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III BIOFILM-ANALYSE gen) überprüft (3µL Ladepuffer; wässrige Lösung von 0,2 g/L Bromphenolblau und 2 g/L Sucrose). Die PCR-Produkte wurden anschließend mittels „Qiaquick ® PCR Purification Kit“ (Qiagen, Hilden, BRD) nach Herstellerangaben gereinigt. Die Sequenzierung erfolgte mit 200 ng PCR Produkt unter Verwendung eines „BigDye ® Terminator kits v3.1“ (Applied Biosystems, Delaware, USA) nach Herstellerangaben auf einem ABI-Prism ® 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) mit ITS5 (White et al. 1990) und NL-4 (Valente et al. 1999) als Sequenzierprimer. III.2.2.4 DNA Extraktion - TEFAP Die DNA wurde mit dem „PowerBiofilm TM DNA Extraction Kit“ (Mobio, Carlsbad, USA) nach dem Protokoll des Herstellers aus etwa 0,2 g der Biofilme extrahiert, wobei der mechanische Aufschluss für drei mal 60 sek und jeweils 10 sek Pause bei maximaler Frequenz (30,0 / sek) mit einer Schwingmühle (MM310, Retsch GmbH, Haan, BRD) erfolgte. Anschließend wurde ein zusätzlicher Aufreinigungsschritt mittels „Qiaquick ® PCR Purification Kit“ (Qiagen) ebenfalls nach Herstellerangaben durchgeführt. III.2.2.5 Primer Design - TEFAP Basierend auf dem universellen Pilzprimer ITS4 (5’-tcctccgcttattgatatgc-3’) (White et al. 1990) wurden acht verschiedene Fusionsprimer mit integrierter, proben-spezifischer 6mer- Tag-Sequenz und der Roche Primer A Sequenz erstellt. Basierend auf dem Standard- Pilzprimer ITS3 (5’-gcatcgatgaagaacgcagc-3’) (White et al. 1990) wurde ein Primer mit integrierter Roche Primer B Sequenz ohne eine 6mer-Tag-Sequenz erstellt (Tab.III-2). 42
III BIOFILM-ANALYSE Tabelle III-2: Verwendete Fusionsprimer (F1-F8) für das Tag Encoded Amplicon Pyrosequencing Primer ITS4 tag1 (F1) ITS4 tag2 (F2) ITS4 tag3 (F3) ITS4 tag4 (F4) ITS4 tag5 (F5) ITS4 tag6 (F6) ITS4 tag7 (F7) ITS4 tag8 (F8) Primer Sequenzen (51bp bzw. 45bp) CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGTCGTATtcctccgcttattgatatgc~* CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGTCGCGAtcctccgcttattgatatgc~ CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGTGCtcctccgcttattgatatgc~ CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGGATAGCtcctccgcttattgatatgc~ CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGATCAGCtcctccgcttattgatatgc~ CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGTGTATCtcctccgcttattgatatgc~ CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGTACGCAtcctccgcttattgatatgc~ CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGAGTCAGtcctccgcttattgatatgc~ ITS3 (kein tag) CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGgcatcgatgaagaacgcagc~ (45bp) *Tags: fett, Roche Primer A und B: Großbuchstaben, sequenzspezifischen Primer ITS3 und ITS4: Kleinbuchstaben. III.2.2.6 Hot-Start PCR – TEFAP Die PCR wurde mit 200 ng extrahierter DNA, 1,25 U Hotstar ® Taq-Polymerase (Qiagen), 2,5 pmol der beschriebenen Primer (Tab.III-2) 62,5 µM dNTPs, 5 µL 10x PCR Puffer (beide: Roche) im 50µL Ansatz nach dem in Tabelle III-3 dargestellten Schema durchgeführt. Tabelle III-3: Ablauf des verwendeten PCR-Programms zur Herstellung tag-markierter ITS2- Amplicons PCR Schritt Temperatur Zeit Anzahl der Durchläufe Aktivierung 95°C 15 min 1 Denaturierung 94°C 30 sek Primer-Annealing 60°C-72°C* 40 sek Elongation 72°C 60 sek Denaturierung 94°C 30 sek Annealing + Elongation 72°C 30 sek Finale Elongation 72°C 60 sek 1 *ansteigende Annealing-Temperatur („ramped-PCR“) in den ersten sieben Durchläufen (+2°C pro Durchlauf); ** zweischrittige PCR 7 15** 43
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Dunkel pigmentierte Biofilme an Tri
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VIII LITERATUR Feinstein, LM, WJ Su
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VIII LITERATUR Heinrichs, G, I Hüb
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VIII LITERATUR Lumini, E, A Orgiazz
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VIII LITERATUR Porteous, NB, SW Red
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VIII LITERATUR Siqueira, JF, Jr., A
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VIII LITERATUR Woertz, JR, KA Kinne
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IX ANHANG ABBILDUNG IV-12: PILZKONZ
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IX ANHANG IX.2 TABELLENVERZEICHNIS
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