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III BIOFILM-ANALYSE
Die Pyrosequencing Reaktion findet in den Kavitäten unter Beteiligung der am „Capture-
Bead“ immobilisierten Einzelstrang-DNA, dem Sequenzierprimer und den Enzymen DNA-
Polymerase, ATP-Sulfurylase, Luciferase und Apyrase sowie den Substraten Adenosin-5‘-
phosphorsulfat (APS) und Luziferin statt.
Fügt man eines der vier Desoxynukleotide (dNTPs) hinzu, katalysiert die DNA-Polymerase
dessen Einbau in den DNA-Strang, sofern es komplementär zum Template-Base an dieser
Stelle ist. Die Zugabe aller vier dNTPs erfolgt sequentiell an jeder Position (TACG).
Beim Einbau von dNTPs wird Pyrophosphat (PP i ) proportional zur Menge eingebauter Nukleotide
frei. ATP-Sulfurylase wandelt in Anwesenheit von APS das PP i in ATP (Adenosintriphosphat)
um, welches wiederum bei der Umwandlung von Luziferin zu Oxo-Luziferin
benötigt wird. Das Oxo-Luzifernin gibt daraufhin Licht ab, dessen Intensität proportional zur
verbrauchten Menge ATP ist. In Summe ist die Intensität des Lichtsignals also proportional
zur Anzahl eingebauter dNTPs. Erfolgt kein Einbau des dNTPs wird auch kein Lichtblitz generiert
(Abb.III-5).
Das System wird durch Apyrase regeneriert, die ATP und überschüssige dNTPs abbaut. Nach
Ablauf eines Zyklus wird das jeweils nächste dNTP zugeführt. Pro Kavität wird das Lichtsignal
als Peak detektiert, dessen Höhe proportional zur Anzahl der eingebauten dNTPs ist. Abbildung
III-5 illustriert die Zusammenhänge.
Polymerase
„Capture
Bead“
dNTP
Apyrase
APS
Luciferin
dNDP + dNMP + Phosphat
ADP + AMP + Phosphat
PP i
Sulfurylase
ATP
Luciferase
Oxy-Luciferin +
Licht
Abbildung III-5: Schema der Pyrosequencing-Reaktion (nach Armougom, Raoult 2009)
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