2 Material und Methoden

Material und Methoden
2.3.28.2 Rezeptorfragment-Titration
In zweiter Reihe von Experimenten wurde cysteinyliertes GLP-1 über C-terminale Thiolgruppe
kovalent an die Flusszelle 2 eines CM5 Chips in Anlehnung an die Anleitung des Herstellers
gekoppelt. Die Flusszelle 1 wurde mit L-Cystein blockiert. Routinemäßig wurden ca. 40-50 RU Peptid
immobilisiert. Die Bindung wurde in Puffer B unter Zusatz von 0.25 M Arginin, 0,05 % Tween-20 mit
einer Flussrate von 30 µl/min bei 20 °C gemessen. Die Regeneration der Oberfläche erfolgte durch
einen 30 µl Puls mit 6 M Harnstoff, 100 mM Formiat, pH 2.0. Die Bindungskurven wurden mit der
BIAevaluation 3.0 Software (BIACORE AB, Uppsala, Sweden) nach 1:1 Langmuir Bindungsmodel
ausgewertet.
2.3.28.3 Kompetition der Bindung
Für Kompetitionsexperimente wurde nGLP-1R mit unterschiedlichen Konzentrationen an
GLP-1[7-36]-NH 2 für 20 min bei Raumtemperatur vorinkubiert. Anschließend wurden diese Proben
als Analyt an eine mit GLP-1-CM-5-Chip Oberfläche bei 30 µl/min injiziert. Die Ermittlung der
Bindungskonstante erfolgte über lineare Regression unter Verwendung folgender Gleichungen (1) und
(2):
( )
0
max
[( R) + ( L)
+ K ] ( R) + ( L)
( RL)
( R) 0
S = S + ∆S
×
(1)
[ K ]
2
0 0 d 0 0 +
d
RL = −
− R × ( L) 2
2
0 0 (2)
mit:
S
S 0
Resonanzsignal im Gleichgewicht nach Injektion
Resonanzsignal des Rezeptor-Ligand-Komplexes ohne Zugabe des Kompetitors
∆S max Differenz zwischen S und S 0
(RL) Konzentration des Rezeptor-Ligand-Komplexes am Chip im Gleichgewicht
(R) 0
Konzentration des eingesetzten Rezeptor Fragments
(L) 0
Konzentration des zur Kompetition eingesetzten Peptides
2.3.28.4 Regenerationsprozedur der CM-5 Chip-Oberfläche
Vor jeder neuen Messreihe am BiacoreX System wurde routinemäßig eine Regenerationsprozedur der
CM-5 Chip-Oberfläche mit anschließender Neukopplung des cysteinylierten GLP-1 durchgeführt
(Bazarsuren & Panzner, 1999).
2.3.29 Isothermale Titrationskalorimetrie (ITC)
Isothermale Titrationskalorimetrie Experimente wurden an einem MicroCal ITC Titration Calorimeter
(MicroCal. Inc., Northampton, MA) gemessen. 26,3 µM GLP-1 wurden zu 2,04 µM nGLP-1R Lösung
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