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Material und Methoden 2.2.12 Ortsgerichtete Mutagenese Zum Einbringen von Punktmutationen in eine DNA-Sequenz wurde der QuikChange Kit von Stratagene verwendet. Dabei wurde die Templat-DNA einer PCR-ähnlichen Reaktion mit 2 komplementären Oligonukleotiden, die veränderte Sequenz enthielten, unterzogen, so dass Plasmide mit der neuen Sequenz synthetisiert wurden. Die Templat-DNA wurde in einem 2. Schritt mit dem Enzym Dpn I verdaut, das nur an einer methylierten 4 bp-Sequenz spaltet. Das synthetisierte Plasmid liegt kreisförmig mit Strangbrüchen vor, die nach der Transformation in E. coli von den bakteriellen Enzymen repariert werden. Es wurde folgendes Temperaturprogramm verwendet: Tabelle 2. Temperaturprogramm für PCR Vorgang Zeit (s) Temperatur (°C) Anzahl der Zyklen Denaturierung 30 95 1 Denaturierung Annealing Extension 30 60 X* (*)Die Extensionszeit sollte 1 min/1kb betragen. Ein typischer Ansatz setzte sich wie folgt zusammen: 95 55 68 18 Templat-DNA 1 µl = 50-100 ng Pfu-Polymerase Puffer (10x) 2.5 µl dNTPs (10 mM) 0.5 µl Oligonukleotid 1 Oligonukleotid 2 1 µl = 20 pmol 1 µl = 20 pmol Pfu-Poymerase (5 Einheiten/µl) 1 µl deionisiertes Wasser ad 25 µl Anschließend wurde 1µl DpnI (10 Einheiten/µl) zugegeben und bei 37 °C für 1 h und bei 65 °C für 10 min inkubiert. Mit 2-4 µl des Ansatzes wurden E. coli-Zellen transformiert. 2.2.13 Ligationsunabhängige Klonierung (LIC-PCR-Methode) Die Methode beruht auf der 3‘-5‘-Exonuklease-Aktivität der T4 DNA Polymerase (Aslanidis & de Jong, 1990) (Abbildung 10). Mittels PCR wird die zu klonierenden Sequenz mit spezifischen Fragmenten aus 12 Basenpaaren versehen. Diese zusätzlichen Enden bestehen aus den Basen A, G und C und enden mit einem T. Nach der PCR werden dann die Fragmente mit T4 DNA Polymerase mit Zusatz von dATP behandelt. Das Enzym arbeitet als 3‘-5‘-Exonuklease und generiert 5‘-Einzelstrang-Überhänge bei den doppelsträngigen PCR-Produkten bis sie auf einen T trifft. Diese Überhänge sind zu 3‘-Überhängen im LIC-Vektor komplementär, so dass die zu klonierender DNA-Fragment mit dem Plasmid gleich annealen kann ohne einen zusätzlichen Ligationsschritt vor der Transformation. 31
Material und Methoden Abbildung 10. Ligationsunabhängige Klonierung (EC/Lic Cloning Kits, Novagen) T4 DNA Polymerase-Behandlung: Ansatz: 5 µl aufgereinigtes PCR-Produkt 2 µl 10x T 4 DNA Polymerase Puffer 2 µl 25 mM dATP 1 µl 100 mM DTT 0,5 µl 2,5 U/µl T 4 DNA Polymerase 9,5 µl Aqua bidest Prozedur: Der Ansatz wurde zusammen pipettiert, 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Inaktivierung der Polymerase erfolgte bei 75 C für 20 min. 2 µl von der mit T4 DNA Polymerase behandelten Probe wurden mit 1 µl LIC-Vektor gemischt und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Zu dem Ansatz wurde dann 1 µl von 25 mM EDTA-Lösung zupipettiert und wiederum 5 min bei 22 °C inkubiert. Anschließend wurde der Ansatz in E. coli XL-1 Blue transformiert. 32
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Seite 9: Material und Methoden 2.2.9 Agarose
Seite 13 und 14: Material und Methoden 2.3.2 Bakteri
Seite 15 und 16: Material und Methoden 2.3.9 Diskont
Seite 17 und 18: Material und Methoden 2.3.15 Aufkon
Seite 19 und 20: Material und Methoden Peptid mit Pu
Seite 21 und 22: Material und Methoden 2.3.28.2 Reze
Seite 23: Material und Methoden Sequenzer von

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