2 Material und Methoden

Material und Methoden
(20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,4) verdünnt, ausgefallenes Material wurde mittels Zentrifugation
(1 h; 10000 rpm; 4°C) entfernt. Der Überstand wurde an 20 ml lose S-Sepharose (Roche Molecular
Biochemicals) im batch durch vorsichtiges Rühren für 30 min bei 4 °C gebunden. Es folgte ein
Waschschritt mit 200 ml Puffer A plus 150 mM NaCl. Das gebundene Protein wurde in einem Schritt
mit 1 M NaCl eluiert. Das Eluat wurde wiederum 1: 10 mit Puffer A verdünnt, abzentrifugiert und
anschließend bei einer Flussrate von 1 ml/min auf eine mit 10 Säulenvolumina des Puffer A
äquilibrierte 5 ml HiTrap SP-Sepharose-Säule (Amersham Pharmacia) geladen. Nach einem
Waschschritt mit 5 Säulenvolumina des Puffer A+150 mM NaCl erfolgte die Elution des Proteins
mittels eines linearen Gradienten von 150 mM auf 1 M NaCl. nGLP-1R wurde bei einer
NaCl-Konzentration von 550 mM von der Säule eluiert.
2.3.19 Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC)
Die Rezeptor-Ligand-Chimäre wurde nach der Renaturierung mittels Hydrophober
Interaktionschromatographie aufgereinigt. Hierzu wurde der Renaturierungsansatz gegen ein 50faches
Volumen des HIC-Bindungspuffers (1,2 M (NH 4 ) 2 SO 4 , 50 mM Na-Phosphat, 1mM EDTA, pH 7,4)
dialysiert. Nach der Dialyse wurde das ausgefallene Protein durch Zentrifugation (30 min; 20000rpm;
4 °C) entfernt und der Überstand auf eine mit dem gleichen Puffer voräquilibrierte 6 ml
Phenylsepharose-Chromatographie-Säule (Phenyl Sepharose 6 Fast Flow, Amersham Pharmacia) bei
einer Flussrate von 1 ml/min gebunden. Es folgte ein Waschschritt mit 5 Säulenvolumina des HIC-
Bindungspuffers. Das gebundene Protein wurde mittels eines linearen Gradienten von
1.5 M Ammoniumsulfat auf 0 M Ammoniumsulfat. Die Rezeptor-Ligand-Chimäre wurde bei einer
Ammoniumsulfatkonzentration von ca. 250 mM von der Säule eluiert.
2.3.20 Gelfiltrationschromatographie
Als letzter Reinigungsschritt wurde für alle verwendeten Proteine eine präparative Gelfiltration
durchgeführt. Dazu wurden 3 ml des Eluats der SP-Säule bzw. der HIC-Säule bei einer Flussrate von
0,5 ml/min auf eine mit 3 Säulenvolumina des Laufpuffers (20 mM Tris; 1 mM EDTA; 0,8 M NaCl,
pH 7,4) äquilibrierte Sephacryl®S-100-Säule (Amersham Pharmacia; Säulenvolumen 75 ml)
aufgetragen. Es wurden 2 ml Fraktionen gesammelt.
2.3.21 Immobilisierte Metallchelat-Affinitätschromatographie (IMAC)
Das Auftrennen des GLP-1 6His von den anderen Bromcyan-Spaltprodukten des Fusionsproteins CBD-
GLP-1 erfolgte über Ni-NTA-Agarose (His-Bind Resin; Novagen; Säulenvolumen 6 ml). Hierzu
wurde der Spaltungsansatz über einen Rotationsverdampfer bis zur Trockne eingeengt und in Puffer 1
(6 M Harnstoff, 0,1 N NaH 2 PO 4 , 0,01 M Tris, pH 8,0) aufgenommen. Die Bindung auf die mit Puffer
1 äquilibrierte Ni-NTA-Agarose-Säule erfolgte bei einer Flussrate von 0,5 ml/min. Nach einem
Waschschritt mit Puffer 2 (6M Harnstoff, 0,1 M NaH 2 PO 4 , 0,01 M Tris, pH 6,3) wurde das gebundene
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