oberfläche der Granula bis zum Abstand von 16 µm
berechnet. Zur Berechnung der thermischen Schäden wurde mit diesen Temperaturverläufen
das Schadensintegral nach Arrhenius berechnet. Für die Temperaturabhängigkeit
der Schadensraten wurden die für 1 - 300 ms Bestrahlungszeiten im Tiermodell gefundenen
Parameter verwendet die sich aus der minimalen Sichtbarkeit der Läsionen im Kaninchenmodell
ergaben [92]. Es sind der Frequenzfaktor A0 3 10 und die
Aktivierungsenergie .
44 s 1 –
= ⋅
= 290kJ ⁄ Mol
-2�10 -6 -1�10 -60
1�10 -6 2�10 -6
E a
0.00002
-0.00002
Abbildung 5.31 :Simuliertes dreilagiges Melanosomenfeld mit dem Durchmesser von
50 µm. Im inneren Bereich wurden Kugelwärmequellen mit Radius 0.5µm
und im äußeren Bereich Punktwärmequellen als Melanosomen verwendet.
5.11.3 Berechnungen der Grundtemperaturerhöhung im RPE bei gepulster
Bestrahlung
Wie in Kapitel 5.10 beschrieben, läßt sich mit optoakustischen Methoden die Grundtemperaturänderung
bei Bestrahlung am Auge bestimmen. Da die gemessen Druckamplitude
von der gesamten bestrahlten Fläche emittiert wird, wird damit die über die Fläche räumlich
gemittelte Temperaturerhöhung bestimmt. Zur Berechnung der Grundtemperaturerhöhung
wurde Gleichung (32) verwendet, die eine homogen absorbierende rechteckige
Schicht betrachtet die mit einem zeitlich rechteckigem Laserpuls bestrahlt wird [98]
(Kap. 5.11.1).
0
-0.00002
0
0.00002

Kapitel 5: Material und Methoden _____________________________________________ 71
Zur Bestimmung der räumlich mittleren Temperaturerhöhung wird über die Kreisfläche
im Innern des Rechtecks gemittelt (Abb. 5.32). Für den Fall der repetierenden Bestrahlung
wird die Grundtemperatur des n-ten Laserpulses zur Zeit ( n ⋅ τrep)
durch die Aufsummierung
der vorherigen Grundtemperaturen gegeben durch:
wobei:
Trep( n)
τrep =1/ Laserwiederholrate,
d = Spotdurchmesser,
=
n
�
i = 1
�
A
T( r, ( i ⋅ τrep) ) dF
π( d⁄ 2)
2
--------------------------------------------
(36)
Mit dieser Gleichung werden die Bestrahlungssituationen mit den verwendeten Spotdurchmessern,
Bestrahlung und Laserwiederholrate berechnet.
h
d
0 τ l Zeit
Abbildung 5.32 :Prinzipskizze der Bestrahlungs- und Laserpulsgeometrie für die verwendete
Lösung der Wärmediffusionsgleichung nach Freund [98]. Zur Berechnung
der mittleren Temperatur wird über die Kreisfläche mit Durchmesser
d gemittelt.
I

72 ____________________________________________ Kapitel 5: Material und Methoden

Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion_______________________________________________ 73
6 Ergebnisse und Diskussion
6.1 Spekle-Werte der Lasersysteme
Die Ergebnisse der Spekle-Faktoren sind über 20 Messungen gemittelt in Tabelle 3
zusammengefaßt dargestellt.
Laser
Faserdurch
-messer
[µm]
NA
Faserlänge
[m]
Spekle-Faktor
F
Kontrast K
Spekle-Durch
messer[µm]
Nd:YLF 160 0.1 1 1.68 ± 0.06 0.88 ± 0.04 2.7-4.1
Nd:YLF 160/100 0.1/0.1 1 / 50 1.22 ± 0.05 0.66 ± 0.02 2.8-5.6
Argon 50 0.1 2 3.80 ± 0.03 0.84 ± 0.03 3.2-5.3
Argon 160 0.1 1 3.18 ± 0.02 0.86 ± 0.02 2.3-4.1
exp.
Nd:YAG
klin.
Nd:YAG
50 0.22 50 1.18 ± 0.02 0.11 ± 0.01 n.a.
50 0.1 2 1.41 ± 0.08 0.76 ± 0.05 2.6-4.5
Tabelle 3: Spekle-Werte nach Fasertransmission für die verwendeten Lasersysteme.
Es zeigt sich, dass zur effektiven Reduzierung des Spekle-Faktors für alle Lasersysteme
eine lange Faser notwendig ist. Dabei haben die im Q-switch mode betriebenen Laser
Nd:YAG und Nd:YLF mit einer 50 m langen Faser die niedrigsten Spekle-Faktoren.
Deren Werte liegen schon nahe dem Wert für ein ideales tophat Profil F tophat = 1. Die
Kohärenzlänge der Laser ist durch ihren gepulsten Betrieb beschränkt. Bei kürzer Faser
(1 m, NA = 0.1) erhöht sich beim Nd:YLF schon der Spekle-Faktor um 37 %. Jedoch hat
der cw-Argonlaser mit seiner längeren Kohärenzlänge bei gleicher Faser (1 m, NA = 0.1)
einen deutlich erhöhten Spekle-Faktor um den Faktor 2. Aufgrund der geringen Intensitätsmodulation
nach Fasertransmission bei dem experimentellen Nd:YAG-Laser konnte
keine Spekle-Größe bestimmt werden.
Mit den jeweiligen Spekle-Faktoren F wurden die bei den Schadenschwellen
bestimmte Bestrahlung
Gleichung (5) korrigiert.
auf deren maximale Bestrahlung mittels
laser
laser
H mean
laser
Hmax Aufgrund der Wärmeleitung wird erwartet, dass es gerade bei langen Laserpulsen zu einer
effektiven Verringerung der Temperatur der Melanosomen kommt, die durch die Speklebildung
ungleichmäßig aufgeheizt wurden. Es wurde für den maximal gemessenen

74__________________________________________ Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion
Spekle-Faktor von 3.8 des Argonlasers (50 µm Kern, NA 0.1, 2 m) die Temperaturverteilung
zwei nebeneinander liegender Melanosomen nach Gl.(24) und Gl. (26) exemplarisch
berechnet. Dabei wurden die Melanosomen, wie in Kap. 5.11 beschrieben, als kugelförmige
Wärmequellen mit dem Durchmesser von 1 µm und dem Abstand 2.5 µm mit homogener
Wärmeproduktion angenommen. Als Abstand der beiden Melanosomen wurde der
durchschnittlich größte gemessen Spekle-Radius (halber Durchmesser) aus Tab 3 verwendet,
da dies das gegebene Ausmaß der Bestrahlungsunterschiede mit dem längsten
Wärmediffusionsausgleich ist, unabhängig von der Melanosomendichte. Einem Melanosom
wurde die 3.8-fache Energie des anderen im gleichen Zeitraum zugeführt. Die
Berechnungen wurden für 8 ns, 200 ns, 1.7 µs, 5 µs und 3 ms Pulsdauer durchgeführt.
In Abb. 6.1 sind die Temperaturverteilungen am Ende des jeweiligen Laserpulses auf die
maximale Temperatur normiert dargestellt. Wertet man die berechneten Temperaturunterschiede
der Melanosomenoberfläche relativ zueinander aus, so zeigt sich, dass bei den
kurzen Pulslängen 8 ns bis 1.7 µs der Spekle-Faktor auch direkt in der Temperaturverteilung
gegeben ist. Bei 5 µs Pulslänge ist Temperatur der nebeneinander liegenden Wärmequellen
aufgrund von Wärmediffusion gleichmäßiger verteilt. Die Temperaturdifferenzen
an den beiden Melanosomenoberflächen haben sich bei 5 µs Pulslänge nur um den Faktor
3.4 erhöht. Dies ist eine Verringerung des Spekle-Faktors um 10 % zu einem “effektiven”
Temperaturunterschied um Faktor 3.3 . Erst bei 3 ms Pulsdauer kommt es zu einer effektiven
Reduzierung des Spekle-Faktors durch Wärmediffusion. Für Pulslängen kürzer
1.7 µs wird der Einfluß der Wärmediffusion schon bei einer Spekle-Größe von 2.5 µm
vernachlässigbar.
normierte Temperatur
1.0 8 ns - Faktor 3.8
200 ns - Faktor 3.8
1.7 µs - Faktor 3.8
0.8
5 µs - Faktor 3.4
3 ms - Faktor 2.1
0.6
0.4
0.2
0.0
3 ms
5 µs
1.7µs
200 ns
8 ns
-0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6
Ort [µm]
Abbildung 6.1 :Normierte Temperaturverteilung zweier Melanosomen mit Abstand 2.5 µm
am Ende eines 8 ns, 200 ns, 1.7 µs, 5 µs und 3 ms Laserpulses. Die beiden
Melanosomen wurden um den Faktor 3.8 unterschiedlicher Bestrahlung
ausgesetzt. Der Abstand der Melanosomen entspricht dem mittleren kleinsten
gemessenen Spekle-Größe.

Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion_______________________________________________ 75
Die Korrektur der Bestrahlungswerte mit den gemessenen Spekle-Faktoren ist bei Laserpulsen
kleiner als 1.7 µs korrekt. Bei 5 µs Laserpulsen ist eine Korrektur der Bestrahlungswerte
noch immer zulässig. Es kommt thermisch bedingt zu einer Verringerung des
Spekle-Faktors um 10 % .
6.2 Empfindlichkeit der Schallwandler
Die Kalibrierung wurde wie in Kap. 5.2.4 beschrieben durchgeführt. Für die Bestimmung
der Wandlerempfindlichkeit wurde der erste positive Maximum des Drucksignals ausgewertet.
In Abb. 6.2 sind einzelne mit dem kalibrierten Hydrophon gemessene Transienten
bei verschiedenen Pulsenergien dargestellt. Mit Hilfe von Gl. (8) wurde unter Berücksichtigung
der Verstärkungsfaktoren der Vorverstärker und den durch die Schallaufzeiten
bestimmten Abständen r der Wandler von der Schallquelle die Empfindlichkeit in Bezug
auf das kalibrierte Hydrophon errechnet. Die Daten sind über 10 Messungen gemittelt in
Tabelle 4 zusammengefaßt.
.
Druck [bar]
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
-0.05
-0.10
-0.15
-0.20
-2 0 2 4
Zeit [µs]
6 8 10
Abbildung 6.2 :Gemessene Transienten des kalibrierten Hydrophons bei verschiedenen
applizierten Pulsenergien. Der erste positive Peak wurde zur Kalibrierung
ausgewertet.
Die beiden verwendeten Wandler detektieren die Schallsignale hochempfindlich im
Bereich einiger V / bar . Dazu muß auch beachtet werden, dass mit dieser Kalibrierung
keinerlei Aussage über die spektrale Empfindlichkeit der Wandler gemacht werden kann,
20µJ
30µJ
40µJ
50µJ
60µJ
70µJ
80µJ
90µJ
100µJ
110µJ
120µJ
130µJ

76__________________________________________ Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion
Modell Empfindlichkeit [mV/bar]
Ceram, No.118 Herstellerangabe 15
Valpey-Fisher, VP1093 1050 ± 40
OA-Kontaktglas, Haag-Streit 5100 ± 700
Tabelle 4: Kalibrierungsdaten der verwendeten Schallwandler
da mit einem Signal der Mittenfrequenz 0.5MHz angeregt wurde. Somit gibt diese Kalibrierung
eher die Größenordnung der Empfindlichkeit richtig wieder, als exakte Werte.
Dies ist bei der Beurteilung der späteren Daten immer zu berücksichtigen.
6.3 Empfangscharakteristik des OA-Kontaktglases
Mit Hilfe des Programms ULTRASIM wurde die Empfangscharakteristik des OA-Kontaktglases
in Abhängigkeit der möglichen Behandlungspositionen am Augenhintergrund
untersucht. Dabei wurde, wie in Kap. 5.2.5 beschrieben, die aufgrund der geometrischen
Verkippungen entstandene Änderung der Phasenflächen des akustischen Signals untersucht.
In Vorversuchen zur Simulation wurde mit dem Breitbandhydrophon (Ceram, No. 118)
die Mittenfrequenz der vom RPE emittierten optoakustischen Signale bei Bestrahlung mit
1.7 µs Laserpulsen (10 - 40 µJ) mit dem Aufbau für optoakustische in vitro Messungen
(Kap. 5.5.1) bestimmt. Gemittelt über die Ergebnisse von 12 Schweine-RPE Proben ergab
sich eine Mittenfrequenz von 1 MHZ (Standardabweichung 120 kHz).
Umgesetzt auf die vorliegende Anwendung wurden 20 Punktquellen auf der Bestrahlungsfläche
mit einem Durchmesser von 160 µm am Augenhintergrund gesetzt. Diese 20
Punktquellen wurden in verschiedene Aufpunkten (Abb. 5.14) im Auge zu der jeweiligen
Verkippung der optischen Achse hin verschoben. Als Näherung der gemessenen optoaku-
2 2
stischen Signale wurde ein spektral engerer Burst [ sin()
t ; t0π [ , ⁄ 2]
; – sin()
t ;
t[ π ⁄ 2,
π]
]
(Abb. 6.3) mit der Mittenfrequenz 1 MHz für die Simulation verwendet. Die Punktschallquellen
strahlen zum Zeitpunkt t = 0 eine Wellenlänge ab.

Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion_______________________________________________ 77
Frequenzleistung [a.u.]
Druckamplitude [a.u.]
1,0
0,5
0,0
-0,5
-1,0
-0,5 0,0 0,5 1,0 1,5
Zeit [µs]
1E-6
1E-7
1E-8
1E-9
1E-10
1E-11
1E-12
0,1 1 10
Frequenz [MHz]
Abbildung 6.3 :Angenäherte anregende Burst-Funktion mit 1 MHz Mittenfrequenz und
dazugehöriges Frequenzleistungsspektrum.
In der Wandlerebene aus Abb. 5.14 wird die Druckverteilung zu verschiedenen Zeitpunkten
nach dem Hygenschen Prinzip errechnet. Dabei werden die Druckwerte über den ringförmigen
Bereich (Abb. 6.4) der Wandlerfläche integriert.
Abbildung 6.4 :Druckverteilung in der Wandlerebene zum Zeitpunkt 15.9 µs nach Abstrahlung
der Schallwelle bei 10° Verkippung des Auges. Über die ringförmige
Wandlerfläche wird das Schallsignal numerisch integriert.
In Abb. 6.5 ist die Druckverteilung in der Wandlerebene zu verschiedenen Zeitpunkten
bei einer Versetzung des Aufpunktes im Auge um 10 ° dargestellt. Man erkennt das
dezentrale Auftreffen der Druckverteilung zum Zeitpunkt 15.9 µs.

78__________________________________________ Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 6.5 : Druckverteilung in der Wandlerebene zu verschiedenen Zeitpunkten bei
Versetzung des Aufpunktes im Auge um 10°. Man erkennt bereits im ersten
Bild ein dezentrales Auftreffen der Druckverteilung. Über die ringförmige
Wandlerfläche (Abb. 6.4) wird anschließend numerisch integriert.
Es wurde für die bei der Behandlung mögliche Versetzungen des Aufpunktes im Auge die
so detektierbare Schallwelle simuliert. In Abb. 6.6 sind die so ermittelten Transienten für
einen Verkippungsbereich von 0° bis 40° dargestellt. Bei einer Behandlung würde 0° einer
zentralen Makulabehandlung entsprechen und 40° der Probeläsionen außerhalb des
Gefäßbogens. Bei 0° wird die höchste Amplitude und die zeitlich kürzeste Transiente
erreicht, die schon um den Faktor 1.5 länger ist als die anregende Welle. Bei größeren
Winkeln wird die Amplitude bis um den Faktor 2 kleiner und es kommt zu einer starken
Verbreiterung der anregenden Welle um den Faktor 5, da durch Verkippung die Laufzeit
der Schallwelle über die Wandlerfläche größer wird.
Diese Veränderungen spiegeln sich auch im Frequenzraum wieder (Abb. 6.7). So ist das
Frequenzmaximum der bei 0 ° Verkippung detektierten Welle von 1 MHz auf 0.6 MHz
abgefallen. Bei einer Winkelverkippung nimmt der obere Frequenzbereich stark ab und
im Frequenzbereich unter 1 MHz wird entsprechend der geringeren Amplituden das
Spektrum niedriger. Das Frequenzmaximum bleibt bei ca. 0.6 MHz.
Wandlersignal [a.u.]
1.0
0.5
0.0
-0.5
-1.0
0 Grad
5 Grad
10 Grad
15 Grad
20-Grad
30 Grad
40 Grad
14 15 16 17 18 19
Zeit [µs]
Abbildung 6.6 : Zu den verschiedenen geometrischen Versetzungen des Aufpunktes im Auge
ermittelte Drucktransienten. Es kommt zu einem unterschiedlichen Beginn
der Transiente als auch zu einer zeitlichen Verbreiterung.

Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion_______________________________________________ 79
Frequenzleistung [a.u.]
1E-6
1E-7
1E-8
1E-9
1E-10
1E-11
1E-12
Anregungsspektrum
0.1 1 10
100
10
1
0.1 0 Grad
0.01
5 Grad
10 Grad
1E-3
15 Grad
20 Grad
1E-4
1E-5
30 Grad
40 Grad
0.1 1 10
Frequenz [MHz]
Abbildung 6.7 : Frequenzverschiebungen durch die Versetzungen des Aufpunktes im Auge.
Je stärker die Verkippung, desto mehr hohe Frequenzen werden abgeschnitten.
Die Mittenfrequenz von 0.6 Mhz bleibt erhalten.
Zusammenfassend läßt sich sagen, dass bei der Anwendung des OA-Kontaktglases am
Auge eine große Variabilität an Signalformen aufgrund der unterschiedlichen Lokalisation
des Schallquellpunktes im Auge zu erwarten ist. Vorausgreifend auf die Ergebnisse
des OA-Kontaktglases zur On-line Dosimetrie der RPE-Schäden bei Patientenbehandlung
(Kap. 6.7), bei der Pulsabweichungen der optoakustischen Transiente zur Datenanalyse
detektiert werden müssen, läßt sich aus der Schallfeldsimulation schließen, dass
keine Referenztransiente definiert werden kann. Die erwarteten optoakustischen Signalformen
bei unterschiedlichen Lokalisationen im Auge werden bis um den Faktor 2 zeitlich
verlängert und die Amplitude um den selben Faktor verringert.
Durch die Breite des Ringwandlers kommt es hauptsächlich zu einer Frequenzverschiebung
in tiefere Frequenzen, die bei den verschiedenen Winkeln nahezu gleich bleiben.
Dies kann durch einen schmaleren Wandlerring reduziert werden, womit auch eine Verringerung
der Empfindlichkeit einhergeht. Aufgrund der erwarteten schwachen Drücke
von einigen mbar ist eine hohe Empfindlichkeit und damit eine große Wandlerfläche notwendig.
Da der Einbau eines Schallwandlers in ein Kontaktglas keine idealen Randbedingungen
zuläßt, ist zu erwarten, dass innerhalb des Kontaktglases sich Reflexionen der
einfallenden Welle bilden. Diese Schallreflexionen lassen sich aufgrund der notwendigen
Frequenzbreite des Wandlers nicht wegdämpfen.

80__________________________________________ Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion
6.4 Temperaturmessung mit Optoakustik
6.4.1 Temperaturabhängigkeit der Druckamplitude für Schweine RPE
Mit dem in Kapitel 5.5.1 beschrieben Aufbau wurden an insgesamt 17 Schweine-RPE
Proben die Materialkonstante TRPE bestimmt. Trägt man die Probentemperatur über das
gemessene Durckmaximum auf, so erhält man einen linearen Zusammenhang. In
Abb. 6.8 ist exemplarisch eine Messung dargestellt.
[a.u.]
Druckamplitude p max
1.00
0.95
0.90
0.85
0.80
Messdaten
lineare Regression
mit T(P) = T + (B P RPE 0 max / I ) 0
15 20 25 30 35 40
Temperatur [°C]
Abbildung 6.8 : RPE Probentemperatur über der maximalen Durckamplitude. Die Amplitude
erhöht sich linear mit der Probentemperatur (Nd:YLF, 250 ns, 1 Hz,
160 µm spot)
Zur Bestimmung der Materialkonstanten TRPE wird ein linearer Datenfit mit
Gleichung (14) durchgeführt. Es ergab sich über die Ergebnisse von 17 Proben gemittelt
ein Wert von TRPE = – 52,3( ± 20,5)
°C. Mit diesem Wert werden alle Daten der OA-Temperaturbestimmung
ausgewertet. Dabei zeigt sich die relativ große gemessene Standardabweichung
von TRPE als Fehlerbalken jedes einzelnen Temperaturmesspunktes.
Die Messungen zeigen, dass die Linearität der Temperatur über dem Druckmaximum im
gemessenen Temperaturbereich zwischen 16 - 45 °C gegeben ist. D.h., der Grüneisenparameter
hängt in diesem Temperaturbereich linear von der Probentemperatur ab. Da aber
nur relative Druckmessungen gemacht wurden, kann der Grüneisenparameter selbst nicht
bestimmt werden.
Es kann angenommen werden, dass in diesem Temperaturbereich keine Strukturänderung
des Schweine-RPE stattgefunden hat. Erst bei höherer Langzeit-Temperaturerhöhung
ändern sich die optischen Eigenschaften des RPE durch thermische Denaturierung [28].
Dies kann durch eine Erhöhung der Lichtstreuung zu einer Änderung der OA-Transiente
führen [87]. Deshalb wurden keine Messungen bei höheren Temperaturen durchgeführt.

Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion_______________________________________________ 81
Ebenso kann es zu einer Depolarisierung des Schallwandlermaterials beim Erreichen der
Curie-Temperatur kommen [62, 67]. Der Wandler sollte jedoch nach Händlerinformationen
nicht über 80 °C erwärmt werden.
Für Lebergewebe des Hundes läßt sich aus den Daten von Larin [89] und Esenaliev [87]
eine Materialkonstante von ebenfalls -50 °C bis -54 °C ermitteln. Bei Esenaliev ergibt
sich durch eine Interpolation der Meßdaten für Myokard-Gewebe des Hundes eine Kalibrationstemperatur
von -118 °C, wobei eine Referenzmessung am Wasser auf +3 °C
kommt [87]. Die gemessene Materialkonstante für Schweine-RPE liegt im Bereich der für
andere Gewebearten bestimmten Werte. Ein Vergleich von Leber- und Myokardgewebe
des Hundes zeigt, dass die Materialkonstanten für verschiedene Gewebearten recht unterschiedlich
ausfallen können.
Da die Materialkonstante TRPE die Temperatur der Druckamplitudenumkehr bei thermoelastischer
Druckentstehung ist, läßt sich daraus schließen, dass nicht das intrazelluläre
Wasser für die Generierung der Drucktransiente verantwortlich ist. Dies ist
erstaunlich, da bei einem Melanosom während eines 200 ns Laserpulses 40 % der absorbierten
Energie durch Wärmediffusion an das umgebende Zellwasser während des Laserpulses,
also auch während der Erzeugung der Schallwelle, abgegeben wird [11]. Für
reines Wasser ergibt sich eine Temperatur der Druckumkehr von 4 °C [100]. Selbst bei
starken Verunreinigungen durch Elektrolyte, was eher dem Zellwasser in der RPE-Zelle
entspricht, verschiebt diese Temperatur nur um bis zu 2 °C [65]. Ob die Melaningranula
direkt oder sowohl die Granula wie auch das Zellwasser zusammen für die Materialkonstante
TRPE verantwortlich sind, kann nicht geklärt werden.
Die Messungen wurden bei einer Bestrahlung von 50 mJ/cm² pro Puls durchgeführt. Bei
Patientenbehandlungen werden jedoch bis zu 600 mJ/cm² pro Puls auf der Retina appliziert.
Es wurde bereits bei Messungen an Wasser gezeigt, dass eine Veränderung der Pulsenergie
den Punkt der Druckumkehr kaum verschiebt [65]. Selbst bei Bestrahlung bis zur
Verdampfungsschwelle verschiebt sich die ermittelte Temperatur nur um 0.5 °C [65].
Diese kleine Variation kann in unserer Anwendung vernachlässigt werden, da die Standardabweichung
der gemessenen Materialkonstante TRPE über eine Größenordnung
höher ist als die zu erwartende Abweichung. Nur die Steigung der Funktion Druckmaximum
über Probentemperatur wird bei Erhöhung der Pulsenergie steiler, der Achsenschnitt
für P = 0 bleibt konstant [65].
6.4.2 Temperaturmessungen an Schweine-RPE bei gepulster Bestrahlung
Bei der Bestrahlung von Schweine-RPE Proben mit 1.7 µs Nd:YLF Laserpulsen bei einer
Pulswiederholrate von 500 Hz und 160 mJ/cm² pro Puls wurden die OA-Transienten mit
dem in Kap. 5.5.1 beschriebenen Aufbau gemessen. Der Normierungswert B0 wurde
0
nach Gl. (13) mit den Werten T0 , TRPE , sowie dem gemessenem Pmax bestimmt. Alle
i
darauffolgenden Druckmaximalwerte Pmax des i-ten Laserpulses wurden nach Gl. (14) zu
Temperaturwerten umgerechnet und in Abb. 6.9 aufgetragen. Da die Materialkonstante

82__________________________________________ Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion
TRPE fehlerbehaftet ist, wurde die gemessene Temperatur für den Mittelwert wie auch
die obere als auch die untere Standardabweichung mit dargestellt. Die Grundtemperaturkurve
beginnt bei der Küvettenwassertemperatur von 18 °C und steigt bis auf 55 °C nach
100 applizierten Laserpulsen. Die Berechnung der Grundtemperaturerhöhung mit der
Aufsummierung der einzelnen Resttemperaturen nach Gl. (36) mit denselben Bestrahlungsparametern
und angefitteten 87 % Lichtabsorption in Schweine-RPE ergibt eine
gute Übereinstimmung mit den gemessenen Werten mit einer maximalen Abweichung
von 8 °C.
Temperatur [°C]
70
60
50
40
30
20
10
0 20 40 60 80 100
Pulszahl [n]
Berechnung
Messung (oben)
Messung (mittel)
Messung (unten)
Abbildung 6.9 : Beispiel für eine Grundtemperaturmessung bei repetitiv gepulster Bestrahlung
von Schweine-RPE. (Nd:YLF, 1,7 µs, 500 Hz, 160 mJ/cm, 100 Pulse,
160 µm spot) Eine Anpassung der Temperaturberechnungen ergibt für
diese Messung 87 % Lichtabsorption im Schweine-RPE. Die gemessenen
Werte wurden jeweils mit dem Mittelwert und der oberen und unteren Standardabweichung
der Materialkonstanten T RPE aufgetragen.
Da für die Lichtabsorption von Schweine-RPE keine Daten oder Literaturwerte vorliegen,
kann ein Vergleich mit der durch die Rechnung angepaßten 87 % Absorption nicht im
Detail erfolgen. Die Schweine-RPE Proben wurden, wie auch schon in Kap. 5.3 beschrieben,
in der Hinsicht vorsortiert, dass nur stark pigmentierte Proben präpariert wurden.
Eine Vergleichbarkeit der gemessenen Grundtemperaturerhöhungen bei verschiedenen
applizierten Pulsenergien erhält man durch die Normierung der Grundtemperaturerhöhung
auf die verwendete Pulsenergie. Beispielhaft sind die Temperaturkurven bei drei
verschiedenen Pulsenergien (21 - 32 µJ, sonst die gleichen Parameter wie zu Abb. 6.9)
übereinandergelagert dargestellt (Abb. 6.10). Der Überschaubarkeit halber wurde in diesen
Graphen auf die oberen und unteren Temperaturen aufgrund des Fehlers von TRPE verzichtet.

Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion_______________________________________________ 83
normierte Temperaturerhöhung [ °C / µJ ]
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
0 20 40 60 80 100
Pulszahl [n]
21µJ
26µJ
32µJ
Abbildung 6.10 :Auf die jeweils applizierte Pulsenergie normierte Grundtemperaturerhöhung
von Schweine-RPE bei repetitierender Bestrahlung (Nd:YLF, 1.7 µs,
500 Hz, 100 Pulse, 160 µm spot).
Bei der Bestimmung der Materialkonstanten TRPE wurde die Linearität nur in dem Temperaturbereich
bis 45 °C gezeigt. Bei der Auswertung zu Abb. 6.9 wird die Linearität des
Grüneisenkoeffizienten von RPE auch im höheren Temperaturbereich angenommen.
Für die Messungen zu Abb. 6.10 ergibt sich bei einem Absorptionskoeffizienten von
µ a=0.8 µm -1 und der Bestrahlung mit 160 mJ/cm² (32 µJ) eine Temperaturspitze von
53 °C an der Oberfläche eines einzelnen, isolierten Melaningranula [11], was mit der
Starttemperatur von 18 °C eine maximale Temperaturspitze von 71 °C ergibt. Für die
Bestrahlung mit 109 mJ/cm² (21 µJ) wird die Melanosomenoberfläche dagegen auf nur
54 °C erwärmt. Trotz einer Differenz der Temperaturspitzen von 17 °C der beiden Pulsenergien
ergibt sich eine gute Übereinstimmung der Werte in Abb. 6.10.
Wäre die Linearität des Grüneisenparameters bei hohen Temperaturen nicht gegeben, so
müßte in Abb. 6.9 die Übereinstimmung der Meßwerte mit den Berechnungen gerade bei
den hohen Temperaturen gegen Ende des Pulszuges nachlassen. Bei den Ergebnissen zu
Abb. 6.10 sollte sich eine systematische Abweichung der Kurven bei verschiedenen Pulsenergien
ergeben, was aber nicht der Fall ist.
6.4.3 Temperaturbestimmung bei Patientenbehandlungen
Bei Patientenbehandlungen wurden optoakustische Messungen bei sowohl
500 Hz / 100 Pulse, als auch 100 Hz / 30 Pulse durchgeführt. Die 500 Hz Pulswiederholrate
waren aus den ersten Tierversuchen von Birngruber und Roider [2] für die Patientenbehandlung
übernommen worden.

84__________________________________________ Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion
Die ersten 50 Patienten der klinischen Pilotstudie wurden mit dieser Wiederholrate behandelt.
Die optoakustischen Temperaturmessungen zeigten jedoch, dass es durch die Verwendung
eines retinalen Bestrahlungsdurchmessers von 176 µm bei Patienten im
Vergleich zu 102 µm [2] bei den Tierversuchen von Roider und Birngruber zu einer erheblichen
Grundtemperaturerhöhung aufgrund der höheren Pulsenergien und hohen Wiederholrate
kommt. Diese induzierte Grundtemperaturerhöhung steht im Gegensatz zur
eigentlichen Idee der selektiven RPE-Behandlung mit geringer thermischen Belastung
der angrenzenden Photorezeptoren. Deswegen wurde die Studie mit 100 Hz Wiederholrate
und 30 Laserpulsen fortgeführt. Die Ergebnisse der optoakustischen Temperaturmessung
der beiden unterschiedlichen Behandlungsparameter sind im folgenden dargestellt.
Behandlungsparameter: 500 Hz Pulswiederholrate, 100 Pulse
Die Messungen zur Grundtemperaturerhöhung bei 500 Hz wurden in der Augenklinik
Regensburg mit dem klinischen Nd:YAG Prototypen (Kap. 5.1.2) der Firma Zeiss durchgeführt.
Der verwendete Spotdurchmesser am Augenhintergrund war 200 µm. Es wurden
50 - 180 µJ appliziert.
Bei den Behandlungen wurden die OA-Transienten mit dem in Kap. 5.5.2 beschriebenen
Aufbau gemessen. Der Normierungswert B0 wurde nach Gl. (13) mit den Werten T0 ,
0
TRPE , sowie dem gemessenen Pmax bestimmt. Alle darauffolgenden Druckmaximum-
i
werte Pmax des i-ten Laserpulses wurden nach Gl. (14) zu Temperaturwerten umgerechnet.
Die gemessenen Temperaturwerte sind exemplarisch anhand einer Messung in Abb. 6.11
dargestellt. Die Grundtemperaturkurve beginnt bei der Körpertemperatur von 37 °C und
steigt bis über 90 °C nach 100 applizierten Laserpulsen. Die Fehlerbalken der einzelnen
Meßwerte entsprechen der Standardabweichung der Materialkonstanten TRPE . Die
Berechnung der Grundtemperaturerhöhung mit der Aufsummierung der einzelnen Resttemperaturen
nach Gl.(36) mit den gleichen Bestrahlungsparametern und angepaßten
52 % Lichtabsorption für menschliches RPE ergibt eine gute Übereinstimmung mit den
gemessenen Werten. Der angepaßte Wert der RPE-Absorption stimmt gut mit den in der
Literatur angegebenen Werten zwischen 50 % [28] und 60 % [29] überein. Bei diesem
Behandlungsareal wurde trotz der hohen Grundtemperatur von 100 °C keine sichtbare
Läsion erzeugt.

Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion_______________________________________________ 85
Temperatur [°C]
120
100
80
60
40
20
Berechnung
Messung (oben)
Messung (mittel)
Messung (unten)
0 20 40 60 80 100
Pulszahl [n]
Abbildung 6.11 :Beispiel einer Messung der Grundtemperaturerhöhung bei Behandlung
mit repetitiver gepulster Bestrahlung. (Nd:YAG, 800 ns, 500 Hz, 100 µJ,
100 Pulse, 200 µm spot) Die Lösung der Wärmediffusionsgleichung ergibt
bei 52 % Lichtabsorption eine gute Übereinstimmung. Die gemessenen
Werte wurden jeweils mit dem Mittelwert und der oberen und unteren Standardabweichung
der Materialkonstanten TRPE aufgetragen.
Behandlungsparameter: 100 Hz Pulswiederholrate, 30 Pulse
Die Patienten wurden mit dem Nd:YLF-Laser (Kap. 5.1.1) bei 1.7 µs Pulsdauer, 100 Hz
Wiederholrate und 30 Laserpulsen am Medizinischen Laserzentrum Lübeck behandelt.
Zur Messung der OA-Transienten wurde der in Kap. 5.5.2 beschriebene Aufbau verwendet.
Die Datenauswertung wurde, wie bei den 500 Hz Behandlungen beschrieben, durchgeführt.
Abbildung 6.12 zeigt beispielhaft eine Temperaturmessung bei einer Behandlung. Mit
den verwendeten Bestrahlungsparametern und angepaßten 32 % Lichtabsorption RPE
ergibt sich für diesen Spot eine gute mittlere Übereinstimmung mit den gemessenen Werten.
Paßt man die Kurve auf die Endtemperatur von 44 °C an, so erhält man 52 % Absorption
im RPE. Bei diesem Behandlungsschuß wurde ebenfalls keine sichtbare Läsion
erzeugt. Die maximale Abweichung der gemessenen Temperatur zu der angepaßten Temperaturberechnung
beträgt 2.5 °C.
Die mit diesem Behandlungsparameter zu detektierenden Amplitudenänderungen von
10 % sind bei den Pulsenergieschwankungen von mehreren Prozent des Nd:YLF Lasers
nur schwer zu detektieren. Durch Mitteln über alle gemessenen 296 Laserpulszüge, die
mit genau 100 µJ Pulsenergie bei 38 Behandlungen appliziert wurden, können die durch
die schwankende Pulsenergie erzeugten Fluktuationen herausgemittelt werden
(Abb. 6.13). An die gemessenen Daten wurden die Ergebnisse der Temperaturberechnungen
mit 26 % Lichtabsorption angefittet.

86__________________________________________ Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion
Temperatur [°C]
46
44
42
40
38
36
34
Berechnung
Messung (oben)
Messung (mitte)
Messung (unten)
0 5 10 15 20 25 30 35
Pulszahl [n]
Abbildung 6.12 :Beispiel einer Messung der Grundtemperaturerhöhung bei Behandlung
mit repetitiver gepulster Bestrahlung. (Nd:YLF, 1.7 µs, 100 Hz, 100 µJ, 30
Pulse, 178 µm spot) Die Temperaturberechnungen ergeben bei angefitteter
32 % Lichtabsorption eine gute Übereinstimmung mit den Messwerten. Die
gemessenen Werte wurden jeweils mit dem Mittelwert und der oberen und
unteren Standardabweichung der Materialkonstanten T RPE aufgetragen.
Grundtemperaturerhöhung [°C]
41
40
39
38
37
36
35
Temperaturberechnung
Messung (oben)
Messung (mitte)
Messung (unten)
0 5 10 15 20 25 30 35
Pulsnummer [n]
Abbildung 6.13 :Über 296 Transienten von 38 Patienten gemessene Grundtemperaturerhöhung
bei Behandlung mit repetitiver gepulster Bestrahlung. (Nd:YLF,
1.7 µs, 100 Hz, 100 µJ, 30 Pulse, 178 µm Spot) Die Anpassung der
Temperaturberechnungen ergeben 26 % Lichtabsorption. Die gemessenen
Werte wurden jeweils mit dem Mittelwert und der oberen und unteren Standardabweichung
der Materialkonstanten T RPE aufgetragen.

Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion_______________________________________________ 87
Die bei den Messungen mit 100 Hz Pulswiederholrate ermittelte Lichtabsorption von
Durchschnittlich 26 % liegt um den Faktor 2 unterhalb der Literaturwerten. Warum sich
dies nur für die Ergebnisse bei 100 Hz Pulswiederholrate ergibt, aber nicht bei 500 Hz
Pulswiederholrate ist unklar, da in beiden Fällen das selbe Meßprinzip und die selben
Annahmen gemacht wurden.
Vergleich der Behandlungsparameter 500 Hz vs. 100 Hz
Bei einer Wiederholrate von 500 Hz zeigt sich eine starke Grundtemperaturerhöhung auf
über 90 °C. Bei dieser Temperatur ist ein thermischer Schaden der Photorezeptoren nicht
mehr auszuschließen und ein ophthalmoskopisch sichtbaren Schaden ist zu erwarten. Für
300 ms cw-Bestrahlung konnte aber auch in Versuchen an Kaninchen experimentell
gezeigt werden, dass bei 86°C Maximaltemperatur in den Photorezeptoren noch kein
sichtbarer Schaden entsteht [90, 91].
Nach Patientenbehandlungen wurde durch Mikroperimetrie gezeigt, dass die Photorezeptoren
nach selektiver RPE Behandlung mit diesem Parametersatz noch funktionsfähig
sind [3]. Im Rahmen der klinischen Pilotstudie kam es bei 500 Hz Wiederholrate sehr selten
zu sichtbaren Läsionen (0.1 %). Bei niedriger Wiederholrate von 100 Hz ist die laserinduzierte
Temperaturerhöhung von 7 °C deutlich niedriger. Bei über 50 Behandlungen
mit den umgestellten Behandlungsparametern 100 Hz, 30 Pulse wurden keine sichtbaren
Läsionen mehr erzeugt. Durch diese großen Grundtemperaturunterschiede sollte sich eine
Vergrößerung der therapeutische Breite mit dem neuen Behandlungsparameter 100 Hz,
30 Pulse im Vergleich zu 500 Hz, 100 Pulse erreichen lassen. Wie groß diese Unterschiede
quantitativ ausfallen war zum Teil Ziel der Tierversuchsstudie.
Bei den bestimmten Temperaturwerten ist zu beachten, dass sie mit der Materialkonstanten
TRPE von Schweine-RPE bestimmt wurden. Für eine Anwendung dieser optoakustischen
Technik zur Therapiekontrolle bei anderen ophthalmologischen
Laseranwendungen sind noch Messungen für humanes RPE zu machen. Große Abweichungen
sind eigentlich aufgrund der Ähnlichkeit der retinalen Strukturen und vor allem
des Melanins nicht zu erwarten.
6.4.4 Temperaturgenauigkeit der OA-Temperaturmessung
Aufgrund der Standardabweichung bei der Materialkonstante TRPE muß bei jeder relativen
Temperaturerhöhung ein absoluter Fehler von 17 % mit einbezogen werden. Dieser
Fehler könnte nur durch deutlich mehr Proben (n > 100) bei der Bestimmung der Materialkonstante
TRPE reduziert werden.
Da bei den Versuchen bei 100 Hz Pulswiederholrate die angepaßte retinale Absorption
um 50 % von den Literaturwerten abweicht, und die genaue Ursache dafür im Rahmen
dieser Arbeit geklärt werden konnte, muß für diese Messungen ein relativer Fehler von
ebenfalls 50 % angenommen werden. Die Ursache hierfür ist unklar, und kann nicht aus

88__________________________________________ Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion
den Ergebnissen abgeleitet werden. Demgegenüber konnte bei den Messungen mit
500 Hz Pulswiederholrate eine Absorption von 52 % angepaßt werden, die in guter Übereinstimmung
mit den Literaturwerten ist.
Bei den Patientenbehandlungen konnten Temperaturänderungen durch die Auswertung
einzelner Laserpulszüge mit maximaler Abweichung von 5.5 °C bestimmt werden. Eine
Auflösung von bis zu 1 °C sollte mit einem pulsstabilen Laser zu erreichen sein. Dies
wäre für die meisten Laseranwendungen am Auge ausreichend. Eine Reduzierung der
Schwankungen innerhalb eines Meßzykluses wie in Abb. 6.12 würde eine Normierung
der Druckamplitude auf die Laserpulsenergie bringen, da die Amplitude in kleinen Energiebereichen
als linear angesehen werden kann.
6.4.5 Grundtemperaturerhöhung bei repetitiver Bestrahlung in Abhängigkeit
des Bestrahlungsdurchmessers
Die Erhöhung der Pulszahl pro Läsion bei maximaler Bestrahlungsdauer von 300 ms
kann nur durch eine Steigerung der Pulswiederholrate erreicht werden. Die Pulswiederholrate
ist wiederum durch die Grundtemperaturerhöhung (Abb. 5.30) bei großen
Bestrahlungsdurchmessern beschränkt. Durch Verringerung des Bestrahlungsdurchmessers
kann eine höhere Pulswiederholrate und damit eine höhere Pulszahl innerhalb von
300 ms appliziert werden. Es wurde bei 100 mJ/cm² und 50 % Absorption im RPE für
verschiedene Bestrahlungsdurchmesser die Grundtemperaturerhöhung am Ende des
Laserpulszuges nach 300 ms in Abhängigkeit der Pulsfolgerate berechnet. Zur Begrenzung
des Rechenaufwandes wurde nur die Temperatur des Mittelpunktes der bestrahlten
Fläche berechnet. Die rechenintensive Integration über die gesamte Bestrahlungsfläche
aus Gleichung (36) wurde nicht durchgeführt. Die dadurch bedingten Temperaturabweichungen
sind aufgrund der langen Diffusionszeit minimal. Der Mittelpunkt der bestrahlten
Fläche stellt immer den wärmsten Punkt der Fläche zu dem Zeitpunkt direkt von dem
nächsten Laserpuls dar. Diese Berechnung ist als untere Abschätzung der Temperaturbelastung
für die an das RPE angrenzende Photorezeptoren durch hoch repetitive Bestrahlung
zu sehen. Eine genauere Abschätzung des möglichen thermisch induzierten
Photorezeptorschaden ist nur durch die Berechnung des Arrheniusintegrals mit Hilfe des
gesamten Zeit-Temperaturverlaufs möglich.
In Abb. 6.14 sind die entstehenden Grundtemperaturerhöhungen bei 100 mJ/cm² für verschiedene
Bestrahlungsdurchmesser in Abhängigkeit der Pulswiederholrate dargestellt.
Bei kleinen Bestrahlungsdurchmessern ergibt sich kein linearer Zusammenhang zwischen
der applizierten Pulswiederholrate und der Temperaturerhöhung. Dies entsteht durch die
nichtlineare Abkühlung nach einem applizierten Laserpuls. Die Berechnungen wurden
mit einer Pulslänge von 1.7 µs durchgeführt. Bei kürzeren Laserpulsen ergibt sich zwar
direkt nach dem Laserpuls eine höhere Temperatur in der bestrahlten Fläche, die aber
durch die lange Diffusionszeit bis zum nächsten Laserpuls im ms-Zeitbereich ausgeglichen
werden. Solange die Pulsdauer klein gegenüber der Zeit zwischen zwei Laserpulsen

Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion_______________________________________________ 89
ist, sind die Temperaturabweichungen klein. Werden statt der 1.7 µs Laserpulse 8 ns
Laserpulse bei gleichen Parametern (100 mJ/cm², 100 Hz, 100 µm Spot) appliziert, so
ergibt sich eine berechnete Temperaturdifferenz von 0.002 %.
Temperaturerhöhung pro 100mJ/cm² [°C]
0 30 60 90 120 150 180 210 240 270
50
40
30
20
10
Temperaturerhöhung pro 100mJ/cm² [°C]
Anzahl der applizierbaren Pulse bei 300ms Bestrahlungszeit
0 30 60 90 120 150 180 210 240
10
8
6
4
2
400µm bei 350µm 100mJ/cm²
300µm
250µm
Anzahl der applizierbaren Pulse bei 300ms Bestrahlungszeit
200µm 150µm125µm 100µm
75µm
50µm
bei 100mJ/cm²
0
0 100 200 300 400 500
Pulswiederholrate [Hz]
600 700 800
400µm
350µm
300µm
250µm
200µm
150µm
125µm
100µm
75µm
50µm
0
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900
Pulswiederholrate [Hz]
Abbildung 6.14 :Grundtemperaturerhöhung am Ende des Pulszuges nach 300 ms Gesamtbestrahlungsdauer
in Abhängigkeit der Pulswiederholrate für verschiedene
Bestrahlungsdurchmesser. Die Temperaturen wurden bei 100 mJ/cm²
und 50 % Lichtabsorption im RPE berechnet. Da sich die Temperatur
linear mit der Bestrahlung erhöht, kann für die jeweiligen Bestrahlungsparameter
die Grundtemperaturerhöhung bestimmt werden.
Aus dieser Darstellung läßt sich die erwartete Grundtemperatur für beliebige Parametersätze
bestimmen. Um eine hohe Anzahl von Laserpulsen pro Pulszug applizieren zu können,
muß eine hohe Repetitionsrate gewählt werden. Zur Vermeidung hoher
Grundtemperaturerhöhungen muß ein entsprechend kleiner Bestrahlungsdurchmesser
gewählt werden.
Da die thermische Denaturierung der Photorezeptoren durch eine Arrheniusdenaturierung
beschrieben werden kann, ist ersichtlich, dass keine “Schwellentemperatur” für einen
Photorezeptorschaden definiert werden kann. Die Temperatur, bei der eine thermische
Denaturierung der Retina einsetzt ist stark von der applizierten Pulsdauer abhängig [13].
Für 300 ms Bestrahlungszeit konnte in Versuchen an Kaninchen gezeigt werden, dass
unterhalb 50°C Temperaturerhöhung keine “Weißfärbung” einsetzt, d.h. insgesamt 86°C

90__________________________________________ Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion
Maximaltemperatur in den Photorezeptoren [90, 91]. Bei 10 sec Bestrahlungszeit reichen
jedoch hingegen schon 10°C Temperaturerhöhung aus um eine sichtbare Läsion zu erzeugen
[102].
6.5 Retinale Schadensmechanismen und -schwellen
6.5.1 Mikroblasenbildungs- und RPE-Zellschadensschwellen bei Lichtexposition
im µs- bis ms-Zeitbereich
Mit den in Kap. 5.7 beschrieben Aufbau wurden Schweine-RPE Proben mit den Pulslängen
5 µs, 50 µs, 500 µs und 3 ms bestrahlt. Mindestens sechs RPE-Proben von jeweils
verschiedenen Schweineaugen wurden pro Pulslänge mit verschiedenen Pulsenergien
bestrahlt. Insgesamt wurden bei diesen Versuchen 1487 Laserpulse appliziert. Im Folgenden
sind typische gemessene Drucktransienten und Reflexionssignale bei 5 µs und 3 ms
Bestrahlung dargestellt.
5 µs Pulsdauer
In Abb. 6.15 sind repräsentativ drei optoakustische Transienten und die ebenfalls gemessenen
Reflexionssignale bei Bestrahlung mit 5 µs Laserpulsen bei verschiedenen Pulsenergien
dargestellt. Bei der Bestrahlung genau an der Schwellenenergie von 5.5 µJ für
Mikroblasenbildung (Abb. 6.15 A/B) wurde bei diesem Laserpuls keine RPE-Zelle
geschädigt. Es ist keine optoakustische Transiente meßbar. Da die applizierten Laserpulslänge
von 5 µs viel größer als die akustische Transitzeit des RPEs von 6 ns ist, wird die
absorbierte Energie nicht effektiv in ein thermoelastischen Signal umgesetzt. Da im Vergleich
zu den in vitro Messungen an Schweine-RPE mit den Parametern der Patientenbehandlungen
(1.7 µs, 160 µm Spot) ein längerer Laserpuls und auch ein kleinerer
Spotdurchmesser verwendet wird, ist die zu erwartende Durckamplitude um 96 % kleiner
[78]. Die zu erwartenden 20 µbar sind auf dem Rauschlevel von 50 µbar nicht zu detektieren.
Im Reflexsignal ist im wesentlichen der zeitliche Verlauf des Laserpulses durch
diffuse Lichtreflexion an der RPE-Probe dargestellt. Die Schwankungen im Reflexionssignal
entsprechen von der Amplitude ungefähr dem Rauschen des PMT. Ebenfalls bei
einer Bestrahlung mit der Schwellenenergie für Mikroblasenbildung von 5.5 µJ
(Abb. 6.15 C/D) kann in diesem Fall eine optoakustische Transiente gemessen werden,
das Reflexsignal zeigt wiederum den zeitlichen Verlauf des Laserpulses. Die Amplitude
der Drucktransiente ist mit maximal 0.2 mbar sehr gering, liegt oberhalb des Rauschlevels
von 50 µbar Peak-to-Peak. Bei Bestrahlung mit 9.5 µJ Abb. 6.15 E/F wurden 100 % der
RPE-Zellen geschädigt. Es ist eine stärkere Transiente mit Druckamplituden bis 0.4 mbar
ist meßbar, im Reflexsignal zeigt sich eine Überhöhung gegen Ende des Laserpulses.

Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion_______________________________________________ 91
E
C
A
1200
1000
D 800 F
1200
1200
1000
B
1000
800
800
600
600
400
Reflexlicht [mV]
600
400
Reflexlicht [mV]
400
Reflexlicht [mV]
200
200
200
0
0
0
2 4 6 8 10 12 14 16 18
Zeit [µs]
2 4 6 8 10 12 14 16 18
Zeit [µs]
2 4 6 8 10 12 14 16 18
Zeit [µs]
Abbildung 6.15 :Optoakustische Transienten (A, C, E) und die dazu gemessenen Reflexionssignale
(B, D, F) bei Bestrahlung von Schweine-RPE Proben mit einzelnen
5 µs Laserpulsen. (A, B, C, D: 5.5 µJ; E, F: 9.5 µJ)

92__________________________________________ Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion
3ms Pulsdauer
Zum direkten Vergleich sind in Abb. 6.16 (A-F) die Reflexionssignale einer Bestrahlung
mit 3 ms Laserpulsen dargestellt. Bei allen dargestellten Bestrahlungen kam es zu 100 %
RPE-Zellschädigung im bestrahlten Areal. Im Fall von Abb. 6.16 A/B war die Bestrahlung
schon zweifach oberhalb der RPE-Schadensschwelle. Es ist keine Drucktransiente
meßbar und im Reflexionssignal keine Änderung während des Laserpulses zu erkennen.
Erst dreifach oberhalb der RPE-Schadensschwelle ist gegen Ende des Laserpulses eine
Transiente optoakustisch meßbar (Abb. 6.16 C). Deren Amplitude ist mit über 2 mbar um
das 25-fache höher als bei den schwächsten gemessenen Transienten (Abb. 6.15 C) bei
Bestrahlung mit 5 µs Laserpulsen. Kleinere Drucktransienten konnten bei 3 ms Bestrahlung
nicht gemessen werden. Im Reflexionssignal (Abb. 6.16 D) zeigt sich zeitgleich mit
der Drucktransiente eine Erhöhung des reflektierten Lichtes. Die zeitliche Länge dieser
Reflexerhöhung beträgt 20 µs.
Bei Bestrahlung vierfach oberhalb der RPE-Schadensschwelle kann eine mehrfache Transientenbildung
während des Laserpulses beobachtet werden (Abb. 6.16 E). Die erste
Transiente bildet sich zeitlich früher als bei der geringeren Bestrahlung zu Abb. 6.16 C.
Es werden Spitzenamplituden mit bis zu 2 mbar bei beiden Drucktransienten gemessen.
Im Reflexionssignal zeigt sich wie in Abb. 6.16 D eine zeitliche Korrelation der gemessenen
Reflexionserhöhungen mit den Drucktransienten. Beide Reflexionserhöhungen
haben eine zeitliche Länge von 20 µs.

Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion_______________________________________________ 93
E
2.0
C
2.0
A
2.0
1.5
1.5
1.5
1.0
1.0
1.0
0.5
0.5
0.0
0.0
-0.5
Druck [mbar]
-0.5
Druck [mbar]
0.5
0.0
-0.5
Druck [mbar]
-1.0
-1.0
-1.0
-1.5
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
Zeit [ms]
-1.5
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
Zeit [ms]
-1.5
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
Zeit [ms]
F
40
30
D
40
B
40
30
30
20
10
Lichtintensität [mV]
20
20
10
Lichtintensität [mV]
10
Lichtintensität [mV]
0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
Zeit [ms]
0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
Zeit [ms]
0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
Zeit [ms]
Abbildung 6.16:Optoakustische Transienten (A, C, E) und die dazu gemessenen Reflexionssignale
(B, D, F) bei Bestrahlung von Schweine-RPE Proben mit einzelnen
3 ms Laserpulsen. (A, B: 170 µJ; C, D: 250µJ; E, F: 340 µJ)

94__________________________________________ Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion
Analyse
Aufgrund der zeitlichen Korrelation der Reflexionssignale und der Drucktransienten bei
der Bestrahlung mit 3 ms Laserpulsen und der Übereinstimmung der Signale
Abb. 6.15 E/F bei 5 µs Pulslänge kann davon ausgegangen werden, dass die gemessenen
Drucktransienten und Reflexionssignale bei Mikroblasenbildung entstehen.
Bei der zur akustischen Transiente (Abb. 6.15 C) gehörigem Reflexionssignal
(Abb. 6.15 D) ist es in diesem Grenzfall schwierig, die Mikroblasenbildung aus dem Rauschen
des diffus reflektierten Lichtes heraus zu detektieren. Erst bei größeren Mikroblasenensembles,
bei denen schon alle bestrahlten Zellen geschädigt sind, kann auch im
Reflexionssignal eine Erhöhung des reflektierten Laserlichtes durch die entstehende Wasser-Blasen-Grenzfläche
detektiert werden (Abb. 6.15 E/F, Abb. 6.16 C/D, E/F). Die
Mikroblasenbildung konnte durch die Messung der Drucktransiente empfindlicher nachgewiesen
werden als durch das Reflexionssignal. Dies deckt sich auch mit den Ergebnisse
in der Arbeit von Rögener, bei der die reflexbasierte Blasendetektion bei 6 µs Einzelpulsbestrahlung
nahe der Schadensschwelle nicht sensitiv genug war um im Reflexionssignal
zwischen diffuser Reflexion und Reflexion mit transienten Blasenanteil zu unterscheiden
[22, 23].
Zur weiteren Auswertung der Versuche wurde die akustische Energie (E a) der OA-Transiente
P(t) als Maß für eine Blasenentstehung ausgewertet.
E a
=
t 1
�
t 0
( Pt () ) 2
dt
Trägt man für den Versuch mit 5µs Laserpulsen die akustische Energie über den Prozent
der geschädigten Zellen auf (Abb. 6.17) so zeigt sich, dass:
- eine Blasenbildungsschwelle definiert werden kann
- kein Zellschaden auftritt, wenn keine Mikroblasen detektiert werden
(Abb. 6.17 Bereich A)
- Mikroblasen gebildet werden, aber kein Zellschaden auftritt
(Abb. 6.17 Bereich B)
- immer wenn RPE-Zellen geschädigt sind, wurden Mikroblasen optoakustisch
detektiert (Abb. 6.17 Bereich C)
Diese Ergebnis ergab sich bei allen acht RPE-Proben bei Bestrahlung mit 5 µs Pulsen.
(37)

Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion_______________________________________________ 95
]
rel. akustische Energie [a.u.
100000
10000
1000
27 20
28
25 19
26 29 13
30
24
23
22
18
17
5µs Pulsdauer
0 20 40 60 80 100
Abbildung 6.17 :Akustische Energie der optoakustischen Transienten für 5 µs Pulslänge
über der Anzahl der geschädigten RPE-Zellen. Markierte Nummern entsprechen
den Transienten aus Abb. 6.15 A-F.
Bei 50 µs Pulslänge kommt es zu Mikroblasenbildung mit und ohne RPE-Schaden
(Abb. 6.18 B/C), andererseits kommt es aber auch zur RPE-Schädigung ohne Mikroblasenbildung
(Abb. 6.18 D).
16
Mikroblasenschwelle
Zelltod [%]
Bei 50 µs Laserpulsdauer zeigt sich bei der Auftragung der akustischen Energie über
dem prozentualen Zelltod (Abb. 6.18), dass
- eine Blasenbildungsschwelle definiert werden kann.
- kein Zellschaden auftritt wenn, keine Mikroblasen detektiert werden
(Abb. 6.18 Bereich A).
- kein Zellschaden auftritt, aber Mikroblasen gebildet werden
(Abb. 6.18 Bereich B).
- teilweise Mikroblasen optoakustisch detektiert werden, wenn RPE-Zellen geschädigt
sind (Abb. 6.18 Bereich C).
- keine Mikroblasen optoakustisch detektiert werden, wenn RPE-Zellen geschädigt
sind (Abb. 6.18 Bereich D).
1
3
14
567 9
2
4
12
15
21 11
10 8

96__________________________________________ Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion
]
[a.u.
rel. akustische Energie
1
0.1
0.01
11
26
10
14 18 20 23
24
27
8
12 16 22 25 28 7
15 17 19 21 9
50µs Pulsdauer
Mikroblasenschwelle
0 20 40 60 80 100
Zelltod [%]
Abbildung 6.18 :Akustische Energie der optoakustischen Transienten für 50 µs Pulslänge
über der Anzahl der geschädigten RPE-Zellen.
Bei 500 µs und 3 ms Pulslänge kommt es immer primär zu einer RPE-Schädigung ohne
Mikroblasenbildung, d.h. einer thermischen Denaturierung. Erst weit oberhalb der Schadensschwelle
kann für beide Pulslängen Mikroblasenbildung wie in Abb. 6.16 C/E nachgewiesen
werden. Da die RPE-Schadens- und die Blasenbildungsschwellen weit
voneinander getrennt sind, wurde auf eine Darstellung der akustischen Energie verzichtet.
Um ein genaueres Bild über die primären Effekte bei schwellennaher Bestrahlung für alle
Proben zu erhalten, wurde im Bereich ED 10 bis ED 90 die relative Häufigkeit eines
RPE-Schadens mit akustisch bestimmter Mikroblasenbildung ausgewertet (Abb. 6.19).
Durch die Limitierung auf den Bereich ED 10 bis ED 90 werden nur die primären Effekte
betrachtet. Effekte, wie z.B. Mikroblasenbildung bei 3-fach überschwelliger Bestrahlung
bei 3 ms Pulsdauer werden bei dieser Einschränkung ausgeschlossen.
4
6
5
3
1
2

Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion_______________________________________________ 97
Häufigkeit [%]
100
80
60
40
20
0
RPE-Schaden mit Mikroblasenbildung
RPE-Schaden ohne Mikroblasenbildung
5 50 500 3000
Pulsdauer [µs]
Abbildung 6.19 :Prozentuale Häufigkeit eines RPE-Schadens sowohl mit, als auch ohne
Mikroblasenbildung im Bereich ED10 bis ED90 bei den applizierten Pulslängen.
Es zeigt sich, dass bei 5 µs Pulsdauer ein RPE-Schaden bei allen RPE-Proben immer mit
Bildung von Mikroblasen einhergeht.
Bei insgesamt 12 der 480 applizierten 5 µs Laserpulse konnte Mikroblasenbildung ohne
RPE-Schädigung nachgewiesen werden. Bei der Messung der Mikroblasen ohne
RPE-Zellschaden kann nicht ausgeschlossen werden, dass Mikroblasenbildung um die
chorioidealen Melanosomen gemessen wurde. Dies ist unwahrscheinlich, da die effektive
Bestrahlung dieser Melanosomen durch die Aufstreuung des applizierten Laserlichtes
durch das RPE und die Chorioidea selbst stark reduziert wird.
Bei 50 µs Pulslänge wird in 16 % der Fälle Mikroblasenbildung nachgewiesen. Bei dieser
Pulslänge kommt es somit vorherrschend (84 %) zu einer RPE-Schädigung ohne Mikroblasenbildung.
Bei 500 µs und 3 ms kommt es immer primär zu einer RPE-Schädigung ohne Mirkoblasenbildung.
Bei den Bestrahlungen mit 3 ms Laserpulsen konnte immer nur weit oberhalb
der RPE-Schadensschwelle Mikroblasenbildung sowohl optoakustisch als auch im Reflexionssignal
detektiert werden.
Aus den gemessenen Schwellendaten wurden mit dem Probit-Algorithmus [80]
(Kap. 5.8.4) die ED 50 -, ED 15 - und ED 85 -Schwellenwerte für Mikroblasenbildung und
den Zelltod bestimmt (Tab. 5). Beispielhaft sind die dichotomen Meßwerte (0 = keine
Mikroblase, 1 = Mikroblase) und die mit Probit angepaßte Verteilungsfunktion bei 50 µs
Pulsdauer für die Bildung von Mikroblasen (Abb. 6.20) und für den RPE-Schaden
(Abb. 6.21) dargestellt. Es wurde auf eine Probability-Auftragung der y-Achse verzichtet,
da damit die dichotomen Meßwerte (0, 1) nicht darstellbar sind.

98__________________________________________ Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion
Wahrscheinlichkeit
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
dichotome Messwerte
Verteilungsfunktion
95% Konfidenzintervall
0 200 400 600 800 1000
Bestrahlung [mJ/cm²]
Abbildung 6.20 :Dichotomen Schwellendaten für Mikroblasenbildung bei 50 µs Pulsdauer
(0 = keine Mikroblase, 1 = Mikroblase) und die mit Probit angepaßte Verteilungsfunktion
und das 95 % Konfidenzintervall.
Wahrscheinlichkeit
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
dichotome Messwerte
Verteilungsfunktion
95% Konfidenzintervall
0 200 400 600 800 1000
Bestrahlung [mJ/cm²]
Abbildung 6.21 :Dichotomen Schwellendaten (n = 1486 Zellen) für RPE-Zellschädigung
bei 50 µs Pulsdauer (0 = kein Zellschaden, 1 = Zellschaden) und die mit
Probit angepaßte Verteilungsfunktion und das 95 % Konfidenzintervall.

Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion_______________________________________________ 99
Trägt man die Schwellen für den Zelltod und Blasenbildung für die untersuchten Bestrahlungszeiten
auf (Abb. 6.22), zeigt sich, dass bei 5 µs Pulslänge die Blasenbildungsschwelle
von 222 mJ/cm² unter der RPE-Schadensschwelle von 252 mJ/cm² liegt.
Aufgrund der RPE-Probenvariation kommt es zu einer Überschneidung der mit Probit
angepaßten Normalverteilung mit logarithmischer Kovariantenbasis. Zwischen den
Bestrahlungszeiten 5 µs und 50 µs kommt es zu einer Umkehr der Schwellen, da für 50 µs
die Blasenbildungsschwelle von 483 mJ/cm² über der Schadensschwelle von 439 mJ/cm²
liegt. Bei 500 µs und 3 ms sind bereits alle RPE-Zellen geschädigt, bevor es zur Mikroblasenbildung
kommt. Die Blasenbildungsschwelle liegt immer deutlich oberhalb der
ED 50 -Schwelle für den RPE-Zelltod.
ED 50 [mJ/cm 2 ]
10000
1000
100
Abbildung 6.22 :RPE-Schadens- und Blasenbildungsschwelle bei verschiedenen Bestrahlungszeiten
und deren Breite der logarithmischen Normalverteilung
(ED 15 , ED 85 ). Bei 5 µs liegt die Blasenbildungsschwelle unterhalb der
Schwelle für Zellschädigung. Für alle anderen Pulszeiten liegt die Blasenbildungsschwelle
oberhalb der Schädigungsschwelle. Zwischen 50 µs und
5 µs kommt es zu Umkehr der Schadensschwellen.
Diskussion
Zelltod
Blasenbildung
thermische RPE-Denaturierung
ohne Mikroblasenbildung
10 100 1000 10000
Pulsdauer [µs]
Da bei den Pulsdauern 3ms und 500 µs im schwellennahen Bereich keine Blasenbildung
zu detektierbar ist (Abb. 6.19), kann bei diesen Pulsdauern von einem primär thermischen
RPE-Schadensmechanismus ausgegangen werden. Dies ist in guter Übereinstimmung
mehrerer Arbeiten, bei denen eine primär thermische Schädigung am RPE nachgewiesen
werden konnte [13, 51, 90, 92]. Die Blasenbildungsschwelle liegt bei diesen Pulsdauern

100_________________________________________ Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion
Laserpulsdauer
ED 50 Schaden
[mJ/cm²]
ED 15 Schaden
[mJ/cm²]
ED 85 Schaden
[mJ/cm²]
ED 50 Blase
[mJ/cm²]
ED 15 Blase
[mJ/cm²]
ED 85 Blase
[mJ/cm²]
5 µs 252 166 359 223 168 277
50 µs 439 340 567 483 396 570
500 µs 1279 1075 1519 2242 1871 2613
3 ms 4346 3488 5414 12106 9397 14815
Tabelle 5: Gemessene RPE-Schadens- und Blasenbildungsschwellen und die jeweiligen
ED 15 und ED 85 Werte bei Einzelpulsbestrahlung im µs- bis ms-Zeitbereich
um den Faktor 1.8 (500 µs) und 2.8 (3 ms) oberhalb der RPE-Schadensschwelle
(Abb. 6.22). Da die minimal gemessenen Druckamplituden der Blasentransienten für
diese Pulsdauern (Abb. 6.16) immer um den Faktor 25 größer sind als bei Bestrahlung mit
5 µs (Abb. 6.15), und die Lebensdauer der Blasen von 20 µs aus den Reflexionssignalen
bestimmt wurde, kann davon ausgegangen werden, dass das gesamte bestrahlte
RPE-Volumen überhitzt wird, und es zur Bildung großer Blasen kommt.
Bei 50 µs Pulsdauer ist ein RPE-Schaden sowohl mit, wie auch ohne Mikroblasenbildung
möglich. In den Fällen, bei denen keine Mikroblasenbildung gemessen werden kann, ist
wie bei den längeren Pulsdauern von einer rein thermischen RPE-Schädigung auszugenen.
Da dies in 84 % der geschädigten RPE-Zellen der Fall ist (Abb. 6.19), ist kommt es
auch bei dieser Pulslänge vorherrschend zu einer thermischen Denaturierung. Bei 16 %
der geschädigten RPE-Zellen (Abb. 6.19) konnte auch bei schwellennaher Bestrahlung
Mikroblasenbildung gemessen werden. Die Schwelle für Mikroblasenbildung liegt um
den Faktor 1.1 höher liegt als die RPE-Schadensschwelle (Abb. 6.22). Es kommt bei
50 µs Pulsdauer wohl primär noch zu einer thermischen Denaturierung, die aber sehr nahe
der Schwelle für Mikroblasenbildung ist. Es ist experimentell schwierig diesen minimalen
Unterschied der Schwellen bei biologischen Proben signifikant herauszuarbeiten.
Bei 5µs Pulsdauer kann immer Mikroblasenbildung bei RPE-Schädigung nachgewiesen
werden (Abb. 6.19). Die Schwelle für RPE-Zellschädigung liegt um den Faktor 1.1 oberhalb
der Schwelle für Mikroblasenbildung. Da Mikroblasenbildung auch ohne RPE-Schädigung
auftritt, und auch immer Mikroblasenbildung bei Zellschädigung nachgewiesen
werden kann, ist bei dieser Pulslänge eine Beteiligung der Mikroblasen an der RPE-Schädigung
wahrscheinlich. Andere Schädigungsmechanismen wie z.B. eine weiterhin rein
thermische Schädigung ist denkbar, erscheint aber aufgrund der experimentellen Ergebnisse
ebenfalls unwahrscheinlich. Ein Zusammenwirken mehrerer Schadensmechanismen
kann aber auch nicht ausgeschlossen werden.
Möglicherweise kommt es durch die Volumenzunahme bei der intrazellulären Mikroblasenbildung
zur Überdehnung und damit zur Zerreißung der RPE-Zellwand. Bei Bestrahlung
mit ns-Laserpulsen konnte Kelly ebenfalls an Schweine-RPE Präparaten
photographisch zeigen, dass Mikroblasenbildung mit einer Zerreißung der Zellmembran

Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion______________________________________________ 101
einhergeht [8]. Es ist jedoch bei Bestrahlung mit ns Laserpulsen eine andere Blasendynamik
zu erwarten, da die eingestrahlte Energie viel effektiver in hohe Temperaturen umgewandelt
wird. Ebenso liegen ns-Laserpulse schon nahe dem akustischen Einschluß bei
Melanosomengrößen von 1 µm. Es werden stärkere Druckgradienten gebildet, die ebenfalls
zum Zellschaden führen können.
Die Melanosomen der RPE-Zellen sind ca. 1-2 µm unterhalb der den Photorezeptoren
zugewandten Zellmembran lokalisiert. Entstehen Mikroblasen, so könnten auch selbst
kleine Mikroblasen direkt die Zellmembran perforieren. Auch eine Membranschädigung
durch Druckgradienten bei Mikroblasenentstehung ist möglich. Douki konnte an an kultivierten
humanen RPE-Zellen zeigen, dass ein Zellschaden eher von den erzeugten
Druckgradienten abhängt wie von dem Druckmaximum [103]. Ein Schadensschwelle für
RPE-Zellen lag bei 70 bar / ns. Solch starke Druckgradienten können an der Oberfläche
der Mikroblasen nicht ausgeschlossen werden, sind aber bei den gemessenen Druckmaxima
von 400 µbar und Druckgradienten von 4 10 -7 •
[bar / ns] sehr unwahrscheinlich.
Aber auch Schäden direkt an den Melanosomen sind denkbar. So ist bekannt, dass durch
gepulste Laserbestrahlung Melanosomen geschädigt werden und toxisch auf RPE-Zellen
wirken [104]. Bei Bestrahlungen mit ns-Laserpulsen konnte Kelly aber zeigen, dass selbst
bei 4-facher Schwellenbestrahlung die Melanosomen nicht geschädigt werden [8]. Da bei
µs-Laserpulsen sehr viel geringere Druckgradienten entstehen und auch die Überhitzung
des Melanosoms aufgrund der langen Pulslänge schwierig ist, ist ein Schaden an den
Melanosomen unwahrscheinlich.
Das Ergebnis ungeschädigter RPE-Zellen bei gemessener Mikroblasenbildung, was bei
den Probenbestrahlung mit 5 µs Laserpulsen bei 12 der 480 applizierten Pulse auftrat
konnte von Pitsillides auch an mit Goldpartikeln behafteten Endothelzellen beobachtet
[57] . In diesen Versuchen konnten bis zu fünf Mikroblasen direkt an der Zellmembran
erzeugt werden, ohne dass die Zelle letal geschädigt oder ein Apoptoseprozeß gestartet
wurde [57]. Dies ist auch bei den in den RPE-Zellen entstehenden Mikroblasen denkbar.
Diese experimentellen Ergebnisse zeigen, dass für Einzelpulse von 5 µs Pulslänge immer
intrazelluläre Mikroblasenbildung um die Melanosomen auftritt, wenn RPE-Zellen
geschädigt werden. Da bei kürzeren Bestrahlungszeiten noch weniger Wärme an die das
Melanosom umgebenden Strukturen abgegeben wird, ist auch für die bei der SRT verwendeten
1.7 µs die Bildung von Mikroblasen möglich. Dabei bleibt zu berücksichtigen, dass
bei der SRT immer multiple Pulse appliziert werden, die in dieser Versuchsreihe nicht
untersucht wurden. Durch den Versuchsaufbau bedingt, konnten nur Einzelpulse appliziert
werden, da das Streulicht des AOM in der Zeit zwischen den Laserpulsen eine zu
starke Grunderwärmung verursacht hätte. Der Nachweis von Mikroblasenbildung bei
RPE-Schädigung mit multiplen 1.7 µs Laserpulsen bleibt hier zunächst offen, wird aber
in Kap. 6.7.3 mit dem gleichen Aufbau aber anderem Laser nachgewiesen.

102_________________________________________ Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion
Es ergibt sich ein Übergangsbereich von rein thermischer RPE-Denaturierung zu
RPE-Schädigung bei der teilweise (50 µs) oder auch immer (5 µs) Mikroblasenbildung
nachgewiesen werden kann. Bei der Schwellenkurve für die maximal zulässige Bestrahlung
(MZB-Wert) des ANSI standart for the safe use of lasers [16], ergibt sich eine Änderung
der Steigung der Schwellenkurve bei ebenfalls 50 µs. Diese Übereinstimmung der
Pulsdauer kann als möglicher Hinweis für den Übergang von einer rein thermischen
Denaturierung zu einer Schädigung, bei der auch Mikroblasenbildung auftritt, angesehen
werden.
6.5.2 Temperatur- und Arrheniusberechnungen im Melanosomenfeld
Für thermische, als auch für thermomechanische Schadensmechanismen, ist die laserinduzierte
Temperaturänderung im RPE von entscheidender Bedeutung. Bei einer rein thermischen
Denaturierung hängt das Ausmaß des thermischen Schadens dabei direkt von der
freien Energie im geschädigten Volumen ab. Bei der Denaturierung als Reaktion erster
Ordnung führt das Arrheniusintegral zu einem Maß für den thermischen Schädigungszustand
[13]. Da experimentell bei 3 ms und 500 µs Pulsdauer eine primär thermische
RPE-Denaturierung ohne Mikroblasenbildung nachgewiesen werden konnte, wurden
ausgehend von diesen Parametern Temperaturberechnungen, und daraus folgend Arrheniusschadensschwellen
zu verschiedenen Abständen innerhalb eines Melanosomenfeldes
berechnet.
Mit den in Kap. 5.11.2 gemachten Annahmen über die Absorption und Ausmaß des Melanosomenfeldes
wurden die Temperaturberechnungen durchgeführt. Aufgrund der Linearität
der Wärmeleitungsgleichung wurden die Temperaturen im Melanosomenfeld mit
einer Bestrahlung von 1 mJ/cm² berechnet. So lassen sich durch Multiplikation mit der
Bestrahlung die Temperaturen bei den gesuchten Werten bestimmen. In Abb. 6.23 sind
die Temperaturverläufe für verschiedene Orte innerhalb und außerhalb des Melanosomenfeldes
dargestellt. An der Oberfläche des mittleren Melanosoms (Abb. 6.23 A) ergeben
sich die höchsten Temperaturen. Mit zunehmenden Abstand von der
Melanosomenoberfläche sinkt die Spitzentemperatur für alle Pulszeiten. Innerhalb des
Melanosomenfeldes sind die relativen Temperaturdifferenzen der verschiedenen Pulszeiten
zueinander konstant. Erst bei großen Abständen (Abb. 6.23 E,F) nähern sich die Spitzentemperaturen
der drei kurzen Pulszeiten an. Nur bei 3 ms Bestrahlungszeit wurde auch
schon während des Laserpulses effektiv Wärme durch Diffusion über die betrachtete Entfernung
abgeführt (Abb. 6.23 F).

Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion______________________________________________ 103
Abbildung 6.23 :Berechnete Temperaturverläufe bei Bestrahlung eines Melanosomenfeldes.
Die Bestrahlung betrug 1 mJ/cm². Die Orte im Melanosomenfeld, für
die die Temperaturen berechnet wurden, sind durch Pfeile gekennzeichnet.
Aus diesen Temperaturverläufen wurde mit Gleichung (34) das Schadensintegral bei den
gemessenen in vitro RPE-Schadensschwellen für alle Pulszeiten errechnet. Um die Rechnungen
mit den gemessenen Parametern vergleichen zu können, wurden die Bestrahlungen
ermittelt, bei denen die Schädigungsintegrale für die verschiedenen Pulslängen
jeweils gleich sind. Für jeden Ort wurde der Wert für das Schadensintegral ausgewählt,
der sich für eine Pulslänge von 3 ms bei der experimentell bestimmten Schädigungsschwelle
(4346 mJ/cm², Tab. 5) ergibt, da bei diesem Parameter von einer thermischen
Denaturierung ausgegangen werden kann.

104_________________________________________ Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion
In Abb. 6.24 sind die Ergebnisse der Arrheniusberechnungen dargestellt. Für die Pulsdauer
500 µs ergibt sich für alle Lokalisationen innerhalb des Melanosomenfeldes
(Punkte A, B, D, E) eine gute Übereinstimmung der Arrheniusschadensschwellen mit
den experimentell bestimmten Werten. Nur für den außerhalb der RPE-Zelle liegenden
Abstand von 10 µm (Abb. 6.23 F) was etwa 1/3 der Dicke der Außensegmente der Photorezeptoren
entsprechen würde, ist eine thermische Denaturierung unwahrscheinlich.
Bei den beiden kürzeren Pulslängen 50 µs und 5 µs ist eine thermische Denaturierung
selbst direkt auf der Melanosomenoberfläche, also dem wärmsten Punkt des Melanosomenfeldes,
unwahrscheinlich, da dafür eine 1.6- bis 2-fach überschwellige Bestrahlung
notwendig wäre. Für die anderen Bereiche, die noch innerhalb der RPE-Zelle liegen
(Punkte B, D, E), ergibt sich dann schon der 2-3 fache Wert der experimentell gemessenen
Schwellenbestrahlung (Tab. 5). Eine rein thermische Denaturierung der gesamten
RPE-Zelle, oder auch nur geringer Volumenanteile ist nach den Berechnungen für 5 µs
und 50 µs unwahrscheinlich.
Bestrahlung [mJ/cm²]
6000
5000
4000
3000
2000
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
Arrhenius an der
heißesten Stelle
Experiment
10 100 1000
Pulsdauer [µs]
verschiedene Abstände
zum Melanosomenfeld
F
E
D
C
B
A
Schadensschwelle
Abbildung 6.24 :Berechnete Schadensschwellen verschiedener Aufpunkte aus Abb. 6.23
über der Pulsdauer. Zum Vergleich die experimentell bestimmten
RPE-Schadensschwellen aus Abb. 6.22.
Dies deckt sich gut mit den experimentell gemessenen Ergebnissen (Abb. 6.19), bei denen
für diese Pulslängen teilweise (50 µs) oder auch immer (5 µs) intrazelluläre Mikroblasenbildung
bei RPE-Schädigung gemessen wird, und eventuell auch an der RPE-Zellschädigung
beteiligt ist.
Altshuler konnte sowohl in Experimenten als auch durch theoretische Betrachtungen zeigen,
dass der Bereich einer selektiven Schädigung durch rein thermische Denaturierung,
in diesem Fall der Haarfolikel, erst oberhalb der thermischen Relaxationszeit des Zielvolumens
beginnt [99]. Dies deckt sich gut mit den hier vorgestellten Ergebnissen, bei denen
sich im Experiment und in der Simulation eine thermische Denaturierung ebenfalls erst

Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion______________________________________________ 105
beim Überschreiten der thermischen Relaxationszeit der absorbierenden RPE-Schicht
ergibt. Eine Aussage über das Ausmaß der Photorezeptorschäden bei den verschieden
Pulslängen ist jedoch nicht möglich.
Bei in vitro Versuchen an Schweine-RPE wurde eine Schwelle für die Bildung von Mikroblasen
von ca. 150 °C bestimmt [12]. Aus den errechneten Temperaturspitzen an der
Melanosomenoberfläche (Abb. 6.23A) wurde die notwendige Bestrahlung zum Erreichen
von 150 °C Oberflächentemperatur bestimmt. In Abb. 6.25 sind diese Bestrahlungen mit
den gemessenen Schwellen für Mikroblasenbildung (aus Abb. 6.22) für alle Pulslängen
dargestellt.
Bestrahlung [mJ/cm²]
10000
1000
100
gemessene Mikroblasenbildungssschwelle
berechnete Bestrahlung für 150°C
an der Melanosomenoberfläche
10 100 1000
Pulslänge [µs]
Abbildung 6.25 :Gemessene Blasenbildungsschwellen und errechnete Bestrahlung zum
Erreichen von 150 °C an der Melanosomenoberfläche im Melanosomenfeld.
Bei 3 ms Bestrahlungsdauer ist die errechnete Bestrahlung von 5246 mJ/cm² zum Erreichen
von 150 °C an der Melanosomenoberfläche um die Hälfte niedriger als die experimentell
bestimmte Schwelle für Mikroblasenbildung von 12106 mJ/cm². Die Pulslängen
500 µs und 50 µs stimmen gut mit den errechneten und den experimentell bestimmten
Werten überein. Bei 5 µs ist die Blasenbildungsschwelle um den Faktor 1.7 unterhalb des
errechneten Grenzwertes. Die errechneten und gemessenen Blasenschwellen stimmen für
die kürzeste und die längste Pulsdauer nur schlecht überein.
Zusammenfassend für die Einzelpulsversuche und -berechnungen stimmt die experimentell
ermittelte Aussage für die längeren Zeitbereiche 500 µs und 3 ms mit den berechneten
Arrheniuswerten für einen primären thermischen Schadensmechanismus. Für kürzere
Pulslängen ist nach den Berechnungen eine thermische Denaturierung - wenn überhaupt -
nur direkt auf der Melanosomenoberfläche wahrscheinlich. Für größere Schädigungsbereiche
die mehr als 0.5 µm von der Melanosomenoberfläche entfernt liegen, ist die rein
thermische Denaturierung bezüglich der Arrhenius-Berechnungen eher unwahrscheinlich.

106_________________________________________ Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion
Die nötige Bestrahlung zum Erreichen einer angenommenen Blasenbildungstemperatur
von 150 °C an der Melanosomenoberfläche wird von den Temperaturberechnungen bei
500 µs und 3 ms zu niedrig, bei 50 µs und 5 µs zu hoch berechnet.
6.5.3 Schadensschwellen in vivo am Kaninchenauge
Tierversuchsstudie 1 ( 500Hz )
In den grundlegenden Arbeiten von Roider und Birngruber [1, 2, 3] zur selektiven Schädigung
des RPE wurde von einer additiven rein thermischen Schädigung des RPEs ausgegangen.
Deshalb wurden in diesen Studien relativ viele Pulse (500) appliziert. Für eine
Patientenbehandlung kamen wegen den Bewegungen des Patientenauges während der
Bestrahlung nur eine kurze Bestrahlungszeit und damit weniger Pulse in Frage.
Es sollte im Rahmen dieser Arbeit in einer ersten Studie untersucht werden, inwieweit
sich die angiographischen und die ophthalmoskopischen Schwellen bei den klinischen
Behandlungsparametern 500 Hz und 100 Pulse in Abhängigkeit von der Pulslänge verändern.
Es wurden mit dem Nd:YLF-Lasersystem Pulse von 5µs, 1.7 µs und 200 ns Pulslänge
(je 100 Pulse, 500 Hz) und als Vergleich mit dem Argon-Laser bei 5 µs und 200 ms
appliziert. Es wurden neun Augen von fünf Kaninchen bestrahlt und insgesamt 379 Läsionen
gesetzt.
Die Bestrahlungen wurden mit dem in Abb. 5.22 beschriebenen Aufbau durchgeführt.
Die Auswertung der Daten erfolgte mit den Probit-Algorithmus [79] mit logarithmischer
Kovariantenbasis der Statistiksoftware SPSS (Kap. 5.8.4). Beispielhaft sind die dichotomen
Meßwerte der angiographischen Schwelle für die Bestrahlung mit 5µs Nd:YLF
Laserpulsen bei 500 Hz Pulswiederholrate und 100 applizierten Pulsen und die mit Probit
angepaßte Verteilungsfunktion in Abb. 6.26 dargestellt. Dabei wird ein angiographischer
Schaden mit 1, kein Schaden als 0 für jede Läsion eingezeichnet. Es wurde auf eine Probability-Auftragung
der y-Achse verzichtet, da sonst die dichotomen Meßwerte (0, 1)
nicht darstellbar sind.

Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion______________________________________________ 107
Wahrscheinlichkeit
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
5µs, 100 Pulse,
500Hz, Nd:YLF
angiogr. Schaden
angiogr. Messwerte
Verteilungsfunktion
95% Konfidenzintervall
0 100 200 300 400 500 600 700
Bestrahlung [mJ/cm²]
Abbildung 6.26 :Dichotome angiographische Schwellendaten bei 5 µs Pulsdauer Nd:YLF,
100 Pulse, 500Hz (0 = kein angiographischer Schaden,
1 = angiographischer Schaden) und die mit Probit angepaßte Verteilungsfunktion
und das 95 % Konfidenzintervall.
In Abb. 6.27 sind die angiographischen und ophthalmoskopischen ED50-Schwellen für
die verschiedenen Parameter aufgetragen. Bei dem Parameter Argon 5 µs konnte aufgrund
der begrenzten Laserleistung keine ophthalmoskopische Schwelle bestimmt werden.
Die jeweiligen ED15 /ED85-Werte sind als Fehlerbalken aufgetragen. Die mit den
Spekle-Werten korrigierten Bestrahlungswerte und der Ergebnisse der 200 ms
cw-Bestrahlung sind in Tab. 6 zusammengefaßt dargestellt. Die therapeutische Breite ist
oph ang dabei über den Bereich zwischen ED15 und ED85 definiert. Dabei findet auch die Steigung
(slope) der mit Probit angepaßten logarithmischen Normalverteilung ihre Berücksichtigung.
n=87 n=137 n=89 n=39
Bestrahlung [mJ/cm²]
500
400
300
200
100
0
opht
ED50 ang
ED50 200ns YLF 17µs YLF 5µs YLF 5µs Ar
Parameter
Abbildung 6.27 :Darstellung der ED50-Schwellenwerte (500 Hz, 100 Pulse) in Abhängigkeit
von Pulsdauer (ED15 / ED85 =Fehlerbalken)

108_________________________________________ Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion
Parameter
200ns
100P
500Hz
1,7µs
100P
500Hz
ED 50 opht
[mJ/cm²]
ED 15 opht
[mJ/cm²]
ED 85 opht
[mJ/cm²]
ED 50 ang
[mJ/cm²]
ED 15 ang
[mJ/cm²]
ED 85 ang
[mJ/cm²]
ED 15 opht /
ED 85 ang
ED 50 opht /
ED 50 ang
345 282 403 73 37 143 2.0 4.8
368 326 416 106 46 250 1.3 3.5
5µs 100P
500Hz 278 248 312 141 103 200 1.2 2.0
Argon 5µs
100P
500Hz
--- 165 94 293 --- ---
Argon
200ms 205W/cm² 130W/cm² 325W/cm² 170W/cm² 113W/cm² 253W/cm² 0.5 1.2
Tabelle 6: Spekle-Wert korrigierte Einzelergebnisse der verschiedenen Bestrahlungsparameter
und die therapeutische Breite (ED 15 opht / ED85 ang ) bei 100 Pulse und 500 Hz Pulswiederholrate.
Aufgrund der langen thermischen Diffusionszeit wurden die Schwellenwerte
der 200 ms Argon-Versuche nicht auf die maximale Bestrahlung normiert.
In dieser ersten Tierversuchsstudie zeigte sich, dass bis auf die Verwendung von
200 ms-Laserpulsen mit allen anderen Parametern ein Bereich zwischen angiographischer
und ophthalmoskopischer Schwelle erzielt werden konnte, der um so größer war, je
kürzer die verwendeten Pulse waren.
Es ergibt sich bei 200 ms cw-Bestrahlung für die ED 50-Schwellen ein Unterschied von
Faktor 1.2, es kommt jedoch durch die flache Steigung der Schwellenkurve bereits zur
Überschneidung an den Grenzen ED 85 ang und ED15 oph . Betrachtet man nur die
ED 50-Schwellen, wie in früheren Arbeiten [2, 4], so würde es in diesem Fall zu dem
Schluß führen, dass in einem kleinen Bereich ein “selektives” Bestrahlen möglich ist. Es
ist zwar möglich einen nicht ophthalmoskopisch aber angiographisch sichtbaren
RPE-Schaden zu setzen, jedoch kommt es bei ED 50 ang zu 13 % sichtbaren Läsionen. Will
man einen zu 85 % gesicherten angiographischen Schaden erzeugen, kommt es bereits zu
über 50 % sichtbaren Läsionen. Ein kleiner praktisch anwendbarer “selektiver” Bereich,
wie er von einem “therapeutischen Fenster” von 1.2 suggeriert wird, liegt nicht vor. Unter
der Berücksichtigung der Breite der angepaßten logarithmischen Normalverteilung ergibt
sich bei 200 ms Pulslänge eine therapeutische Breite (ED 15 opht / ED85 ang ) von 0.5 .
Die angiographische Schadensschwelle verringert sich bei kürzeren Laserpulsdauern. Da
bei kürzeren Laserpulsen weniger Wärme während des Laserpulses durch Wärmediffusion
von den Melanosomen abgegeben wird, reicht eine niedrigere Pulsenergie aus, um
die Melanosomen zu erwärmen. Die ophthalmoskopische Schwelle bei 200 ns und 1.7 µs
ist in etwa gleich, bei 5 µs Laserpulsen ist sie 25% jedoch niedriger. Die größte therapeutische
Breite von 2.0 ergibt sich bei 100 applizierten 200 ns Laserpulsen.

Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion______________________________________________ 109
Ein wichtiger Faktor ist die bei 500 Hz Pulswiederholrate gegebene Grundtemperaturerhöhung.
In Abb. 6.28 sind die mit Gl. (36) errechneten Grundtemperaturerhöhungen für
die gemessenen Schadensschwellen der verschiedenen Laserparameter dargestellt.
Grundtemperaturerhöhung [K]
30 nach 100 Pulse @ 500 Hz
116µm Spot, 50% Absorption
20
10
0
200ns YLF 17µs YLF 5µs YLF 5µs Ar
Parameter
Abbildung 6.28 :Berechnete Grundtemperaturerhöhungen gemittelt über den Bestrahlungsspot
nach 100 Pulsen bei 500 Hz Wiederholrate, bei den ED 50 -Schwellen
für die gegebenen Versuchsparameter nach Gl. (36).
Analyse der Tierversuchsstudie 1 (500 Hz)
ophth. Schwelle
angiogr. Schwelle
Durch die Korrektur der gemessenen Pulsenergien von 5 µs Nd:YLF und 5 µs Argon auf
deren maximale Bestrahlung mit den Spekle-Faktoren ergibt sich eine gute Übereinstimmung
der Bestrahlungswerte zueinander (Abb. 6.27). Ohne die Korrektur der
Spekle-Werte hätte es einen Unterschied der Schwellen um den Faktor 2.5 ergeben. Die
gemessene angiographische Schwelle von 21 mJ/cm², die 7-fach unter den im Rahmen
dieser Arbeit gemessenen Ergebnisse liegt, wurde von Roider und Birngruber mit 5 µs
Laserpulsen, 100 Pulse bei 500 Hz Pulswiederholrate ebenfalls am Kaninchen bestimmt
[2] . Der bei diesen Experimenten gegebene Spekle-Faktor wurde nicht gemessen. Der bei
Roider und Birngruber verwendete Aufbau ist vom Prinzip her gleich dem in dieser Arbeit
verwendeten Argonlaser-Aufbau (Abb. 5.1.4), bei dem ein Spekle-Faktor von 3.8 gemessen
wurde. Unter der Annahme vergleichbarer experimenteller Bedingungen der Aufbauten
kann die Bestrahlung der angiographische Schadensschwelle von 21 mJ/cm² auf ca.
80 mJ/cm² speklekorrigiert werden, wodurch die Schwelle immer noch 2-fach unter den
hier vorgestellten Schwellen liegt. Bei einem Vergleich der Schwellen der 200 ns Laserpulse
von Roider [2] (Nd:YAG, 500 Hz, 10 Pulse: ang. 43 mJ/cm², opht. 110 mJ/cm² //
500 Pulse: ang. 26 mJ/cm², opht. 105 mJ/cm²) mit den in dieser Arbeit gemessenen
Schwellen zeigt sich, dass sie in etwa um den Faktor 2.5 höher liegen. Auch die 200 ns
Experimente von Roider, die mit einem gepulsten Nd:YAG mit kurzer Faser durchgeführt
wurden, sind nicht speklekorrigiert. Dieser 200 ns Nd:YAG (Zeiss) ähnelte in Grundzügen
dem klinischen Nd:YAG (Kap. 5.1.2) der Firma Zeiss mit 800 ns, der mit einer 2 m
langen Faser ein Spekle-Faktor von 1.4 hat (Tab. 3). Zur groben Überschlagung können

110_________________________________________ Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion
die von Roider gemessenen Schwellenwerte auch mit diesem Spekle-Faktor korrigiert
werden, und somit ergeben sich mit Rücksicht auf die spekultativen Annahmen nur noch
Differenzen um den Faktor 1.2 zu den hier vorgestellten Schwellenwerten. Die, wenn
auch sehr spekulativen Vergleiche geben einen Hinweis darauf, dass die zum Teil sehr
großen Schwellenunterschiede verschiedener Arbeiten auf die Speklebildung bei fasergeführter
Bestrahlung zurückgeführt werden können.
Der Spekle-Faktor ist wichtig bei der Bestimmung von Schwellenwerten. So muß bei
fasergeführten Experimenten, d.h. verspekelter Bestrahlungsfläche, immer der
Spekle-Faktor in der Auswertung zur Bestimmung der effektiven Bestrahlung berücksichtigt
werden. Bei Pulsdauern oberhalb der thermischen Relaxationszeit des maximalen
Spekle-Durchmessers kommt es, wie in Kap. 6.1 gezeigt, durch thermische Diffusion zur
effektiven thermischen Reduzierung des Spekle-Faktors.
Für einen ophthalmologisch sichtbaren Schaden kann bei 200 ms eine rein thermische
Denaturierung angenommen werden. In dieser Arbeit wurden 205 W/cm² als ophthalmoskopische
ED 50 Schwelle für diesen Parameter gemessen. Bei den applizierten Pulszügen
mit verschiedenen Pulsdauern, aber gleicher Gesamtbestrahlungsdauer von 200 ms ergaben
sich aus den ophthalmoskopischen ED 50 Schwellen mittlere Bestrahlungsstärke von
114 W/cm² für 5µs, 151 W/cm² für 1.7 µs und 142 W/cm² für 200 ns Pulsdauer. Diese
Bestrahlungsstärken liegen 25 -50 % unterhalb der gemessenen Bestrahlungsstärke von
205 W/cm² bei 200 ms Pulsdauer. Ob bei der ophthalmoskopischen Schadensschwelle bei
repetitiver Bestrahlung ein rein thermischer oder ein thermischer Schaden mit zusätzlichen
anderen Komponenten wie z.B. Drucktransienten oder Mikroblasenbildung vorliegt,
kann aus der Datenlage nicht geklärt werden. Da die thermische Denaturierung der Photorezeptoren
nicht linear von der Temperatur abhängt, kann somit auch durch die Temperaturspitzen
bei gepulster Bestrahlung ein ophthalmoskopische Schaden bei geringerer
mittlerer Leistung erzeugt werden.
Bei den Expositionen mit dem Nd:YLF-Laser zeigt sich, dass die 5 µs und die 1.7 µs
Expositionen im Gegensatz zu den Ergebnissen von Roider und Birngruber [1] eine nur
geringe therapeutische Breite aufweisen. Es wurden damals bei 5 µs Pulslänge, 25
applizierten Pulsen und 500 Hz Pulswiederholrate ein “therapeutisches Fenster”
(ED 50 opht /ED50 ang ) von >3.8 und bei 100 applizierten Pulsen >5 gemessen [2]. Die ophthalmoskopische
Schadensschwelle wurde bei diesen Versuchen nicht erreicht. Unter der
Berücksichtigung der ED 85 ang ergibt sich eine therapeutische Breite (ED15 opht /ED85 ang )
von >1.5 bei 25 Pulsen und >2.4 bei 100 applizierten Pulsen [2], was mindestens doppelt
so groß ist, wie die hier vorgestellten Ergebnisse. Da die beiden Experimente unter sehr
ähnlichen Bedingungen statt gefunden haben, ist eine Erklärung für die unterschiedlichen
therapeutischen Bereiche schwer zu geben. Neben der unterschiedlichen Kaninchenrasse
Chinchilla Grey bei Roider und Chinchilla Bastard in dieser Arbeit fällt am stärksten die
evtl. gegebene unterschiedliche Spekle-Bildung auf. Diese verringert, wie in dieser Studie
angedeutet, die angiographische Schadensschwelle. Ein möglicher Einfluß auf die oph-

Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion______________________________________________ 111
thalmoskopische Schwelle läßt sich aber nicht klar skizzieren, da der Schadensmechanismus
für eine ophthalmoskopisch sichtbare Läsion bei repetitiver Bestrahlung nicht
eindeutig geklärt ist.
Es kommt auch bei dem retinalen Bestrahlungsdurchmesser von 116 µm und 500 Hz
Pulswiederholrate bei den Kaninchenbestrahlungen zu nicht vernachlässigbaren Grundtemperaturerhöhung,
vor allem bei den ophthalmoskopischen Schwellen um über 20 °C
(Abb. 6.28). Dieser Effekt ist unerwünscht und überlagert sich mit anderen thermischen
Effekten. Aus diesem Grund wurde in der zweiten Tierversuchsstudie mit 100 Hz Pulswiederholrate
bestrahlt.
Histologien müssen letztlich klären, ob bei Bestrahlung in der therapeutischen Breite ein
Photorezeptorschaden ausgeschlossen werden kann.
Tierversuchsstudie 2 ( 100Hz )
In der zweiten Studie wurden mit dem Nd:YLF-Laser Experimente mit abgestufter
Anzahl der Pulse (100 Pulse, 10 Pulse bei 100 Hz sowie Einzelpulse) mit jeweils 1.7 µs
und 200 ns, und 10 Pulse bei 20 Hz sowie Einzelpulse bei 8 ns Pulsdauer mit dem
Nd:YAG durchgeführt. Durch die Verwendung von 100 Hz Repetitionsrate sollte ein Einfluß
der erhöhten Grundtemperatur auf die Schadensschwellen ausgeschlossen werden.
Für die hier vorgestellten Parameter lag die errechnete maximale Grundtemperaturerhöhung
unter 4 °C. Insgesamt wurden in dieser Versuchsreihe 11 Augen von 6 Kaninchen
für die Berechnung der Schwellenwerte verwendet. Dabei wurden insgesamt 748 Laserläsionen
gesetzt.
Die Auswertung der Daten erfolgte mit den Probit-Algorithmus [79] mit logarithmischer
Kovariantenbasis der Statistiksoftware SPSS (Kap. 5.8.4). In Abb. 6.29 sind die angiographische
und ophthalmoskopischen ED 50 Schwellen mit deren Pulsenergie für die verschiedenen
Parameter aufgetragen. Die jeweiligen ED 15 /ED 85-Werte sind als
Fehlerbalken aufgetragen. In Tabelle 7 sind die errechneten Bestrahlungen unter Berücksichtigung
der Spekle-Faktoren und die therapeutische Breite zusammengefaßt. Zum
direkten Vergleich sind jeweils die Ergebnisse der Tierversuchsstudie 1 bei 500 Hz
zusätzlich dargestellt.

112_________________________________________ Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion
Bestrahlung [mJ/cm²]
800
700
600
500
400
300
200
100
0
Abbildung 6.29 :Darstellung der ED 50 -Schwellenwerte (100 Hz, 500 Hz) in Abhängigkeit
von Pulsdauer und Pulszahl (ED 15 / ED 85 =Fehlerbalken).
Parameter
ED 50 opht
[mJ/cm²]
ED 15 opht
[mJ/cm²]
ED 85 opht
[mJ/cm²]
ED 50 ang
[mJ/cm²]
ED 15 ang
[mJ/cm²]
ED 85 ang
[mJ/cm²]
ED 15 opht zu
ED 85 ang
ED 50 opht zu
ED 50 ang
8ns 1P 365 231 562 144 70 305 0.8 2.5
8ns 10P 266 186 379 72 48 111 1.7 3.7
200ns 1P 354 194 650 123 87 181 1.1 2.9
200ns 10P 335 223 504 89 60 137 1.6 3.7
200ns
100P 249 205 301 42 27 71 2.9 5.9
1.7µs 1P 461 264 801 282 185 448 0.6 1.6
1.7µs 10P 312 224 433 123 74 214 1.0 2.5
1.7µs
100P 356 263 480 131 112 159 1.7 2.7
200ns
100P
500Hz
1,7µs
100P
500Hz
345 282 403 73 37 143 2.0 4.8
368 326 416 106 46 250 1.3 3.5
5µs 100P
500Hz 278 248 312 141 103 200 1.2 2.0
Argon 5µs
100P
500Hz
n=58 n=103 n=84 n=86 n=94 n=86 n=137 n=100
100 Hz
ophth
ED50 ang
ED50 500 Hz
--- 165 94 293 --- ---
Tabelle 7: Spekle-Wert korrigierte Einzelergebnisse der verschiedenen Bestrahlungsparameter
und die therapeutische Breite (ED 15 opht / ED85 ang ).

Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion______________________________________________ 113
Es zeigt sich, dass beinahe immer die angiographischen Schwellen bei Reduzierung der
Pulsdauer niedriger werden. Nur bei dem Parameter 8 ns Einzelpuls ergibt sich dies nicht
im Vergleich zu dem Parameter 200 ns Einzelpuls.
Mit der Anzahl der applizierten Pulse sank die angiographische Schwelle. So konnte die
niedrigste Schwelle bei Bestrahlung mit 100 Pulsen und 200 ns Pulsdauer erreicht werden,
während die höchste Schwelle für einen einzelnen 1.7 µs-Puls gefunden wurde. Bei
den angiographischen Schwellen zeigten sich, wie in der ersten Tierversuchsreihe, Änderungen
der Schwellen in Abhängigkeit von Pulsdauer und auch Anzahl der Pulse um mehr
als den Faktor 2. Die ophthalmoskopischen Schwellen zeigten uneinheitliche Werte und
änderten sich um ca. 30 - 40 %.
Mit zunehmender Anzahl der applizierten Laserpulse wird die Breite der angepaßten logarithmischen
Gausverteilung schmaler, d.h. die Schwankungen kleiner. Die breitesten
Verteilungen ergeben sich bei den ophthalmoskopischen Schwellen für Einzelpulse.
Trägt man die angiographisch und ophthalmoskopische ED 50-Schwellenbestrahlung über
der Anzahl der applizierten Pulse auf (Abb. 6.30), so zeigt sich, dass die angiographische
Schwelle dem empirisch gefundenen n -1/4 Gesetz
ED50( n)
= n
–
1 4 ⁄
ED50( 1)
(38)
für die Anzahl n der Laserpulse für alle Pulsdauern folgt [108]. Die ophthalmoskopische
ED 50-Schwellenbestrahlung fällt für alle Pulsdauern langsamer über der Pulszahl ab.
Bestrahlung [mJ/cm²]
500
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
jeweils n -1/4 * ED 50 (n=1)
1 10 100
Abbildung 6.30 :Abhängigkeit der ED 50 -Schadensschwellen von der Pulszahl bei 100 Hz.
Das empirische n -1/4 Gesetz für Mehrfachpulse wurde mit eingezeichnet.
⋅
opht
1,7µs ED 50
opht
200ns ED 50
opht
8ns ED 50
ang
1,7µs ED 50
ang
200ns ED 50
ang
8ns ED 50
Anzahl der Laserpulse [n]

114_________________________________________ Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion
Bezüglich der therapeutischen Breite war eine Abhängigkeit der Pulsanzahl bei allen
Pulslängen zu sehen (Abb. 6.31). Da die ophthalmologische Schwelle langsamer als die
angiographische über der Pulszahl abfiel, kam es sukzessive zu einer Vergrößerung der
therapeutischen Breite bei vielen applizierten Pulsen.
n-fache therapeutische Breite
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
100Hz
500Hz
Parameter
opht ang
Abbildung 6.31 :Darstellung der n-fachen therapeutischen Breite (ED15 /ED85 ) für
100 Hz und 500 Hz.
Vergleicht man die beiden Tierversuchsstudien miteinander, so war als grundlegender
Unterschied in der 1. Studie eine Repetitionsrate von 500 Hz und in der 2. Studie 100 Hz
verwendet worden. Aufgrund der Grundtemperaturerhöhung bei 500 Hz (Abb. 6.28) ist
davon auszugehen, dass diese Schwellen ca. 10 % niedriger sein sollten als die vergleichenden
Parameter (100 Hz, 100 Pulse) bei gleicher Pulsdauer. Entgegen der Erwartung
waren vor allem die Schwellenwerte bei 200 ns, 100 Pulse und 100 Hz niedriger als bei
500 Hz.
Deshalb wurden noch einmal beide Parameter 1.7 µs, 200 ns mit je 100 Pulsen bei 100 Hz
und 500 Hz vergleichend an einem Kaninchenauge experimentell erfaßt (Abb. 6.32). Für
1.7 µs ergaben sich für bei Pulswiederholraten dieselben Schwellen. Lediglich bei 200 ns
lag die angiographische Schwelle mit 500 Hz etwas niedriger als die mit 100 Hz. Experimentell
war es schwierig einen Unterschied der Schwellen von 10 % signifikant herauszuarbeiten.

Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion______________________________________________ 115
Bestrahlung [mJ/cm²]
400
300
200
100
0
1,7µs 500Hz 1,7µs 100Hz 200ns 500Hz 200ns 100Hz
Abbildung 6.32 :Direkter Vergleich der beiden Parameter 1.7 µs und 200 ns mit je
100 Pulsen und 100 Hz oder 500 Hz Wiederholrate in beiden Augen eines
Kaninchen.
Analyse der Tierversuchsstudie 2 (100 Hz)
Parameter
ED 50 opht.
ED 50 ang.
Auch in dieser zweiten Versuchsstudie zeigt sich, dass sich die angiographische Schadensschwelle
zu kürzeren Pulslängen hin verringert (Abb. 6.29). Da bei kürzeren Laserpulsen
weniger Wärme während des Laserpulses durch Wärmediffusion von den
Melanosomen abgegeben wird, reicht eine niedrigere Pulsenergie aus, um die Melanosomen
zu erwärmen. Erstaunlich ist genau das umgekehrte Verhalten bei den beiden Parametern
8 ns und 200 ns Einzelpuls. Die kürzere Pulsdauer liegt 17 % oberhalb der
angiographischen Schwelle für 200 ns Einzelpuls. Der Grund hierfür bleibt unklar, da
auch ohne weitere Annahmen zu Schadensmechanismus nicht geklärt werden kann, ob
die angiographische Schwelle bei 8 ns Einzelpuls zu hoch, oder die angiographische
Schwelle bei 200 ns Einzelpuls zu tief liegt. Die angiographische Schwelle verringert sich
bei allen applizierten Pulslängen bei Erhöhung der Pulszahl, und ergeben eine gute Übereinstimmung
mit dem empirisch gefundenen n -1/4 Gesetz für Mehrfachpulse (Abb. 6.30).
Bei den in der Literatur vorgestellten Ergebnissen wurde dieses empirische Gesetz bei
Retinaschäden nur für den ophthalmoskopisch sichtbaren Schaden beschrieben
[102,108]. In diesen Arbeiten wird von einem rein thermischen Schaden am Fundus bei
kleinem Bestrahlungsdurchmesser (~20 µm) ausgegangen. Bei größeren Bestrahlungsdurchmessern
zeigte sich diese Abhängigkeit nicht [107], was sich auch in diesen Experimenten
für die ophthalmologisch sichtbare Schwelle darstellt. Diese
Pulszahlabhängigkeit ergab sich aber sowohl für thermische Schäden [102,108] im
ms-zeitbereich, wie auch bei thermomechanische Schäden in ns- bis fs-Zeitbereich
[105,107].
Die ophthalmoskopischen Schadensschwellen sinken mit der Anzahl der applizierten
Pulse ab (Abb. 6.30). Jedoch ergibt sich nicht das n -1/4 Gesetz für Mehrfachpulse, das bei
der angiographischen Schwelle gute Übereinstimmung zeigte. Die ophthalmoskopischen

116_________________________________________ Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion
Schadensschwellen fallen weniger stark über der Anzahl der applizierten Pulse ab. Die
verschiedenen Laserpulszeiten im Vergleich ergeben kein einheitliches Bild der ophthalmoskopischen
Schadensschwelle bei gleichen Pulszahlen.
Neben der Pulszahlabhängigkeit der angiographischen wie auch ophthalmoskopischen
Schwelle zeigt sich auch eine Verringerung der Streuung der Schwellenwerte bei Erhöhung
der Pulszahl (Abb. 6.29), was sich in einer steileren Steigung der an die Schwellenwerte
angepaßten logarithmischen Normalverteilung niederschlägt. Die ED 15 und
ED 85 -Werte, die in Abb. 6.29 als Fehlerbalken eingezeichnet sind, liegen näher an den
ED 50-Werten.
Dadurch, dass die angiographische Schadensschwelle stärker über der Anzahl der applizierten
Pulse abfällt als die ophthalmoskopische Schadensschwelle, und auch die
Schwankungen der Schwellenwerte bei höheren Pulszahlen abnehmen, vergrößert sich
die therapeutische Breite für alle Pulslängen bei Erhöhung der Pulszahl (Abb. 6.31). Die
größte therapeutische Breite von Faktor 2.9 ergibt sich für 200 ns Pulsdauer und
100 applizierte Pulse. Die derzeit klinisch verwendete Pulslänge von 1.7 µs hatte bei 10
applizierten Pulsen eine therapeutische Breite von 1 und erhöhte sich bei 100 Pulse auf
den Faktor 1.7 . Selbst die 8 ns Laserpulse, der mit 10 Hz Pulswiederholrate appliziert
wurden, hatten bei nur 10 Pulsen schon eine therapeutische Breite von ebenfalls 1.7 . In
beiden Tierversuchsstudien hatten jeweils die längsten Laserpulse die niedrigsten therapeutischen
Breiten.
6.5.4 Histologische Ergebnisse
Wie aus den Ergebnissen von Kap.6.5.3 hervorgeht, ist die therapeutische Breite bei Verwendung
von 200 ns Laserpulsen immer größer als der bereits klinisch verwendete Parameter
mit 1.7 µs Pulsdauer. Da in den Untersuchungen von Roider und Birngruber [3]
bereits histologisch gezeigt wurde, dass mit 5 µs Laserpulsen ein selektiver RPE Schaden
gesetzt werden kann, wurden hier nun die klinisch verwendeten Parameter
1.7 µs / 10 Pulse (behandelt wird z. Z. mit 30 Pulsen) und 200 ns / 10 Pulse histologisch
untersucht. Die klinische Verwendung von 100 Pulsen, die eine größere therapeutische
Breite in der Studie aufweisen, haben aufgrund der langen Bestrahlungszeit von einer
Sekunde keine klinische Relevanz. Es wurden bei den gewählten Parametern jeweils die
1.2-fache ED 50 ang als auch 0.8-fache ED50 oph untersucht. Mit diesen Parametern sollte
einerseits, wie auch klinisch erwünscht, gesichert ein RPE-Schaden gesetzt werden
(1.2-fache ED 50 ang ), und andererseits der selbe Parameter bei hoher Bestrahlung, aber mit
noch nicht ophthalmoskopisch sichtbaren Schaden (0.8-fache ED 50 oph , behandelnder
Arzt sieht noch keinen Effekt) histologisch untersucht werden. Zum Vergleich wurde
noch der Parameter 200 ns 100 Pulse sichtbare Läsion untersucht. Es konnte leider aus
den Präparaten zu bei dem Parameter 1.2-fache ED 50 ang für 1.7 µs keine Histologie
erstellt werden.

Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion______________________________________________ 117
Histologien 200 ns
In Abb. 6.33 ist eine Übersicht in 157-facher Vergrößerung über zwei Läsionen bei
23 µJ = 266 mJ/cm² = 0.8-fach ED 50 oph für 200 ns Laserpulsdauer dargestellt (speklekorrigierte
Bestrahlung). Sie zeigt deutlich dass sich die Läsion hauptsächlich auf das retinale
Pigmentepithel, sowie die Außenglieder der Photorezeptoren beschränken. In Abb. 6.34
ist in 1000-facher Vergrößerung der rechte Übergang der linken Läsion dargestellt. Die
Choriokapillaris ist durchgängig. Die Bruchsche Membran ist intakt. Das RPE ist vollkommen
geschädigt, kondensiert und die Zellreste liegen immer auf der Bruchschen
Membran an. Die RPE-Zellkerne sind kondensiert und stark angefärbt. Die Enden der
Außensegmente sind aufgelockert und oberhalb der Läsion heller angefärbt. Dieser Effekt
ist bei 0.8-fach ED 50 oph stärker als bei dem niedrigeren Parameter. Die Innensegmente,
äußere Körnerschicht und folgende Schichten der neuronalen Netzhaut sind intakt und
zeigen keine histologischen Veränderungen. Bei der niederenergetischeren Läsion mit
11 µJ =127 mJ/cm² = 1.2-fache ED 50 ang (Abb. 6.35) zeigt sich bei 1000-facher Vergrößerung
ein ähnliches histologisches Bild. Nur die Auflockerungen an den Enden der Außensegmente
sind etwas geringer.
Im Vergleich zu diesem Parameterpaar wurde noch in 400-facher Vergrößerung eine
sichtbare Läsion mit 200 ns, 100 Pulsen und bei 30 µJ = 346 mJ/cm² = 1.4-fach ED 50 oph
histologisch untersucht (Abb. 6.36). Auch bei dieser sichtbaren Läsion ist sowohl die
Choriokapillaris als auch die Bruchsche Membran unverändert. Das RPE ist im Bereich
der Läsion vollkommen geschädigt und die Zellreste liegen auf der Bruchschen Membran
auf. Die äußeren Segmente der Photorezeptoren sind an den Enden stark geschädigt und
über die ganze Schicht vakuolisiert. Die inneren Segmente sind teilweise zueinander verschoben
und ebenfalls vakuolisiert. Die äußere Körnerschicht und die folgenden Schichten
der neuronalen Netzhaut sind unverändert.
Histologien 1.7 µs
Bei 1.7 µs Pulsdauer, 10 Pulsen und 22 µJ =254 mJ/cm² = 0.8-fach ED 50 oph ist die Läsion
auf das RPE beschränkt (Abb. 6.37). Die Choriokapillaris ist durchgängig und ungeschädigt
und im Bereich der Läsionen sind keine Veränderungen feststellbar. Die Bruchsche
Membran ist intakt und durchgängig. Das RPE selbst ist vollkommen geschädigt, die
Zellkerne kondensiert und stärker angefärbt. Die Reste des RPEs liegen auf der Bruchschen
Membran auf. Die Außensegmente sind zum Teil verkürzt und der Bereich oberhalb
der Läsion ist aufgelockert und weniger stark angefärbt. Die Innensegmente, äußere
Körnerschicht und die folgenden Schichten sind unverändert.

118_________________________________________ Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 6.33 :Lichtmikroskopische Aufnahme zweier Läsionen mit 200 ns, 10 Pulse,
0.8-fach ED 50 opht = 266 mJ/cm² = 23 µJ in 157-facher Vergrößerung. Die
Pfeile markieren den Bereich der Läsionen.
Abbildung 6.34 :Lichtmikroskopische Aufnahme einer Läsion mit 200 ns, 10 Pulse,
0.8-fach ED 50 opht = 266 mJ/cm² = 23 µJ in 1000-facher Vergrößerung. Es
ist der Übergang Läsion - normales RPE dargestellt (links nach rechts).
Der dunkle Pfeil markiert die Läsionsgrenze, weiser Pfeil deutet auf einen
kondensierten Zellkern, A aufgelockerte Außensegmente der Photorezeptoren.

Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion______________________________________________ 119
Abbildung 6.35 :Lichtmikroskopische Aufnahme einer Läsion mit 200 ns, 10 Pulse,
1.2-fach ED 50 ang =127 mJ/cm² = 11 µJ in 1000-facher Vergrößerung. Es
ist der Übergang normales RPE - Läsion dargestellt (links nach rechts).
Der Pfeil markiert die Läsionsgrenze.
Abbildung 6.36 :Lichtmikroskopische Aufnahme einer sichtbaren Läsion mit 200 ns,
100 Pulse, 30 µJ = 346 mJ/cm² in 400-facher Vergrößerung. Die weisen
Pfeile markieren den Bereich der Läsion. Die schwarzen Pfeile deuten auf
Vakuolisierungen in den Innerensegmenten hin.

120_________________________________________ Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 6.37 :Lichtmikroskopische Aufnahme von 1,7µs, 10 Pulse, 0.8-fach
ED 50 opht =254 mJ/cm² = 22 µJ in 400-facher Vergrößerung. Die Pfeile
markieren den Bereich der Läsion.
Zusammengefaßt sind die histologischen Ergebnisse in Tabelle 8. Beim Vergleich der
histologischen Ergebnisse der verschiedenen Parameter untereinander wurde festgestellt,
dass bei allen Werten unterhalb der ophthalmoskopisch sichtbaren Schwelle sich ein sehr
ähnliches Bild ergibt. Immer ist das RPE vollkommen geschädigt und liegt auf der intakten
Bruchschen Membran auf. Die angrenzenden Außensegmente sind an den Enden
leicht aufgelockert. Ob für diese Fälle immer ein bleibender Schaden der Photorezeptoren
ausgeschlossen werden kann ist nicht eindeutig zu beantworten. Es ist bekannt, dass Schäden
der Aussensegmente resorbiert werden können [3]. Bei einer ophthalmoskopisch
sichtbaren Läsion zeigt sich eine starke Vakuolisierung sowohl der äußeren als auch der
inneren Segmente der Photorezeptoren (Abb. 6.36). In diesem Fall kann von einem irreparablen
Schaden an den Innen- und Außensegmenten ausgegangen werden.
Im Vergleich zu den früheren Arbeiten von Roider [2] zeigt sich, dass in allen hier untersuchten
Parametern das geschädigte RPE immer auf der Bruchschen Membran aufliegt.
Bei den Versuchen mit 500 Pulsen, 200 ns Nd:YAG bei 500 Hz Wiederholrate fand
Roider [2] bei ophthalmoskopisch nicht sichtbaren Läsionen sowohl RPE Abhebungen
als auch stark erweiterten subretinalen Raum zwischen RPE und Außensegmenten. Dies
konnte bei den in dieser Studie gemachten Histologien auch bei den sichtbaren Läsionen
nicht beobachtet werden. Bei Roider waren die Zellstruktur bei geschädigten RPE-Zellen
noch zu erkennen. Sie waren mit Vakuolisierungen durchzogen und lichtmikroskopisch

Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion______________________________________________ 121
Parameter Abb. 6.35 Abb. 6.33, Abb. 6.34 Abb. 6.36 Abb. 6.37
Pulsdauer 200ns 200ns 200ns 1700ns
Pulsanzahl 10 10 100 10
Pulsenergie 11µJ 23µJ 30µJ 22µJ
Angiogr + + + +
Ophthalmo. - - + -
Chorio-
kapillaris
-durchgängig,
unverändert
nur schwer von intakten RPE-Zellen zu unterscheiden [2]. Bei den Histologien, die im
Rahmen dieser Arbeit gemacht wurden, waren die geschädigten RPE-Zellen immer vollkommen
geschädigt und die Zellreste lagen der Bruchschen Membran auf.
Folgerung Tierversuchsstudie I und II
-durchgängig,
unverändert
-durchgängig,
unverändert
Bruch-Membran intakt intakt intakt intakt
RPE
Außensegmente
-vollkommen
geschädigt
-Kerne kondensiert und
stärker angefärbt
-Zellreste liegen immer
auf der Bruch-Membran
auf
-Enden aufgelockert
-im Bereich der Läsion
schwacher angefärbt
-vollkommen
geschädigt
-Kerne kondensiert
und stärker angefärbt
-Zellreste liegen
immer auf der
Bruch-Membran auf
-Enden aufgelockert
- Bereich oberhalb
der Läsion
schwacher angefärbt
-vollkommen
geschädigt
-Kerne kondensiert
und stärker
angefärbt
-Zellreste liegen
immer auf der
Bruch-Membran
auf
-stark vakuolisiert
- durchgängig
aufgelockert
-durchgängig,
unverändert
-vollkommen
geschädigt
-Kerne
kondensiert und
stärker angefärbt
-Zellreste liegen
immer auf der
Bruch-Membran
auf
-Enden
aufgelockert
- Bereich
oberhalb der
Läsion schwacher
angefärbt
Innensegmente unverändert unverändert vakuolisiert unverändert
andere
Schichten
unverändert unverändert unverändert unverändert
Tabelle 8: Wesentliche schematische histologische Befunde an Kaninchen nach retinaler Exposition
mit repetierenden Laserpulsen aus Abb. 6.33 bis Abb. 6.37.
Für eine Behandlung am Menschen sollte immer der Parameter mit der größten therapeutische
Breite verwendet werden, um inter- und intraindividuelle Schwankungen der
Schadensschwelle bei Menschen sicher ausgleichen zu können. Da das RPE des Kaninchens
in etwa dieselbe Absorption wie humanes RPE [28], ebenfalls eine granuläre
Absorberstruktur mit Melanosomen hat und auch die Photorezeptoren direkt an die
RPE-Zellage anschließen, ist eine Übertragbarkeit dieser experimentellen Ergebnisse auf
den Menschen in der grundlegenden Tendenz möglich. Die am Kaninchen bestimmten
Werte der therapeutischen Breite können in deren generellen Abhängigkeiten auch am
Menschen erwartet werden. Somit ist unter der Annahme der Übertragbarkeit der Tierversuchsergebnisse
bei der Wahl der Pulslänge zukünftig 200 ns aufgrund der größten therapeutischen
Breite aber histologisch ähnlichem Bild zu bevorzugen. Davor sollte jedoch

122_________________________________________ Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion
vergleichend die Mikroblasendynamik von 200 ns und 1.7 µs Pulslänge um Melaningranula
und im RPE untersucht werden, um eventuelle ungewollte Blasendynamikeffekte die
aus den Histologien nicht erkennbar sind, auszuschließen.
Nicht erklären läßt sich die große Differenz der im Tierversuch bestimmten angiographischen
Schwelle von 123 mJ/cm² (1.7 µs / 10 Pulse / 100 Hz) zu der bei Patientenbehandlungen
gemessenen 450 mJ/cm² (1.7 µs / 30 Pulse, Kap. 6.7.4) um den Faktor 3.5 .
Jedoch decken sie sich gut mit der durch CalzeinAM-Färbung bestimmten Schadensschwelle
für Schweine-RPE von 120 mJ/cm² (1 µs, 10 Pulse, 500 Hz) überein [11]. Über
die Absorption des RPE von Chinchilla Bastard Kaninchen gibt es keine Arbeiten, jedoch
ergibt sich bei Chinchilla Gray Kaninchen ein Absorption (46 %, [28]) die dem von
humanen RPE (43 %, [28]) bei der verwendeten Laserwellenlänge nahezu gleich ist.
Eventuell ergeben sich aber für eine Mikroblasenbildung noch weitere wichtige Faktoren
wie Melaningranulagröße, Oberflächenstruktur und mögliche Kondensationskeime an
der Granulaoberfläche. In einem direkten Vergleich von Kavitationsschwellen um isolierte
humane Melanosomen (520 mJ/cm², 1 µs Pulsdauer) und Schweine-Melaningranula
(280 mJ/cm², 1 µs Pulsdauer) in Suspension ergaben auch ein um den Faktor 1.9
höhere Mikroblaseschwelle bei den Granula humanen Ursprungs [11]. Was aber letztendlich
der Grund für diese Diskrepanz ist kann nicht geklärt werden.
In einer vergleichenden Arbeit zwischen Kaninchen und Menschen mit 20 ms cw Läsionen
ergab sich ein Unterschied um den Faktor 2.8 bei den ED 50 Bestrahlungswerten für
sichtbare Läsionen [93]. In dieser Arbeit wurde dies durch die mögliche unterschiedliche
optische Transmission der Augen erklärt [94].
Aus den Histologien läßt sich die Art des primären RPE-Schadensmechanismus nicht
erkennen. Für einen rein thermischen RPE-Schadensmechanismus spricht die Verringerung
der angiographischen Schadensschwelle bei Erhöhung der Pulszahl bei allen Pulslängen.
Dies ergibt sich bei der Arrhenius-Berechnung nach Gl. (34) durch die Integration
über den zeitlichen Temperaturanstieg. Diese Pulszahlabhängigkeit ergibt sich jedoch
auch bei den 8 ns Laserpulsen, bei denen in anderen Arbeiten [8, 11] ein thermomechanischer
RPE-Schadensmechanismus durch Mikroblasenbildung bei Einzelpulsbestrahlung
gezeigt werden konnte. Ob der Schadensmechanismus bei multiplen 8 ns Laserpulsen
noch immer primär thermomechanischer Natur ist, kann nicht geschlossen werden. Die
Übereinstimmung der angiographischen Schwellen für alle Pulslängen mit dem empirisch
gefundenen n -1/4 Gesetz läßt sich aber nicht aus einer thermischen Denaturierung schließen.
Es konnte in dieser Arbeit bei den Versuchen mit 5 µs Einzelpulsen gezeigt werden,
dass Mikroblasen entstehen, die die bestrahlte RPE-Zelle nicht Schädigen. Bei intrazellulärer
Mikroblasenbildung könnte angenommen werden, dass ein subletaler Schaden
erzeugt wird, der unbedeutend ist, solange nur ein einzelner Puls appliziert wird. Zelluläre
Reparaturmechanismen können beschränke Schäden beseitigen. Werden mehrere Pulse
hintereinander appliziert ist die Zelle zu stark geschädigt und die Reparaturmechanismsen
überfordert, startet ein Apoptoseprozeß und die Zelle geht zu Grunde.

Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion______________________________________________ 123
Extrapoliert man die Temperaturberechnungen an Melanosomen bei verschiedenen Pulslängen
aus der Arbeit von Brinkmann [12], so erhält man, dass für einen RPE-Schaden
durch Mikroblasenbildung bei angenommenen 150 °C Oberflächentemperatur [12] an
den Melanosomen, die angiographische Schwelle gerade bei 8 ns Laserpulsen im Vergleich
zu 200ns um 35 %, und bei 1.7 µs um 60 % niedriger sein sollten, da bei 8 ns Pulslänge
ein thermischer Einschluß der Melanosomen vorliegt. Bei 200 ns Einzelpulse ergab
sich statt der erwarteten 35 % niedrigeren Schwelle eine 15 % höhere Schadensschwelle,
und bei 10 Pulsen 26 % niedrigere Schwelle für 8 ns Einzelpulse. Im Vergleich zu 1.7 µs
war die Schwelle bei 8 ns Einzelpulsen um 50 %, und bei 10 Pulsen um 42 % erniedrigt.
Die angenommen Werte werden mit Ausnahme von bei 200 ns Einzelpuls alle etwa um
10 - 20 % unterschritten. Diese Abschätzung der notwendigen Schwellenänderung läßt
sich bei einer thermischen Denaturierung wegen der extremen nichtlinearität des Temperatur-Zeit-Verhaltens
nicht direkt machen. In diesem Fall müßte eine Arrhenius-Berechnung
wie in Kap. 6.5.2 für multiple Pulse durchgeführt werden um genauere Aussagen
treffen zu können.
Der RPE-Schadensmechanismus der zu einer angiographischen Leckage führt, kann aus
den Ergebnissen der Tierversuchsstudie nicht eindeutig geklärt werden.
6.6 Fluoreszenzbasierte On-line Dosimetrie
6.6.1 A2E Fluoreszenz und thermische Stabilität
Es sollte mit dem in Kap. 5.4.1 vorgestellten Aufbau untersucht werden, ob es möglich
ist, A2E thermisch zu denaturieren, und ein Zusammenhang zur Schädigung der RPE-Zellen
während der selektiven RPE Behandlung hergestellt werden kann.
A2E hat ähnlich wie Lipofuszin ein breites Anregungs- und Emissionsspektrum
(Abb. 6.38). Das Exzitationsmaximum liegt breitbandig zwischen 420 nm und 530 nm
und das Emissionsmaximum zwischen 570 nm und 700 nm. Die Messungen wurden bei
der Exzitationswellenlänge 467(5) nm und Emissionswellenlänge 632(20) nm durchgeführt.
Bei 467 nm hat die anregende Quecksilber-Hochdruckdampflampe des Fluoreszenzspektrometers
ein Maximum, wodurch mehr Fluoreszenzlicht zur Verfügung steht als
beim Exzitationsmaximum des A2E von 480 nm.

124_________________________________________ Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion
Fluoreszenz [cps]
Fluoreszenz [cps]
8000 Excitation
Detektion bei 632nm
6000
4000
2000
400 420 440 460 480 500 520 540
16000 Emission
12000
Anregung bei 467nm
8000
4000
Wellenlänge [nm]
500 550 600 650 700
Wellenlänge [nm]
Abbildung 6.38 :Emissions- und Exzitationsspektrum von A2E in DMSO gelöst (1µM)
In Langzeitexperimenten wurde untersucht, ob sich die Probe während der Meßzeit von
bis zu 30 Minuten spektral oder in der Intensität verändert. Es zeigten sich keine Änderungen
im Zeitraum von 2 Stunden. Ein Ausbleichen von A2E innerhalb des Meßzeitraums
durch das anregende Licht von 0.87 µW bei 467 nm ist nicht gegeben.
Bei einer Temperaturerhöhung von 20 °C auf 37 °C senkte sich die Fluoreszenzintensität
um 20 %. Beim anschließenden Abkühlen wurde die anfängliche Fluoreszenzintensität
wieder erreicht (Abb. 6.39). Auch bei hohen Temperaturen (75 °C) bleibt die Fluoreszenzintensität
über den Meßzeitraum von zehn Minuten konstant (Abb. 6.40). Wird die Fluoreszenzintensität
über der Probentemperatur aufgetragen, so ergibt sich ein linearer
Zusammenhang (Abb. 6.41). Die Messungen wurden bei einer Exzitationswellenlänge
von 467 nm und einer Emissionswellenlänge von 632 nm durchgeführt, die Integrationskonstante
betrug 0.2 Sekunden.

Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion______________________________________________ 125
Fluoreszenz [cps]
Temperatur [°C]
40
35
30
25
20
8000
7500
7000
6500
6000
5500
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Zeit [s]
Abbildung 6.39 :Fluoreszenzintensitätsverlauf beim Erwärmen und anschießenden Abkühlen
von A2E in DMSO (1 µM). A2E erniedrigt die Fluoreszenzintensität
ungefähr um 1 % pro °C. Bei Abkühlung wird wieder die Ausgangsintensität
erreicht. A2E wird nur thermisch reversibel verändert.
Fluoreszenz [cps]
Temperatur [°C]
80
70
60
50
40
30
20
3500
3000
2500
2000
1500
0 100 200 300 400 500 600 700
0 100 200 300
Zeit [s]
400 500 600 700
Abbildung 6.40 :Fluoreszenzintensitätsverlauf bei Erwärmung von A2E in DMSO (1 µM)
auf 75 °C.

126_________________________________________ Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion
Fluoreszenz [cps]
3500
3000
2500
2000
1500
Lineare Regression für Y = A + B * X
Parameter Wert Fehler
----------------------------------------------
A 4193.72056 25.30512
B -31.52344 0.36119
----------------------------------------------
20 30 40 50 60 70 80
Temperatur [°C]
Meßdaten
linearer Datenfit
Abbildung 6.41 :Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit von der Probentemperatur. Es ergibt
sich ein linearer Zusammenhang zwischen Temperatur und der Fluoreszenzintensität.
A2E ist bis zu einem Temperaturbereich von 80 °C thermisch stabil und verringert seine
Fluoreszenzintensität linear mit der Temperatur. Dieser Prozeß ist reversibel. Eine Aussage
über höhere Temperaturen konnte aufgrund der technischen Möglichkeit der Probenkammer
nicht gemacht werden.
6.6.2 AF-Messung bei Bestrahlung von Schweine-RPE
Erste Versuche zur Fluoreszenzdetektion wurden an präpariertem Schweine-RPE
(Kap. 5.3.1) durchgeführt. Aufgrund der kurzen Lebenszeit von Mastschweinen hat sich
entsprechend wenig Lipofuszin im RPE angesammelt. Die retinale Autofluoreszenz ist
um drei Größenordnungen kleiner als beim Menschen [35]. Deswegen wurde an der Fluoreszenzauskopplung
anstatt einer Photodiode eine Glasfasereinkopplung mit anschließendem
Photomultiplier adaptiert (Abb. 5.20). Der Photomultiplier mißt die
Fluoreszenzintensität der Lichtbandbreite, die durch den Strahlteiler
(570-750 nm, Abb. 5.19) und den Filter vorgegeben wird. Um eine Korrelation zwischen
den gemessenen Fluoreszenzdaten und der Schädigungsschwelle der RPE-Zellen zu
ermöglichen, wurde nach der Bestrahlung CalceinAM auf die Probe gegeben und so die
RPE-Zellschädigung nachgewiesen (Kap. 5.3.1).
Die Proben wurden mit dem Nd:YLF Laser und Pulsenergien von 20 µJ bis 40 µJ, bei
einer Pulslänge von 1.7 µs und einer Pulsfolgerate von 500 Hz auf einem Spot von
160 µm bestrahlt. Es wurde die Fluoreszenzintensität über der Anzahl der applizierten
Laserpulse gemessen. Der Fluoreszenzintensitätswert wurde vor der Auftragung auf die
jeweilige Laserpulsenergie, die mit der Photodiode gemessen wurde, normiert. Es zeigt
sich für alle Laserpulsenergien ein Abfall der Fluoreszenzintensität über der Anzahl der
applizierten Laserpulse (Abb. 6.42).

Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion______________________________________________ 127
Fluoreszenzintensität [a.u.]
1000
900
800
700
600
Datenfit mit e -n/τ
40.0 µJ
35.0 µJ
30.0 µJ
27.5 µJ
25.0 µJ
22.5 µJ
20.0 µJ
500
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Laserpulsnummer
Abbildung 6.42 :Normierte Autofluoreszenzintensität einer Schweine-RPE Probe über der
Anzahl der applizierten Laserpulse für verschiedene Pulsenergien bei
500 Hz Pulswiederholrate. Die Fluoreszenzintensität fällt über der Anzahl
der applizierten Pulse ab. Die Abnahme beträgt bis zu 22%. An alle Kurven
wurde ein monoexponentieller Fluoreszenzintensitätsabfall mit der
Abfallkonstanten τ angepaßt.
An die Meßdaten wurde ein monoexponentieller Abfall mit der Abfallkonstanten τ als
Maß für die Abfallgeschwindigkeit angefittet. Über sieben Proben gemittelt sind die Fluoreszenzabfallkonstanten
über der applizierten Pulsenergie in Abb. 6.43 A aufgetragen. Es
ergibt sich eine starke Änderung der Abfallkonstanten bei einer Bestrahlung von
130 mJ/cm² (Abb. 6.43 A).
Bei der Anfärbung mit CalceinAM zeigte sich neben den in Kap. 5.3.2 beschriebenen
Zellfärbungen (RPE nicht angefärbt - RPE-Zelle tot; RPE fluoresziert - RPE-Zelle vital)
auch eine Hyperfluoreszenz im bestrahlten Bereich. Die hyperfluoreszenten Zellen wurden
neben den beiden bekannten Kriterien (vital / tot) gesondert ausgewertet. Durch Auszählen
der jeweiligen RPE-Zellen pro bestrahltem Areal erhält man die
Schadenswahrscheinlichkeit in Abhängigkeit der applizierten Pulsenergie (Abb. 6.43 B).
Die RPE-Schadenswerte und die Werte für hyperfluoreszente RPE-Zellen wurden statistisch
mit Probit (Kap. 5.8.4) ausgewertet und die ED 50-Schwellenwerte bestimmt.
Beim Vergleich der Kurven aus Abb. 6.43 A und Abb. 6.43 B sieht man in diesem Fall
eine Änderung der Autofluoreszenzabfallkonstanten τ bei Zunahme der hyperfluoreszenten
RPE-Zellen.

128_________________________________________ Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion
Diskussion
Fluoreszenzabfallkonstante τ
Zellschaden / Zelltod [%]
450
400
350
300
250
200
100
80
60
40
20
0
Pulsenergie [µJ]
15 20 25 30 35 40
77 103 129 155 181 207
Hyperfluoreszenz
Zelltod
Bestrahlung [mJ/cm²]
77 103 129 155 181 207
Bestrahlung [mJ/cm²]
Abbildung 6.43 :A: Fluoreszenzabfallkonstante über der Bestrahlung der Schweine
RPE-Proben. Es zeigt sich eine Änderung der Abfallkonstanten bei
130 mJ/cm².
B:Hyperfluoreszenz- und Zellschadensschwellen von Schweine-RPE.
(Schadensschwelle: 125 mJ/cm², Hyperfluoreszenzschwelle: 180 mJ/cm²)
Die RPE-Zellreaktion, die zur Entstehung der hyperfluoreszenten Anfärbung führt ist
nicht bekannt. Die Änderung der Autofluoreszenzabfallkonstanten τ bei Zunahme der
hyperfluoreszenten RPE-Zellen kann deshalb nicht einer bestimmten Zellreaktion zugeordnet
werden.
Eventuell entsteht Hyperfluoreszenz einerseits durch eine leicht geschädigte RPE-Zellmembran
mit erhöhter CalceinAM Permeabilität, oder andererseits durch einen erhöhten
Umsatz von Esterasen durch einen beginnenden Apoptoseprozeß, was mit einer verstärkter
Umbildung von intrazellulärem CalceinAM zu Calcein einher gehen würde. In beiden
Fällen würde sich die intrazelluläre Calceinkonzentration, und damit auch die Fluoreszenzintensität
der RPE-Zelle erhöhen.
A
B

Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion______________________________________________ 129
Es ist zu berücksichtigen, dass bei der Verringerung der Fluoreszenzintensität über der
Anzahl der applizierten Laserpulse mehrere Faktoren eine Rolle spielen können. Einerseits
kann es, wie in den A2E-Temperaturversuchen gezeigt (Kap. 6.6.1), nur eine
Verringerung durch die im RPE induzierte Wärme sein. Diese würde generell in keinem
direkten Zusammenhang mit der Schädigung der RPE-Zelle oder RPE-Zellreaktion stehen.
Wie in Kap. 6.4.2 experimentell gezeigt wurde beträgt die durch den Laserpulszug
generierte Grundtemperaturerhöhung 34 °C . Da sich die Fluoreszenz von A2E um ca.
1 % pro °C erniedrigt sollte ein Fluoreszenzintensitätsabfall von 34 % zu erwarten sein.
Dieser liegt bei dieser Bestrahlung nur bei maximal 19 % (siehe Abb. 6.42; 30 µJ). Diese
Diskrepanz kann eventuell durch den möglichen Einfluß der weiteren acht natürlichen
Fluorophore des Lipofuszin entstehen. Auch ist ein Ausbleichen des Fluorophors bei der
eingestrahlten Bestrahlungsstärke von 90 kW/cm² während 1.7 µs (bei 30 µJ), naheliegend.
6.6.3 AF-Messung bei Bestrahlung von Kaninchen
Im Rahmen der ersten Tierversuchsstudie wurde auch die Änderung der Autofluoreszenz
bei Bestrahlung mit dem in Kapitel 5.4.2 beschriebenen Aufbau gemessen. Bei Bestrahlung
mit 5 µs Argon-Laserpulsen (100 Pulse, 500 Hz) wurde wie in den in vitro Versuchen
an Schweine-RPE ein Fluoreszenzabfall über der Anzahl der applizierten Pulse
gefunden. Zur Auswertung wurde ein monoexponentieller Autofluoreszenzabfall angepaßt
und die Fluoreszenzabfallkonstante als Maß für die Fluoreszenzänderung bestimmt.
Es zeigt sich, wie bei den in vitro Versuchen, eine Verringerung der Fluoreszenzabfallkonstante
bei höheren Bestrahlungswerten (Abb. 6.44). Ob eine Sättigung der Fluoreszenzabfallkonstanten
bei höheren Bestrahlungswerten als bei den in vitro Versuchen
(Abb. 6.43) auftritt, konnte aufgrund der begrenzten Laserleistung nicht näher untersucht
werden. Es wurden 39 Läsionen in zwei Augen gesetzt.
τ
Fluoreszenzabfallkonstante
1200
1000
800
600
400
200
Pulsenergie [µJ]
2 4 6 8 10 12
5µs Argon Puls
A
10 21 31 41 52 62
angiographische Sichtbarkeit [%]
10 21 31 41 52 62
Bestrahlung [mJ/cm²]
Bestrahlung [mJ/cm²]
Abbildung 6.44 :A: Autofluoreszenzabfallkonstante τ eines angepaßten monoexponentiellen
Abfalls über der applizierten Bestrahlung am Kaninchenauge (5 µs,
100 Pulse, 500 Hz).
B: Angiographische Sichtbarkeit der Läsionen über der Bestrahlung.
100
80
60
40
20
0
B
Pulsenergie [µJ]
4 6 8 10 12
5µs Argon Puls

130_________________________________________ Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion
Die Autofluoreszenz des Augenhintergrundes der Kaninchenaugen war wie bei den
Schweine RPE Proben in der Größenordnung um 10 nJ/J, also um den Faktor 2000 kleiner
als die Autofluoreszenz des menschlichen Auges [19]. Es konnte kein Schwellenkriterium
aus den gemessenen Autofluoreszenzdaten festgelegt werden.
6.6.4 AF-Messung bei Patientenbehandlung
Während der Patientenbehandlung konnte durch den modularen Fluoreszenzaufbau an
der Spaltlampe (Kap. 5.4.2) die retinale Autofluoreszenz direkt während der Behandlung
am Patienten in vivo gemessen werden. Durch die hohe Lipofuszinakkumulation im
menschlichen Auge ist genügend Fluoreszenzlicht vorhanden, um es mit einer Photodiode
nachzuweisen (Abb. 5.22).
Während des Projektzeitraumes von Januar 1999 bis März 2002 wurden Patienten mit
zwei unterschiedlichen Parametersätzen behandelt: 100 Pulse bei 500 Hz und 30 Pulse
bei 100 Hz Wiederholrate. Dadurch ergeben sich wie bereits in Kap. 6.4.3 gezeigt, unterschiedliche
Grundtemperaturen im bestrahlten Areal direkt nach dem Laserpulszug. Nach
Berechnungen wird bei 500 Hz das Gewebe um 75 °C erwärmt (Abb. 6.11), bei 100 Hz
jedoch nur um 10 °C (Abb. 6.12).
Aufgrund der unterschiedlichen Endtemperaturen und der gemessenen Temperaturabhängigkeit
der A2E-Fluoreszenz werden die Daten nach Laserwiederholrate getrennt diskutiert.
Autofluoreszenz bei Patientenbehandlungen mit 500 Hz Wiederholrate
Bei zehn Behandlungen mit diabetischer Makulopathie wurde mit 500 Hz Laserwiederholrate
behandelt und die retinale Autofluoreszenz während der Behandlung gemessen.
Dabei zeigte sich in allen gemessenen 198 Behandlungsspots eine Abnahme der Autofluoreszenz
über der Anzahl der applizierten Laserpulse. Exemplarisch ist ein Beispiel
eines Behandlungsherdes bei 100 µJ Pulsenergie in Abb. 6.45 dargestellt. Durch Anfitten
einer monoexponentiellen Funktion wurden die Fluoreszenzabfallkonstanten bestimmt.
Exemplarisch sind in Abb. 6.46 vier der gemessenen Behandlungsergebnisse zusammengefaßt
dargestellt. Dabei wurden pro Patient alle Abfallkonstanten einer Pulsenergie
gemittelt und die Mittelwerte und der Standardfehler aufgetragen. In allen Fällen zeigt
sich, dass die Fluoreszenzabfallkonstanten τ bei Erhöhung der Laserpulsenergie abnimmt.
Bei allen vier Patienten lag die angiographische Sichtbarkeit der Laserläsionen bei
100 µJ. Es konnte aufgrund der Inhomogenität der Daten bei zehn Behandlungen keine
Korrelation mit der angiographischen Schadensschwelle gefunden werden.

Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion______________________________________________ 131
Fluoreszenzintensität [a.u.]
1.00
0.98
0.96
0.94
0.92
fit mit
y=a*e -n/τ
Pulsenergie 100µJ
0 20 40
Pulsnummer
60 80 100
Abbildung 6.45 :In vivo Fluoreszenzintensität über der Anzahl der applizierten Laserpulse
bei 500 Hz Pulswiederholrate und 100 µJ. Es zeigte sich eine Abnahme der
retinalen Autofluoreszenz über der Anzahl der Laserpulse. Bei einer Pulsenergie
von 100 µJ ergab sich eine Abnahme um 6 %. Durch einen Datenfit
mit einer monoexponentiellen abfallenden Funktion ergibt sich die Fluoreszenzabfallkonstante
τ.
Fluoreszenzabfallkonstante τ
5000
4000
3000
2000
1000
Patient A
Patient B
Patient C
Patient D
0
40 60 80 100 120 140
Pulsenergie [µJ]
Abbildung 6.46 :Mittelwerte und Standardabweichungen der Fluoreszenzabfallkonstante τ
für verschiedene Patientenbehandlungen. Diese Daten wurden während
der Behandlung von diabetischer Makulopathie gemessen. Es zeigt sich ein
Abfall der Fluoreszenzabfallkonstante τ bei Erhöhung der Laserpulsenergie.
Die angiographische Sichtbarkeit der Läsionen lag bei 100 µJ. Eine
klare Schwelle läßt sich aus den gewonnenen Werten nicht bestimmen. Insgesamt
wurden bei zehn Patienten die Fluoreszenzdaten erfaßt.

132_________________________________________ Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion
Betrachtet man die Verteilung des prozentualen Fluoreszenzabfalls für alle applizierten
Läsionen (Abb. 6.47), so zeigt sich, dass es im Mittel zu ungefähr 4 % Verringerung der
retinalen Autofluoreszenz durch den Laserpulszug kommt. Bei einer Läsion ergab sich
keine Erniedrigung der Autofluoreszenz.
Anzahl der Läsionen [n]
16 500Hz Pulswiederholrate (n=141)
14
12
10
8
6
4
2
0
-15 -10 -5 0 5
Verringerung der Autofluoreszenz [%]
Abbildung 6.47 :Verteilung der prozentualen Verringerung der retinalen Autofluoreszenz
durch den Laserpulszug für alle Läsionen bei 500 Hz Laserwiederholrate;
(50-130 µJ, 100 Pulse, 176 µm Spot, 10 Patienten).
Auch hier kann ein Vergleich mit dem zu erwartenden Fluoreszenzabfall der A2E Temperaturergebnisse
gemacht werden. Für die in Abb. 6.47 dargestellten Werte kann man eine
durchschnittliche Pulsenergie von 100 µJ annehmen, was nach Kap. 6.4.3 eine Grundtemperaturerhöhung
von 60 °C bedeutet. Danach sollte der durch die Grundtemperaturerhöhung
bedingte Autofluoreszenzabfall der A2E-Komponenten statt der gemessenen
mittleren 4 % bei der Behandlung 60 % betragen. Warum sich Lipofuszin in vivo und dessen
Hauptbestandteil A2E in vitro so unterschiedliche Ergebnisse zeigen ist unklar.
Wegen der großen Diskrepanz der Ergebnisse aus Abb. 6.46 läßt sich somit kein schlüssiges
Bild der im RPE vorkommenden Fluoreszenzprozesse bei SRT mit 500 Hz Pulswiederholrate
liefern.
AF-Messungen bei Behandlung mit 100 Hz Wiederholrate
Die retinale Autofluoreszenz wurde bei 20 Behandlungen mit 30 Pulsen und 100 Hz Pulswiederholrate
als Behandlungsparameter gemessen. Es zeigte sich teilweise eine
Abnahme der retinalen Autofluoreszenz um bis zu 8 % (Abb. 6.48 B, C). Jedoch gab es
auch Bestrahlungsareale in denen sich die Autofluoreszenz nicht änderte (Abb. 6.48 A).
Im allgemeinen war die induzierte Fluoreszenzerniedrigung schwächer als bei der
Bestrahlung mit 500 Hz Wiederholrate. Durch Anfitten einer monoexponentiellen Funktion
wurden die Fluoreszenzabfallkonstanten bestimmt. Exemplarisch sind in Abb. 6.49
vier der gemessenen Behandlungsergebnisse zusammengefaßt dargestellt. In allen Fällen

Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion______________________________________________ 133
zeigt sich kein eindeutiger Trend der Fluoreszenzabfallkonstanten τ bei Erhöhung der
Laserpulsenergie. Bei allen vier Patienten lag die angiographische Schwelle bei 100 µJ.
Die Fluoreszenzabfallkonstanten gaben in allen 20 Fällen keinen Hinweis auf die
RPE-Schadensschwelle.
Fluoreszenzintensität [a.u.]
0.48
0.46
0.44
0.42
0.40
0.38
0.36
C
B
A
0 5 10 15 20 25 30
Pulsnummer
Abbildung 6.48 :Beispiele für die in vivo Fluoreszenzintensität einzelner Läsionen über der
Anzahl der applizierten Laserpulse bei 100 Hz Lasperpulswiederholrate
und 100 µJ Pulsenergie. Es zeigt sich teilweise eine Abnahme der retinalen
Autofluoreszenz über der Anzahl der Laserpulse (B und C). In manchen
Fällen (A) zeigte sich keine Änderung der Autofluoreszenz. Durch einen
Datenfit mit einer monoexponentiellen abfallenden Funktion ergibt sich die
Fluoreszenzabfallkonstante τ.
Fluoreszenzabfallkonstante τ
4000
3000
2000
1000
0
Patient E
Patient F
Patient G
Patient H
40 60 80 100 120 140
Pulsenergie [µJ]
Abbildung 6.49 :In vivo Fluoreszenzabfallkonstante τ für verschiedene Patientenbehandlungen.
Es wurden vier Patientendaten exemplarisch dargestellt. Es zeigte
sich hierbei keine systematische Änderung der angepaßten Fluoreszenzabfallkonstante
τ. Die angiographische Schadensschwelle lag bei den
Behandlungen bei 100 µJ Insgesamt wurden bei 20 Patienten die Fluoreszenzdaten
erfaßt.

134_________________________________________ Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion
Betrachtet man die Verteilung des prozentualen Autofluoreszenzabfalls nach einem
Laserpulszug für alle Behandlungsläsionen bei 100 Hz Pulswiederholrate, so zeigt sich
eine mittlere Fluoreszenzverringerung um 2 % (Abb. 6.50). In dieser Abbildung wurden
die Daten aus Abb. 6.47 (500 Hz) mit eingezeichnet, und beide Graphen wegen der besseren
Übersicht auf deren prozentualen Anteil der Läsionen als Ordinate umgerechnet.
Bei 100 Hz Pulswiederholrate kam es bei 14 % der Läsionen zu keiner Fluoreszenzänderung
(0 %) oder sogar zu einer Fluoreszenzzunahme (>0 %) während des Laserpulszuges.
Im Vergleich zu der Verteilung bei 500 Hz Pulswiederholrate ist die Verteilung breiter.
prozentuale Anzahl der Läsionen [%]
16 500Hz Pulswiederholrate (n=141)
100Hz Pulswiederholrate (n=666)
14
12
10
8
6
4
2
0
-15 -10 -5 0 5
Verringerung der Autofluoreszenz [%]
Abbildung 6.50 :Verteilung der prozentualen Verringerung der retinalen Autofluoreszenz
durch den Laserpulszug für alle Läsionen bei 100 Hz und 500 Hz Laserwiederholrate;
500 Hz: 50-130 µJ, 100 Pulse, 10 Patienten, 141 Läsionen
100 Hz: 50-160 µJ, 30 Pulse, 20 Patienten, 666 Läsionen
Es muß beachtet werden, dass sich bei 100 Hz Wiederholrate nur eine geringe Grundtemperaturerhöhung
ergibt (Kap. 6.4.3). Da die Verringerung der Autofluoreszenz bei 100 Hz
um die Hälfte kleiner ist als bei 500 Hz, kann ein temperaturinduzierter Zusammenhang
durch A2E in Betracht gezogen werden. Bei Temperaturdifferenzen von 60 °C der Grundtemperatur
von 500 Hz zu 100 Hz sollte die Differenz der Autofluoreszenzänderung größer
sein.
Eventuell ist die Autofluoreszenzänderung bei beiden Pulswiederholraten auch durch ein
Ausbleichen des Lipofuszins gegeben. Bei 500 Hz Pulswiederholrate wurde durchschnittlich
mit 100 µJ behandelt, was einer Gesamtenergie von 10 mJ entspricht. Bei 100 Hz
Pulswiederholrate lagen die Schwellen etwas höher, so dass durchschnittlich mit 120 µJ
und 30 Pulsen behandelt wurde, was einer Gesamtenergie von 3.6 mJ entspricht. Es
wurde bei Behandlungen mit 100 Hz nur 36 % der Gesamtenergie eines 500 Hz Pulszuges
mit 100 Pulsen appliziert, was nahe den 50 % weniger Autofluoreszenzabfall für 100 Hz
Pulswiederholrate ist.

Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion______________________________________________ 135
6.6.5 Spektral aufgelöste AF-Messungen bei Patientenbehandlung
Da sich die retinale Autofluoreszenz breitbandig über einen Spektralbereich von 500 nm
bis 770 nm erstreckt (Abb. 2.4), wurde untersucht, ob sich in der spektralen Verteilung
des Autofluoreszenzlichtes eine Änderung durch den Behandlungseffekt ergibt.
Mit Hilfe des in Kapitel 5.4.2 beschriebenen Aufbaus konnten während der Behandlung
spektral aufgelöste Messungen am Augenhintergrund durchgeführt werden. Aufgrund der
durchgeführten Kalibration (Kap. 5.4.2) können Absolutwerte angegeben werden. Es
wurden bei insgesamt drei RCS und einer DMP Behandlung die Fluoreszenzspektren
gemessen. Da das Fluoreszenzlicht über die Spaltlampe in das Spektrometer eingekoppelt
wird, ist der Spektralbereich durch den dichroitischen Strahlteiler in der Spaltlampe auf
600 - 750 nm (Abb. 5.19) beschränkt. Jedoch ist damit auch ein Großteil des retinalen
Fluoreszenzspektrums eingeschlossen (Abb. 2.4). In Abb. 6.51 ist beispielhaft ein gemessenes
Spektrum dargestellt. Es werden je nach Lokalisation des Fundus Lichtenergien in
der Größenordnung µJ / nm pro appliziertem Joule emittiert. Diese Daten decken sich
sowohl in der spektralen Verteilung als auch in der emittierten Fluoreszenzlichtleistung
mit den Ergebnissen am gesunden Menschenauge von Delori [19] (Abb. 2.4).
Fluoreszenz [(µJ/nm)/J]
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
580 600 620 640 660 680 700 720 740 760
Wellenlänge [nm]
DMP Patient
110µJ
Abbildung 6.51 :Gemessenes Autofluoreszenzspektrum eines Pulses bei selektiver Bestrahlung
von DMP (110 µJ, bei 100 Hz).
Bei der Auswertung der Daten wurde untersucht, ob sich eine spektrale Veränderung in
Abhängigkeit von der Anzahl der applizierten Pulse bei verschiedenen Pulsenergien
ergibt. Dabei zeigte sich in allen behandelten Fällen, dass die Fluoreszenzintensität, wie
bereits in Kap. 6.6.4 gezeigt, über der Anzahl der applizierten Laserpulse leicht abnimmt.
Dabei bleibt die emittierte spektrale Verteilung im Rahmen der Meßgenauigkeit in allen
Fällen konstant. In Abb. 6.52 sind exemplarisch für drei verschiedene Behandlungsspots
(120 µJ, 100 Hz, 30 Pulse, angiogr. positiv), die Spektren und die dazugehörigen, jeweils
auf das erste Spektrum normierte Differenzspektren, aufgetragen. Wie in Kap. 5.4.2

136_________________________________________ Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion
beschrieben konnten von den 30 Pulsen nur zehn Pulse, d.h. also jeder dritte Puls gemessen
werden. Die spektrale Verteilung ist in allen drei Fällen sehr ähnlich. In den Differenzspektren
zeigt sich keine eindeutige spektrale Änderung.
Abbildung 6.52 :Gemessene Autofluoreszenzspektren und die dazugehörigen auf das
jeweils erste Spektrum normierten Differenzspektren.
Zusammenfassend ist das Konzept der autofluoreszenzbasierten On-line Dosimetrie in
den hier erarbeiteten Varianten aus den Kap. 6.6.2 bis Kap. 6.6.5 nicht als nichtinvasive
On-line Kontrolle einsetzbar. Es konnten mit Hinblick auf die angiographischen Schadensschwellen
keine signifikanten Korrelationen mit den Autofluoreszenzdaten, weder
im Bezug auf die Änderung der Gesamtfluoreszenzenergie, als auch die Änderung der
spektralen Verteilung festgestellt werden. Eine autofluoreszenzbasierte On-line Dosimetrie
ist bei selektiver RPE Therapie nicht möglich.
6.6.6 Postoperative Autofluoreszenz nach selektiver Patientenbehandlung
Eine weitere, nichtinvasive Methode zur Verifikation des Lasererfolges, die keinen
On-line Nachweis zuläßt, könnte die bildgebende AF-Messung nach der Behandlung darstellen.
Es wurden, wie in Kap. 5.4.3 detailliert beschrieben, an 26 Patienten Messungen
durchgeführt.
Eine Identifikation der Laserläsionen war durch Autofluoreszenzaufnahmen bei 22 von
26 Patienten möglich. Bei den erfolgreichen Läsionen zeigte sich postoperativ eine
Abnahme der Autofluoreszenz und eine entsprechende Leckage in der Angiographie in
den bestrahlten Arealen (Abb. 6.53 A,B). Die Abnahme der Autofluoreszenz konnte
bereits 10 Minuten nach Behandlung detektiert werden und zeigte eine Stunde später eine
Verstärkung. Bei Patienten mit diabetischer Makulopathie, die mit zahlreichen Leckagearealen,
Makulaödem und verdickter Netzhaut einhergeht, gestaltete sich die AF-Messung
aufgrund dieser Netzhautpathologien schwieriger. Über Fluoreszein, welches auch

Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion______________________________________________ 137
aus den retinalen Gefäßen entweicht, besteht bei stärkerem zentralen Ödem nicht die
Möglichkeit, zwischen Ödem und Laserläsion zu unterscheiden. Hingegen kann mit ICG,
welches aufgrund seiner größeren Molekülstruktur nicht aus den retinalen Gefäßen entweichen
kann, sondern nur bei Zerstörung der Choriokapillaris in den subretinalen Raum
poolt, unabhängig vom Makulaödem, ein RPE-Schaden anzeigt werden
(Abb. 6.54 A, B, C).
Abbildung 6.53 :A: Autofluoreszenzmessung eine Stunde nach selektiver Laserbehandlung
bei Drusenmakulopathie (140 µJ). Die gridförmig angelegten Laserläsionen
können durch eine Abnahme der Autofluoreszenz (grau-schwarz) gut
identifiziert werden.
B: Die korrespondierende Fluoreszenz-Angiographie zeigt Leckage in den
behandelten Arealen.

138_________________________________________ Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 6.54 :A: Autofluoreszenzmessung eine Stunde nach selektiver Laserbehandlung
bei diabetischer Makulopathie. Die Testläsionen (weiße Pfeile; links
125 µJ, mitte/oben 150 µJ, rechts 175 µJ) am unteren Gefäßbogen sind
durch eine Abnahme der Autofluoreszenz gut zu erkennen. Die zentralen
Läsionen hingegen sind aufgrund des Makulaödems nicht zu verifizieren.
B: Die korrespondierende Fluoreszenz-Angiographie läßt die Testläsionen
am unteren Gefäßbogen sichtbar werden, jedoch ist zentral keine genaue
Abgrenzung der Behandlungsläsionen und des Makulaödems möglich.
C: Die korrespondierende ICG-Angiographie zeigt eine genaue Lokalisation
der zentralen Laserläsionen ohne Störung durch das vorhandenen
Makulaödem.
Eine Visualisierung von ophthalmoskopisch nicht sichtbaren Laserläsionen nach selektiver
RPE-Behandlung durch postoperative AF-Messungen kann oftmals erreicht werden.
Eine On-line Kontrolle direkt während der Behandlung ist damit nicht möglich, da der für
einen sicheren Nachweis notwendige Autofluoreszenzbildkontrast erst eine Stunde nach
der Behandlung zu erzielen ist. Die Fluoreszenz-Angiographie kann als invasive Maßnahme
zur Therapiekontrolle durch die nicht-invasive AF-Messung in den meisten Fällen
abgelöst werden. Nur in Einzelfällen, wie z.B. bei fortgeschrittenen diabetischen Makulopathien,
muß eine ICG-Angiographie zum sicheren Nachweis des Lasererfolges in
Betracht gezogen werden.
6.7 Optoakustische On-line Dosimetrie
Wie in Kapitel 6.5 gezeigt, kann bei der Bestrahlung mit einzelnen 5 µs-Laserpulsen
optoakustisch intrazelluläre Mikroblasenbildung bei RPE-Zellschädigung nachgewiesen
werden. Ein Nachweis der RPE-Schädigung bei den Patientenbehandlungen mit optoakustischen
Methoden erscheint vielversprechend.
6.7.1 Optoakustische Transienten bei Bestrahlung von Schweine RPE
Es wurde in in vitro Versuchen an Schweine RPE-Proben untersucht, ob für die gegebenen
Behandlungsparameter (1.7 µs, 30 Pulse, 100 Hz, 160 µm Spot in vitro) ein optoakustischer
RPE-Schadensnachweis möglich ist. Da schon zu Beginn der Versuche aus den
Simulationen zur Empfangscharakteristik des OA-Kontaktglases (Kap. 5.2.5, Kap. 6.3)

Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion______________________________________________ 139
klar war, dass bei Patientenbehandlungen eine absolute Messung der Drucktransienten
nicht praktikabel ist, wurde bei den in vitro Versuchen ein Lösungsweg gesucht, der auch
ohne Absolutwerte eine sicheres RPE-Schadenskriterium liefert.
Frisch präparierte Schweine RPE-Proben (Kap. 5.3.1) wurden mit dem in Kapitel 5.5.1
beschriebenen optoakustischen in vitro Aufbau bestrahlt. Aufgrund der niedrigeren Schadensschwelle
für Schweine RPE von 110 µJ/cm² [11] im Gegensatz zu den bei Patientenbehandlungen
verwendeten 450 mJ/cm² [114] wurde nur bis zu 60 µJ Pulsenergie
appliziert. Die emittierten Drucktransienten wurden mit dem Wandler (PIN-Transducer,
Kap. 5.2.2) gemessen. Zum Nachweis des RPE-Schadens wurde nach den Versuchen die
Probe mit CalceinAM angefärbt und nach 20 Minuten Inkubationszeit unter dem Fluoreszenzmikroskop
ausgewertet.
Als Beispiel sind typische Transienten in Abb. 6.55 für vier verschiedene Pulsenergien
dargestellt. Dabei wurden die jeweils 30 gemessenen OA-Transienten eines Bestrahlungsareals
überlagert dargestellt. Unterhalb der Schadensschwelle (100 mJ/cm²)
(Abb. 6.55 A) wird eine rein thermoelastische Transiente gemessen. Da bei einem Wandlerabstand
von ca. 1 mm im akustischen Fernfeld gemessen wird, ist die Transiente bipolar
[65] und wird gefolgt von akustischen Reflexionen innerhalb des Wandlers und dem
RPE-Probenhalter. Aufgrund der kürzeren Pulslänge von 1.7 µs und dem deutlich größeren
Bestrahlungsdurchmesser von 160 µm, der 10-fachen Fläche gegenüber den Bestrahlungen
mit 5 µs Einzelpulsen (Spot 50 µm) aus Kap. 6.5.1, kann bei diesen Experimenten
mit dem selben Hydrophon und ähnlichen Probenabstand immer, auch unterhalb der
Schadensschwelle eine thermoelastische Transiente gemessen werden. Die 30 Transienten
unterscheiden sich minimal voneinander. Es werden Druckamplituden bis zu
0.75 mbar gemessen.
Leicht oberhalb der Schadensschwelle (125 mJ/cm²) (Abb. 6.55 B) ist der bipolare Teil
der Transiente noch unverändert. Am Ende der bipolaren Welle kommen leichte
Puls-zu-Puls Abweichungen von 100 µbar Amplitude hinzu. In Kap. 6.5.1 konnten bei
Mikroblasenbildung Druckamplituden von 200 µbar (Abb. 6.16 C / E) bei Bestrahlung
von 8 RPE-Zellen gemessen werden. Die Abweichungen aus Abb. 6.55 B von 100 µbar
sind wahrscheinlich die akustische Überlagerung der einzelnen Transienten der entstandenen
Mikroblasen im Bestrahlungsfeld. Da die Mikroblasenentstehung ein zufälliger
Prozeß ist und bei dem verwendeten Spotdurchmesser von 160 µm ca. 80 RPE-Zellen
bestrahlt werden, kommt es zu den unregelmäßigen Puls-zu-Puls Variationen. Die Druckamplituden
der thermoelastischen bipolaren Welle sind 0.5 mbar.
Erhöht man die Energie auf 150 mJ/cm², so nimmt die Amplitude der Puls-zu-Puls Variationen
stark zu (Abb. 6.55 C). Es werden Druckspitzen von 1 mbar erreicht. Auch zeigen
sich die Fluktuationen zeitlich früher. Bei der hohen Bestrahlung ist davon auszugehen,
dass die Mikroblasenbildung zeitlich früher einsetzt, wie in Abb. 6.55 B gezeigt. Dieser
Effekt bei Erhöhung der Bestrahlung konnte auch in den Experimenten mit einzelnen
3 ms Laserpulsen beobachtet werden (Abb. 6.16).

140_________________________________________ Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion
Bei 2.5-facher Schadensschwelle (450 mJ/cm²) bildet sich eine zweite bipolare Transiente
aus, die als Blasenkollaps der Mikroblasen gewertet werden kann (Abb. 6.55 D). In dieser
Abbildung sind die ersten fünf Transienten von den anderen hervorgehoben. Man erkennt,
dass bei der ersten Transiente der zeitliche Abstand zwischen dem ersten und dem zweiten
bipolaren Peak mit 6 µs am größten ist. Mit zunehmender Pulszahl verringert sich der
zeitliche Abstand der beiden Peaks auf 3.75 µs bei der fünften, und letztlich 3 µs bei der
30. Transiente. Kelly zeigte bei Versuchen mit ns-Pulsen, dass sich bei 3-fach überschwelliger
Bestrahlung die einzelnen Mikroblasen mehrerer bestrahlter RPE-Zellen sich zu
einer großen Makroblase zusammenschließen können [8]. Die bestimmten zeitlichen
Abstände zwischen den bipolaren Peaks können als Blasenlebensdauer der “Makroblase”
angesehen werden. Im Gegensatz zu den Transienten Abb. 6.55 B / C , bei denen die
durch die Mikroblasen entstehenden Druckamplituden im Bereich einiger hundert Mikrobar
war, entstehen in diesem Fall Amplituden von über 20 mbar. Bei dieser Pulsenergie
wurde auch Materialauswurf aus der bestrahlten Fläche und komplette RPE-Zerstörung
mit dem Spaltlampenmikroskop beobachtet. Die Blasenbildung selbst konnte nicht beobachtet
werden, da die Blasen zeitlich zu kurz waren und keine stationären Blasen im RPE
zurück blieben. Bei in vivo Bestrahlung von Kaninchenaugen zeigte Roider, dass es bei
10-fach überschwelliger Bestrahlung mit 200 ns Laserpulsen zu ophthalmoskopisch
sichtbarer Blasenbildung kommt die auch nach einer Stunde noch sichtbar waren [4].
Durch den ersten Laserpuls kommt es wahrscheinlich schon zum Materialauswurf, da die
Blasenlebensdauern der darauf folgenden Laserpulse kürzer sind. Durch den Materialauswurf
wird die Absorption im bestrahlten RPE für die folgenden Laserpulse verringert, und
somit können nur kleinere Blasenensembles mit kürzerer Blasenlebensdauer gebildet
werden.

Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion______________________________________________ 141
1.0 1. Puls
10. Puls
20. Puls
0.5
30. Puls
C
1.0 1. Puls
10. Puls
20. Puls
0.5
30. Puls
A
0.0
Druck [mbar]
0.0
Druck [mbar]
-0.5
-0.5
-1.0
-1.0
0 2 4 6 8 10 12
Zeit [µs]
0 2 4 6 8 10 12
D
Zeit [µs]
20
B
10
1.0 1. Puls
10. Puls
20. Puls
30. Puls
0.5
0
1. Puls
2. Puls
3. Puls
4. Puls
5. Puls
-10
Druck [mbar]
0.0
Druck [mbar]
-0.5
-20
-1.0
-30
0 2 4 6 8 10 12
Zeit [µs]
0 2 4 6 8 10 12
Zeit [µs]
Abbildung 6.55:30 Überlagerte optoakustische Transienten bei Bestrahlung von präpariertem Schweine-RPE.
A: Unterschwellig bei 100 mJ/cm²: Nur thermoelastische Transienten, keine Puls-zu-Puls Fluktuation;
B: knapp Überschwellig bei 125 mJ/cm²: Thermoelastische Transiente, kleine Puls-zu-Puls Fluktuation am Ende des bipolaren Peaks;
C: 26 % Überschwellig bei 150 mJ/cm²: Thermoelastische Transiente, starke Puls-zu-Puls Fluktuationen nach dem bipolaren Peak,
Amplituden der Fluktuationen sind höher als die thermoelastische Transiente;
D:250 % Überschwellig bei 450 mJ/cm²: Bildung einer Blasenkollapstransiente als zweiter bipolaren Peak nach 3-6 µs mit Druckspitzen
von 20 mbar Bar.

142_________________________________________ Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion
6.7.2 Datenauswertung der optoakustischen Transienten
Bei der Auswertung der gemessenen Transienten muß ein Algorithmus gefunden werden,
der zwischen rein thermoelastischen Transienten (Abb. 6.55 A) und thermoelastischen
Transienten mit lokalen Abweichungen (Abb. 6.55 B/C) durch die Mikroblasen unterscheidet,
als auch in der einleitenden Skizze Abb. 4.3 dargestellt. Auch die Randbedingungen
der Messungen bei Patientenbehandlung sollten hier berücksichtigt werden. So
muß beachtet werden, dass wie in Kap. 5.2.5 gezeigt, bei einer Patientenbehandlung die
akustische Transferfunktion von Behandlungsareal zu Behandlungsareal verschieden ist,
und somit eine Auswertung der optoakustischen Daten über deren akustische Energie wie
in Kap. 6.5.1 nicht möglich ist. Aus dem selben Grund kann auch keine “Referenztransiente”
definiert werden, mit der man alle gemessenen Behandlungstransienten vergleicht.
Nur eine Entfaltung der gemessenen Transienten wäre eine Lösungsmöglichkeit.
Das würde die Kenntnis von den jeweils aktuellen geometrischen Parametern wie Lokalisation
im Auge, Verkippung des OA-Kontaktglases, und ebenso die Transferfunktion
des OA-Kontaktglases während jedes einzelnen Behandlungsareals voraussetzten.
Zur Datenanalyse wurde basierend auf den oben genannten Randbedingungen ein stabiler,
schneller und robuster Algorithmus entwickelt, der es erlaubt, eine Unterscheidung
zwischen rein thermoelastischen Transienten (Abb. 6.55 A) und thermoelastischen Transienten
mit lokalen Abweichungen durch Mikroblasenbildung (Abb. 6.55 B/C) zu fällen.
Aus den n = 30 gemessenen optoakustischen Transienten Pj() t wird zuerst die gemittelte
Transiente Pt () nach
Pt ()
n
1
= -- P
n � j() t
j = 1
(39)
errechnet. Danach wird von allen gemessenen Transienten Pj() t die gemittelte Transiente
Pt () subtrahiert. Man erhält die Abweichungen Dj() t der einzelnen Transienten Pj() t von
der gemittelten Transiente Pt () mit
Dj() t = Pj() t – Pt () . (40)
Anschließend werden der Betrag der Abweichungen Dj() t über ein zeitliches Fenster
[ t1, t2] integriert.
E j
=
t 2
�
t 1
Dj() t dt
(41)

Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion______________________________________________ 143
Der Wert Ej ist ein Maß für die Abweichung der j-ten Transiente von der gemittelten
Transiente
durch
Pt () . Der größte Wert der Abweichungen Ej wird als OA-Wert definiert
OA– Wert = max[ Ej] ; j = 1…n.
(42)
Dieser Wert ist ein Maß für die maximalen Druckdifferenzen der Transienten eines Pulszuges
untereinander in einem durch das Integral zeitlich vorgegebenen Fenster.
Da bei der Anwendung bei Patientenbehandlung keine Referenztransiente zur Verfügung
steht, wird in Gl. (39) die Mittelwerttransiente als Referenztransiente jedes einzelnen
Pulszuges errechnet. Wegen der geringen Augenbewegungen während der 300 ms
Bestrahlungszeit kommt es zu keiner Änderung der akustischen Transferfunktion während
des Pulszuges. Durch die Subtraktion in Gl. (40) fällt der thermoelastische Teil der
Transienten weg, da dieser sich von Puls zu Puls nicht ändert. Im Falle einer unterschwelligen
Bestrahlung erhält man nach diesem Schritt nur noch das Rauschen der Signale. Bei
überschwelliger Bestrahlung wird ebenfalls das stabile thermoelastische Signal entfernt,
nur die Abweichungen durch die Blasentransienten bleiben. Mit Gl. (42) wird sichergestellt,
dass wenn nur bei einer Transiente ein Blasenanteil gemessen wurde, dieser auch
Ausschlaggebend für die Beurteilung ist. Mit diesem Algorithmus wurden alle optoakustischen
Messungen ausgewertet.
6.7.3 Ergebnisse der OA-Dosimetrie bei in vitro Bestrahlungen
Es wurden sechs RPE-Proben mit Pulsenergien von 5-50 µJ, 30 Pulse bei 100 Hz
bestrahlt und anschließend mit CalceinAM angefärbt. Nach einer Inkubationszeit von 30
Minuten wurde die Anzahl der geschädigten RPE-Zellen pro Spot unter dem Fluoreszenzmikroskop
ausgezählt. Die gemessenen OA-Transienten wurden in dem Zeitbereich von
3 µs nach dem ersten bipolaren Peak mit dem beschriebenen Algorithmus (Kap. 6.7.2)
ausgewertet. In Abb. 6.56 sind die pro Bestrahlungsareal erhaltenen OA-Werte über der
Anzahl der geschädigten RPE-Zellen in Prozent aufgetragen. Es ergibt sich eine klar definierte
Grenze von OAvitro = 2.4 10 -10 ⋅ [bar ⋅
s] mit der man zwischen RPE Schädigung
und ungeschädigtem RPE unterscheiden kann. Es ist sogar möglich, die Mikroblasen einzelner
geschädigter Zellen unter dem thermoelastischen Signal der insgesamt 80 bestrahlten
RPE-Zellen herauszufiltern. Unter den 142 bestrahlten Arealen kam es dabei zu
insgesamt sechs falsch detektierten Bestrahlungsarealen. Bei den drei falsch/positiv
detektierten Fällen, bei denen zwar stärkere Puls-zu-Puls Abweichungen aber keine Zellschädigung
festgestellt wurden, waren entweder die Pulsform der 30 applizierten Laserpulse,
und damit die thermoelastische Transiente unregelmäßig, oder es kam zu
elektro-magnetischen Störungen. In den ebenfalls drei falsch/negativ gewerteten Fällen
haben sich eventuell die akustischen Transienten der einzelnen Mikroblasen destruktiv
überlagert und konnten somit nicht detektiert werden. Die Schadensschwellenwerte wurden
in ihre dichotomen Einzelwerte umgerechnet, wodurch jede bestrahlte RPE-Zelle als

144_________________________________________ Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion
Einzelereignis betrachtet wird, und mit Probit analysiert [80]. Die RPE-Schadensschwelle
lag bei ED 50=193 mJ/cm² mit ED 15=149 mJ/cm² als untere, und ED 85=251.6 mJ/cm² als
obere Breite der angepaßten logarithmischen Normalverteilung. Dieser Wert liegt
erstaunlicherweise etwas höher als die von Rögener gemessenen RPE-Schadensschwelle
von 156 mJ/cm² bei Pulsserien mit 3 µs Pulsdauer (in vitro RPE-Probe, CalceinAM,
10 Pulse, 500 Hz, 50 µm Spot) [11]. Dies kann ein Effekt des relativ großen Bestrahlungsdurchmessers
sein, da die Annahme, jede RPE-Zelle als Einzelereigniss zu betrachten,
gerade bei starker Mikroblasenbildung nicht gegeben ist.
Bei der Behandlung wird nur die fluoreszenzangiographische Leckage als Schadenskriterium
herangezogen. Das bedeutet, dass nicht jede RPE-Zelle als Einzelereigniss zu
betrachten ist, sondern die Gesamtheit der bestrahlten RPE-Zellen eines Spots. Kommt es
zur angiographischen Leckage kann nur der Schluß gezogen werden, dass RPE-Zellen
geschädigt wurden. In welchem Ausmaß, ob 10 % oder 90 % der Zellen, läßt sich nicht
beurteilen. Aus diesem Grund wurden auch bei den Schweine RPE-Proben der gesamte
bestrahlte Spot als dichotomer Einzelwert in dem es zur Zellschädigung kommt oder
nicht, d.h. ohne die Berücksichtigung der Anzahl der geschädigten RPE-Zellen, mit Probit
ausgewertet. So ergab sich der Schwellwert von ED 50 spot =130 mJ/cm²
(ED 15 spot =114 mJ/cm², ED85 spot =145 mJ/cm²) für die sechs RPE-Proben. Unter dieser
Voraussetzung der Probitanalyse stimmt die ED 50 spot -Schwelle sehr gut mit den experimentellen
Pulsserienergebnissen von Rögener überein [80]. Bei der Schwellenwertbestimmung
für die OA-Werte wurde der bestimmte Grenzwert OA vitro = 0.024 zur
Umsetzung der OA-Werte in dichotome Einzelwerte, die ebenfalls den Spot als Gesamtwert
betrachten, umgerechnet und mit Probit analysiert. Der Schwellenwert für eine nachgewiesene
Mikroblasenbildung mit ED 50 OA =92 mJ/cm² (ED15 OA =66 mJ/cm²,
ED 85 OA =128 mJ/cm²) ist sogar noch 30 % unterhalb der Schwelle für den generellen
RPE-Schaden ED 50 spot =130 mJ/cm² im bestrahlten Spot.

Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion______________________________________________ 145
OA-Wert [bar s]
1E-8
1E-9
1E-10
Grenzwert
0 20 40 60 80 100
Zelltod [%]
Abbildung 6.56 :OA-Werte über Prozent der geschädigten RPE-Zellen von sechs Proben
mit insgesamt 142 bestrahlten Arealen. Der Grenzwert für Zellschädigung
liegt bei OAvitro =2.410 -10 ⋅ [bar ⋅ s]. Dabei wurden nur insgesamt drei
Areale als falsch/positiv und ebenfalls drei als falsch/negativ detektiert. Bei
den 3 falsch/negative beurteilten Arealen muß auch beachtet werden, dass
sie jeweils immer noch unterhalb der Schwelle für 50 % Zellschädigung
(~ 40 RPE-Zellen im Spot) lagen.
Auch im Fall repetitiver Bestrahlung mit 1.7 µs Laserpulsen ergibt sich wie bei der
Bestrahlung mit 5 µs Einzelpulsen (Kap. 6.5.1), dass bei RPE-Schädigung Mikroblasenbildung
gemessen werden kann. Auch unterhalb der ED 50-Schwelle (50 % geschädigte
RPE-Zellen im Spot) können die durch die Mikroblasen induzierten Puls-zu-Puls Fluktuationen
sicher mit optoakustischen Methoden detektiert werden.
Mit einem auf Reflexion basierenden Aufbau konnte Rögener bei der Bestrahlung von
Schweine-RPE mit repetitierenden 6 µs Laserpulsen eine Mikroblasenschwelle 10 %
oberhalb der ED 50 Schadensschwelle bestimmen [22]. Die reflexbasierte Mikroblasendetektion
nahe der RPE-Schadensschwelle war nicht sensitiv genug, um im Reflexionssignal
zwischen diffuser Reflexion und Reflexion mit oder ohne transienten Blasenanteil zu
unterscheiden [22, 23]. Erst bei größeren Mikroblasenensembles, bei denen schon mehrere
bestrahlte RPE-Zellen geschädigt sind, konnte auch im Reflexionssignal eine Erhöhung
des reflektierten Laserlichtes durch die entstehende Wasser-Blasen-Grenzfläche
detektiert werden.
Ein optoakustischer Nachweis des RPE-Schadens unterhalb der ED 50 -Schwelle in vitro
ist möglich. Der entwickelte Auswertalgorithmus ist mit einem PC sehr schnell (30.2 ms,
Pentium 120 MHz) und liefert zuverlässig Werte, die eine Diskriminierung in vitro erlauben.

146_________________________________________ Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion
6.7.4 OA-Dosimetrie bei Patientenbehandlung
Für Messungen bei Patientenbehandlungen wurde das für diese Anwendung entwickelte
und in Kap. 5.2.3 näher beschriebene OA-Kontaktglas verwendet, das wegen seiner
hohen Empfindlichkeit von 5 V/bar (Kap. 6.2) es erlaubte die optoakustischen Transienten
am Patientenauge zu messen. Es wurde der in Kap. 5.5.2 beschriebene Behandlungsaufbau
verwendet. Als Laser wurde der Nd:YLF-Laser (Kap. 5.1.1) bei 1.7 µs Pulslänge
und 100 Hz Wiederholrate verwendet. Es wurden bei 37 Behandlungen Messungen
durchgeführt.
Exemplarisch sind in Abb. 6.57 die ersten beiden OA-Transienten eines Laserpulszuges
einer diabetischen Makulopathie-Behandlung bei 100 µJ dargestellt. Der Übersicht halber
wurden sie in drei Bereiche unterteilt. Die Messung der Transiente beginnt mit Einstrahlung
des Laserpulses. Die ersten 5 µs des Bereichs Abb. 6.57 A enthält kein Signal, was
der minimalen akustischen Laufzeit zu den nächsten absorbierenden Strukturen des
Auges entspricht. Ab 5 µs sind thermoelastische Signale im Zeitbereich 5-14 µs meßbar,
die sich aufgrund der Überlagerung nicht ihren einzelnen Strukturen zuordnen lassen.
Diese Transienten entstehen nur bei älteren Patienten bei denen eine Trübung der Augenmedien
auch vorhanden ist. Durch die Lichtstreuung von getrübten Augenmedien kann
auch Laserlicht auf die geometrisch naheliegenden absorbierenden Strukturen wie der Iris
und der vordere Teil des Augapfels gebracht werden. Der zeitliche Beginn von 5 µs entspricht
einem Laufweg von 7.4 mm, was in etwa dem Abstand der Iris von der Wandlerfläche
entspricht. Bei der relativ jungen Patientengruppe für die RCS (Alter ~ 40 Jahre)
kam es zu keinen signifikanten Transienten im Zeitbereich unterhalb 14 µs (siehe
Abb. 6.61). Im Bereich Abb. 6.57 B , ab 14 µs wird dann die thermoelastische Transiente
des Augenhintergrundes gemessen. Daraus ergibt sich mit der Schallgeschwindigkeit für
den Glaskörper von 1532 m/s [101] eine Strecke von 21 mm, was dem durchschnittlichen
Durchmesser des Augapfels entspricht [26]. Im Bereich Abb. 6.57 B sind auch die
Puls-zu-Puls Abweichungen bei überschwelliger Bestrahlung enthalten. Diese sind in
Ausschnitt Abb. 6.57 A nicht vorhanden. In Segment Abb. 6.57 C sind dann Reflexionen
der in Abb. 6.57 B detektierten Transiente innerhalb des Kontaktglases und ein gedämpftes
Ausschwingen des Piezokristalls mit seiner Resonanzfrequenz 1 MHz meßbar.

Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion______________________________________________ 147
A B C
Abbildung 6.57 :Die drei verschiedenen Bereiche einer OA-Transiente bei Patientenbehandlung.
A: Durch Lichtstreuung an trüben Augenmedien induzierte thermoelastische
Transiente absorbierender Strukturen des vorderen Augenabschnittes.
B: Thermoelastisches Signal des Augenhintergrundes mit Abweichungen
bei überschwelliger Bestrahlung.
C: Schallreflexionen innerhalb des OA-Kontaktglases und Ausschwingen
des Wandlers mit der Resonanzfrequenz 1 MHz.
In Abb. 6.58 ist jeweils die erste OA-Transiente eines Laserpulszuges bei 110 µJ für alle
37 gemessenen Behandlungen überlagert dargestellt. Bei dieser Pulsenergie wurden insgesamt
334 Behandlungsherde gesetzt. Man erkennt die hohe Variabilität der Signalformen
wie sie sich auch schon aus den Ergebnissen der Simulationen zur
Empfangscharakteristik des OA-Kontaktglases ergeben (Kap. 6.3). Es werden Durckamplituden
bis zu 60 mbar gemessen.
Abbildung 6.58 :Die jeweils erste OA-Transiente des Laserpulszuges bei 110 µJ von 334
Läsionen bei 37 Patientenbehandlungen.

148_________________________________________ Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion
Wertet man alle gemessenen Druckamplituden auf deren Pulsenergie normiert aus
(Abb. 6.59), so zeigt sich, dass unabhängig von der Pulsenergie immer ähnlich viel applizierte
Laserenergie in eine Drucktransiente umgewandelt wird. Bei den Druckmaxima der
ersten positiven bipolaren Welle werden durchschnittlich 4.2 µbar/µJ (Standardfehler
1.0 µbar/µJ) am OA-Kontaktglas gemessen. Die Entstehung der Mikroblasen bei den
hohen Pulsenergien, die zur Behandlung verwendet werden, führen offensichtlich nicht zu
einer signifikanten Amplitudenerhöhung. Die größten der Druckmaxima der gesamten
Transiente liegen immer über denen der Druckminima. Dies ist in Übereinstimmung mit
den Ergebnissen von Sigrist für die Formveränderung einer akustischen Transiente im
Fernfeld [65].
relativer Druck [µbar/µJ]
6
4
2
0
-2
-4
40 60 80 100 120 140 160
Pulsenergie [µJ]
Maximum
Minimum
Abbildung 6.59 :Gemittelte Druckmaxima und -minima pro Pulsenergie über der jeweiligen
Pulsenergie. Unabhängig von der Pulsenergie wird immer gleich viel
Energie in Druck umgewandelt. Das Druckmaximum liegt im Mittelwert
bei 4.2 µbar/µJ.
Vergleicht man das bei den Behandlungen gemessene, gemittelte Frequenzleistungsspektrum
aller optoakustischen Transienten (n = 41100) mit dem in der Simulation der Empfangscharakteristik
erhaltenen Ergebnis für den verwendeten Ringwandler (Kap. 6.3), so
ergibt sich eine gute Übereinstimmung der Werte (Abb. 6.60). Es kommt zu einer starken
Reduzierung der Mittenfrequenzen von den erwarteten 1 MHz auf 300 kHz. Frequenzen
oberhalb 1 MHz werden kaum mehr gemessen. Dies deckt sich ebenfalls mit den simulierten
Werten für größere Winkelverschiebungen im Auge, in diesem Fall 15°. Im Vergleich
zu den Ergebnissen der 0°-Simulation stimmt sowohl die Mittenfrequenz als auch
die Dämpfung hoher Frequenzanteile überein. Durch die große Wandlerflächen und durch
das schiefe Auftreffen der Schallwellen werden hohe Frequenzanteile weggemittelt. Es
muß bei den Behandlungen immer von einer Verkippung der Kontaktglases und zusätzlich
einer eventuell dezentralen Behandlung ausgegangen werden. Dies kommt dadurch
zustande, dass der behandelnde Arzt das Kontaktglas verkippt, um sich selbst nicht mit
den Reflexionen des Spaltlampenlichtes an der Kontaktglasoberfläche zu blenden.

Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion______________________________________________ 149
Frequenzleistung [a.u.]
1
0.1
0.01
1E-3
gemitteltes gemessenes Leistungsspektrum
simuliertes Leistungsspektrum bei 15°
simuliertes Leistungsspektrum bei 0°
0.1 1
Frequenz [MHz]
Abbildung 6.60 :Normiertes gemitteltes Leistungsspektrum aller gemessener Transienten
im Vergleich zu dem simulierten Leistungsspektren bei 15° und 0° Verkippung
des Schallquellpunktes.
Vergleicht man die OA-Transienten bei verschiedenen Pulsenergien in einem Patienten,
so ergibt sich ein ähnliches Bild wie in den in vitro Versuchen an Schweine RPE. In
Abb. 6.61 sind die Transienten dreier Pulsserien einer RCS-Patientenbehandlung bei verschiedenen
Pulsenergien abgebildet. Bei unterschwelliger Bestrahlung mit 50 µJ, d.h. es
ist kein fluoreszenzangiographischer Schaden nachweisbar, ergeben sich keine
Puls-zu-Pulsschwankungen (Abb. 6.61 A). Bei gerade überschwelliger Bestrahlung mit
angiographisch sichtbarem Schaden kommt es zu Puls-zu-Puls Abweichungen, bei denen,
wie in den in vitro Versuchen, die Abweichungen durch die zusätzlichen Blasenbildungsund
Kollapstransienten assoziiert werden kann (Abb. 6.61 B). An einer anderen retinalen
Lokalisation konnten bei der selben Pulsenergie schon zusätzliche bipolare Peaks durch
einen Blasenkollaps detektiert werden (Abb. 6.61 C, Pfeil). Das es bei einem zweiten
bipolaren akustischen Peak um eine Blasenkollapstransiente handelt, konnte in vitro in
Kap. 6.5.1 und in vivo bei Kaninchenbestrahlung in Kap. 6.8.1 mit Hilfe zusätzlicher
Reflexionsmessungen gezeigt werden. Geht man von der Blasenbildung in der ersten µs
des Laserpulses aus, so läßt sich daraus eine Blasenlebensdauer von 6 µs bestimmen. Solche
klar detektierbaren Kollapstransienten mit zweitem bipolaren Peak wurden nur bei
drei der insgesamt 1370 Behandlungsareale detektiert.

150_________________________________________ Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion
Druck [µbar]
Druck [µbar]
Druck [µbar]
200
0
-200
-400
1000
500
0
-500
-1000
A
0 10 20 30 40 50
B
Zeit [µs]
0 10 20 30 40 50
Zeit [µs]
50µJ
600 125µJ
400
200
0
-200
-400
-600
-800
0 10 20 30 40 50
Zeit [µs]
Abbildung 6.61 :Typische OA-Transienten einer Patientenbehandlung (RCS).
A: Unterschwellige Bestrahlung mit 50 µJ. Keine angiographische Läsion.
B: Überschwellige Bestrahlung mit 125 µJ, angiographische Läsion,
Puls-zu-Puls Abweichungen.
C: Überschwellige Bestrahlung ebenfalls bei 125 µJ. Teilweise Blasenkollaps
(Pfeil) 6 µs nach thermoelastischer Transiente.
Da sich dieselben charakteristischen Änderungen der Transienten bei den Behandlungen
als auch bei den in vitro Versuchen an Schweine RPE zeigten, wurde auch der Auswertealgorithmus,
wie in Kap. 6.7.2 beschrieben, verwendet. Jedoch wurden der auszuwertende
Zeitbereich auf 12 µs-30 µs beschränkt, da hier die stärksten Signaländerungen zu
beobachten waren. Entsprechend der Leistungsspektren der gemessenen Transienten
(Abb. 6.60) wurden die Daten noch digital mit einem Butterworthfilter (Labview, [75])
zwischen 5 kHz und 1 MHz in vierfacher Ordnung bandpaßgefiltert, um elektromagnetische
Störungen herauszufiltern. Butterworth-Filter höherer Ordnung erreichen nahezu die
ideale Filter-Antwort mit 1 im Durchlassbereich und Null im Sperrbereich.

Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion______________________________________________ 151
6.7.5 Vergleich zwischen Fluoreszenzangiographie und OA-Wert
Als Kriterium für einen gewünschten RPE Zellschaden wurde von Birngruber und Roider
bei Patientenbehandlungen die fluoreszenzangiographische Sichtbarkeit eingeführt [7, 2].
Sie ist somit bisher der Goldstandard, mit dem die Ergebnisse der OA-Dosimetrie verglichen
werden müssen. Aufgrund der intraindividuellen Variabilität der Absorption am
Augenhintergrund muß dafür jeder einzelne Behandlungsherd mit seinem angiographischen
Ergebnis verglichen werden. Bei der Patientengruppe mit diabetischer Makulopathie
ist dies nicht möglich, da bei diesem Krankheitsbild der ganze Fundus eine diffuse
Leckage zeigt. Die Patientengruppe mit RCS hat meistens nur einen Quellpunkt, wodurch
das Auffinden der einzelnen Läsionen gut möglich ist. Dabei darf dann aber wiederum
keine Läsion zweimal auf denselben Punkt gesetzt werden.
Unter diesen strengen Bedingung konnten nur vier der insgesamt 37 Behandlungen mit
der detaillierten angiographischen Punktauswertung analysiert werden. Dabei wird jede
gesetzte Läsion aus der Videoaufnahme der Behandlung mit dem FLA-Bild abgeglichen.
In Abb. 6.62 sind die analysierten OA-Werte über der applizierten Pulsenergie für alle
vier auswertbaren Behandlungen aufgetragen. Grün markiert sind die Läsionen mit angiographisch
sichtbarem Schaden, rot ohne angiographisch sichtbarem Schaden und blau die
nicht auswertbaren Läsionen.
. s]
OA-Wert [bar
10 -8
10 -9
10 -10
Pat 65
Pat 69
Pat 70
Pat 72
Schwellenwert
FLA positiv
FLA negativ
nicht analysierbar
Abbildung 6.62 :OA-Wert über der applizierten Pulsenergie (30 Pulse, 100 Hz) für vier verschiedene
Patienten. Dabei sind grün markiert die FLA-positiven und rot
die FLA-negativen Ergebnisse. Blau markierte Punkte waren nicht auswertbar.
Es ergibt sich ein Grenzwert von OAvivo = 1.96 10 -10 40 60 80 100 120 140
Pulsenergie [µJ]
⋅ [bar ⋅s]
für die angiographische Sichtbarkeit.

152_________________________________________ Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion
Es ergibt sich eine Schwelle der angiographischen Sichtbarkeit bei einem
OAvivo = 1.96 10 -10 [bar s]. Im Falle dieser vier Behandlungen waren von den 94
gesetzten Läsionen 2 falsch-negativ und ebenfalls zwei falsch-positiv von der optoakustischen
Dosimetrie gewertet worden. Dies entspricht einer 95 %igen Detektionsquote der
angiographischen Schwelle. Der optoakustische Grenzwert für die angiographische
Sichtbarkeit (OAvivo = 1.96 10-10 [bar s]) deckt sich beinahe mit dem Wert für
RPE-Zelltod in den in vitro Versuchen (OAvitro = 2.4 10-10 ⋅ ⋅
⋅ ⋅
⋅ [bar ⋅
s]). Dies ist erstaunlich,
da nicht davon ausgegangen werden kann, dass die Frequenzübertragungsfunktionen der
beiden verwendeten Wandler gleich ist. Die Frequenzübertragungsfunktionen konnten bei
der Kalibrierung der Wandler (Kap. 6.2) nicht gemessen werden, sondern nur deren mittlere
Empfindlichkeit.
Bei einer Behandlung ergibt sich eine große Variation der OA-Werte bei der selben Pulsenergie.
Dabei sind oft niedrigere OA-Werte bei der Behandlung ödematöser Areale entstanden.
6.7.6 Vergleich ICG-Angiographie Intensität und OA-Wert
In den in vitro Versuchen an Schweine RPE (Kap. 6.7.3) ergab sich in einer groben Näherung,
dass je größer der OA-Wert ist, desto mehr RPE-Zellen waren im bestrahlten Areal
geschädigt (Abb. 6.56). Da sich bei den Patientenbehandlungen eine große Variabilität
der OA-Werte bei gleicher Pulsenergie und dem selben Auge ergaben, wurde versucht,
ein Vergleich mit den Intensitätswerten der sichtbaren Läsionen einer Fluoreszeinangiographie
zu machen. Dabei zeigte sich, dass bei der FLA, aufgrund des kurzen Zeitraums
zwischen Injektion und Durchtritt durch das RPE von wenigen Sekunden, eine Unterscheidung
verschiedener Grauwerte nicht möglich ist, da entweder die Läsionen noch
nicht sichtbar sind, oder alle Läsionen gleichmäßig hell erscheinen und das Fluoreszein
sich diffus ausbreitet. Beim Nachweis der Läsionen mit ICG kommt es aufgrund der
molekularen Unterschiede des Farbstoffes erst in der Spätphase, ca. 20 Minuten nach
Injektion, zur sichtbaren Leckage an den Läsionen. Da hier ein Zeitbereich von einer halben
Stunde vorliegt, kann ein Bild mit differenzierbaren Grauwerten in den Läsionen
generiert werden. Die Läsionen eines ICG-Angiogramms wurden mit dem Bildverarbeitungsprogramm
ImageJ [106] ausgewertet. Dabei wurden die Grauwerte der Läsionen
über deren Bestrahlungsdurchmesser gemittelt (0 = schwarz, 256 = weiß), und der Grauwert
über dem OA-Wert in Abb. 6.63 aufgetragen. Bei schwacher Anfärbung der Läsionen
sind ebenfalls die OA-Werte niedrig. Je höher die OA-Werte sind, desto heller ist der
ICG-Spot.

Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion______________________________________________ 153
.
Abbildung 6.63 :ICG-Angiogramm und gemittelte ICG-Grauwerte über OA-Wert der jeweiligen
Arealnummern. Mit helleren ICG-Läsionen steigt der OA-Wert an.
Die ICG-Angiographie stellt keine gesicherte Methode dar, das Ausmaß der am RPE
gesetzten Leckage zu bestimmen. Spekulativ kann angenommen werden, dass je stärker
die Leckage ist, desto mehr RPE-Zellen wurden geschädigt. Über das mikroskopische
Ausmaß des Schadens bzw. Schadensstrukturen läßt sich keine Aussage treffen. Mit dieser
Annahme ergibt sich, wie in den in vitro Ergebnissen, bei den Patientendaten eine Korrelation
des Schadens mit der Höhe des OA-Wertes.
6.7.7 Transienten verschiedener OA-Werte
Um einen besseren Überblick über den Wertebereich der OA-Werte zu bekommen, wurden
in Abb. 6.64 beispielhaft Transienten zu verschiedenen OA-Werten zusammengefaßt
dargestellt. Alle Läsionen der dargestellten Transienten waren angiographisch sichtbar
und sind von jeweils verschiedenen Patienten. Beim optoakustischen Grenzwert von
OAvivo = 1.96 10 -10 [bar s] sind die Puls-zu-Puls Abweichungen schwer zu erkennen
(Abb. 6.64 A). Bis zum Bereich von OA = 4 10-10 [bar s] werden die Fluktuationen
stärker und auch im Plot gut sichtbar (Abb. 6.64 B). Die durch Mikroblasen induzierten
Abweichungen bleiben unterhalb der Amplituden der thermoelastischen Transiente. Ab
einem OA-Wert von 12 10-10 [bar s] führen die Druckamplituden der Mikroblasen
bereits zu einer Überhöhung des thermoelastischen Signals in einzelnen Transienten
(Abb. 6.64 C). Möglicherweise bilden sich hierbei schon die ersten Mikroblasen zu Blasenensembles
zusammen. Bei einem OA-Wert von 20 10 -10 ⋅ ⋅
⋅ ⋅
⋅ ⋅
⋅ [bar ⋅s]
sind bei mehreren
Transienten Überhöhungen durch die Abweichungen zu erkennen (Abb. 6.64 D). Es
kommt zu weitaus stärkerer Mikroblasenbildung wie in Abb. 6.64 A,B.
Eine genaue Korrelation der OA-Werte mit dem gesetzten Schadensausmaß im RPE und
an den Photorezeptoren kann nicht gegeben werden. Bei der Parameterstudie an Kaninchen,
bei der auch Histologien gemacht wurden, war eine optoakustische Dosimetrie mit
dem Kontaktglas nicht möglich, da das verwendete Glas deutlich größer als das Kaninchenauge
war, und somit keine gute akustische Ankopplung an das Auge möglich war.

154_________________________________________ Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion
-10
OA-Wert = 12*10 [bar*s]
C
-10
OA-Wert = 2*10 [ bar*s ]
A
400
500
200
0
Druck [µ bar]
0
Druck [µ bar]
- 500
-200
-1000
-400
0 10 20 30 40 50
Zeit [µs]
0 10 20 30 40 50
Zeit [µs]
-10
OA-Wert = 20*10 [ bar*s ]
D
1000
-10
OA-Wert = 8*10 [ bar*s ]
B
500
500
0
Druck [µ bar]
0
-500
Druck [µ bar]
-500
-1000
-1000
Abbildung 6.64:Typische optoakustische Transienten bei Patientenbehandlung. Alle Läsionen waren angiographisch positiv, hatten jedoch
unterschiedliche OA-Werte. Die Transienten stammen von unterschiedlichen Patienten.
A: 90 µJ, OA-Wert = 2 [ 10 -10 bar s], Puls-zu-Puls Schwankungen nicht direkt sichtbar
B: 130 µJ, OA-Wert = 8 [ 10 -10 bar s], Puls-zu-Puls Schwankungen sichtbar
C: 130 µJ, OA-Wert = 12 [ 10 -10 bar s], Puls-zu-Puls Schwankungen, die vereinzelt zu starken Abweichungen führen
D: 130 µJ, OA-Wert = 20 [ 10 -10 Zeit [µs]
Zeit [µs]
bar s], starke Puls-zu-Puls Abweichungen mehrerer Transienten
0 10 20 30 40 50
0 10 20 30 40 50

Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion______________________________________________ 155
6.7.8 Vergleichbarkeit der OA-Ergebnisse
Um die Streubreite der hier verwendeten Werte besser abschätzen zu können, wurden in
Abb. 6.65 die gemessenen Werte von 27 Behandlungen aller drei Krankheitsbilder
zusammengefaßt dargestellt. Die restlichen zehn Patientenmessungen waren mit Fehlern
behaftet. Die verschiedenen Fehlerquellen werden später gesondert diskutiert.
Bei 50 µJ Pulsenergie wurde bei keinem der Patienten eine angiographisch sichtbare
Läsion erzeugt. Dies deckt sich mit dem bestimmten Schwellenwert von
OAvivo = 1.96 10 -10 [bar s], da auch in Abb. 6.65 bei 50 µJ kein OA-Wert über 2 10 -10
liegt. Der Pulsenergiebereich mit OA-Wert < 2 10 -10 erstreckt sich bis 135 µJ. Patienten
mit hohen Schadensschwellen waren meist ältere DMP-Patienten mit Kataraktbildung
und stark ödematöser Netzhaut. In diesen Fällen wird ein undefinierbarer Teil des eingebrachten
Laserlichtes schon vor dem Auftreffen auf dem RPE durch Lichtstreuung abgeschwächt.
Der Bereich OA-Wert > 2 10 -10 ⋅ ⋅ ⋅
⋅
⋅ beginnt bei 70 µJ (runde Punkte, junger RCS
Patient, Pat 50, gute optische Transmission) steigert sich bis 150 µJ (Dreiecke, DMP-Patient,
Pat 79, stark ödematös). Gerade bei den Ergebnissen von Pat 79 kann man die Streubreite
der OA-Werte absehen, die sich bei fester Pulsenergie innerhalb eines Auges bildet.
OA-Wert [ 10 -10 bar s ]
100
10
1
Pat 50
Pat 79
40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160
Pulsenergie [µJ]
Abbildung 6.65 :OA-Werte über der applizierten Pulsenergie für 27 Patientenbehandlungen
(n = 2573). Es ergibt sich eine große Variabilität der notwendigen Pulsenergien
die nötig sind, den OA vivo -Grenzwert zu erreichen. Bei 50 µJ
war keine Läsion fluoreszenzangiographisch sichtbar.

156_________________________________________ Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion
Unterteilt man für alle Behandlungsläsionen die OA-Werte in die Bereiche:
- OA-Wert < 2 10-10 ⋅ , d.h keine Fluktuation der Transienten, kein angiographische
Schaden, Pulsenergie zu niedrig
- 2 10 -10

Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion______________________________________________ 157
Generell muß hervorgehoben werden, dass die optoakustische Detektion der Schadensschwelle
gerade bei den Testläsionen außerhalb der Gefäßbogens schwierig ist. Dies korreliert
mit den Ergebnissen der Simulation der Wandlerempfangscharakteristik (Kap.6.3).
Eine Bestrahlung außerhalb der Gefäßbogens entspricht einer geometrischen Versetzung
des Schallquellpunktes um 30 - 40° im Auge, wodurch eine starke Verzerrung der Transienten
entsteht. Bei den Testläsionen liegt in der Regel der OA-Wert > 2 10-10 ⋅
ca. 20 - 30 % oberhalb der angiographischen Schwelle. Bei den Behandlungen wurde aus
diesem Grund nach den ersten Behandlungsläsionen im zentralen Bereich die Pulsenergie
in den meisten Fällen wieder um 10 - 20 µJ reduziert, da hier hohe OA-Werte gemessen
werden konnten.
6.7.9 Fehlerquellen bei der OA On-line Dosimetrie
Aufgrund der Ringwandlergeometrie ist es technisch schwierig, eine elektromagnetisch
geschlossene Abschirmung des Wandlerkristalls zu erreichen. Somit können starke
el.-mag. Felder eingestreut, und mit dem Vorverstärker verstärkt werden. Diese Fehler
werden bei der Datenauswertung nur durch eine zusätzliche Bandpaßfilterung verringert.
Liegt die Störungsfrequenz zwischen 5 kHz und 1 MHz, so führt dies zu einem falschen
Ergebnis des OA-Wertes. Da in dem hier verwendeten Behandlungssystem der Laser und
der Behandlungsraum räumlich 20 Meter voneinander getrennt sind, war der Störeinfluß
durch die starken Felder des Lasers und dessen Treibern gering. Jedoch kam es trotzdem
bei vier Behandlungen zu offensichtlichen el.-mag. Störungen, die nicht lokalisiert werden
konnten.
Ein systembedingtes Problem war, dass die PC-Meßkarte, einmal gestartet, nicht wieder
zurückgesetzt werden konnte. Brach der behandelnde Arzt einen Pulszug vorzeitig ab,
wartete die PC-Meßkarte noch auf die fehlenden Signale. Diese wurden dann erst beim
folgenden Pulszug gegeben. Es kam so bei der Auswertung zu einer Überschneidung dieser
beiden unterschiedlichen Behandlungsspots miteinander. Dies führte bei der Auswertung
vereinzelt zu falschen Ergebnissen. Solche technischen Probleme sind in einer
industriellen technischen Realisierung vermeidbar.
6.8 Reflexbasierte On-line Dosimetrie im Tiermodell
Wie in Kap. 6.5.1 experimentell gezeigt, kann die Entstehung von Mikroblasen an den
Melanosomen durch die Reflexion von Licht an der Mikroblasenoberfläche nachgewiesen
werden. In der Arbeit von Rögener wurde ein Mikroskopaufbau für in vitro Versuche
an Schweine-RPE verwendet, der die hohe numerische Apertur von NA = 0.42 des
Objektivs ausnutzte [22]. Eine hohe NA bedeutet eine bessere Detektierbarkeit der
Mikroblasen, da ein großer Raumwinkel ausgenützt wird. Selbst damit konnte erst 10 %
oberhalb der RPE-Zellschadensschwelle Mikrokavitation bei 3 µs Einzelpulsen nachgewiesen
werden. Für die Anwendung am Augenhintergrund ist nur eine NA von 0.1 möglich.
Dies scheint auch schon bei den Versuchen aus Kap. 6.5.1 der limiterende Faktor für

158_________________________________________ Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion
eine gute Nachweisbarkeit der Schadensschwelle zu sein. Dort konnte immer nur 30 %
oberhalb der optoakustisch detektierten Mikroblasenschwelle ein blasenbedingtes Reflexionssignal
nachgewiesen werden.
6.8.1 Reflexmessungen bei Kaninchen-Bestrahlung
Im Rahmen der Tierversuchsstudie 2 wurden teilweise auch Reflexmessungen bei
Bestrahlung durchgeführt. Es wurde der in Kap. 5.6.1 und Kap. 5.6.2 beschriebene Aufbau
verwendet. Die zeitliche Auflösung des Aufbaus war durch den nachgeschalteten
Verstärker des Photomultipliers auf 250 ns begrenzt.
Um die retinale Temperaturerhöhung durch die eingekoppelte gepulste Laserdiode zur
Reflexmessung niedrig zu halten, wurde eine Detektionspulslänge von 20 µs verwendet
und maximal 20 mW eingestrahlt. Jedoch waren die mit dem PMT gemessenen Reflexionssignale
sehr gering, so dass immer die bei der Bestrahlung angeregte retinale Autofluoreszenz
das Reflexionssignal überlagerte. Es war nicht möglich im
fluoreszenzangiographisch schwellennahen Bereich Blasensignale zu detektieren. Erst
bei 2.5-fach überschwelliger, und sogar ophthalmoskopisch sichtbaren Schäden konnte
ein eindeutiges Blasenreflexionssignal gemessen werden (Abb. 6.67). Die so bestimmten
Blasenlebensdauern deckten sich mit den gleichzeitig gemessenen OA-Transienten. So
konnte mit diesen Messungen zumindest gezeigt werden, dass die z.B. auch bei Patientenbehandlungen
optoakustisch gemessenen doppelten bipolaren Transienten dem Aufschwingen
und Kollabieren einer Blase zugeordnet werden können, und die so bestimmte
Blasenlebensdauer real gegeben ist. In Abb. 6.67 ist auch der durch die retinale Autofluoreszenz
hervorgerufene Signalpeak am Anfang des Reflexionssignal zu erkennen. Dieser
tritt bei der Bestrahlung immer auf, was eine Signaldeutung schwierig macht. Erst bei langer
Blasenlebensdauer ist ein Unterschied klar zu erkennen.

Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion______________________________________________ 159
Reflexsignal [mV]
Druck [mbar]
1.3 250ns, 50µJ
1.2
1.1
1.0
4
2
0
-2
-4
0 2 4 6 8
0 2 4 6 8
Zeit [µs]
Abbildung 6.67 :Reflexionssignal und OA-Transiente einer ophthalmologisch sichtbaren
Läsion bei Kaninchenbestrahlung (50 µJ, 250 ns). Im Reflexionssignal
zeigt sich eine Blasenlebensdauer von 4.5 µs. Dies stimmt mit dem Zeitbereich
zwischen den beiden bipolaren OA-Transienten überein.
Es wurde auch bei drei Patientenbehandlungen das reflektierte Behandlungslaserlicht mit
dem Aufbau aus Kap. 5.6.1 gemessen. Dabei wurde genügend reflektiertes Laserlicht
empfangen welches die Pulsform des Lasers widerspiegelte. Jedoch konnte mit diesem
Aufbau keine Blasenbildung und somit auch keine Behandlungsschwelle nachgewiesen
werden.
Eine reflexbasierte On-line Dosimetrie scheint für einen schwellennahen Schadensnachweis
ungeeignet. Ein Problem ist wahrscheinlich die Limitierung auf eine numerische
Apertur von NA = 0.1 bei einer ophthalmoskopischen Anwendung am Patienten. Gerade
im schwellennahen Bereich muß bei größeren Behandlungsdurchmessern zwischen der
diffusen Reflexion der gesamten Bestrahlungsfläche und den transienten Änderungen
durch die Mikroblasen unterschieden werden.

160_________________________________________ Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion

Kapitel 7: Folgerungen und Ausblick ______________________________________________161
7 Folgerungen und Ausblick
7.1 RPE-Schadensmechanismus
Schweine-RPE Proben wurden in vitro mit Einzelpulsen von 5 µs, 50 µs, 500 µs und
3 ms Laserpulsdauer bestrahlt. Ein Nachweis von Mikroblasen erfolgte unter der
Annahme, dass bei Entstehung von Mikroblasen einerseits die optoakustischen Signale
und andererseits auch eine transiente Erhöhung des reflektierten Lichtes gemessen werden
können (Abb. 5.25). Die RPE-Zellvitalität wurde nach Bestrahlung mit dem Vitalitätsmarker
CalceinAM bestimmt (Kap. 5.3.2). Werden RPE-Zellen geschädigt und keine
Mikroblasenbildung gemessen, so ist bei den verwendeten Pulsdauern von einer rein thermischen
Schädigung auszugehen (Kap. 6.5.1).
Bei 500 µs und 3 ms Pulslänge kommt es primär im schwellennahen Bereich zu keiner
nachgewiesenen Mikroblasenbildung (Abb. 6.19). Bei 500 µs Pulslänge kommt es erst
bei 1.7-facher Schadensschwelle, bei 3 ms erst bei 2.8-facher Schadensschwelle zur
Mikroblasenbildung (Abb. 6.22). Dies konnte sowohl mit optoakustischen, als auch mit
Reflexionsmessungen nachgewiesen werden. Bei diesen Pulslängen ist von einem rein
thermischen Schaden auszugehen.
Ein Wechsel von einem rein thermischen Schaden zu einem Schaden, bei dem auch
Mikroblasen entstehen, ergibt sich bei einer Pulslänge von 50 µs (Kap. 6.5.1). Dabei
kommt es bei 18 % der geschädigten RPE-Zellen zu Mikroblasenbildung (Abb. 6.19).
Bei 5 µs Pulsdauer konnte immer Mikroblasenbildung nachgewiesen werden, wenn
RPE-Zellen geschädigt sind (Abb. 6.19). Die Schwelle für Mikroblasenbildung liegt
unter der RPE-Schadensschwelle.
Mit den Arrhenius-Parametern [13] einer sichtbaren thermischen Schädigung der Retina
wurden Temperatur- und thermische Denaturierungsberechnungen nach Arrhenius innerhalb
eines Melanosomenfeldes durchgeführt. Diese zeigten, dass für 3 ms und 500 µs eine
thermische Denaturierung innerhalb und außerhalb des Melanosomenfeldes mit den
gemessen Schadensschwellenparametern möglich ist (Abb. 6.24). Bei 50 µs ist an der
Melanosomenoberfläche eine Denaturierung nur mit 1.5-facher Schwellenenergie wahrscheinlich.
Schon zwischen zwei Melanosomen wäre eine thermische Denaturierung nur
bei doppelter Schadensschwellenenergie gegeben. Bei 5 µs wäre selbst für die Melanosomenoberfläche
die doppelte, zwischen den Melanosomen die dreifache Schwellenenergie
für eine thermische Denaturierung erforderlich.
Bei der Bestrahlung mit multiplen Laserpulsen bei gegebenen Behandlungsparametern
(1.7 µs, 30 Pulse 100 Hz, 160 µm Spot) kann Mikroblasenbildung mit Hilfe optoakustischer
Techniken gemessen werden. Die bei Bestrahlung von Schweine-RPE in vitro Versuch
gemessenen minimalen Puls-zu-Puls Abweichungen von der thermoelastischen
Transiente (Abb. 6.55) bei nachgewiesenem RPE-Schaden haben die gleiche Amplitude

162___________________________________________Kapitel 7: Folgerungen und Ausblick
von 200 µbar wie bei der Bestrahlung mit 5 µs Einzelpulsen gemessenen optoakustische
Transienten (Abb. 6.15) bei Mikroblasenbildung. Es konnte in vitro gezeigt werden
(Kap. 6.7.3), dass die Schwelle für Puls-zu-Puls Abweichungen mit der im CalceinAM-Vitalitätsassay
nachgewiesenen Schadensschwelle übereinstimmt (Abb. 6.56).
Bei Patientenbehandlungen in vivo konnte mit Hilfe des OA-Kontaktglases die durch die
Mikroblasenbildung erzeugten Puls - zu - Puls Abweichungen gemessen werden
(Abb. 6.61). In einer direkten Korrelation nahe der angiographischen Schadensschwelle
stimmt die mit dem OA-Kontaktglas ermittelte Schadensschwelle zu 95 % mit dem
angiographisch gezeigten Leckagenachweis überein (Abb. 6.62).
Aus den histologischen Ergebnissen der tierexperimentellen Studien konnte, wie auch
schon in den Arbeiten von Roider [2], kein Hinweis auf einen primären Schadensmechanismus
sowohl bei Einfach-, wie auch bei Mehrfachpulsen gefunden werden. Es ergab
sich sowohl bei 8 ns wie auch bei 200 ns und 1.7 µs eine Verringerung der angiographischen
Schwelle bei Erhöhung der Pulszahl.
Da bei Einzelpulsbestrahlung mit 5µs Laserpulsen bei RPE-Schädigung immer Mikroblasen
gemessen wurden, ist ein primärer RPE-Schaden durch Mikroblasen für diese
Pulslänge naheliegend. Andere Schädigungsmechanismen wie z.B. durch die entstehenden
Drucktransienten sind aufgrund der geringen Drücke im mbar-Bereich und Druckgradienten
von 4 10-7 ⋅
bar/ns eher unwahrscheinlich (Kap. 6.5.1), können aber nicht
ausgeschlossen werden. Auch eine weiterhin rein thermische Schädigung ist denkbar,
erscheint aber aufgrund der Denaturierungsberechnungen und der experimentellen Ergebnisse
ebenfalls unwahrscheinlich. Ein Zusammenwirken mehrerer Schadensmechanismen
kann aber auch nicht ausgeschlossen werden.
Eine primär rein thermische RPE-Schädigung bei 3ms, bei der keine Mikroblasenbildung
im schwellenahen Bereich gemessen werden konnte, ist in guter Übereinstimmung
mit den Ergebnissen anderen Arbeiten [13, 51, 90, 92]. Bei 500 µs ergibt sich somit ebenfalls
eine primär rein thermische RPE-Schädigung. Bei 50 µs kommt es in 84 % der
schwellennah geschädigten RPE-Zellen zu einer rein thermischen Schädigung. Bei 16 %
der schwellennahen RPE-Schädigung werden aber auch Mikroblasen gebildet. Welcher
Schadensmechanismus in diesem Fall primär ist, kann nicht eindeutig gesagt werden.
Da sowohl bei der in vitro Bestrahlung von Schweine-RPE als auch bei Patientenbehandlungen
in vivo mit multiplen 1.7 µs Pulsen optoakustisch gemessene Puls-zu-Puls
Abweichungen bei erzeugtem RPE-Schaden auftraten, ist auch dabei ein primärer
RPE-Schaden durch Mikroblasen naheliegend. Wie bei den Einzelpulsversuchen kann
es auch hier zur Überlagerung mehrerer Schadensmechanismen kommen, da weitere
Effekte mit diesen Experimenten nicht ausgeschlossen werden können.
Die in den Tierversuchen für alle applizierten Pulslängen gemessene Verringerung der
angiographischen Schadensschwelle bei Erhöhung der Pulszahl, läßt sich mit einem thermischen
Schadensmechanismus assoziieren, da sich bei einem thermischen Schaden eine
Additivität direkt ergibt. Jedoch konnte die Pulszahlabhängigkeit der Schadensschwellen

Kapitel 7: Folgerungen und Ausblick ______________________________________________163
auch für retinale Schäden mit ps-Laserpulsen [107] und fs-Laserpulsen [105] mit vorherrschendem
thermomechanischen Schaden gefunden werden. Welcher statistische Prozeß
bei einem thermomechanischen Schaden zur Erniedrigung der Schadensschwelle führt,
ist unklar.
Vor diesem Hintergrund, dass bei SRT immer Mikroblasen entstehen, wenn ein
RPE-Schaden erreicht wird, ist die Verwendung von µs-Laserpulsen, bei denen 60 % der
von den Melanosomen absorbierten Energie während des Laserpulses durch Wärmediffusion
an das umliegende Gewebe abgegeben wird [11], nicht die ausgezeichnete Pulslänge
zur Erzeugung von Mikroblasen bei gleichzeitig möglichst geringer thermischer
Belastung der anliegenden Photorezeptoren. Es sollten möglichst kurze Pulslängen in
Betracht gezogen werden, die aber keine weiteren mechanischen Sekundäreffekte wie
Schockwellen oder große Kavitationsblasen mit sich bringen. Es ist eine Balance zwischen
minimaler thermischer und minimaler mechanischer Belastung für die Photorezeptoren
bei Schädigung der RPE-Zellen zu finden.
7.2 Behandlungsparameter
In den Tierversuchstudien konnte gezeigt werden, dass auch bei der Verwendung von
zehn repetitiven 8 ns Laserpulsen ein ophthalmoskopisch nicht sichtbarer RPE-Schaden
möglich ist. Die therapeutische Breite (ED 85 ang /ED15 oph ) von 1.6 ist so groß wie bei der
klinisch verwendeten Pulslänge von 1.7 µs, bei 100 Pulsen. Bei Bestrahlung mit repetierenden
5 µs Laserpulsen (100 Pulse, 500 Hz) ergibt sich eine therapeutische Breite von
1.2 . Es muß jedoch beachtet werden, daß bei ähnlichen Versuchen mit repetitierenden
5 µs Laserpulsen (100 Pulse, 500 Hz) von Roider und Birngruber eine therapeutische
Breite größer 3.2 ebenfalls an Kaninchen bestimmt wurde [2]. Die Diskrepanz der
Schwellenwerte kann in Ansätzen durch Speklebildung an dem fasergeführten Aufbau
erklärt werden (Kap. 6.5.3). Bei der Bestrahlung mit 200 ms cw-Einzelpulsen ist keine
therapeutische Breite gegeben. Bei allen Parametern kommt es durch die starke Streuung
der Meßwerte zu einer effektiven Verringerung der therapeutischen Breite.
In Abhängigkeit von der Pulszahl ergab sich für die angiographische Schwelle das empirische
n -1/4 Gesetz für alle verwendeten Pulslängen. Die ophthalmologische Schwelle
fällt deutlich schwächer mit n -1/12 ab. Dadurch kommt es immer zu einer größeren therapeutischen
Breite bei Erhöhung der Pulszahl. Für eine Erhöhung der therapeutischen
Breite sind somit möglichst viele Laserpulse zu applizieren. Bei der Patientenbehandlung
ist die Anzahl der applizierbaren Laserpulse bei gegebener Pulswiederholrate auf die
durch die Augenbewegungen limitierte maximale Bestrahlungszeit von 300 ms begrenzt.
Eine Erhöhung der Pulszahl pro Läsion, kann bei vorgegebener Bestrahlungszeit nur
durch eine Steigerung der Pulswiederholrate erreicht werden. Diese ist wiederum durch
die Grundtemperaturerhöhung repetitiv applizierter Laserpulse bei großen Bestrahlungsdurchmessern
beschränkt. Durch Verringerung des Bestrahlungsdurchmessers kann eine

164___________________________________________Kapitel 7: Folgerungen und Ausblick
höhere Pulswiederholrate, und damit eine höhere Pulszahl innerhalb der 300 ms appliziert
werden (Abb. 6.14). Ob kleinere Bestrahlungsdurchmesser auch bei Behandlungen praktikabel
sind, muß letztlich die klinische Praxis zeigen.
Bei der Verwendung von 200 ns Laserpulsen (100 Hz, 100 Pulse) kam es bei Kaninchen
durch eine niedrige angiographische Schwelle im Vergleich zu den anderen Pulslängen zu
einer effektiven Verbreiterung der therapeutischen Breite auf 2.8 . Das ist eine Erhöhung
der therapeutischen Breite um 75 % im Vergleich zu den Ergebnissen bei 1.7 µs. Die
untersuchten Histologien zeigten bei diesen beiden Pulslängen ein ähnliches Bild.
Für eine Behandlung am Menschen sollte immer der Parameter mit der größten therapeutischen
Breite verwendet werden, um inter- und intraindividuelle Schwankungen der
Schadensschwelle bei Menschen sicher ausgleichen zu können. Mit der Annahme der
Übertragbarkeit dieser experimentellen Ergebnisse auf den Menschen ist bei der Wahl der
Pulslänge zukünftig 200 ns aufgrund der größten therapeutischen Breite zu bevorzugen.
Zusammenfassend sollte eine signifikante Verbreiterung der therapeutischen Breite die
Verwendung von 100 applizierten Pulsen mit einer Pulslänge von 200 ns erbringen. Unter
der Berücksichtigung, dass die angiographische Schadensschwelle bei 200 ns Laserpulsdauer
im Kaninchen ca. nur 30 % der notwendigen Bestrahlung von 1.7 µs Laserpulsen
ist, kann eine höhere Pulswiederholrate appliziert oder ein größerer Bestrahlungsspot verwendet
werden, um eine ähnliche Grundtemperaturerhöhung auszuschöpfen. Neben den
klinischen Vorteilen dieser Parameter ergeben sich auch weitere Vorteile für eine industrielle
Umsetzung. Das Lasersystem vereinfacht sich wenn statt 1.7 µs nur 200 ns Pulslänge
bei hoher Pulswiederholrate gefordert sind. Bei einer Reduzierung des Bestrahlungsdurchmessers
muß auch weniger Pulsenergie laserseitig erzeugt werden. Es sollte sich ein
endgepumptes, miniaturisiertes Nd:YAG-Lasersystem realisieren lassen.
7.3 On-line Dosimetrie
Das Konzept auf retinaler Autofluoreszenz basierenden On-line Dosimetrie, welche mit
dem Behandlungslaserpuls selbst angeregt und mit einem thermischen RPE-Schaden
assoziiert wird, zeigte bei Behandlung keine Korrelation zum gesetzten Schaden
(Kap. 6.6.4). Erst nach der Behandlung konnte ein Schadensnachweis mit einem Autofluoreszenzbild,
das mit einem Retina-Angiographen aufgenommen wurde, erbracht werden
(Kap. 6.6.6).
Mit dem auf den Nachweis von Mikroblasen basierende optoakustische On-line Dosimetriesystem
konnte ein Schadensgrenzwert bestimmt werden. Im direkten Vergleich
der klinischen fluoreszenzangiographischen Befunde bei verschiedenen Pulsenergien
wurden 95 % der Läsionen richtig zugeordnet (Kap. 6.7.5). Der optoakustische Schadensgrenzwert
war unabhängig von der Höhe der Schwellenbestrahlung, wodurch auch interund
intraindividuelle Schwankungen der angiographischen Schwellen detektiert werden
konnten (Abb. 6.62). Insgesamt wurden 27 Patientenbehandlungen, die mit dem optoakustischen
Detektionssystem kontrolliert wurden, erfolgreich durchgeführt.

Kapitel 7: Folgerungen und Ausblick ______________________________________________165
An Schweine-RPE Proben wurde in vitro gezeigt, dass die Anzahl der geschädigten
RPE-Zellen tendenziell mit dem OA-Wert ansteigt (Kap. 6.7.3). Anhand einer Patientenbehandlung
konnte an 10 Läsionen gezeigt werden, dass bei höheren OA-Werten ebenfalls
die Grauwertintensität des ICG-Angiogramms erhöht ist (Kap. 6.7.6). Über das
mikroskopische Ausmaß des Schadens, bzw. der Schadensstrukturen, läßt sich im Rahmen
dieser Messungen keine Aussage treffen. Da die OA-Werte bei einer Pulsenergie und
innerhalb eines Behandlungsareals eines Patienten stark schwanken (Abb. 6.65), könnte
dies ein Hinweis auf eine unterschiedlich starke Schädigung der einzelnen Areale sein.
Der entwickelte Algorithmus zur OA-Datenanalyse liefert ein stabiles Kriterium, um zwischen
angiographisch nachgewiesenen RPE-Schaden und keiner Schädigung unterscheiden
zu können. Da er auf dem Vergleich mehrerer Transienten des gleichen
Bestrahlungszuges untereinander beruht, ist er nur für eine Auswertung bei Bestrahlung
mit multiplen Pulsen verwendbar. Für die Analyse einzelner optoakustischer Transienten
muß ein neuer Algorithmus entwickelt werden. Als dafür möglicher Lösungsansatz sollte
die gemessene optoakustische Transiente von ihrer akustischen Impulsübertragungsfunktion
des OA-Kontaktglases wie auch geometrischen Übertragungsfunktion der Behandlungslokalisation
im Auge entfaltet werden. Somit kann sie dann mit einer
Referenztransiente verglichen, und die blaseninduzierten Abweichungen analysiert werden.
Die Analyse und Auswertung der Daten muß in Echtzeit geschehen. Für diese komplexe
und auch rechenintensive Entfaltung kommen nur Hardwarelösungen mit DSP
(digitalem Signalprozessor) oder FPGA (Free Programmable Gate Array) in Frage, da ein
PC mit seinen Zugriffszeiten auf Hardware im ms-Bereich zu langsam ist. Um eine noch
zuverlässigere On-line Kontrolle zu erreichen und zur eventuellen Bestimmung weiterer
schadensspezifischer Signalparameter der optoakustischen Transienten, ist auch der Einsatz
neuronaler Netzwerke geeignet [115]. Voraussetzung für eine On-line Dosimetrie ist
auch hier eine hinreichend hohe Geschwindigkeit der Datenauswertung.
Eine weitere Verbesserung der optoakustischen On-line Dosimetrie könnte eine Weiterentwicklung
des OA-Kontaktglases bringen. Wie in der Simulation zur Wandlerempfangscharakteristik
gezeigt, kommt es aufgrund der Ringwandlergeometrie zur
Signalverzerrung (Kap. 6.3). Aus diesem Grund ist die Mittenfrequenz der detektierten
Transiente zu 0.5 MHz hin verschoben (Abb. 6.7), was nicht der Resonanzfrequenz des
im Kontaktglas implementierten Wandlers von 1 MHz entspricht. Ein Wandler mit
0.5 MHz Mittenfrequenz sollte deutlich empfindlicher sein. Durch die starke Signalverzerrung
bei einem dezentralen Aufpunkt im Auge ist es schwierig, die angiographische
Schwelle bei den Testläsionen am äußeren Gefäßbogen mit der OA-Detektion zu erfassen.
Eine Unterteilung der Wandlerfläche in mehrere Einzelwandler würde die entstehenden
Signalverzerrungen verkleinern.
Werden statt der derzeit verwendeten 1.7 µs Laserpulse kürzere Laserpulse zur SRT verwendet,
so wird die thermoelastische Druckamplitude der optoakustischen Transiente
aufgrund der kürzeren Pulsdauer stark zunehmen [78]. Damit wird auch das Amplitudenverhältnis
der thermoelastischen Transiente zu den Puls - zu - Puls Abweichungen

166___________________________________________Kapitel 7: Folgerungen und Ausblick
schlechter und ein Nachweis schwieriger. Genauere Untersuchungen sind nötig, um das
dabei entstehende Signal-Rausch Verhältnis (SNR) abzuschätzen und die OA-Analyse
erneut zu überprüfen.

Kapitel 8: Zusammenfassung ________________________________________________ 167
8 Zusammenfassung
In der vorliegenden Arbeit wurden sowohl in vitro als auch in vivo Untersuchungen zu
Mechanismen der selektiven RPE-Zellschädigung bei Bestrahlung mit Einzelpulsen und
Pulszügen durchgeführt, und zwei Ansätze einer nichtinvasiven On-line Dosimetrie bei
SRT untersucht und validiert.
In in vitro Experimenten an Schweine-RPE wurden sowohl die RPE-Schadens- als auch
die Mikroblasenbildungsschwelle bei Einzelpulsbestrahlung im Milli- bis Mikrosekunden
Zeitbereich untersucht. Bei 5 µs Laserpulsdauer konnte bei RPE-Zellschädigung
immer intrazelluläre Mikroblasenbildung an den stark absorbierenden Melanosomen
nachgewiesen werden. Dabei wurden sowohl die bei Blasenbildung entstehenden Drucktransienten
als auch die durch Lichtreflexion an der Mikroblasenoberfläche entstehenden
Signale gemessen. Bei 500 µs und 3 ms Pulslänge fand primär eine RPE-Schädigung
ohne Mikroblasenbildung statt, die auf einen rein thermischen Schaden schließen läßt.
Erst bei Bestrahlung mit zwei- bis dreifacher Schadensschwellenenergie konnte bei diesen
Pulslängen Mikroblasenbildung gemessen werden. Bei 50 µs Laserpulslänge zeigte
sich ein Übergangsbereich. So konnte bei dieser Pulslänge Mikroblasenbildung bei 16 %
geschädigten RPE-Zellen gemessen werden. Bei 84 % wurde keine Blasenbildung nachgewiesen.
Diese experimentellen Ergebnisse wurden durch ein mathematisches Modell nach Arrhenius
zur thermischen Denaturierung innerhalb eines Melanosomenfeldes mit den gemessenen
Schwellenparametern verglichen. Bei den beiden langen Pulsdauern 3 ms und
500 µs ist eine thermische Denaturierung des RPEs wahrscheinlich. Bei 50 µs Pulslänge
ist für die berechnete thermische Denaturierung direkt auf der Melanosomenoberfläche,
also der wärmsten Stelle, schon die 1.7-fache, zwischen den Melanosomen die doppelte
Bestrahlung nötig. Bei der kürzesten Pulslänge 5 µs ist eine berechnete thermische Denaturierung
auf der Melanosomenoberfläche erst mit doppelter, zwischen den Melanosomen
mit dreifacher Bestrahlung möglich. Dies deutet auf andere Schädigungsmechanismen
als eine rein thermische Schädigung hin.
Da bei Einzelpulsbestrahlung mit 5 µs Laserpulsen bei RPE-Schädigung immer Mikroblasen
gemessen wurden, ist ein primärer RPE-Schaden durch Mikroblasen für diese
Pulslänge naheliegend. Eine primär thermische RPE-Schädigung kann bei 500 µs und
3 ms angenommen werden, da hier im schwellennahen Bereich keine Mikroblasenbildung
vorliegt.
Für die bei selektiver RPE Therapie verwendeten Behandlungsparameter mit repetierenden
1.7 µs Laserpulsen konnten immer, sowohl in vitro an Schweine-RPE als auch bei
Patientenbehandlung, Puls-zu-Puls Abweichungen von den thermoelastischen Transienten
bei erzeugtem RPE-Schaden optoakustisch gemessen werden. Die in vitro gemesse-

168 _______________________________________________ Kapitel 8: Zusammenfassung
nen Abweichungen hatten die gleichen Amplituden wie die bei 5 µs Einzelpuls
gemessenen Druckamplituden der Mikroblasen. Auch hier ist ein primärer RPE-Schaden
durch Mikroblasen naheliegend.
Die Grundtemperaturerhöhung des Fundus durch repetitive Laserpulse, wie sie bei der
selektiven RPE Therapie verwendet werden, wurden nichtinvasiv mittels optoakustischer
Techniken bestimmt. Aufgrund der Temperaturabhängigkeit des thermischen Ausdehnungskoeffizienten
kann aus den mit den Bestrahlungspulsen selbst generierten thermoelastischen
Transienten die im RPE induzierte Grundtemperaturerhöhung durch den
Pulszug bestimmt werden. An Schweine-RPE Proben wurde gezeigt, dass die thermoelastische
Druckamplitude linear mit der RPE-Probentemperatur ansteigt. Es konnte sowohl
in vitro an Schweine-RPE als auch bei Patientenbehandlung eine Grundtemperaturerhöhung
um 60 ± 9 °C bei Bestrahlung mit 500 Hz Pulswiederholrate und 100 applizierten
Pulsen nichtinvasiv bestimmt werden. Temperaturberechnungen waren in guter Übereinstimmung
mit den gemessenen Temperaturwerten für angenommene 50 % Absorption im
RPE. Demgegenüber ergab sich bei der erniedrigten Pulswiederholrate von 100 Hz mit
30 applizierten Laserpulsen eine Grundtemperaturerhöhung von nur 6 ±
2 °C.
Da die am RPE gesetzten selektiven Schäden für den Ophthalmologen unsichtbar sind,
und nur durch eine invasive Fluoreszein- oder ICG-Angiographie postoperativ nachgewiesen
werden können, ist eine On-line Dosimetrie für eine industrielle Umsetzung und
eine breitere Akzeptanz dieser neuen Therapie wünschenswert. Es wurden zwei unterschiedliche
Ansätze zur On-line Dosimetrie verfolgt. Einerseits die Änderung der durch
die Laserpulse selbst angeregten retinalen Autofluoreszenz bei Behandlung, und andererseits
der optoakustische Nachweis entstehender Mikroblasen.
Bei Behandlung mit 500 Hz Pulswiederholrate konnte eine Verringerung der mit dem
Behandlungslaser selbst angeregten Autofluoreszenzintensität um 10 % über der Anzahl
der applizierten Laserpulse gemessen werden, die sich bei 100 Hz Pulswiederholrate verringerte.
Es konnte keine Korrelation zwischen der gemessen Fluoreszenzabnahme und
der angiographisch bestimmten Schadensschwelle gefunden werden. Auch bei spektral
aufgelösten Messungen ergab sich keine wellenlängenspezifische Korrelation. An A2E,
einem synthetisch herstellbaren Hauptbestandteil des retinalen Fluorophors Lipofuszin,
konnte gezeigt werden, dass die Fluoreszenzintensität sich reversibel und linear mit steigender
Temperatur verringert. Daher liegt es nahe, dass der bei Patientenbehandlung
gemessene Autofluoreszenzabfall bei 500 Hz Pulswiederholrate ein Effekt der starken,
auch optoakustisch nachgewiesenen Grundtemperaturerhöhung ist.
Mit Hilfe eines selbst entwickelten Kontaktglases mit integriertem Schallsensor konnten
bei Patientenbehandlungen die durch die Behandlungspulse entstehenden Drucktransienten
gemessen werden. Unterhalb der angiographischen Schadensschwelle wurden rein
thermoelastische Transienten gemessen, die keine Puls-zu-Puls Abweichungen innerhalb
eines Pulszuges zeigten. War ein angiographisch sichtbarer Schaden nachweisbar, so
zeigten sich statistisch verteilte Puls-zu-Puls Abweichungen von den bipolaren thermoelastischen
Transienten. Schallfeldsimulationen zur Empfangscharakteristik des Kon-

Kapitel 8: Zusammenfassung ________________________________________________ 169
taktglases zeigten eine hohe Variabilität der akustischen Transienten in Abhängigkeit von
der jeweiligen Behandlungslokalisation im Auge. Zur Auswertung der akustischen Transienten
wurde deshalb ein Algorithmus entwickelt, der es unter den gegebenen Randbedingungen
erlaubt, die Meßdaten On-line zu analysieren und ein Schwellenkriterium
direkt nach Applikation des Pulszuges zu liefern. Im direkten Vergleich der klinischen
fluoreszenzangiographischen Befunde von vier Patienten wurden 95 % der Läsionen richtig
zugeordnet. Im Rahmen dieser Arbeit wurden insgesamt 27 Patientenbehandlungen
mit diesem kompakten, rechnergestützten On-line Dosimetriesystem erfolgreich kontrolliert
und ein RPE-Zellschaden sicher detektiert.
In einer Parameterstudie an Kaninchen wurde die Abhängigkeit verschiedener Bestrahlungsparameter
auf die angiographisch und ophthalmoskopisch sichtbare Schadensschwelle
untersucht, und die therapeutische Breite (ED 15 opht /ED85 ang ), innerhalb der
eine “selektive” RPE-Schädigung möglich ist, bestimmt. Bei der Pulszahlabhängigkeit
ergab sich für die untersuchten Pulslängen 8 ns, 200 ns und 1.7 µs, dass die angiographische
Schwelle für n applizierte Pulse mit n -1/4 abnimmt. Die ophthalmologische Schadensschwelle
fällt deutlich schwächer mit n -1/12 für alle Pulslängen ab. Dadurch kommt
es immer zu einer größeren therapeutischen Breite bei Erhöhung der Pulszahl. Die höchste
gemessene therapeutische Breite von 2.8 ergab sich bei einer Pulsdauer von 200 ns mit
100 applizierten Pulsen und 100 Hz Pulswiederholrate. Bei 1.7 µs Pulslänge, aber sonst
gleichen Parametern, halbierte sich die therapeutische Breite beinahe auf 1.6 , die auch
bei 8 ns und 10 Pulsen gemessen wurde. In den Histologien eine Stunde nach Bestrahlung
zeigten sich zwischen der derzeit klinisch eingesetzten Laserpulslänge von 1.7 µs und den
ebenfalls untersuchten 200 ns bei 10 Pulsen keine Unterschiede bei der 0.8-fachen ED 50
für ophthalmologische Sichtbarkeit. Aufgrund der größeren therapeutischen Breite, aber
histologisch ähnlichem Befund zu 1.7 µs, könnten 200 ns Pulse eventuell sogar besser für
die SRT geeignet sein, wenn eine Übertragbarkeit der tierexperimentellen Ergebnisse auf
den Menschen angenommen wird.
Ein auf optoakustischen Methoden basierendes On-line Dosimetriesystem für die selektive
RPE Therapie wurde entwickelt und verifiziert. Es kann direkt für eine medizinische
Anwendung umgesetzt werden. Möglichkeiten der Optimierung der bereits klinisch eingesetzten
Behandlungsparameter wurden herausgearbeitet und sollten auf Grund der vorliegenden
Ergebnisse erprobt werden.

170 _______________________________________________ Kapitel 8: Zusammenfassung

Kapitel 9: Literatur______________________________________________________________ 171
9 Literatur
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Dissertation, Universität Frankfurt, (1978)
[14] W. S. Weinberg, R. Birngruber, B. Lorenz:
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Photocoagulation;
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Kapitel 9: Literatur______________________________________________________________ 173
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[89] K. V. Larin, I. V. Larina, M. Motamedi, R. O. Esenaliev:
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[97] Mathematica:
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Kapitel 9: Literatur______________________________________________________________ 183
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[112] C. Gerthsen, H. O. Kneser, H. Vogel:
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[113] V. E. Gusev, A. A. Karabutov:
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Kapitel 9: Literatur______________________________________________________________ 185
[115] L. Fausett:
Fundamentals of Neural Networks: Architecture, Algorithms and
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Prentice-Hall, Englewood Clis (1994)

186________________________________________________________ Kapitel 6: Literatur

Anhang A: Thermoelastische Druckentstehung ________________________________________187
Anhang A: “Thermoelastische Druckentstehung”
Bei der Erzeugung von lichtinduzierten Schall in einem Medium lassen sich fünf verschiedene
physikalische Mechanismen unterscheiden: Lichtdruck, Elektrostriktion,
dielektrischer Durchbruch, Verdampfung und thermoelastische Expansion [41, 65].
Unterhalb der Ablationsschwelle ist für absorbierende Medien und vor allem für Gewebe
die thermoelastische Expansion von Bedeutung [109].
In diesem Kapitel sollen die grundlegenden Zusammenhänge diskutiert werden, deren
Verständnis für die theoretische Beschreibung optoakustischer Transienten notwendig ist.
Die zu diesem Zweck zu betrachtende Mechanismen basieren auf Überlegungen hinsichtlich
der Akustik, der Hydrodynamik, der Elastizitäts- und der Thermodynamik.
Festkörper, Flüßigkeiten und Gase werden zunächst stets als Kontinua angesehen. Die
Ausdehnung eines Teilchens in diesem Sinne ist klein gegen die das betrachtendem
Gesamtvolumens. Sie ist jedoch groß gegen die Ausdehnung einzelner in dem Volumen
enthaltener Atome und Moleküle, so dass einem Teilchen die auf einer statistischen
Gesamtheit basierenden Begriffe der Temperatur sowie der Entropie zugeordnet werden
können. Des weiteren sind Teilchen daher innerhalb ihres Volumens als homogen anzusehen.
Hinsichtlich der Anwendung optoakustischer Methoden am Auge, ist biologisches Zellgewebe
in dieser Arbeit von besonderem Interesse. Es besteht im Durchschnitt zu 70 -
80 % aus Wasser [96]. Es wird durch Zellwände oder Kollagenfasern stabilisiert. Im konkreten
Anwendungsfall, der thermoelastischen Schallentstehung im RPE durch µs-Laserpulse,
wird, wie die Ergebnisse der Temperaturberechnungen aus Kap. 6.5.2 zeigen,
neben den absorbierenden Melaningranula durch Wärmediffusion Größtenteils die
gesamte RPE-Zelle erwärmt. Aufgrund des hohen Wassergehalts gelten für die thermoelastische
Druckentstehung die Gesetze der Hydromechanik.
Der für die thermoelastische Entstehung von Schallwellen wichtige Eigenschaft ist, dass
die akustische Absorption von Scherwellen um 5 Größenordungen höher ist wie die
Absorption von Logitudinalwellen [63]. Auch die Ausbreitungsgeschwindigkeit ist mit
10 m/s deutlich kleiner als bei Longitudinalwellen mit ca. 1500 m/s.
Zur mathematischen Beschreibung des Bewegungszustandes einer Flüßigkeit bedarf es
der zeitlichen Entwicklung der räumlichen Geschwindigkeitsverteilung v( x, y, z t,
) sowie
zweier beliebiger thermodynamischer Größen. Dies können beispielsweise der Druck
p( x, y, z t,
) und die Dichte ρ( x, y, z t,
)
sein. Diese sind in den grundlegenden Beziehungen
von Kontinuitätsgleichung, der Bewegungsgleichung und der Wärmetransportgleichung
miteinander verbunden. Basierend auf diesen Identitäten kann eine Beschreibung des
Druckverhaltens und des Druckmaximums in Abhängigkeit der gegebenen Situation
gefunden werden.

188_______________________________Anhang A: Thermoelastische Druckentstehung
Die Kontinuitätsgleichung:
Der Erhaltungssatz der Masse besagt, dass der Teilchenstrom in, oder aus einem
Volumen V0 zu einer Änderung der Dichte ρ in diesem Volumen führt [112]. Betrachtet
man die aus der Oberfläche O herausfließende Teilchen mit Richtungskomponenten
der Geschwindigkeit v( x, y, z t,
) parallel zum Flächenvektor df , so erhält man:
(43)
Nach Anwendung des Gaußschen Satzes für Flächenintegrale auf der linken Seite können
beide Seiten zu einem Volumenintegral zusammengefaßt werden.
Wodurch sich dann:
ergibt. Dies ist die Kontinuitätsgleichung der Hydrodynamik.
Die Bewegungsgleichung:
�° ρvdf
∂
= –
∂t
O
ρdV (44)
(45)
Die auf ein Flüßigkeitsvolumen wirkende Kraft F ergibt sich aus der Integration über den
Druck einer begrenzenden Oberfläche O zu:
(46)
Nach Anwendung des Gaußschen Satzes und des zweiten Newtonschen Axiom ergibt
sich:
�
V0 ∂
� ∇( ρv)
dV
= –
∂t
V 0
0
=
�
V0 ∂ρ
+ ∇(
ρv)
∂t
�°
F = – pdf O
d
m v = – ( ∇p)
dV
dt
�
V 0
d
⇔ ρ v = – ∇p
dt
ρdV ∂ 1
⇔ v+ ( v∇)v=
– -- ∇p
∂t
ρ
(47)

Anhang A: Thermoelastische Druckentstehung ________________________________________189
Dies ist die von L. Euler aufgestellte Gleichung. Sie beschreibt die Erhaltung des Impulses
und gilt in dieser Form für ideale inkompressible Flüssigkeiten ohne Reibung. Mit der
Scherviskosität
kes-Gleichung:
η und dem dissipativem Term η∆vergibt sich daraus die Navier-Sto-
Die Wärmetransportgleichung:
(48)
Die Volumenenergiedichte ergibt sich aus des Summe ihrer kinetischen und inneren Energie:
(49)
betrachtet man deren zeitliche Änderung, so kann man diese unter der Benutzung der
Kontinuitätsgleichung, der Bewegungsgleichung und der Maxwellschen Relationen der
Thermodynamik schreiben als [110]:
ε
ϖ
= innere Energie pro Masseneinheit
= Enthalpie pro Masseneinheit
(50)
Wärmeleitung bewirkt einen Energiestrom – k∇T
. In Gleichung (50) eingesetzt ergibt
sich dann:
(51)
Bei nochmaliger Benutzung der Kontinuitätsgleichung, der Bewegungsgleichung und der
Maxwell Relationen ergibt sich die allgemeine Wärmetransportgleichung:
s
= Entropie
∂
ρ v + ρ( v∇)v=
– ∇p+
η∆v ∂t
ρv 2
-------- + ρε
2
∂ ρv
∂t
2
�
�
-------- + ρε�
ρv
2 �
v2
= – ∇ �
�
---- + ϖ�
2 �
∂ ρv
∂t
2
�-------- + ρε�
ρv
� 2 �
v2
= – ∇ �---- + ϖ�
– k∇T � 2 �
ρT�∂s + v∇s� = ∇(
k∇T) �∂t� Mit Hilfe der thermodynamischen Identität:
�∂s� �∂t� P
=
CP -----
T
(52)
(53)

190_______________________________Anhang A: Thermoelastische Druckentstehung
kann die Entropie eliminiert werden. Für ruhende Flüssigkeiten verschwindet die Teilchengeschwindigkeit
und deren Komponenten enthaltenden Terme. Gleichung (53) reduziert
sich somit zu der allgemein bekannten Wärmediffusionsgleichung:
Die homogene Wellengleichung für die Schallausbreitung:
(54)
Aus der Kontinuitätsgleichung (45) und der Eulerschen Bewegungsgleichung (47) wird
nun zunächst eine homogene Wellengleichung für die Schallausbreitung in einer idealen
Flüßigkeit hergeleitet. Die Lasereinstrahlung wird später in der Wärmetransportgleichung
durch einen Quellterm eingefügt. Die Gleichungen (45) und (47) können unter der Bedingung
geringer Schwingungsamplituden, geringer Temperaturänderung bzw. Entropieänderung
linearisiert werden. Somit gilt:
ρ'
p'
s'
C v
= Dichteänderung
= Druckänderung
= Entropieänderung
∂T
ρCP∂ t
= spezifische Wärmekapazität bei konstantem Volumen
(55)
Dichte und Druck hängen somit unmittelbar voneinander ab. Entwickelt man den Druck
um die ungestörte Dichte für geringe Auslenkungen, so erhält man:
Eingesetzt in Gleichung (45) erhält man:
=
k∆T ρ' vp's'---- ∼ ----- ∼ ---- ∼ ----- « 1
ρ0 c0 p0 Cv ∂
p'
∂t
∂p
p' ≈ � �
�∂ρ� (56)
(57)
Da von geringen Auslenkungen ausgegangen wird, kann der zweite Term in Gleichung
(47) vernachlässigt werden.
ρ'
ρ0 ∂p
+ � � ∇v = 0
�∂ρ� ∂
v
∂t
ρ 0
1
+ -- ∇p'
=
0
ρ
(58)

Anhang A: Thermoelastische Druckentstehung ________________________________________191
Durch Einführung eines Geschwindigkeitspotentials ϕ kann mit Gleichung (58) der
Druck durch ϕ ausgedrückt werden:
Durch zusammenführen von Gleichung (59), (56) und (57) erhält man schließlich:
( ∂p
⁄ ∂ρ)
≡ ρ0
2
c0 2
= Quadrat der Ausbreitungsgeschwindigkeit
(59)
(60)
Dies ist die Wellengleichung für das Geschwingigkeitspotential in einer idealen Flüßigkeit
bei geringen Teilchenauslenkungen.
Die inhomogene Wellengleichung für den Druck:
Um ein geschlossenes System von Gleichungen zu erhalten, muß die Zahl der unabhängigen
Variablen reduziert werden. Zu diesem Zweck werden Druck p und Temperatur
T in der Gleichung (48) als auch in Gleichung (52) durch ihre thermodynamischen
Zustandsgleichungen durch die Dichte ρ und die Entropie s ausgedrückt. Auch hier
werden die zulässigen Linearisierungen für geringe Änderungen benutzt:
β
= Volumenexpansionskoeffizient
∂ϕ
v = ∇ϕ � p = – ρ0∂t t 2
∂ϕ
– �∂ϕ� 1
+ ∇ϕ
= 0 ----
�
∂ ∂ρ�0
2
t 2
∂ϕ
⇔ – ∆ϕ
= 0
∂
Die Navier-Stockes Gleichung (48) wird somit zu:
(61)
(62)
(63)
Der nichtlineare Term der Teilchengeschwindigkeit konnte mit den Relationen (55) eliminiert
werden. Ebenso kann die Wärmetransportgleichung (52) mithilfe von (62) geschrieben
werden als:
c 0
2
2 T0c0ρ0 β
p = p0+ c0ρ' + --------------------s'
2
C p
2
T0c0 β
T T0--------------ρ' ρ0Cp T0 = + + -----s'
Cv ∂ 2
ρ0 v = – c0∇ρ'
∂t
∂s
ρ0T0∂ t
–
2
T0c0β -------------- ∇s' + η∇v C p
2
T0k kT0c0β =
-------- ∆s'
+ ----------------- ∆ρ'
– ∇�S�
Cv ρ0Cp (64)

192_______________________________Anhang A: Thermoelastische Druckentstehung
Dabei wurde mit ∇�S� die durch die Divergenz des Pointing-Vektors
deponierte Volumenenergiedichte als Quellterm eingebracht.
S beschriebene
Basierend aus den durch die Umformungen erhaltenen Gleichungen wird nun die inhomogene
Wellengleichung für den Druck hergeleitet. Die drei Gleichungen enthalten nun
die erforderlichen Größen. Durch Kombination der linearisierten Navier-Stockes Gleichungen
(63) und der linearisierten Kontinuitätsgleichung (45) kann die Dichteänderung
ρ' eliminiert werden. Durch Einführen des Geschwindigkeitspotentials ϕ in Gleichung
(62) führt zu:
2
t 2
2
∂ϕ 2 c0β ∂
– c0∆ϕ
= – -------- ( T0s') ∂
Cp ∂t
(65)
Dabei wurde auch gleich der durch η ergebende dissipative Term der Schallabsorption
für die betrachtenden Volumina vernachlässigt.
Da in dieser Arbeit hauptsächlich Laserpulse kleiner der thermischen Relaxationszeit des
absorbierenden Mediums (RPE) verwendet wurden, ergibt sich aus Gleichung (64):
∂
( T0s') ∂t
∇�S�
= – -----------ρ0
Die so reduzierte Gleichung (66) kann nun direkt in (65) eingesetzt werden. Man erhält:
2
t 2
∂ϕ 2
– c0∆ϕ
=
∂
2
c0β ----------- ∇�S�
ρ0C p
(66)
(67)
Dies entspricht genau einer inhomogenen Wellengleichung für das Geschwindigkeitspotential
ϕ . Der durch die Divergenz des Pointing-Vektors S beschriebene Quellterm
liegt im Fall eines absorbierenden Medium in Form von Wärmeenergie vor. Die Konstanten
des Quellterms sind zusammengefaßt als Grüneisenparameter bekannt:
∇�S�
2
βc0 Cp Γ =
--------
(68)
Er berücksichtigt die Effizienz der Umsetzung der deponierten Wärmeenergie in Druck.
Dieser Parameter selbst ist wiederum Temperaturabhängig. Diese Abhängigkeit wird im
Rahmen dieser Arbeit noch in einem eigenen Abschnitt genauer dargestellt werden.

Anhang A: Thermoelastische Druckentstehung ________________________________________193
Lösung der inhomogenen Wellengleichung mithilfe der Transferfunktion:
Der zeitliche Verlauf sowie die Amplitude optoakustisch erzeugter Drucktransienten wird
durch eine Vielzahl von Parametern beeinflußt. Sie unterteilen sich in die optischen Parameter
wie Absorptions- und Streukoeffitient sowie der Schallgeschwindigkeit. Der
bestrahlende Laserpuls wird durch seine Parameter Wellenlänge λ , Pulsdauer τL, Energiedichte Φ0 und Bestrahlungsradius r0 bestimmt.
Zur Lösung der inhomogenen Wellengleichung wird auf die Methode der Transferfunktion
zurückgegriffen [111]. Dieses Verfahren wird im Bereich der thermooptischen
Schallgenerierung zur Lösung der Wellengleichung viel verwendet [65, 109]. Das Problem
der inhomogenen Wellengleichung soll nun eindimensional betrachtet werden. Dies
impliziert die Ausbreitung ebener Druckwellen. Diese Gültigkeit der Lösung ist damit auf
das akustische Nahfeld beschränkt. Des weiteren wird von einer Kreisförmig homogenen
Bestrahlung ausgegangen. Dabei soll die optische Eindringtiefe gering gegenüber der
lateralen Ausdehnung der Bestrahlungsfläche sein:
(69)
Zunächst kann der Quellterm aus Gleichung (67) unter den gegebenen Voraussetzungengeschrieben
werden als:
ft ()
= normierter zeitlicher Verlauf des Laserpulses
Aus Gleichung (67) ergibt sich dann:
2
1
---- « r
µ 0
a
�S� I0e µ – az
= ft ()
� ∇�S�
– µ aI e
0 µ – az
= ft ()
2
t 2
∂ϕ 2
c0
∂ t 2
∂ϕ 1
– ---- Γµ
∂ ρ aI0e 0
µ – az
=
–
ft ()
(70)
(71)
(72)
Wegen der eindimensionalen Bedingung konnte der Laplaceoperator aus Gleichung (67)
auf die Ableitung in der z-Achse beschränkt werden. Zur Lösung von (72) ist es Vorteilhaft
weiter in der spektralen Darstellung zu rechnen und danach in den Zeitraum rücktranformieren.

194_______________________________Anhang A: Thermoelastische Druckentstehung
Es ergibt sich dann:
2
z 2
d
ϕ˜ ( z, ω)
d
ω2
+ ----- ϕ˜ ( z, ω)
=
2
Wobei die spektralen Darstellungen für ϕ( z, t)
und ft () lauten:
ϕ( zt , )
ft ()
Die Lösung von Gleichung (73) ergibt sich dann zu:
( ) = Cpose ϕ˜ z, ω
iωz
-------c0
(73)
(74)
(75)
(76)
Diese Lösung läßt sich jedoch weiter reduzieren. Der letzte Term fällt exponentiell ab und
kann somit für axiale Distanzen einiger optischer Eindringtiefen vernachlässigt werden.
Der zweite Term ist aufgrund seines Vorzeichens nicht physikalisch sinnvoll. Daraus folgt
die Bedingung Cneg = 0 . Die verbleibende Konstante Cpos läßt sich mit Hilfe der Randbedingungen
bestimmen dass die Schallwelle nicht an einer freien Oberfläche entsteht.
Somit gilt:
Daraus ergibt sich dann für die verbleibende Konstante [113]:
c 0
∞
– ∞
µ aβ -----------I
δ0C 0e p
µ – az
f˜ ( ω)
1
----- e
2π
iωt – = � ϕ˜ ( z, ω)
d ω
=
∞
1
----- e
2π
iωt –
� f˜ ( ω)
d ω
– ∞
iωz
– -------- βI0 c µ 0
a
Cnege ----------ρ0Cp
2 ω
µ a
2
+ + ----------------------- f˜ ω
� �
� + ----- � 2
� �
∂ϕ
∂z
z = 0
∂p
∂z
z = 0
Cpos( ω)
i c0 ---ω
βI0 ----------ρ0Cp
2 ω
µ a
2
=
– ------------------f˜ ( ω)
+ -----
=
=
0
0
2
µ a
2
c0 c 0
( )e µ – az
(77)
(78)
(79)

Anhang A: Thermoelastische Druckentstehung ________________________________________195
Um auf die allgemeine Lösung für den Druck P zu kommen ist es sinnvoll die Zeit
t in den Betrag z⁄ c0zu transformieren [111]. Unter der Verwendung der akustischen
Transferfunktion K folgt dann:
˜
τ = t – z ⁄ c0 K ˜
p'( τ)
= retardierte Zeit im Koordinatensystem der Drucktransiente
= akustische Transferfunktion
1
----- I
2π 0 K˜ ( ω)f˜(
ω)e
iωt –
= �
dω
(80)
Das Frequenzspektrum der Lösung ist offensichtlich das Produkt aus den Spektrum des
Intensitätsverlaufs des eingestrahlten Laserlichts und einer akustischen Transferfunktion,
welche sich aus den akustischen, thermischen und optischen Parametern des absorbierenden
Mediums ergibt:
Durch die weitere Transformation der Zeit in Θ , die gegeben ist durch:
∞
– ∞
K˜ ( ω)
Γ c0 µ 2
a
= -----------------------
2 2 2
µa + ω
Θ = τr =
c 0
– 1 – 1
τ τr
( t – z ⁄ c0) (81)
(82)
und unter der Voraussetzung keines akustischen Einschlußes (acoustic confinement)
ergibt sich dann als angenäherte Lösung für Θ ≥ 0 [65]:
p( Θ)
=
βI0c 0
------------ f( Θ)
Cp (83)
Es wird also die Zeitabhängigkeit der Laserpulsform in dieser Näherung in die Pulsform
der Druckwelle reproduziert. Aus Gleichung (83) folgt auch dass der maximale Druck
pmax gegeben wird durch:
p max
=
βI0c 0
------------
Cp (84)

196_______________________________Anhang A: Thermoelastische Druckentstehung

_______________________________________________________________________________197
Danksagung
Ich danke Herrn Prof. Dr. R. Birngruber für die Ermöglichung dieser Arbeit sowie für die
Unterstützung bei der Einwerbung von Drittmitteln zur Finanzierung des Projektes und
zahlreicher Konferenzbesuche.
Mein Dank gilt auch Herrn Ralf Brinkmann, der mir in den vergangenen Jahren als
Betreuer stets mit Rat unterstützend zur Seite stand. Die stete Möglichkeit einer Diskussion
waren auch Triebkraft für neue Inspirationen. Das Heranführen an einen wissenschaftlichen
Austausch im Rahmen von internationalen Kooperationen und
Konferenzbesuchen, wie auch die gezielte Zusammenarbeit mit Industriepartnern habe
ich als eine große Bereicherung meiner Arbeit empfunden.
Für die engagierte Zusammenarbeit bei der klinischen Umsetzung der Ergebnisse dieser
Arbeit danke ich Herrn Prof. Dr. J. Roider von der Klinik für Augenheilkunde der Universität
Kiel der die klinische Studie leitete. Für den großen alltäglichen Einsatz bei der
Durchführung der Patientenbehandlungen und das Verständnis für die Technik danke ich
Herrn Dr. Ch. Wirbelauer, Frau Dr. E. Joachimmeyer, Herrn Dr. H. Elsner und Herrn Dr.
H. Hörauf von der Klinik für Augenheilkunde der Medizinischen Universität zu Lübeck,
wie auch Herrn Dr. C. Framme von der Augenklinik der Universität Regensburg.
Allen Mitarbeitern und Kooperateuren des Medizinischen Laserzentrums Lübeck danke
ich für ihre Unterstützung sowie für die angenehme und produktive Arbeitsatmosphäre.
Diese Arbeit wurde finanziert durch Projektgelder des Bundesministeriums für Bildung,
Wissenschaft, Forschung und Technologie im Rahmen eines Verbundes zur In-vivo Perfusions-
und Stoffwechselmonitoring (Förderkennziffer 13N7309). Der Besuch internationaler
Konferenzen wurde mir durch die Fazit-Stiftung ermöglicht.

198________________________________________________________________________
Lebenslauf:
Persönliche Daten
Vorname, Name Georg Schüle
Geburtsdatum 23. Dezember 1971
Geburtsort Pforzheim
Staatsangehörigkeit deutsch
Familienstand ledig
Kinder keine
Schule
08/82 - 06/88 Realschule, Vaihingen/Enz
08/88 - 06/91 technisches Gymnasium, Bietigheim- Bissingen
Studium
10/91 - 02/97 Physikstudium, Universität Göttingen
Diplomarbeit bei Prof. Dr. D. Harder am Institut für medizinische
Physik und Biophysik mit dem Thema :
Nachweis von Penetration und Spreitung lokal auf die Haut applizierter
Wirkstoffe durch Fluoreszenzspektroskopie