2 Material und Methoden

Material und Methoden
2.3.2 Bakterienanzucht zur Expression von nGLP-1R- und GLP-1-Varianten
2.3.2.1 Anzucht in Schüttelkolben
Die Expression rekombinanter Proteine im Kleinmaßstab erfolgte durch Animpfen einer
15-30 ml Vorkultur mit einer Kolonie von einer LB-Agar Platte oder einer Glycerinkultur. Die
Vorkultur wurde über Nacht bei 37 °C geschüttelt. Zum Animpfen der Hauptkultur wurde die
Vorkultur 1:100 in frischem LB-Medium in 5 L Schüttelkolben (bis zu 1,5 L Medium) verdünnt. Die
Kolben wurden bei 37 °C geschüttelt bis die Zellen eine optische Dichte von 0.5-0.6 bei 578 nm
erreicht hatten. Anschließend wurde die Proteinexpression durch Zugabe von 1 mM IPTG induziert.
Nachdem die Zellen weitere 4 h bei 37 °C geschüttelt wurden, wurden sie durch Zentrifugation
15 min bei 5000 x g und 4 °C geerntet.
2.3.2.2 Fed Batch-Fermentation
Die Fermentation wurde in einem 10 l Biostat ED Bioreaktot (B- Braun, Deutschland) nach Neubauer
et. al durchgeführt. Das Kulturvolumen entsprach 8 Litern. Die Zellen wurden bis zu einer optischen
Dichte von 60 bei 500 nm bei 35 °C kultiviert und die Expression von rekombinantem Protein wurde
durch Zugabe von 0.4 mM IPTG induziert. Nach 3-4 h wurden die Zellen durch Zentrifugation bei
5000 x g für 15-20 min bei 4 °C geerntet. Bis zur weiteren Aufarbeitung wurde das Zellmaterial bei
-20 °C gelagert.
2.3.3 Inclusion body (IB) Isolierung.
Die Isolierung und Solubilisierung von Inclusion Bodies wurde nach Rudolph et al 1998 durchgeführt.
Dazu wurden die Zellen im ersten Schritt mittels Hochdruckdispersion in einem Gaulin-
Homogenisator (Gaulin Micron Lab 40; APV Homogenisator GmbH; Lübeck) bei einem Druck von
1200 bar und 0,25 g Zellmaterial/ml 0.1M Tris, 1 mM EDTA, pH 7,0 aufgeschlossen.
Die aufgeschlossenen Zellen wurden dann einer DNAse-Behandlung (10 µg/ml) mit Zusatz von
3 mM MgCl 2 für 30 min bei Raumtemperatur unterzogen. Anschließend wurde der Ansatz mit
0,5 Volumina 60 mM EDTA, 1,5 M NaCl, 6 % (w/v) Triton X-100, pH 7,0 gemischt und bei 4 °C für
30 min inkubiert. Die Sedimentation von Inclusion Bodies erfolgte nach einer Zentrifugation bei
30000xg für 15 min und 4 °C. Danach wurde das Pellet 3fach mit 0,1 M Tris, 20 mM EDTA, pH 7,0
gewaschen und bei -20 °C gelagert.
2.3.4 Solubilisierung von Inclusion Bodies
Die Solubilisierung von isolierten Inclusion Bodies erfolgte in 6 M GdmHCl, 0.1 M Tris,
1mM EDTA, 100 mM DTT, pH 8.5 bei Raumtemperatur für 2 h bei einer Proteinkonzentration von
10-20 mg/ml. Unlösliches Zellmaterial wurde durch Zentrifugation (20 min, 20000 rpm, 4 °C)
abgetrennt. Der Ansatz wurde mit HCl auf einen pH von 2,0-3,0 titriert und zur vollständigen
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