Biochemie Praktikum I

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Praktikumsskript Biochemie für Biologen-Bachelor SS2011 Michaelis-Menten-Kinetik Zur Auswertung von Messergebnissen wird meistens die Auftragung nach Lineweaver-Burk verwendet. Dazu wird die Michaelis- Menten Gleichung wie folgt umgeformt: v= v max (1+K M /C S ) = v max K M +C S C S Der reziproke Ausdruck hiervon lautet: 1 K M +C S K = M 1 1 = + V v max C S v max C v S max Mit 1/v und 1/C S als Variable erhält man eine Gerade mit der Steigung K M /v max und dem Achsenabschnitt 1/v max. Das heißt: Trägt man gemessene Werte für 1/v über 1/C S auf, so kann man aus Steigung und Achsenabschnitt K M und v max ermitteln (siehe Abb. 2). Abb.2: Auftragung nach Lineweaver-Burk Versuchsdurchführung: Zur Ermittlung der MICHAELIS-MENTEN Kinetik der LDH für das Coenzym NADH/H + misst man die Enzymaktivität analog dem LDH-Test, allerdings mit unterschiedlicher NADH/H + -Konzentration. 13
Praktikumsskript Biochemie für Biologen-Bachelor SS2011 Michaelis-Menten-Kinetik Der Test wird in 1 ml Plastikküvetten am Eppendorf-Photometer bei 366 nm und Raumtemperatur durchgeführt. Die Testlösung enthält: 67 mM Phosphatpuffer pH 7.2 950 µl Pyruvatlösg (2.75 mg/ml) 20 µl Enzymlösg. (25 µg/ml) 10 µl NADH-Lösg. aus Verdünnungsreihe 20 µl Stammlösung vorbereiten: 67 mM Phosphatpuffer pH 7.2 9.5 ml Pyruvatlösg (2.75 mg/ml) 200 µl Enzymlösg. (25 µg/ml) 100 µl Start der Reaktion durch Zugabe der NADH-Lösung. Verdünnungsreihe: NADH-Stammlösg: 15,5 mM (11 mg/ml) Verdünnungsfaktor: 1 2 4 8 10 20 30 40 __________________________________________________________________________ Schreiberempfindlichkeit __________________________________________________________________________ NADH-Konz. [mM]: __________________________________________________________________________ NADH-Konz. im Test [mM]: __________________________________________________________________________ Reaktionsgeschw. V [U/ml]: Bestimmumg der Reaktionsgeschwindigkeit (d.h. Volumenaktivität) Extinktionskoeffizient: 3.3 l/(mmol⋅cm)= 3.3 ml/(µmol⋅cm) Schichtdicke d= 1 cm ∆E V T ⋅ n 14
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