Biochemie Praktikum I

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Praktikumsskript Biochemie für Biologen-Bachelor SS2011 LDH-Test / Proteinbestimmung Bestimmung der Proteinkonzentration (Gesamtprotein) nach Bradford Neben der Proteinbestimmung nach der Biuret-, bzw. der Lowry-Methode stellt die Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford eine geeignete Möglichkeit dar, auch sehr kleine Proteinkonzentrationen (10-100 µg/ml) zu ermitteln. Zur Messung der Proteinkonzentration werden Proteinlösungen mit dem blauen Farbstoff Coomassie Brillant Blue R250 versetzt. Die Farbstoffmoleküle binden adsorptiv an die Proteinmoleküle; dadurch tritt eine Verschiebung des Absorptionsmaximum nach 595 nm auf (vgl. Lottspeich, Bioanalytik). Diese wird anhand von Extinkitionsmessungen ermittelt und daraus die Proteinkonzentration bestimmt: SO 3 Na H 3 C N HN CH 3 H 3 C CH 3 O CH 3 N + SO - 3 Abb. 3: Coomassie Brillant Blue R 250 Gegenüber anderen Proteinbestimmungen hat die Bradford -Methode folgende Vorteile: - hohe Empfindlichkeit Proteinkonzentration im Test 1-10 µg (Biuret ca 100 µg) - kurze Reaktionszeit (ca. 2 min) - geringe Störanfälligkeit: keine Beeinflussung des Testergebnisses durch K + -, Mg 2+ - Ionen, EDTA, TRIS, Thiolreagentien und Kohlenhydrate Versuchsdurchführung Erstellen einer Eichgerade Um die ermittelten Extinktionswerte einer Proteinkonzentration c zuweisen zu können, muß eine Eichgerade erstellt werden. Eine Verdünnungsreihe mit Rinderserumalbumin (BSA) ansteigender Konzentration (10 – 100 µg/ml) wird zur Verfügung gestellt. Von den Verdünnungen werden nun jeweils 100µl zu 1 ml Bradford-Stammlösung (vorgelegt in Küvetten) gegeben (Verdünnungsfaktor 1 : 11). Die Küvetten mit Parafilm abdichten, gut vermischen, 10 min inkubieren und anschließend messen 7
Praktikumsskript Biochemie für Biologen-Bachelor SS2011 LDH-Test / Proteinbestimmung Gemessen wird bei 595 nm. Vor Beginn der Messung wird das Spektrometer mit 1 ml Bradford-Stammlösung + 100 µl H 2 O auf Null gestellt (Extinktion der Negativkontrolle entspricht dem Nullwert). Durch Auftragen der bekannten Proteinkonzentrationen gegen die zugehörigen Extinktionswerte erhält man eine Eichgerade. Proteinverdünnungen zur Ermittlung der Eichgerade (2 mal unabhängig voneinander ansetzen und messen): Konz. c [µg/ml] Eichlösungen Extinktion 1. Messung Extinktion 2. Messung 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Auswertung: Erstellen der Eichgeraden auf Millimeterpapier: Extinktion Konzentration [ µg / ml ] Messung der Proteinkonzentration der LDH-Lösung / spezifische Aktivität Messung der Proteinkonzentratoin der LDH-Lösung mit Hilfe der Bradford-Methode. LDH- Probe so vorverdünnen, dass die Extinktion im Bereich der Eichkurve liegt. Extinktion bestimmen; Konzentration aus der Eichgerade ablesen. Aus der Volumenaktivität (VA; [U/ml]) und Proteinkonzentration (PK [mg/ml]) kann die spezifische Aktivität der Enzymlösung ermittelt werden. VA : PK = SA [U/mg] 12 diese kann ein Maß für den Reinheitsgrad des Enzyms sein Bei bekanntem MW 13 kann die Proteinkonzentration in µmol/ml umgerechnet werden. Bei Bildung des Quotienten erhält man die Umsatzzahl: K cat = VA[µmol/(ml • s) : PK [µmol/ml]; [µmol • ml / µmol • ml • s] = [1/s] K cat gibt an wie viele Substratmoleküle ein Enzymmoleküle in der Sekunde umsetzt 12 entsprechende Rechnungen wurden in den Übungen zur Biochemie I Vorlesung durchgeführt 13 LDH: 135 000 Da 8
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