Biochemie Praktikum I

Praktikumsskript Biochemie für Biologen-Bachelor SS2011
LDH-Test / Proteinbestimmung
Um Pipettierfehler möglichst gering zu halten kann für den Testansatz folgende Lösung (Mix)
vorbereitet werden (bei RT aufbewahren!):
Versuchsdurchführung:
67 mM Phosphatpuffer pH 7.2 9.4 ml
Pyruvatlösg. (2,75 mg / ml)
200 µl
NADH-Lösg. (11 mg / ml) 200 µl
LDH aus Schweinherzmuskel so verdünnen 10 , dass die Ausgangslösung eine
Volumenaktivität von ca. 2 – 4 U/ml (ΔE/min = 0,13 – 0,26) hat.
Die Reaktion wird mit der Zugabe der LDH-Probenlösung gestartet. Dafür werden in die
Küvette 980 µl Testlösung vorgelegt und 20 µl LDH-Probenlösung dazu pipettiert. Die
Küvette mit Parafilm abdichten, mischen, zum Entfernen von Luftbläschen einige Male auf
den Tisch klopfen ins Photometer stellen und sofort mit Hilfe des Schreibers die Abnahme der
Extinktion verfolgen.
Mehrere Tests zur Messung der Volumenaktivität in der Ausgangslösung durchführen.
ΔE/min ermitteln, Volumenaktivität errechnen 11 .
10 wird in kristalliner Form als Suspension in Ammoniumsulfat gelagert.
Herstellung der Testlösung: 400 µl Suspension 10 min bei 13 000 Rpm zentrifugieren, Niederschlag in 200 µl
Phosphatpuffer aufnehmen und zum Erreichen der geforderten Volumenaktivität verdünnnen.
11 die Vorgehensweise beim Test sollte danach verinnerlicht sein. Abweichungen in der Messwerte sollte < 10% sein.
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