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II „BARCODE-IDENTIFIER“
NL-4 (Valente et al. 1999) (Sigma) sowie 1,25 U Taq-Polymerase (Roche) mit folgendem
Cycling-Programm durchgeführt: 94°C initial für 1 min, dann 94°C für 1 min, 55°C für 1 min
und 72°C für 3 min für 35 Durchläufe, mit einem terminalen Elongations-Schritt bei 72°C für
5 min (Labcycler, Sensoquest, Göttingen, BRD). Zur Kontrolle der PCR wurden jeweils 10µL
des PCR Produktes zu 3 µL Ladepuffer (0,2 g/L Bromphenolblau, 2 g/L Sucrose, in A. dest.)
gegeben und mittels Gelelektrophorese (2% Agarose, E-Gel ® , Invitrogen, Carlsbad, USA)
überprüft. PCR-Produkte wurden mittels „Qiaquick ® Purification Kit“ nach Herstellerangaben
aufgereinigt. Die Sequenzierung wurde mit 200 ng DNA unter Verwendung eines „BigDye ®
Terminator kits v3.1“ (Applied Biosystems, Delaware, USA) nach Herstellerangaben mittels
ABI Prism ® 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) mit ITS5 und NL-4 als Sequenzierprimer
durchgeführt.
II.2.3 Analyse der Nukleotidsequenzen mittels des BLAST-Algorithmus
Mit Sequenzen von (i) 68 Barcode-Identifier Kandidaten (Längenbereich 27-50 bp; Strategie
A), (ii) den ITS2 Abschnitten (Längenbereich 183-249 bp; Strategie B) und (iii) den kompletten
ITS1-5.8S-ITS2 Sequenz Abschnitten (Längenbereich 477-595 bp; Strategie C) wurden
auf der NCBI Webseite (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) BLAST-Analysen (Altschul et al.
1990) (BLASTN 2.2.25+ in der Version vom 31.10.2011) durchgeführt. Bei allen drei
Suchstrategien wurden die gleichen Einstellungen verwendet: General Parameters - Max target
sequences‘100’, Short queries ‘Automatically adjust parameters for short input sequences’,
Expect threshold ‘10’, Word size ‘28’; Scoring Parameters - Match/Mismatch Scores ‘1,-
2’, Gap Costs ‘linear’; Filters and Masking -Filter ‘Low complexity regions’, Mask ‘Mask for
lookup table only’. Die Suchanfrage wurde auf Pilze beschränkt (Taxid 4751). Resultierende
Sequenzen mit weniger als 100% query coverage wurden bei der nachfolgenden Analyse
nicht berücksichtigt.
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