2 Material und Methoden

Material und Methoden
2.2.12 Ortsgerichtete Mutagenese
Zum Einbringen von Punktmutationen in eine DNA-Sequenz wurde der QuikChange Kit von
Stratagene verwendet.
Dabei wurde die Templat-DNA einer PCR-ähnlichen Reaktion mit 2 komplementären
Oligonukleotiden, die veränderte Sequenz enthielten, unterzogen, so dass Plasmide mit der neuen
Sequenz synthetisiert wurden. Die Templat-DNA wurde in einem 2. Schritt mit dem Enzym Dpn I
verdaut, das nur an einer methylierten 4 bp-Sequenz spaltet. Das synthetisierte Plasmid liegt
kreisförmig mit Strangbrüchen vor, die nach der Transformation in E. coli von den bakteriellen
Enzymen repariert werden. Es wurde folgendes Temperaturprogramm verwendet:
Tabelle 2. Temperaturprogramm für PCR
Vorgang Zeit (s) Temperatur (°C) Anzahl der Zyklen
Denaturierung 30 95 1
Denaturierung
Annealing
Extension
30
60
X*
(*)Die Extensionszeit sollte 1 min/1kb betragen.
Ein typischer Ansatz setzte sich wie folgt zusammen:
95
55
68
18
Templat-DNA
1 µl = 50-100 ng
Pfu-Polymerase Puffer (10x) 2.5 µl
dNTPs (10 mM) 0.5 µl
Oligonukleotid 1
Oligonukleotid 2
1 µl = 20 pmol
1 µl = 20 pmol
Pfu-Poymerase (5 Einheiten/µl) 1 µl
deionisiertes Wasser ad 25 µl
Anschließend wurde 1µl DpnI (10 Einheiten/µl) zugegeben und bei 37 °C für 1 h und bei 65 °C für
10 min inkubiert. Mit 2-4 µl des Ansatzes wurden E. coli-Zellen transformiert.
2.2.13 Ligationsunabhängige Klonierung (LIC-PCR-Methode)
Die Methode beruht auf der 3‘-5‘-Exonuklease-Aktivität der T4 DNA Polymerase (Aslanidis & de
Jong, 1990) (Abbildung 10).
Mittels PCR wird die zu klonierenden Sequenz mit spezifischen Fragmenten aus 12 Basenpaaren
versehen. Diese zusätzlichen Enden bestehen aus den Basen A, G und C und enden mit einem T. Nach
der PCR werden dann die Fragmente mit T4 DNA Polymerase mit Zusatz von dATP behandelt. Das
Enzym arbeitet als 3‘-5‘-Exonuklease und generiert 5‘-Einzelstrang-Überhänge bei den
doppelsträngigen PCR-Produkten bis sie auf einen T trifft. Diese Überhänge sind zu 3‘-Überhängen
im LIC-Vektor komplementär, so dass die zu klonierender DNA-Fragment mit dem Plasmid gleich
annealen kann ohne einen zusätzlichen Ligationsschritt vor der Transformation.
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