Protokoll f Â¨ur MolekularBiologische Praktikum - stinfwww

Protokoll für MolekularBiologische 

Praktikum 

Guan Zhang (Gruppe 6) 

4. Mai 2006 

Inhaltsverzeichnis 

1 Einleitung 2 

2 Gewinnung des GFP-codierenden Gens 3 

2.1 06.März 2006 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 

2.1.1 PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 

2.1.2 Analytische und präparative Gelelektrophorese . . . 5 

2.2 07.März 2006 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 

2.2.1 Aufreinigung des PCR-Produkts . . . . . . . . . . . . 7 

2.2.2 Bestimmung der DNA-Konz. mit dem Spektralphotometer 

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 

3 Gewinnung des Klonierungsvektor pQE30 11 

3.1 06,März,2006 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 

3.1.1 Herstell. und Sterilisation von Flüssignähhrm. . . . . 11 

3.2 07,März,2006 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 

3.2.1 Ansetzung übernachtkultur . . . . . . . . . . . . . . . 11 

3.3 08,März,2006 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 

3.3.1 Plasmid-Päparation von pQE30(Alkalische Lyse) . . 13 

4 Restriktionsverdau sowie Dephosphorylierung 16 

4.1 08,März,2006 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 

4.1.1 Restriktionsverdau von PCR-Produkt . . . . . . . . . 16 

4.2 9,März,2006 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 

4.2.1 Dephosphorylierung des Vektors . . . . . . . . . . . . 18 

4.2.2 Ethanolfällung von pQE30 und GFP-Gen . . . . . . . 20 

4.3 10,März,2006 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 

4.3.1 Fortsetzung der Reinigung von Vektor pQE30 und 

PCR-Produkt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 

4.3.2 Aufreinigung des Vektors pQE30 durch präparative 

Agarose - Gelelektrophorese . . . . . . . . . . . . . . 22 

1

INHALTSVERZEICHNIS 2 

5 Ligation von geschnittenem Vektor pQE30 und GFP-Gen 25 

5.1 10,März,2006 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 

5.1.1 Ligation von geschnittenem Vektor pQE30 und GFP- 

Gen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 

5.2 13,März,2006 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 

5.2.1 Agarose-Gel für Ligation . . . . . . . . . . . . . . . . 26 

6 Transformation 28 

6.1 09,März,2006 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 

6.1.1 Gießen von Nährmedium im Petrischalen . . . . . . . 28 

6.2 13,März,2006 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 

6.2.1 Transformation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 

6.3 14,März,2006 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 

6.3.1 Auswertung der Tranformation von E.coli . . . . . . 32 

6.3.2 Untersuchung der erhaltenen Transformanden(Kolonie- 

PCR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 

7 Expression von GFP 35 

7.1 14,März,2006 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 

7.1.1 Ansetzen einer Übernacht-kultur . . . . . . . . . . . . 35 

7.2 15,März,2006 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 

7.2.1 Expression von GFP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 

7.3 16,März,2006 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 

7.3.1 Expressionskontrolle mittels SDS-PAGE ( Polysacrylamid- 

Gelelektrophores ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 

8 plasmidpreparation und Sequenzierung 41 

8.1 15,März,2006 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 

8.1.1 Plasmidpräparation von pQE-GFP . . . . . . . . . . . 41 

8.1.2 Sequenzierung des GFP-Gens in pQE-GFP . . . . . . 43 

8.2 16,März,2006 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 

8.2.1 Aufarbeitung der Sequenzier-Reaktion . . . . . . . . 46 

9 Auswertung der Sequenzierung 48 

9.1 17,März,2006 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48 

9.1.1 Sequenzierung OK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48 

9.1.2 Sequenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48 

9.1.3 Alignment GFP mit Priginal in pQBI63 . . . . . . . . 48 

10 Ligation in silico 51 

10.1 DNA-Sequenz des Plasmids pQBI63 und Lokalisation des 

GFP - Gens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 

10.2 DNA-Sequenz des Plasmids pQE-30 . . . . . . . . . . . . . . 52 

10.3 Schnittstelle für BamHI und PstHI . . . . . . . . . . . . . . . 53

INHALTSVERZEICHNIS 3 

10.4 Primer-Sequenzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 

10.5 Verdauen das GFP-Gen und den Vektor pQE-30 . . . . . . . 54 

10.6 seqenz des Zielplamid pQE-GFP . . . . . . . . . . . . . . . . 54 

10.7 plasmidkarte erstellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

1 EINLEITUNG 4 

1 Einleitung 

In diesem Praktikum soll die Anwendung molekularbiologischer Techniker 

anhand der Klonierung,Expression und Sequenzanalyse des ”Green Fluorescent 

Protein”(GFP) 1 aus der pazifischen Qualle Aequorea victoria erlernt 

werden. 

Aufgrund seiner intensiven Autofluoreszenz ist GFP in der Molekularbiologie 

ein beliebter,nicht-invasiver Indikator (Marker)für die Kontrolle 

gentechnischer Experimente und speziell der Genexpression. 

Um eine Expression von GFP in E.coli zu erreichen,muß die codierende 

Sequenz (d.h. das Gen) in einem geeigneten genetischen Kontext in diesem 

Bakterium vorliegen.Dazu muß das GFP-Gen in ausreichender Menge 

(µg) vorliegen und unter der Kontrolle eines von E.coli-RNA-Polymerase 

erkennbaren Promotors in einen Vektor (Plasmid,”Genfähre”)ligiert werden.Das 

neuentstandene Plasmid ist ein transportables genetisches Element,das 

mit Hilfe chemischer bzw. elektrischer Verfahren in eine Bakterienzelle 

eindringen kann(d.h. es transformiert die Zelle). 

Bei der Vermehrung repliziert E.coli auch die zusätzlich vorhanden,plasmidcodierte 

genetische Information und ermöglicht deren Expression zum Protein. 

im Idealfall fluoreszieren die mit einem GFP-Plasmid transformierten 

E.coli-Zellen leuchtendhellgrün. 

1 Einige Referenzen zum Thema GFP 

(http://www.cryst.bbk.ac.uk/PPS2/projects/jonda/index.htm ) 

(http://www.rpc.edu/cbm2/gfp1.htm) 

(http://faculty.washington.edu/cemills/Aequorea.html)

2 GEWINNUNG DES GFP-CODIERENDEN GENS 5 

2 Gewinnung des GFP-codierenden Gens 

2.1 06.März 2006 

2.1.1 PCR 

Einleitung 

Die PCR (Polymerase Chain Reaction, Polymerase Kettenreaktion) ist eine 

Methode um DNA zu vervielfältigen, ohne auf lebende Organismen 

zurückgreifen zu müssen. Zum anderen ist sehr vorteilhaft, dass dieses 

Verfahren sehr wenig Ausgangsmaterial benötigt (in einigen Fällen ist nur 

ein einzelner DNA - Strang nötig). 

Der zu kopierende Teil der Ausgangs - DNA wird durch einen Primer 

festgelegt, welcher den Anfang und das Ende festlegt. Der PCR Prozess 

besteht aus drei Teilen: 

1.Melting 

2.Annealing 

3.Elongation 

Bei jedem Durchlauf dieser drei Schritte wird die DNA verdoppelt. Somit 

beträgt das maximale Wachstum für diese Methode 2n, da sowohl sense 

als auch anti-sense Strang kopiert werden können (in einem Durchlauf). 

Durch PCR ist es möglich, einen Teil eines Gens oder auch ein ganzes Gen 

zu klonieren. 

Material 

• Matrize: Plasmid pQB163(Quantum Biotechnology) 

• Primerpaar: GFP04F,GFP04R 

• Nucleotid-Mix aus dATP,dGTP,dCTP und dTTP,jeweils 10 mM(Fermentas) 

PCR-Puffer liegt als 10X-Puffer vor und enthält 500 mM KCL,100 mM Tris- 

HCL,pH 8.3 @25 ◦ C,15mM MgCl 2 ,0.01% (w/v) Gelatine (Applied Biosystems) 

• Tag-DNA-Polymerase(selbst präpariert) 

• Wasser (HPLC-Qualität) 

• PCR-Maschine(Eppendorf) 

Reaktionsansatz


Material für 1 Ansatz für 5+1 Ansätze 

Wasser 80µl 480µl 

10X-PCR-Puffer 10µl 60µl 

Matrize:pQBI63 1µl 6µl 

dNTP-Mix 2µl 12µl 

GFP04F 2,5µl 15µl 

GFP04R 2,5µl 15µl 

Tag-Polymerase 1µl 6µl 

Durchführung 

• alle Reagenzien bis auf die Polymerase kurz vortexen,zentrifugieren und 

in ein 1,7ml-Gefäß pipettieren,Mischung vortexen,kurz anzentrifugieren 

und in fünf 99µl-Aliquots in 0,2ml-Gefäßen aufteilen. 

• Gefäße in die PCR-Maschine 

• Temperaturprogramm: 

Denaturierung : 

99 ◦ C 5 min 

4 ◦ C ∞(sound) 

• Gefäße auf Eis stellen,jeweils 1 mul Polymerase zugeben 

• Temperaturprogramme: 

30X 

Denaturierung: 94 ◦ C 120sec 

Annealing: 60 ◦ C 60sec 

Elongation: 72 ◦ C 60sec 

Abschluß : 

72 ◦ C 10min 

4 ◦ C ∞ 

Analytik 

Bewertung 

•siehen Analytische und präparative Gelelektrophorese 

•siehen Analytische und präparative Gelelektrophorese


2.1.2 Analytische und präparative Gelelektrophorese 

Einleitung 

Die wanderung geladener Moleküle im elektrischen Gleichstromfeld nennt 

man Elektrophorese. 

Aufgrund unterschiedlicher Ladung und Masse bewegen sich verschiedene 

Moleküle mit unterschiedlichen Geschwindigkeit. Meistens wird die 

relative Geschwindigkeit einer Substanz zu einem mitaufgetrennten Standard 

angegeben.Dadurch läßt sich das Wanderungsverhalten verschiedener 

Substanzen auch charakterisieren.Man unterscheidet elektrophoretische 

Trennmethoden in freier Lösung(z.B. Kapillarelektrophorese) von der 

Auftrennung in stabilisierenden Medien(Agarose,Polyacrylamid).Die Wahl 

des Trennmediums richtet sich nach der Art der zu untersuchenden Substanz.Die 

Elektrophorese in Agarosegelen eignet sich zur Auftrennung von 

Fragmenten doppelsträngiger DNA mit Kettenlängen von ca.100 bis 10.000 

Basenpaaren.Agarose ist ein Polysaccharid,das aus roten Meeresalgen gewonnen 

wird. 

Das Pulver wird in Elektrophoresepuffe aufgenommen (suspendiert) und 

durch Erhitzen auf über 80 ◦ C in Lösung gebracht.Die vielen Hydroxygruppen 

(OH-Grupen) ermöglichen die Ausbildung von Wasserstoffbrücken- 

Bindungen,durch die die erstarrte Gelmatrix ihre Festigkeit erhält.Während 

des Abkühlens laern sich die Doppel Helices aneinander und binden dann 

an andere Helices.Agarosegele sind großporige,sog. nich -restriktive Gele,bei 

denen die Molekülgröße eine deutlich geringere Rolle als die Ladung 

spielt.Sie sind einfach herzustellen, und man hat die Möglichkeit,nach erfolgter 

Auftrennung aus dem Gel Stücken kann man die Substanz(DNA) 

mit verschiedenen Methoden(z.B. durch Erwärmen)leicht wieder freisetzen. 

Material 

•Agarose 

•50X TAE-Puffer: Tris 2M 

Na-Acetat 1M 

EDTA 0.05M 

•6X-Probenladepuffer(Fermentas): Tris-HCL 10mM 

Bromphenolblau 0.03% 

Xylencyanol FF 0.03% 

Glycerin 60% 

EDTA 

60mM 

•1kb-DNA-Leiter (Fermentas). Fragmente: 250,500,750,1000,1500,2000, 

2500,3000,3500,4000,5000,6000,8000,10.000 Basenpaare 

•Elektrophoresekammer,Spannungsgeber 

•Färbebad mit Ethidiumbromid-Lösung(0,5 µ/ml) 

•Geldokumentationsanlage(UV-Transilluminator,CCD-Kamera)


•PCR Produkt aus vorangegangener Versuch. 

Reaktionsansatz 

0.8 g Agarosepulver werden mit 100 ml 10X TAE – Puffer 

Durchführung 

•0.8 g Agarosepulver werden mit 100 ml 10X TAE 

•Puffer vermischt und durch kochen (in Mikrowelle) aufgelost . 

•auf 50 ◦ C abgekuhlte Lösung wird in Geleinrichtung (mit Kamm fur Ladetaschen) 

gegossen und erkaltet (Dauer ca. 30 min). 

•Kamm entfernt und Geltaschen mit PCR Produkt gefullt; dazu 1 der 5 

Proben gewahlt und 5 µl PCR Losung mit 1 µl Bromphenolblau gemischt 

und in die Ladungstasche pipettiert 

•zusatzlich in die Randtaschen links und rechts DNA Leiter zur Analyse 

aufgetragen (je 2 µl) . 

•anlegen von 80 V konstanter Spannung ca. 30-45 min,bis Marker 2/3 der 

Laufstrecke erreicht hat; 

•dann Spannung abgeschaltet . 

•einfarben des Gels in Ethidiumbromid-Losung (0.5 µg/ml) ca. 25 min (danach 

in Wasser auswaschen), 

•damit DNA Fragmente sichtbar werden im UV Licht . 

•Gel wird photographiert. 

Analytik 

Bewertung es gibt ein bisschen weniger DNAs als die anderen Gruppe 

nach der PCR


2.2 07.März 2006 

2.2.1 Aufreinigung des PCR-Produkts 

Einleitung 

PCR-Produkte könne n mit verschiedenen Techniken von überschüssigen 

Primern,Nucleotiden,Pufferbestandteilen und Polymerase befreit werden. 

wir verwenden in diesm Praktikum das ”QIAquick PCR Purification Kit”der 

Firma Qiagen.Das Verfahren basiert auf der Tatsache,dass einzel- und doppelsträngige 

DNA (ab einer kettenlänge von ca.100 Nucleotiden bzw. Basenpaaren) 

in Gegenwart hoher Salzkonzentration an Silicagel bindet und bei 

niedriger Salzkonzentration wieder fregesetzt (= Eluiert) wird . Während 

die DNA gebunden ist,können Verunreinigungen,die nicht binden,effizient 

weggewaschen werden.Die Adsorption von Nucleinsäuren an Silicagel- 

Oberflächen ergfolgt ausschließlich in Gegenwart sog. chaotroper Salze 

(Vogelstein & Gillespie,1979),die die Struktur des Wassers modifizieren 

(Hamaguchi & Gillespie,1979).Die adsorption der DNA an Silicagel hängt 

darüber hinaus vom pH-Wert ab.Idealerweise sollte dieser im Bereich pH 

7,5 liegen(95% Adsorption). 

Material 

•5 PCR-Reaktionen vom Montag 

•1 QLAuick-Spin-Säule + Auffanggefäß 

•Puffer PB,PE,EB (Kit) 

•Tischzentrifuge 


Durchführung 

•Vereinigung der fünf PCR-Reaktionen,Verteilung auf zwei 1,7 ml-Gefäße 

(jeweils 250 µl) 

•Zugabe von 5 Volumina Puffer PB(=1250 µ pro Gefäß),vortexen 

•Binden der DNA: Spinsäule in ein 2 ml-Auffanggefäß geben,die Mischung 

aus Schritt 2 portionweise(ca 700µl) aufgeben und jeweils 60 ssec bei 13.000 

rp, (ca. 10.000g)zentrifugieren; Durchfluß jeweils verwerfen 

•Waschen:Aufgabe von 0.75 ml Puffer PE,Zentrifugation 60 sec bei 13.000 

rpm;Durchfluß wieder verwerfen 

•Spinsäule mit vollständig leerem Auffanggefäß zentrifugieren:Zentrifugation 

60 sec bei 13.000 rp,. Der Durchfluß wird verworfen.(Der Puffer PE enthält 

Ethanol,das vollständig von der Säule entfernt werden muss,da es nachfolgende 

enzymatische Reaktionen beeinflussen kann) 

•Elution:Spinsäule in ein sauberes 1,7 ml-Gefäß geben 

•Vorsichtig 50 µl Puffer EB in die Mitte der Membran pipettieren,dabei nicht 

mit der Pipettenspitze an die Membran gelangen.1 min stehenlassen,dann


zentrifugieren(60 sec,13.000 rpm).Die DNA sollte sich jetzt im Eluat befinden 

Analytik 

siehe DNA-Konzentrationsbestimmung mit dem Spektralphotometer 

siehe DNA-Konzentrationsbestimmung mit dem Spektralpho- 

Bewertung 

tometer


2.2.2 Bestimmung der DNA-Konz. mit dem Spektralphotometer 

Einleitung 

Die Konzentrationsbestimmung erfolgt über die Messung der Absorption 

(oder: optischen Dichte,OD).Nucleinsäure-Lösunggen(DNA,RNA)zeigen bei 

einer Wellerlänge von 260 nm ein ausgeprägtes Absorptionsmaximum.Das 

Maß der Absorption ist proportional zur Konzentration der Nucleinsäure 

in Lösung.Es gelten die folgenden Relation: 

Nucleinsäure OD 2 60 konzentration[µg/ml] 

dsDNA 1 50 

ssDNA[> 100 Nucleotide] 1 40 

ssDNA[< 100 Nucleotide] 1 35 

ssRNA 1 40 

Wir benutzen dazu ein Einkanal-Photometer(Beckman),in dem Probe und 

Referenz (Lösungsmittel) nicht gleichzeitig,sondern nacheinander vermessen 

werden.Die zu untersuchenden DNA-Proben werden 1:20 in Wasser 

verdünnt,in Quarz-Mikroküvetten gefüllt(Assistent!) und im Photometer 

plaziert. Mit diesem Gerät kann sowohl das Spektrum als auch nur punktuell(bei 

einer bestimmten Wellenlänge)gemessen werden. In der Regel 

nimmt man mindestens die OD-Werte bei 260 nm, 280 nm(Absorption von 

Proteinverunreinigungen)und 320 nm(Hintergrund) auf.Für die Konzentration 

mit Hife des Vedünnungsfaktors und dem für die doppelsträngige 

DNA spezifischen Multiplikationsfaktor(50 µg/ml=50 ng/µl) 

C(ng/µl)=OD 2 60× verdünnngung ×50 

Das Verhältnis OD 2 60/OD 2 80 spiegelt das Ausmaß an Reinheit bzw. 

Verunreinigung wider Liegt der Quotient zwischen 1,7 und 2,0 ,handelt es 

sich um eine gut aufgereinigte DNA-Lösung. 

Material 

•DNA-Probe 

•deionisiertes Wasser 

•Mikroküvette 

•UV/Vis-Sektraphotometer Beckman DU-530 

•Küvettenständer 


Durchführung 

•95 µl Wasser in einem 1,7 ml-Gefäß vorlegen 

•5 µl Probe zufügen,gut mischen(vortexen). Beschriften Sie das Gefäß mit


”P”(für Probe) und Ihrer Gruppennummer 

•Probe in eine Mikroküvette pupetitieren (Assistent) •Aufnahme eines 

Spektrums 

•Aufnahme der Daten bei 260 nm,280 nm,320 nm 

•Berechnung der DNA-Konzentration und DNA-Ausbeute sowie der Reinheit 

Analytik 

Wellerlänge[nm] Intensität[ABS] 

260 0.046 

280 0.023 

320 0.006 

•Konzentration c = (0.046 − 0.06) = 40µg/ml 

Bewertung 

es gibt aber nur weniger DNAs nach der Reinigung.

3 GEWINNUNG DES KLONIERUNGSVEKTOR PQE30 13 

3 Gewinnung des Klonierungsvektor pQE30 

3.1 06,März,2006 

3.1.1 Herstell. und Sterilisation von Flüssignähhrm. 

Einleitung 

Material 

•Trpton 

•Hefeextrakt 

•NaCl 

•deionisiertes Wasser 

•5 Falcon 2059-Kunststoff-Röhrchen 

•100ml Erlenmeyer-Kolben,Becherglas,Meßzylinder 

•sterile Pipette,Pipetterhilfe 


Durchführung 

•0.25 g Trypton, 0.125 g Hefeextrakt, 0.25 g NaCl in 25 ml H 2 O gelöst und 

in Flasche gefüllt 

•20 min erhitzt auf 121 ◦ C mit 1 atm Überdruck (Sterilisation im Autoklaven) 

•abkühlen lassen und zu je 5 ml – Aliquots in sterile Röhrchen pipettiert 

•Röhrchen kühl gestellt bis zum nächsten Tag 

Analytik 

Bewertung 

3.2 07,März,2006 

3.2.1 Ansetzung übernachtkultur 

Einleitung 

Plasmid sind zirkuläre,extrachromosomale DNA-Moleküle,die sich i einer 

Zelle autonom vermehren können.Sie kommen in vielen Bakerien natürlich 

vor und verfügen oft über ein Transfersystem,das eine effiziente Ausbreitung 

dieser(konjugativen)Plasmide innerhalb einer Bakterienpopulation 

erlaubt.Viele der natürlich vorkomenden Plasmiden sind sogenannte


Plasmidvektoren entwickelt worden,die sich durch folgende Eigenschaften 

auszeichnen:Sie sind klein,haben (in der Regel) eine hohe Kopienzahl und 

besitzen im allgemeinen nur noch ein für die Selektion notwendiges Resistenzgen 

sowie den sog. Replikationsursprung für ihre Vermehrung. Aus 

Gründen der biologischen Sicherheit fehlen in Vektoren alle Sequenzbereiche,die 

für die Übertragung auf andere Stämme notewendig sind, d.h. diese 

Plasmide können sich nicht mehr durch Konjugation übertragen und sind 

auch durch andere konjugative Plasmide nicht mobilisierbar. Zur Erleichterung 

von Klonierungsexperimenten tragen Vektoren meist eine künstlich 

eingefügte Region, die eine Reihe von singulären Restriktionsschnuttstellen 

enthält (Polylinker,multiple cloning site) . manche Vektoren enthalten 

darüber hinaus noch Sequenzabschnitte, die für eine erfolgreiche Expression 

klonierter Gene erforderlich sind, wie z.B. Promotoren und Termnatoren. 

Moderne Vektoren sind kommerziell erhältlich (alte häufig auch über nationale 

Stammsammlungen wie die DSMZ ; http://www.dsmz.de/). 

Wir verwenden in diesem Praktikum den Expressionsvektor pQE30 der 

Firma Qiagen (Abb.7),der im E.coli-Stamm SURE der Firma Stratagene vorliegt. 

Der Vektor wird in ausreichender Menge gewonnen, wenn man den 

Stamm SURE/pQE30 vermehrt(kultiviert) und anschließend das Plasmid 

aus diesen Zellen isoliert und aufreinigt. Die Kultivierung von Bakterien 

beginnt ausgehend von einer Stamm- bzw. Dauerkultur,die Bakterien in 

einer 50%igen Glycerin-Suspension enthält und bei -80 ◦ C gelagert wird. 

Aus dieser Kultur wird eine kleine Menge entnommen,auf Agarplatten 

ausgestrichen und bei 37 ◦ C inkubiert. Nach ca.15 h sind kleine Kolonien 

gewachsen,die als inokulat(= Impfmaterial)für die hier anzusetzenden 

Flüssigkulturen dienen, um nur sokce Zellen zu selektieren,die tatsächlich 

dieses Plasmid tragen,muß die Kultivierung unter Zusatz des Antibiotikums 

Ampicillin erfolgen,da pQE30 den Zellen eine Amplicillin Resistenz 

vermittelt(Gen: bla, β-Lactamase). 

Material 

•Verdünnungsausstrich SURE/pQE30 

•Falcon-Röhrchen mit 5 ml LB-Medium 

•Ampicillin-Stammlösung(100mg/ml) 

•sterile Zahlstocher 

•Schüttelinkubator,37 ◦ C 


Durchführung 

•Untersterilen Bedingungen(Sterilbank)werden dem LB-Medium 5µl der


Ampicillin-Stammlösung zugesetzt(Verd. 1:1000; Endkonzentration 100µg/ml). 

•Mit einem sterilen Zahnstocher wird eine Kolonie entnommen und in das 

FalconRöhrchen überführ. Anschließend wird das Röhrchen mit dem Deckel 

verschlossen (der Deckel ist noch beweglich) 

•Kultivierung über Nacht bei 37 ◦ C,225 rpm. 

Analytik 

Bewertung 

3.3 08,März,2006 

3.3.1 Plasmid-Päparation von pQE30(Alkalische Lyse) 

Einleitung 

Viele Methoden zur Isolation von Plasmid-DNA aus Bakterien wie z.B. die 

Cäsiumchloridgradienten-Zentrifugation nutzen die zirkuläre Natur und 

geringe Größe der Plasmide zur gewinnung von DNA in guter Qualität und 

Reinheit. In diesem Kurs soll eine Plasmid-Präparation mit Hilfe des QIAprep 

Miniprep Kits der Fa.Qiagen durchgeführt werden.Dabei werden die 

Bakterein zunächst durch Behandlund mit NaOH und Natriumdodecylsulfat(SDS) 

Lysiert,bevor in weiteren Schritten weitere Zelluläre Bestandteile 

abgestrennt bzw. zerstört werden,die - verglichen mit der Plasmid-DNA - 

in großen Mengen vorliegen(RNA,Proteine)und nachfolgende Reaktionen 

beeinflussen könnten. Bei realtiv vorsichtiger Lyse der Zellen wird das Bakterienchromosom 

nicht zerstört und kann durch Zentrifugation abgetrennt 

werden. Die im großen Überschluß vorhandene RNA wird durch Einwirkung 

des Enzyms Rnase I abgebaut. Die weitere Reinigung der Plasmid- 

DNA erfolgt ähnlich wie die bereits durchgeführte Aufreinigung des PCR- 

Produkts mit Hilfe von Spinsäulen. 

Material 

•Puffer p1,p2,N3,PE 

•Qiaprep Spinsäule mit Sammelgefäß 

•Puffer EB(10 mM Tris-HCL,pH 8.5 

Reaktionsansatz


Durchführung 

•von Ubernachtkultur, die 16 - 20 h stand, 1.5 ml unter Sterilbank in 1.7 ml 

Gefas pipettiert und 5 min bei 6000 rpm und 4 ◦ C zentrifugiert . 

•Zentrifugieren: 5 min,6.000 rpm,4 ◦ C 

•überstand abnehmen und in einem separaten Gefäß aufbewahren; die Reste 

durch AUtokavieren zerstört werden! 

•Zum Bakterienpellet weitere 1,5ml der Übernachtkultur geben und zentrifugieren: 

5 min,5.000 rpm; Orientierung des Gefäßes in der Zentrifuge 

beibehalten! 

•Überstand abnehmen s.o. 

•Zum Bakterienpellet noch einmal 1,5ml Übernachtkultur geben und zentrifugieren: 

5 min,5.000 rpm; Orientierung des Gefäßes in der Zentrifuge 

beibehalten! 

•überstand abnehmen s.o. 

•Erhaltenes Bakterien pellet in 250µl Puffer P1 resuspendieren(mit einer 

Pipette vorsichtig auf- und abbewegen); es sollten keine Zellklumpen mehr 

zu sehen sein 

•250µl Puffe rP2 zugeben,durch 4-6 maliges ”Kippen”des Gefäßes mischen(NICHT 

VORTEXEN!) und max. 5 min bei RT inkubieren; anschließend 

350 µl Puffer N3 zugeben und schnell,daber vorsichtig durch 4-6 

maliges ”Kippen”des Gefäßes mischen (ein dicker weißer Niderschlag sollte 

entstehen) 

•Anschließend zentrifugieren: 10 min, 13.000 rpm, RT 

•Eine QIAprep-Spinsäule mit AUffanggefäß bereitstellen,Überstand abnehmen 

und in SPinsäule geben. 

•Zentrifugieren: 1 min, 13.000 rpm;Durchfluß verwerfen •Spinsäule mit 

leerem Auffanggefäß zentrifugieren(1 min, 13.000 rpm), um Alkoholreste 

aus PE zu entfernen,die im Eluat nachfolgende enzymatische Reaktionen 

stören könnten;Durchfluß verwerfen 

•Elution:Spinsäule in ein frisches 1,7ml-Gefäß stellen 

•Vorsichtig 50µl Puffer EB in die Mitte der Membran pipettieren,dabei nicht 

miut der Pipettenspitze an die Membran gelangen, 1 min stehen lassen, 

dann 1 min bei 13.000 rpm zentrifugieren:Die DNA sollte sich jetzt im Eluat 

befinden 

Analytik 

Kontrolle der Präparation: 

•Spektrophotometrische Konzentrationsbestimmung(vgl. Dienstag). 

Wellerlänge[nm] Intensität[ABS] 

260 0.050 

280 0.033 

320 0.021


•Konzentration c = (0.050 − 0.021) = 29µg/ml 

•Agarose-Gelelektrphorese(vgl.Montag). 

Bewertung

4 RESTRIKTIONSVERDAU SOWIE DEPHOSPHORYLIERUNG 18 

4 Restriktionsverdau sowie Dephosphorylierung 

4.1 08,März,2006 

4.1.1 Restriktionsverdau von PCR-Produkt 

Einleitung 

In diesem Praktikum werden der Vektor pQE-30 sowie das PCR-amplifizierte 

GFP-Gen mit den Enzymen BamHI und PstI geschnitten. Damit werden lineare 

Fragmente mit verschiedenen, nicht kompatiblen Enden erhalten, die 

die Wahrscheinlichkeit einer Aneinanderlagerung zu Ketten deutlich verringern 

(”forced cloning”). Zusätzlich wird der Vektor nach der Linearisierung 

dephosphoryliert (d.h., die endständigen Phosphatgruppen werden 

hydrolysiert), damit der Vektor nicht ohne Insertion des zu klonierenden 

Gens zirkularisieren kann. 

Material 

(1)Ansatz für die Verdaus von pQE30 und GFP-Gen 

•gereinigtes Plasmid pQE30 

•gereinigtes PCR-Produkt 

•Restriktinsenzyme Pstl(MBI;10U/µl)und BamHL(MBI;10U/µ) 

•Alkalische Phosphatase(AP=Alkaline Phosphatase;Roche;1U/µ) 

•10X-Retriktionspuffer BamHL + (MBI);Zusammensetzung: 

•10mM Tris-HCL(pH 8,0 @37 ◦ C) 

•5mM MgCl 2 

•100 mM KCL 

•0,02% Triton X-100 

•0,1 mg/BSA 

•10X-Dephosphorylierungspuffer (Roche);Zusammensetzung: 

•0.5M Tris-HCL(pH8,5 @20 ◦ C) 

•1mM EDTA 

•Chloroform p.a.(Merck) 

•70% Ethanol p.a.(v/v) 

•3M Natriumacetat,oH7,0 @ 25 ◦ C(CH 3 COO − Na + ) 

•Wasser(HPLC-Qualität) 

•Brutschrank oder Wasserbad@ 

•Heizblock @ 80 ◦ C 


Verdau von pQE30


Vektor pQE30 4µg 

BamHl + -Puffer(10X) 10µl 

Restriktionsenzym BamHl(10U/µl) 0.5µl 

Restriktionsenzym Pstl(10U/µl) 1.0µl 

Wasser(HPLC-Qualität) ad 100µl 

Verdau des GFP-Gens 

GFP-Gen(=Insert) 4µg 

BamHl + -Puffer(10X) 10µl 

Restriktionsenzym BamHl(10U/µl) 0.5µl 

Restriktionsenzym Pstl(10U/µl) 1.0µl 

Wasser(HPLC-Qualität) ad 100µl 

Durchführung 

•GFP Gen(PCR-Produkt): 40 µ eigenes Material ( 29µg/µl) und 16µl ca 

2.4µug vom Assistenten bekommen 

•pQE30(Vektor) alle ca. 4µg (16.1µl 249µl) von gruppe 5 

•Vektor und GFP-Gen werden getrennt,d.h. in zwei verschiedenen Reaktionsgefäßen 

verdaut: Im ersten 1,7 ml -Gefäß wird as GFP-Gen mit Pstl und 

BamHL verdaut, im zweiten 1,7 ml -Gefäß der Vektor pQE30 mit den gleichen 

Enzymen.Gefäße entsprechend(lesbar) mit wasserunlöslichem Stift 

beschriften,dann auf Eis platzieren! 

•Pipettieren Sie gemäß der oben angegebenen Schemata,beginnend mit 

Wasser,die einzelnen Komponenten ohne die Restriktionsenzyme in die jeweiligen 

1,7ml-Gefäße 

•Die Restriktionsenzyme werden ca.3 sec gevortext und anschließend sofort 

wieder auf Eis gestellt(Enzyme immer kühlen,nie bei Raumtemperatur 

stehen lassen!) 

•Zugabe der Restriktionsenzyme zu den beiden Ansätzen 

•Inkubation für 2h bei 37 ◦ C im Brutschrank oder Wasserbad 

•nach Ablauf der 2h werden die Restriktionsenzyme beider Ansätze bei 

80 ◦ C im Heizblock für 10 min inkubiert,um die Enzyme zu inaktivieren 

•Beide Ansätze auf Eis bzw. im Tiefkühlschrank bis zur weiteren Verwendung 

lagern 

Analytik


Bewertung 

4.2 9,März,2006 

4.2.1 Dephosphorylierung des Vektors 

Einleitung


Material 


gesamter Restriktionsansatz pQE30 100 µl 

10X-Dephosphorylierungspuffer 12 µl 

Alkalische Phosphatase 

1 U/µl 

Wasser(HPLC-Qualität) 7 µl 

Durchführung 

•Die Dephosphorylierung wird im gleichen 1,7 ml-Gefas durchgefuhrt, 

in dem auch der Vektor verdaut wurde, d.h. Puffer und CIAP werden in 

den 100 µl-Ansatz hineinpipettiert! 

•Gefas auf Eis platzieren, Wasser und Puffer zugeben. 

•Alkalische Phosphatase ca. 3 sec vortexen, angegebene Menge Enzym zum 

Reaktionsansatz pipettieren; das Enzym danach bitte sofort wieder bei in 

den Kuhlschrank. (4 ◦ C) stellen; die Phosphatase darf nicht eingefroren werden! 

•Reaktionsansatz 30 min bei 37 ◦ C im Brutschrank inkubieren. 

•Nach Beendigung der Reaktion wird die Phosphatase im Heizblock thermisch 

inaktiviert: 10 minutiges Erhitzen auf 80 ◦ C; Ansatz anschliesend auf 

RT abkuhlen lassen. 

•Entfernung der Enzyme durch Phenol-Chloroform-Extraktion : Zugabe 

von 120 µl Phenol bei pQE-30 bzw. 100 µl bei GFP-Gen, 60 sec vortexen. 

•Zentrifugieren: 60 sec bei 13.000 rpm. 

•Mit einer 200 µl-Pipette wird die obere, wassrige Phase moglichst vollstandig 

abgenommen und in ein frisches Gefas uberfuhrt. Passen Sie dabei 

auf, kein ausgefalltes Protein von der Phasengrenze in die wassrige Phase 

zu verschleppen. 

•Die Phenol-Phase wird entsorgt (halogenfreie Losungsmittel). 

•Zugabe von 120 µl Chloroform bei pQE-30 bzw. 100 µl bei GFP-Gen zur 

wassrigen Phase (Entfernung von Phenolresten), 60 sec vortexen. 

•Zentrifugieren: 60 sec bei 13.000 rpm. 

•Wieder wird die obere, wassrige Phase abgenommen und in ein frisches 

1,7 ml-Gefas uberfuhrt; die organische Phase wird entsorgt (halogenhaltige 

Losungsmittel). 

•Lagern Sie den Ansatz bis zur weiteren Verwendung im Gefrierschrank 

oder auf Eis.


Analytik 

Bewertung 

4.2.2 Ethanolfällung von pQE30 und GFP-Gen 

Einleitung 

Bestimmen Sie zunachst das Volumen der wassrigen Losung von pQE-30 

(nach der Phenol-Chloroform Extraktion) mit Hilfe Ihrer Pipette: Stellen 

Sie dazu eine 200 µl-Pipette exakt auf 120 µl ein. Nehmen Sie dann die 

wassrige pQE-30-Losung auf und drehen Sie so lange an der Volumen- 

Einstellschraube der Pipette, bis die untere Phasengrenze der Losung bundig 

mit der Pipettenspitze abschliest. Lesen Sie das angezeigte Volumen ab 

und berechnen Sie den Reaktionsansatz. 


(a)Fällung GFP pQE30 

wäßrige DNA-Lösung X 85 µl 102 µl 

100% Ethanol 2, 5 × X 212.5 µl 255 µl 

3M Natriumacetat 0.1 × X 8.5 µl 10.2 µl 

(b)Waschen der gefällten DNA 

70% Ethanol 2.5 × X 212.5 µl 255 µl 

Durchführung 

•In zwei parallelen Ansätzen wird die DNA von Vektor (pQE-30) und 

GFP-Gen in getrennten Gefäßen gefüllt. Die Durchführung wird allgemein 

beschrieben und gilt für beide Füllungen. Bitte alle Gefäße entsprechend 

beschriften! 

•Zugabe von Ethanol und Natriumacetat-Lösung, vortexen. 

•Gelelektrophorese mit pQE-30 (siehe Montag, 1. Woche, II. statt PCR- 

Produkt den Vektor pQE-30 benutzen) 

•Inkubation beider Fällungsansatze über Nacht bei -20 ◦ C. 

•Weiter am folgenden Tag. 

Analytik


Bewertung 

4.3 10,März,2006 

4.3.1 Fortsetzung der Reinigung von Vektor pQE30 und PCR-Produkt 

Einleitung 

siehe vorhier 

Material 

siehe vorhier 


siehe vorhier 

Durchführung 

•Die 1,7 ml-Gefase werden mit passenden Adaptern in eine auf 4 ◦ C vorgekuhlte 

Zentrifuge gestellt: Markieren Sie, welche Seite des Gefases nach 

ausen zeigt, und spater das DNA-Pellet wieder zu finden! 

•Zentrifugation bei 13.000 rpm, 4 ◦ C, 30 min. 

•Der Uberstand wird vorsichtig dekantiert (= abgegossen); man orientiert 

sich dabei an der gesetzten Markierung, um die gefallte DNA nicht zu 

verlieren. Restliche Ethanoltropfen werden vorsichtig vom Gefasrand mit 

einem Papiertuch (Kleenex) abgenommen. 

•Waschen des Pellets: Zugabe 500 für von 70 %igem Ethanol, 10 sec vortexen 

(Entfernung von Salzresten). 

•Zentrifugation: 13.000 rpm, 4 ◦ C , 20 min. 

•Uberstand erneut vorsichtig dekantieren, Reste an Flussigkeit am Gefasrand 

entfernen. 

•Trocknung der Pellets: ca. 5 min mit offenem Deckel stehen lassen. 

•Losung: Zugabe 30 µ1 Wasser- zum Losen der DNA das Gefas mehrmals 

mit dem Finger antippen (darauf achten, dass das Pellet auch wirklich gelost 

ist!). 

•Verdautes und gereinigtes GFP-Gen: spektrophotometrische Konzentrationsbestimmung 

(vgl. Dienstag). 

•Anschliesend Lagerung bei -20 ◦ C. 

•Fur den verdauten, dephosphorylierten Vektor schliest sich eine praparative 

Reinigung durch Agarose-Gelelektrophorese an, durch die das ausgeschnittene 

Fragment entfernt wird. 

Analytik


Bewertung 

4.3.2 Aufreinigung des Vektors pQE30 durch präparative Agarose - Gelelektrophorese 

Einleitung 

Da das aus dem Vektor pQE-30 herausgeschnittene Fragment bei der anschließenden 

Neuverknüpfung (= Ligation) mit dem geschnittenen Gen 

stört, muss dieses vor der Ligation entfernt werden. Dazu trennt man die 

von Enzymen befreite und aufkonzentrierte DNA in einem Agarosegel auf, 

bei dem man anstelle einer kleinen Ladetasche eine breite Ladetasche benutzt, 

die durch Abkleben mehrerer SZähne”des Kamms entsteht. Nach 

beendeter Auftrennung wird die Bande des Vektors mit Ethidiumbromid 

sichtbar gemacht und unter UV-Beleuchtung mit einem Skalpell ausgeschnitten. 

Aus der Agarose extrahieren wir die DNA wieder mit einem 

”Kit”, das analog zu dem am Dienstag verwendeten aufgebaut ist. 

Material 

•Vektor pQE-30 (nach Ethanolfallung): ca. 30 µl 

•QIAquick Gel Extraction Kit (Puffer QG, Puffer EB, Puffer PE, Spin-Saulen), 

Qiagen. 

•1,7 ml-Gefase . 

•Heizblock @ 50 ◦ C 

•0,8 %ige Agaroselosung in 1X TAE-Puffer . 

•DNA-Leiter . 

•6X-Probenpuffer . 

•Elektrophoreseapparatur . 

•sauberes Skalpell . 

•Gel-Dokumentationsanlage mit UV-Transilluminator . 

•EtBr-Bad zum Farben (vgl. Hinweise unter Agarose-Gelelektrophorese, 

Montag) 


Durchführung 

•Zugabe von 6 µl 6X-Probenpuffer zur Losung des verdauten und gereinigten 

Plasmids pQE-30. 

•Abkleben von ca. 2-4 Taschen des Kammes der Agarose-Gies-Apparatur; 

Giesen eines 0,8 %igen Agarosegels. 

•Der kompletten Ansatz aus vorgereinigtem Vektor und Probenpuffer (36


µl) wird vorsichtig in die entstandene breite Ladetasche gefullt. Zur Langenbestimmung 

wird rechts und links davon eine DNA-Leiter aufgetragen. 

•Elektrophorese (mit ca. 45µl) bei 60-70 V, ca. 1 h. Anschliesend Farben des 

Gels mit EtBr (vgl. Montag). 

•Auswiegen eines leeren 1,7 ml-Gefases, Notieren des Wertes. Gewicht von 

leerem 1,7 ml-Gefas = 1,090 g . 

•Legen Sie das Agarosegel auf den UV-Transilluminator und reduzieren 

sie die Intensitat des UV-Lichtes auf 70% (Wohlschalter am UV-Tisch). Zur 

Vermeidung von DNA-Schaden sollte die DNA moglichst kurz dem energiereichen 

UV-Licht ausgesetzt sein. 

•Schneiden Sie mit einem sauberen und schaden Skalpell die 3400 bp-Bande 

des geschnittenen Vektors aus dem Agarosegel aus und uberfuhren Sie das 

Agarose-Stuck in Ihr ausgewogenes 1,7 ml-Gefas. Passen Sie darauf auf, 

moglichst genau zu schneiden, um uberschussige Agarose bei der Aufreinigung 

zu vermeiden. Arbeiten Sie moglichst schnell und tragen sie die 

bereitgelegte Schutzausrustung (Handschuhe, Maske)! 

•Wiegen Sie das Gefas mit dem Agarose-Stuck erneut und ermitteln Sie das 

Gewicht der Agarose. Gewicht von 1,7 ml-Gefas mit herausgeschnittenem 

Agarose-Stuck = 1.09 g Gewicht von herausgeschnittenem Agarose-Stuck 

= 0,101 g . 

•Geben Sie pro 100 mg Agarose 300 µl Puffer QG zu. 

•Puffer QG: 303 µl . 

•Inkubieren Sie die Suspension 10 min im vorgeheizten Thermoblock (50 ◦ C). 

Nehmen Sie das Gefas alle 2 min aus dem Heizblock heraus und vortexen 

Sie 10 sec; dies fuhrt zu einer schnelleren Auflosung der Agarose. 

•Die aufgeloste Agarose wird in eine komplette Spin-Saule (bestehend aus 

einer violetten Saule und einem farblosen 2ml-Sammelgefas) pipettiert. 

•Zentrifugation der Saule bei 13.000 rpm, Raumtemperatur (RT), 1 min. 

•Ziehen Sie das Sammelgefas von der Spinsaule ab und verwerfen Sie den 

Durchfluss. 

•Das Sammelgefas wird wieder auf die Saule geschoben. Zugabe von 500 µl 

Puffer QG (um noch vorhandene Agarosereste von der Saule zu waschen). 

•Zentrifugation der Saule bei 13.000 rpm, RT, 1 min. 

•Durchfluss verwerfen (s.o.), Sammelgefas wieder auf die Saule schieben. 

•Waschen: 750 µl Puffer PE auf die Saule geben und zentrifugieren (13.000 

rpm, RT, 1 m in). 

•Durchfluss aus dem Sammelgefas vollstandig abgiesen, Sammelgefas auf 

die Saule schieben. 

•Erneut zentrifugieren (13.000 rpm, RT, 1 min), um Reste von Puffer PE zu 

entfernen. 

•Setzen Sie die Saule in ein frisches 1,7 ml-Gefas und werfen Sie das vorherige 

Sammelgefas weg. 

•Zugabe von 30 µ1 Puffer EB direkt auf die Membran. 1 min am Platz stehen 

lassen. Die Membran darf nicht mit der Pipettenspitze beruhrt werden !


•Zentrifugieren Sie die Saule mit 1,7 ml-Gefas (13.000 rpm, RT, 1 min). 

•Das Eluat (ca. 28 µl) im 1,7ml-Gefäß enthalt die aufgereinigte Plasmid- 

DNA. Die Saule kann nun weggeworfen werden. 

•Spektrophotometrische Konzentrationsbestimmung (vgl. Dienstag). 

•Der Vektor wird bei -20 ◦ C im Tiefkuhlschrank gelagert. 

Analytik 

Gelanalyse 

Spektrophorese 

320nm 

280nm 

260nm 

0.015ABS 

0.025ABS 

0.048ABS 

Vektor konzentration ist 33µg/µl 

Bewertung

5 LIGATION VON GESCHNITTENEM VEKTOR PQE30 UND GFP-GEN27 

5 Ligation von geschnittenem Vektor pQE30 und GFP- 

Gen 

5.1 10,März,2006 

5.1.1 Ligation von geschnittenem Vektor pQE30 und GFP-Gen 

Einleitung 

Der entscheidende Schritt bei einer Klonierung ist die Ligation, d.h., die kovalente 

Verknupfung von Vektor-DNA und zu insertierendem Gen. Diese 

Reaktion (Knupfung von Phosphordiester-Bindungen) erfolgt mit Hilfe einer 

Ligase. Eine wichtige Rolle spielt bei dieser Reaktion die Konzentration 

der beiden Reaktionspartner, die ja nicht zu langen Ketten hintereinander 

gehangt werden, sondern zu einem zirkularen Molekul verknupft werden 

sollen. Nach Dugaiczyk (1975) wird die Vektorkonzentration j, bei der die 

Wahrscheinlichkeit fur die intramolekulare Ligation optimal ist, wie folgt 

berechnet: 

√ 

i[µg/µg Ligationslösung]= 

51.1 

MW Vektor 

Zusatzlich muss beachtet werden, dass bei einer Ligationsreaktion das 

stochiometrische Verhaltnis von Insert- und Vektor-DNA 1:1 bis 3:1 betragen 

soll (ideal ist ein leichter Uberschuss an Insert-DNA). Eine Ligation 

wird - je nach verwendetem Enzym, Puffersystem und Schwierigkeit der 

Reaktion - bei Temperaturen zwischen 4 ◦ C und 25 ◦ C durchgefuhrt und 

dauert zwischen 10 min und 15 h (uber Nacht). Direkt im Anschluss an die 

Ligation erfolgt i.a. die Transformation in kompetente Zellen. Ligationsreaktionen 

konnen aber auch eingefroren und spater transformiert werden. 

Material 

•Vektor: pQE-30, geschnitten mit BamHI und PstI, dephosphoryliert. 

•Insert: GFP-Gen, geschnitten mit BamHI und PstI. . T4-DNA-Ligase, 3 U/µl 

(Promega). 

•10X T4-DNA-Ligase-Puffer (Promega): 300 mM Tris-HCI (pH 7,8), 100 mM 

MgCl2, 10 mM ATP. 

•Wasser (HPLC-Qualitat). 

•Isoliergefas mit Eis. 

•0,75 ml-Reaktionsgefase. 

•PCR-Maschine (Eppendorf). 

•Heizblock @ 55 ◦ C. 

Reaktionsansatz


linearisierter Vektor pQE30 200ng(=90fmol) 6.1 µl 

geschnittenes GFP-Gen 85ng(=180fmol) 0.7 µl 

T4-DNA-Ligase-Puffer(10X) 2 µl 

T4-DNA-Ligase(3U/µl) 1 µl 

Wasser(HPLC-Qualität) ad 20 µl 

Durchführung 

Um eine möglichst hohe Ligationseffizienz zu erzielen, werden Vektor 

(V) und Insert (I) bei der Ligation im Verhältnis V : I = 90 fmol : 180 fmol 

eingesetzt (1 fmol = 10-15 mol). Bitte errechnen Sie anhand der ermittelten 

Konzentrationen für Insert und Vektor die jeweils einzusetzenden Volumina 

(vgl. allg. Ligationsansatz). 

•Pipettieren Sie Vektor und Insert in ein 0,75 ml-Reaktionsgefäß und erhitzen 

Sie den Ansatz für 3 min auf 55 ◦ C; dies soll etwaige unspezifische 

Bindungen zwischen den einzelnen DNA-Fragmenten aufschmelzen. 

•Nach Ablauf der 3 min wird der Ansatz für 1 min auf Eis abgekühlt. 

•Zentrifugation 1 min bei 13.000 rpm, um Kondensat am Deckel wieder 

in das Reaktionsvolumen zurückzuführen. Gefäß anschließend wieder auf 

Eis stellen. 

•Zugabe von Wasser und Ligase-Puffer. 

•Ligase ca. 3 sec vortexen, danach sofort wieder auf Eis stellen (Enzyme nie 

bei Raumtemperatur stehen lassen, immer kühlen!). 

•Ligase zum Reaktionsansatz geben, vortexen, kurz anzentrifugieren. 

•Inkubation bei 12 ◦ C im PCR-Block über Nacht. 

•Am Folgetag (Sonnabend) wird der Ligationsansatz bei -20 ◦ C bis zur weiteren 

Verwendung gelagert. 

Analytik 

Bewertung 

5.2 13,März,2006 

5.2.1 Agarose-Gel für Ligation 

Einleitung 

siehe vorher 

Material 

siehe vorher



siehe vorher 

Durchführung 

siehe vorher 

Analytik 

Bewertung

6 TRANSFORMATION 30 

6 Transformation 

6.1 09,März,2006 

6.1.1 Gießen von Nährmedium im Petrischalen 

Einleitung 

Für die Vermehrung von transformierten Bakterien benötigen wir feste 

Nährmedien - die sog. Agar-Platten. Wir verwenden wiederum Luria- 

Bertani-(LB)-Medium, dem Ampicillin zur Selektion von Plasmid-tragenden 

Bakterien zugesetzt wird. Durch Zugabe von Agar-Agar geliert das Nährmedium 

bei Abkühlung auf Raumtemperatur. Da Ampicillin nicht thermostabil ist, 

kann das antibiotikum dem noch flüssigen Medium erst nach dem Sterilisieren 

und Abkühlung auf ca. 55 ◦ C zugefügt werden. 

Material 

•Trpton 

•hefeextrakt 

•NaCl 

•Agar-Agar 

•deionisiertes Wasse 

•Ampicillin-Stammlösung(100mg/ml) 

•Waage 

•Meßzylinder 

•Erlenmeyerkolben 


Ansatz für 100ml LB-Agar, ausreichend für 4-5 platten: 

Trpton 1.0g 

Hefeextrakt 0.5g 

Nacl 1.0g 

Agar-Agar 2.0g 

deionisiertes Wasser ad 100ml 

Durchführung 

•Der pH-Wert des Mediums muss mit 5 N NaOH auf pH 7,0 eingestellt 

werden. 

•Autoklavieren (=Dampfsterilisieren) des Mediums. 

•Nach der Sterilisation lasst man das Medium auf 55 ◦ C abkuhlen (man 

kann es gerade anfassen, ohne sich die Finger zu verbrennen) und gibt 

Ampicillin bis zu einer Endkonzentration von 100 f Êg/ml zu. 

•Das warme Nahrmedium wird unter sterilen Bedingungen (Sterilbank) in 

Petrischalen gegossen (ca. 20 ml pro Petrischale)


•Nach Aushartung des Agars werden die Platten mit dem Namen des 

verwendeten Antibiotikums beschriftet (z.B. Ämp”), verpackt, mit dem 

Herstellungsdatum versehen und im Kuhlschrank bei 4 ◦ C gelagert. 

Analytik 

Bewertung 

6.2 13,März,2006 

6.2.1 Transformation 

Einleitung 

Unter Transformation versteht man das Einbringen von freier DNA in 

Wirtszellen. Zur Vermehrung dieser DNA ist (außer in den seltenen Fällen 

einer Integration in das Wirtsgenom) eine autonome Replikationsstart- 

Sequenz notwendig (ori-origin of replication). Die Träger fremder genetischer 

Information sind in der Regel zirkuläre Plasmide. Transformierte 

Zellen können von nicht-transformierten durch eine auf der eingebrachten 

DNA codierte Antibiotikums-Resistenz (z.B. Ampicillin-Resistenz) unterschieden 

werden. Einige Bakterienzellen sind von Natur aus kompetent, 

d.h. bei ihnen stellt die Aufnahme von Fremd-DNA einen natürlichen Vorgang 

dar. Dessen Effizienz kann beispielsweise durch die Verwendung spezieller 

Nährmedien noch weiter verbessert werden. Bei E. coli, der wichtigsten 

Wirtszelle für Klonierungsexperimente, erreicht man die Aufnahme 

von Fremd-DNA entweder durch CaCl 2 -vermittelte Transformation oder 

durch sog. Elektroporation. Bei dem Verfahren der Elektroporation werden 

die frei suspendierten Zellen zunächst durch das Anlegen einer geringen 

Wechselspannung perlschnurartig aneinander gelagert (Dielektrophorese): 

Die geringe Wechselspannung erzeugt Dipole in den Zellen, und die 

Perlschnurbildung wird durch die Anziehungskräfte zwischen diesen Dipolen 

herbeigeführt. Die aneinander liegenden Membranen benachbarter 

Zellen werden nun durch eine kurzzeitig angelegte Gleichspannung in ihrer 

Lipid-Doppelschicht-Struktur so weit gestört, dass kleine Löcher entstehen. 

Aufgrund des hohen Widerstands biologischer Membranen müssen hierzu 

starke elektrische Felder (1,5-2 kV) erzeugt werden. Dadurch kann die 

Vektor-DNA inklusive der gewünschten Fremd-DNA in die Zelle gelangen. 

Material 

•100µl elektrokompetente Escherichia coli-Zellen(XL 1-Blue,Stratagene) 

•Ligationsansatz 

•Elektroporationsküvette,Spaltbreite 1mm (Eppendorf)


•steriles 15 ml-Gefäß(Falcon 2059) 

•SOC-Medium(= SOB-Medium + Glucose) 

•SOB-Medium : 

SOB-Medium: Trypton 20.0g 

Hefeextrakt 5.0g 

NaCl 0.5g 

deionisiertes Wasser ad 980ml 

nach dem Sterilisieren werden die folgenden Salze zugegeben : 

MgCl 2 (1M) 

10 ml 

MgSO 4 (1M) 

10 ml 

SOC-Medium : SOB-Medium 100 ml 

Glucose-Lösung (2M) 1 ml 

•LB-Luria-Bertani)-Ampicillin-Agarplatten(LB a mp-Platten) 

•Brutschrank oder Wasserbad @ 37 ◦ C 

•Elektroporator (Eppendorf 2510) 


kompetente Zelle 100 µl 

Ligationsansatz 2 µl 

Durchführung 

•Darstellen des SOB-Medium: 

•Fullen eines leeren Glases mit 2,0 g Trypton, 0,5 g Hefeextrakt und 0,05 

g NaCl, sowie deionisiertem Wasser, so dass das Gesamtvolumen 98 ml 

ergibt. 

•Nach dem Sterilisieren und kurz vor der Weiterverarbeitung werden 

2 ml MgCl2 -MgSO 4 - Mix zugegeben. 

•Darstellen des SOC-Medium: 

•5 ml SOB-Medium in einen frischen Behalter pipettieren und 50 µl 

Glucose hinzufugen. 

Kompetente Zellen sind sehr empfindlich! Sie durfen erst kurz vor der 

Transformation aus dem -80 ◦ C-Tiefkuhlschrank entnommen werden und 

dann nur eisgekuhlt am Platz stehen. Kommt es zu einer ungewollten Erwarmung 

der Zellen vor der Transformation, ist der Ansatz zu verwerfen. 

textbullet Inkubieren Sie das SOC Medium bei 37 ◦ C im Wasserbad oder 

Brutschrank. 

•Die bei -80 ◦ C gelagerten kompetenten Zellen werden 10 min auf Eis aufgetaut; 

parallel werden Elektroporationskuvette sowie Ligationsansatz auf 

Eis vorgekuhlt. 

•An der Sterilbank werden 2 µl Ligationsansatz in das 1,7ml-Gefas mit den 

kompetenten Zellen gegeben und mit diesen durch Auf- und Abpipettie-


ren vermischt. Dabei keine Luftblasen produzieren und die kompetenten 

Zellen immer auf Eis lassen! 

•Nehmen Sie den Transformationsansatz mit einer 200 f Êl-Pipette auf und 

uberfuhren Sie ihn blasenfrei in den Spalt der gekuhlten Elektroporationskuvette 

die Kuvette dabei moglichst standig auf Eis lassen! 

•Stellen Sie am Elektroporator einen Spannungsimpuls von 1800 Volt/mm 

ein. 

•Das temperierte SOC-Medium sowie eine 1000 µl-Pipette werden bereitgelegt, 

die Pipette ist auf ein Volumen von 900 µl einzustellen. . Fuhren Sie 

die Kuvetten in der richtigen Orientierung in den Schlitten des Elektroporators 

ein, die ”Nase”der Kuvette zeigt dabei noch vorne. Schieben Sie den 

Schlitten zuruck in das Gerat. 

•Losen Sie den Spannungsimpuls aus (2 X drucken), nehmen Sie nach erfolgtem 

Puls (Ton!) sofort die Kuvette aus dem Elektroporator, fugen Sie 

dem Inhalt 900 µl SOC-Medium (37 ◦ C) zu und saugen den gesamten Inhalt 

auf einmal zuruck in die Pipettenspitze. 

•Uberfuhren Sie die Suspension in ein 15ml-Rohrchen. Dessen Deckel wird 

anschliesend in der oberen Stellung (=geoffnet) arretiert. 

•Inkubation 1 h bei 37 ◦ C, 220 rpm im Schuttelinkubator. 

Analytik 

siehe Auswertung der Transformation 

Bewertung 

siehe Auswertung der Transformation


6.3 14,März,2006 

6.3.1 Auswertung der Tranformation von E.coli 

Einleitung 

1. Sind Kolonien vorhanden 

2.Wieviele Transformation, indem Sie die Anzahl erhaltener Kolonien(a) 

mit den ausplattierten Volumina,(b) mit der bei der Transformation eingesetzten 

Menge an Vektor-DNA korrelieren und berechnen Sie die Koloniebildenden 

Einheiten(CFU) pro µg eingesetzter Vektro-DNA : 

CFU/[µg]Vektor-DNA=N kolonien /mDNA[µg]×1000[µl]/V tatsaechlich [µl] 

Material 


Durchführung 

rechnen nach der Formen 

CFU/[µg]Vektor-DNA=N kolonien /mDNA[µg]×1000[µl]/V tatsaechlich [µl] 

Analytik 

100ml platte 13 Kolonien 650 



Bewertung


6.3.2 Untersuchung der erhaltenen Transformanden(Kolonie-PCR) 

Einleitung 

Keine Ligation führt ausschließlich zu dem gewünschten Produkt-Plasmid. 

Häufig relegiert ( trotz Dephosphorilierung schließt sich das aufgetrennte 

Plasmid wieder ) der Vektor in den das GFP-Gen insertiert werden soll 

und bildet, aufgrund der immer noch vorhandenen Ampicillin-resistenz , 

ebenfalls Kolonien. Nach ca. 24h können sog. positive Klone aufgrund ihrer 

leuchtend grünen Farbe, die durch die Expremierung des GFP-Genes 

entsteht, erkannt werden. Um schon früher solche positiven Klone zu erkennen, 

entnimmt man ein paar Kolonien, amplifiziert deren DNA mittels 

einer PCR ( Polymerase Chain Reaction ) und trägt sie auf ein 0,8 %-iges 

Agarosegel auf und führt eine Elektrophorese durch. Anhand der charakteristischen 

Länge der entsprechenden DNA-Fragmente können dann schon 

früher positive Klone erkannt werden. 

Material 

•Platte mit Kolonien 

•sterile Zahnstocher 

•Primerpaar GFP04F (= Forward Primer) und GFP04R (= Reverse Primer) 

•Nucleotid-Mix,jeweils 10mM(Fermentas) 

•10X -PCR -Puffer (Applied Biosystem) 

•Taq-DNA-Polymerase(selbst präpariert) 



pro Ansatz 

10X-PCR-Puffer 5µl 

dNTP-Mix 2µl 

GFP04F 1,25µl 

GFP04R 1,25µl 

Tag-Polymerase 1µl 

Durchführung 

•Es sollen drei Klone gestestet werden.Stellen Sie deshalb drei 0.2 ml- 

Reaktionsgefäße bereit und beschriften Sie diese mit den Niummern der 

Klone. 

•Pipettieren Sie in jedes der Gefäße 40,5 µl Wasser 

•Übertragen Sie mit Hilfe eines sterilen Zahnstochers jeweils eine Kolonie 

von der Platte in das Wasser.schließen Sie den Deckel des Gefäßes 

•Zur Freisetzung der DNA werden die Zellen durch Kochen lysiert: 10 min


100 ◦ C in PCR-Maschine;anschließend zentrifugieren Sie kurz und stellen 

die Proben auf Eis 

•Geben Sie jedem Ansatz die überigen Reagenzien anhand der nachfolgenden 

Tabelle inklusive Taq-Polymerase zu (siehe oben Reaktionsansatz) 

•Gefäße in die PCR-Maschine Stellen 

•Temperatur Programm der PCR siehe PCR 

Analytik 

Bewertung

7 EXPRESSION VON GFP 37 

7 Expression von GFP 

7.1 14,März,2006 

7.1.1 Ansetzen einer Übernacht-kultur 

Einleitung 

Für einen Experessionsversuch benötigt man eine ”frische”Übernachtkultur 

zum Beimpfen des Medium am nächsten Morgen 

Die GFP-codierende Sequenz eines ”positiven Klonsßoll durch Sequenzanalyse 

überprüft werden.ür die Sequenzierung (s.Mittwoch) wird gereinigte 

Plasmid-DNA des neuen Plasmids pQE-GFP benötigt.Diese wird wie in 

der Vorwoche am Beispiel des Plasmids pQE30 bereits erlernt - aus einer 

übernachtkultur und Plasmid-Präparation gewonnen. 

Material 

•Verdünnungsausstrich XL1-Blue/pQE-GFP 

•Falcon-Röhrchen mit 5ml LB-Medium 

•Ampicillin-Stammlösung (100 mg/ml) 

•sterile Zahnstocher 

•Schüttelinkubator @ 37 ◦ C 


Durchführung 

•Unter sterilen Bedingungen(Sterilbank)werden dem LB-medium 5µl der 

Ampicillin-Stammlösung zugesetzt (Verdünnung 1:1000; Endkonzentration 

100 µg/ml) 

•Mit einem sterilen Zahnstocher wird eine Kolonie entnommen und in das 

Falcon Röhrchen überführt; mit Deckel verschließen (Achtung: der Deckel 

muß noch beweglich sein, damit die Kultur belüftet wird) 

•Kultivierung überNacht bei 37 ◦ C ,225 rpm 

Analytik 

Bewertung


7.2 15,März,2006 

7.2.1 Expression von GFP 

Einleitung 

Bei einer optischen Dichte von 0,6 bei einer Wellenlänge von 600 nm ( 

OD600=0,6 ) befinden sich die Bakterien in der sog. Logarithmischen Wachstumsphase. 

Diese Phase ist gekennzeichnet durch eine hohe Teilungsrate 

ohne Akkumulation toxischer Stoffwechselprodukte. Diese Wachstumsphase 

ist optimal, um die GFP-Expression ( Proteinbiosynthese ) anzuschalten 

( Induktion ). Die Induktion des GFP-Gens wird durch sog. negative 

Regulation erreicht, in dem eine Substanz ( IPTG –Stammlösung ) 

zugegeben wird, die sich an den die Genexpression verhindernden Repressor 

bindet, dessen Struktur soweit verändert, dass er wirkungslos wird. 

Nun kann die Polymerase am Promoter binden und die Genexpression 

stattfinden. Der Expressionsvektor pQE-30 der Firma Qiagen erlaubt eine 

Überexpression fremder Proteine“. Die Basis der Überexpression ist der 

” 

T5-Promoter-Transkriptions –Translationssystems ( stammt aus der Phage 

T5 ). Dieser Promoter wird von der Echerichia coli RNA –Polymerase erkannt. 

Ungewollte Transkription wird durch zwei lac –Operatorsequenzen 

verhindert, der synthetischen Ribosomenbindungsstelle ( RBSII ) und der 

multiple cloning site“ ( MCS ). 

” 

Material 

•frische Ubernacht-Kultur ( XL1 Blue/ pQE-GFP ) 

•Falcon-Rohrchen mit 5ml LB -Medium 

•Ampicillin 

•Stammlosung ( 100mg / ml ) 

•1 M IPTG Stammlosung (Isopropyl-β-(D)-thiogalactopyranosid ) 

•Sterilbank 

•Schuttelinkubator 

•Kuvette fur Messung der optischen Dichte 

•UV / VIS Spektralphotometer( Beckman DU-530) 

•Kuvettenstander 

•LB Medium als Referenz 

•Wasser (HPLC .Qualitat ) 

•Roti- Load Probenpuffer ( Fa. Roth ) 


Durchführung 

•Unter sterilen Bedingungen(Sterilbank) werden dem LB -Medium 5µl der


Ampicillin-Stammlösung zugesetzt (Verdünnung 1:1000 ; Endkonzentration 

100µg/ml) 

•Animpfen des LB-Medium mit 100µl ÜN-Kultur(1:50) 

•Röhrchen in den Schüttelinkubator stellen(37 ◦ C,200 rpm) 

•Nach 60 Minuten unter sterilen Bedingungen eine Probe von 200 µl Kulturmedium 

entnehmen und in der ersten Küvette mit 800 µl Wasser mischen ; 

zusätzlich noch in einer zweiten Küvette 200 µl frisches LB-Medium mit 800 

µl Wasser mischen(= Referenz bei der Bestimmung der optischen Dichte; 

wird für die folgenden Messungen aufbewahrt) 

•Bestimmung der optischen Dichte(OD) bei einer Wellenlänge von 600nm 

•Überwachung des Wachstumsverlaufs bis zum Erreichen einer OD 6 00=0.6 

; dazu alle 30-60 Minuten erneut eine Probe (s.o.)entnehmen 

•Ist die OD 6 00=0.6 erreicht,wird eine Probe von 1ml Flüssigkultur entnommen 

und bei 6.000 rpm,5 min,4 ◦ C abzentrifugiert. Der überstand wird 

verworfen und das Pellet mit 10 µl Roti-Load-Puffer und 30 µl Wasser versetzt. 

Die Probe wird bei -20 ◦ C gelagert. 

•Induktion : Zugabe von 1M IPTG-Stammlösung: Endkonzentration 1mM 

IPTG; Menge an zuzugebender IPTG-Stammlösung bitte selbst ausrechnen! 

•Kultur wieder zurück in den Schüttler stellen: 3h,37 ◦ C,200 rpm 

•1 ml Probe entnehmen ,abzentrifugieren(s.o.) und mit Roti-Load-puffer 

versetzen (s.o,);bei -20 ◦ C lagern 

Analytik 

11:00 13:15 14:30 – Plasmid Konz 500ng = µl 

0.115 0.19 0.35 0.69 33ng/µl 15.2 

Bewertung 

7.3 16,März,2006 

7.3.1 Expressionskontrolle mittels SDS-PAGE ( PolysacrylamidGelelektrophores 

) 

Einleitung 

Die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese(SDS-PAGE) ist ein Verfahren zur 

Auftrennung von Proteinen nach ihrem Molekulargewicht. Das anionischen 

Detergenz natriumdodecylsulfat(SDS) bindet an die durch Hitzebehandlung 

denaturierten und in ihre Untereinheiten zerfallenen Proteine. 

Die Zahl der angelagerten SDS-Moleküle ist propertional zum Molekulargewicht 

der Polypeptide, so dass im elektrischen Feld eine Auftrennung 

der Proteine nach ihrem Molekulargewicht möglich ist. Die Ladung der 

Aminosäurereste des Polypeptides braucht aufgrund der Starken negativen


Ladung der SDS-Moleküle nicht berücksichtigt werden. Die Molekulargewichtsbestimmung 

der Polypeptide erfolgt durch Vergleich der Laufstrecke 

mit der bekannter Proteine(Marker). 

Ein Problem bei jeder Zonalelektrophorese ist die Tatsache,dass die Proben 

ein merkliches Volumen haben und infolge der apparativen Gegebenheiten 

die aufgetraggenen Zonen durch ihre Breite die an sich hohe 

Auflösung vermindern. Dem entgegengewirkt werden. Dabei besteht das 

Polyacrylamidgel aus zwei Gelen unterschiedlicher Konzentration und unterschiedlicher 

Pufferung, also einem diskontinuierlichen Puffersystem . 

Die Probe ist gelöst im Probenpuffer Tris-HCL pH6.8 . Sie wird über das 

Sammelgel(ßtacking gel”, Tris-Hcl,pH6.8) gegeben und erreicht nach Anlegen 

einer Spannung nach einer gewissen Zeit in Form einer scharfen Bande 

(dem ßtack”) das Trenngel (”running gel”, Tris-HCL ,pH8.8) , wo sie dann 

je nach Molekülmasse in Banden unterschiedlicher Laufstrecke gestrennt 

wird. 

Nach Beendigung der Elektrophorese werden die Proteine mit dem Farbstoff 

Coomassie Brilliant Blue R250 angefärbt. Überschüssiger Farbstoff 

wird durch Entfärben aus dem Gel herausgewasschen . Ein optimal bearbeitetes 

Gel ist bis auf die Blau angefärbten Proteinbanden fablos. 

Material 

•Cerankochplatte 

•Edelstahltopf 

•12%-iges SDS-PAGE-Gel ( fertig gegossen ) 

•Elektrophorese-Apparatur 

•Spannungsgeber 

•Protein-Größenstandard (29kDa, 45kDa, 67kDa, 97kDa ) 

•Coomassie-Färbelösung (125ml Isopropanol, 0,25g Coomassie Brilliant 

Blue R250, 40ml Eisessig, ad 500ml Wasser ) 

•10 %-ige Essigsäure ( Entfärbelösung ) 

•Plastikwanne zum Färben/ Entfärben 

•1 x Proteingelpuffer ( 3g Tris; 14,4g Glycin, 1g SDS, ad 1l Wasser ) 

•Schüttler 


Durchführung 

•Die eingefrorenen Zellpellets 10 min im Wasserbad aufkochen und bis 

zum Auftragen auf Eis lagern 

•Polyacrylamidgel in die Elektrophorese-Apparatur einspannen 

•Die Apparatur mit 1X Proteingelpuffer befüllen; es werden ca. 800 ml


Puffer benötigt; Ladetaschen mit Spritz spülen, Apparatur auf Dichtigkeit 

prüfen 

•Kontrolle des Gels auf Luftblasen zwischen den Platten im Pufferbehälter 

der Anode, gegebenenfalls mit Spritze entfernen 

•Auftrag von je 15 µl Probe in die Ladetaschen; Auftrag von 7 µl Marker in 

den äußeren Ladetaschen des Gels 

•Einstellung am Spannungsgeber: 180V - 200V , 50 mA; Dauer der Elektrophorese 

ca. 3h; der Lauf ist beendet,wenn der blaue Farbstoff aus dem Gel 

herausgelaufen ist 

•Spannungsgeber ausschalten! 

•Gel aus der Apparatur nehmen und Glasplatten mittels Spatel durch leichtes 

Verkanten anheben 

•Gel entnehmen und 25 min in Coomassie-Lösung geben (das Gel sollte in 

der Färbelösung fre schwimen können,ca. 300 ml) und bei 80 rpm schütteln 

•Coomasie-Färbelösung in den vorgesehenen Behälter zurückgießen; Gel 

mit dest. Wasser spülen . 

•Gel in 10%ige Essigsäure legen und bei 80 rpm auf dem Schüttler über 

Nacht entfärben; ausgewaschener Farbstoff wird von Papiertüchern gebunden; 

dazu muss das Gel in der Entfärberlösung frei schwimmen können 

•Dokumentation des Gels durch Fotographie bzw. Einscannen erfolgt am 

nächsten Tag. 

Analytik


Bewertung

8 PLASMIDPREPARATION UND SEQUENZIERUNG 43 

8 plasmidpreparation und Sequenzierung 

8.1 15,März,2006 

8.1.1 Plasmidpräparation von pQE-GFP 

Einleitung 

siehe Einleitung Plasmidpräparation Woche 1 

Materal 

siehe Material Plasmidpräparation Woche 1 ( Aussnahme Puffer N3 statt 

P3 ) 


•1,5ml Ubernachtkultur 

•250µl Puffer P1 

•250µl Puffer P2 

•350µl Puffer N3 

•750µl Puffer PE 

•30µl Elutions - Puffer 

Durchführung 

wie 1.Woche, Mittwoch 

Analytik


Bewertung


8.1.2 Sequenzierung des GFP-Gens in pQE-GFP 

Einleitung 

Die Sequenzierung von DNA kann nach zwei Prinzipien erfolgen, entweder 

nach Maxam-Gilbert durch chemische Zerlegungs eines DNA-Fragments, 

in ale möglichen unterschiedlich langen Bruchstücke,oder nach Sanger 

durch Synthese aller möglichen- unterschiedlich langen DNA-Einzelstränge 

mit komplementärer Sequenz zum abgelesenen(kopierten) Fragment. Gemeinsam 

ist beiden Methoden, dass die generierten DNA-Bruchstücke 

durch Gelelektrophorese entsprechend ihrer länge getrennt werden müssen 

und aus den Bruchstücken die Nucleotidsequenz abgeleitet werden kann. 

Die Sanger-Methode hat den Vorteil, auch die direkte Sequenzierung eines 

DNA-Fragments in einem Vektor zu ermöglischen und dominiert deshalb(und 

wegen ihrer unkomplizierteren Durchführung) die heute praktizierten 

Verfahren. 

Sangers Verfahren beruht auf der Anfertigung von Kopien eines DNA- 

Strangs-ähnlich wie bei der PCR: Zunächst bindet ein Primer an die komplementäre 

Sequenz der zu sequenzierenden Matrize und wird dort von 

einer DNA-Polymerase verlängert;ersetzt man einen Teil der monomeren 

Nucleotide durch Analoga,denen die für die Polymerisation nötige 3’- 

OH-Gruppe fehlt(Didesoxy-Nucleotide,ddNTPs),produziert die Polymerase 

statistisch verteilte Kettenabbrüche. Ursprünglich wurde eine Sequenzierreaktion 

in vier Portionen geteilt, in denen jeweils nur eines der vier 

dNTPs durch das entsprechende ddNTP ersetzt war. Zusätzlich wurde ein 

kleiner Teil eines Nucleotids durch ein radioaktiv markiertes dNTP ersetzt, 

das ebenso in die Ketten eingebaut wird und die Detektion der Banden 

im Gel durch Autoradiographie (auf einem Film) möglich machte . Die 

entwicklung von ddNTPs, die Flureszenzfarbstoffe tragen, ermöglicht heute 

eine drastische Vereinfachung der Sangerschen Methode, weil alle vier 

Abbruchreaktionen ïn einem Topf”durchgeführt werden können (vorausgesetzt, 

die Farbstoffe sind verschieden und nebeneinander detektierbar;) 

Zu den heute mit größtmöglicher Empfindlichkeit detektierbaren Sequenzierfarbstoffen 

gehören die von der Firma ABI entwickelten ”Big Dyes ”, 

sog. FRET-Farbstoffe (FRET = Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer). 

Eine zusätzliche Beschleunigung erfahren heutige Analysen durch den 

Einsatz von Kapillaren anstelle von Gelen zur Anftrennung der DNA- 

Fragmente(vgl. Abb.11 und 12). 

Bei einer Kaillarelektrophorese werden DNA-Fragmente an der Kathode 

(-) aufgetragen und wandern bei Anlegen einer Hochspannung aufgrund 

ihrer eigenen negativen Ladung in die Kapillare hinein Richtung Anode(+). 

In der Kapillare befindet sich einflüssiges Polymer, dass wie ein Sieb die 

Fragmente ihrer Länge nach sortiert und bei fortschreitender Wanderung 

durch die Kapillare auftrennt. wenn die Fragmente am Detektor vorbei-


wandern, werden sie von einem Laser angeregt, und die an den Fragmenten 

befindlichen Fluoreszenz-Farbstofe senden Licht einer bestimmten 

Wellenlänge aus. Diese Lichtsignale werden von einer CCD-Kamera digita 

aufgezeichnet und in der EDV analysiert. Die Ergebnisse zeigen die 

Länge der aufggetrennten DNA-Fragmente zusammen mit der jeweilige 

Farbmarkierung an. 

Materal 

•Plamid-DNA: pQE-GFP 

•BigDye TM Terminator Ready Reaction Mix(ABI) 

•PCR-Maschine(Eppendorf Mastercycler personal) 


•Primer GFP04F(= Forward Primer) 

•95% Ethanol 

•70% Ethanol 

•Speed-Voc (=Vakuumzentrifuge; Eppendorf 

•Hi-Di Formamid(besonders reines Ameisensäureamid;ABI) 


errechnen anhand der ermittelten Konzentration des Plasmids pQE-GFP 

das jeweils einzusetzende Volumen 

Plasmid-DNA pQE-GFP 

500ng(=15.2µl) 

Terminator Ready Reaction Mix(ABI) 1.5 µl 

6X Sequenzier-Puffer(ABI) 3.3 µl 

Primer GFP04F(3,2 µM) 1 µl 

Wasser (HPLC-Qualität) ad 20 µl 

Durchführung 

Die Sequenzier-PCR wird mit im Gegensatz zur ”normalen”PCR (= exponentielle 

Amplifikation doppelsträngiger DNA) nur mit einem Primer 

pro Reaktionsansatz durchgeführt . Das Produkt dieser ”linearen PCRßind 

einzelsträngige, fluoreszenzmarkierte DNA-Fragmente. Um das Plasmid 

in beiden Richtungen zu sequenzieren, müßten 2 Reaktionsansätze durchgeführt 

werden(einer mit dem ”Forward Primer und einer mit dem ”ReversePrimer). 

In diesem Praktikum sequenzieren wir nur in einer Richtung 

mit dem Primer GFP04F. 

•Pipettieren Sie gemäß oben angegebenem reaktionsschema, beginnend 

mit dem Wasser, alle Reagenzien bis auf den Terminator-Mix in ein 0,2 ml- 

Reaktionsgefäß 

•Stellen Sie die Proben in die PCR-Maschine (Programm:SEQ) ; die Proben 

werden 5 min auf 99 ◦ C erhitzt; um die doppelsträngige Plasmid-DNA


vollständig zu denaturieren - nach ablauf der Zeit meldet die PCR-Maschine 

dies mit einem Signalton 

•Stellen sie die Proben sofort für eine Minute auf Eis 

ACHTUNG : An dieser Stelle verwenden Sie den Terminator-Mix. Diese 

ist ausgesprochen teuer. Arbeiten sie deshalb sehr umsichtig und passen 

Sie auf ,dass der Mix immer auf Eis steht 

•Pipettieren Sie den Terminator-Mix zu Ihrem Reaktionsansatz und stellen 

Sie das Reaktionsgefäß wieder in die PCR - Maschine 

•Starten Sie das SEQ-Programm(s.u; Programmdauer ca. 2h) 

•Nach Ablauf des SEQ-Programmes arbeiten Sie die Proben auf bzw. lagern 

Sie im Gefrierfach(-20 ◦ C) 

Temperaturprogramm SEQ: 

Denaturierung : 99 ◦ C 5min 

4 ◦ C ∞ Sound 

•Gefäß auf Eis stellen,jeweils Terminator-Mix zugeben. 

25X 

Denaturierung: 96 ◦ C 10sec 

Annealing: 50 ◦ C 5sec 

Elongation: 60 ◦ C 4 min 

Abschluß 4 ◦ C ∞ 

Analytik 

Bewertung


8.2 16,März,2006 

8.2.1 Aufarbeitung der Sequenzier-Reaktion 

Einleitung 

Verunreinigungen werden hier lediglich durch Ethanolfällung und anschließendes 

Waschen mit 70 % igem Ethanol abgetrennt, um den Materialverlust 

so gering wie möglich zu halten und nicht durch die Aufreinigung 

neue fluoreszierende Substanzen einzutragen, die die hochempfindliche 

Detektionstechnik stören könnten. 

Materal 

•PCR-Reaktion(kompletter Ansatz) 

•100%iges(bzw.95%iges)Ethanol 


•70%iges Ethanol 


Durchführung 

•Überführen Sie den kompletten PCR-Reaktionsansatz (20 µl)aus dem 0,2 

ml-Gefäß in ein 1,7 ml-Gefäß 

•Zugabe von 64 µl 100%igem Ethanol und 16 µl Wasser 

•5 sec vortexen,anschließend 20 min bei Raumtemperatur stehen lassen 

•Platzieren Sie die Gefäße in der Zentrifuge und markieren Sie die Lage 

der Gefäße (Pellet möglichweise nicht sichtbar); Zentrifugation: 20 min bei 

13.000 rpm, RT 

•Überstand wird mit der Pipette vorsichtig und vollständig abnehmen(Markierung 

beachten!) 

•Zugabe von 250µl 70%igem Ethanol, 5 sec vortexen 

•Gefäße mit der gleichen Orientierung wie beim ersten Zentrifugatinsschritt 

in die Zentrifuge stellen 

•Zentrifugation: 10 min, 13.000 rpm, RT 

•Überstand vollständig abnehmen(s.o.) 

•Die Proben werden in der Speed-Vac bei 45 ◦ C 3 min getrocknet(Stoppuhr!) 

. Es ist wichtig,die DNA nicht zu lange zu trocken , da sie sich dann nur 

noch sehr schwer löst. Kontrollieren Sie das Ergebnis : Gegebenenfalls muß 

in 1 min-Schritten weitergetrocknet werden 

•Die getrocknete DNA wird in 20 µl Hi-Di Formamid aufgenommen und 

anschließend mit dem Sequenzierautomaten ABI 3100 analysiert


Analytik 

Bewertung

9 AUSWERTUNG DER SEQUENZIERUNG 50 

9 Auswertung der Sequenzierung 

9.1 17,März,2006 

9.1.1 Sequenzierung OK 

nein ,habe kein Sequenz bekommt ,für weitere Arbeit habe ich von Gruppe 

2 die Rohdaten bekommen. 

9.1.2 Sequenz 

¿2 ACAAAAAAGGCTCTTCACGATCGTGTCCAGATCTTGTTGAATTAGATGTT CGATGTTAACGGGCACAAGTTCTCTGTCAGGG- 

GAGAGGGTGAAGGTGATG CAACATACGGAAAACTTACCCTGAAGTTCATCTGCACTACTGGCAAACTG CCTGTTCCATGGCCAA- 

CACTAGTCACTACTCTGTGCTATGGTGTTCAATG CTTTTCAAGATACCCGGATCATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTG CCAT- 

GCCCGAAGGTTATGTACAGGAAAGGACCATCTTCTTCAAAGATGAC GGCAACTACAAGACACGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGT- 

GATACCCTTGT TAATAGAATCGAGTTAAAAGGTATTGACTTCAAGGAAGATGGCAACATTC TGGGACACAAATTGGAATACAAC- 

TATAACTCACACAATGTATACATCATG GCAAACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGTGAACTTCAAGACCCGCCACAA CATTGAA- 

GATGGAAGCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTC CAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGT- 

CCACA CAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCACGAAAAGAGAGACCACATGGTCCTT CTTGAGTTTGTAACAGCTGCTGGGATTA- 

CACATGGCATGGATGAACTGTA CAACTGACTGCACCAAGCTTAATTAGCTGAGCTTGGACTCCTGTTGATAG ATCCAGTAATGACTT- 

CAGAACTCCATCTGGATTTGTTCAGACGCTCGGTT GCCGCCGGGCGTTTTTTAATGGTGGAAATCCAACTAGCTTGGCGAGATTT 

CAGAACTAAGGAACTAAATGAAAAAAAATCCCTGGGTATTAC 

9.1.3 Alignment GFP mit Priginal in pQBI63 

¿2 ———————————————————— ———————————————————— —————————————————— 

—— ——————————–ACAAAAAAGGCTCTTCACGATC-GTGT- ——CCA—GATCTTGTTGAATTAGATGTTC—GATGTTAACGGGCA— 

CAAGTT CTCTGTCAGGGGAGAGGGTGAAGGTG-ATGCAACATACGGAAAACTTACCCTGAAGTTCA TCTGCACTACTGGCAAACT- 

GCCTGTTCCATGGCCAACACTAGTCACTACTCTGTGCTATG GTGTTCAATGCTTTTCAAGATACCCGGATCATATGAAACGGCAT- 

GACTTTTTCAAGAGTG CCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAAAGGACCATCTTC–TTCAA–A——-GATGA CGG-CAACTACAAGACACG- 

TGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTG—TTAA- -TAGAATCGAGTTAAAAGGTATTGACTTCAAGGAAGATGGCAACATTCTGGGACACAAA- 

TTGGAATACAACTATAACTCACACAATGTATACATCATG—GCAAACAA-ACAAAAGAA -TGGAATCAAAGTGAACTTCAAG–ACCCGCCACAACATTGAAGATGGAAGCGT- 

TCAAC TAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTT—TACCAG ACAACCATTAC-CTGTCCACACAATC- 

TGCCCTTTCGAAAGATCC——CACGAAAAG -AGAGACCAC-ATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAAC-AGCTGCTGGG-ATTACACATGGCAT 

GGATGAACTGTACAACTGACTGCAC–CAAGCTTAATTAGCTG-AGCTTGGA—-CT– –CCTGT—-TGATAGATCCAGTAATGAC–TTCAGAACTCCATCTGGATTTGTTCAGA 

CGCTCGGTTGCCGCCGG—-GCGTTTTT-TAATGGTGGAAATCCAACTAGCTTGGCGAG ATTTCAGAACTAAGGAACTAAATGAAAAAAAATCCCT– 

GGGTATTAC———— ———————————————————— ———————————————————— ————————— 

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—————————————————— ———————————————————— ———————————————————— — 

——————————————————— ———————————————————— ——————————— ¿pQBI63 TTCTCATGTTT- 

GACAGCTTATCATCGATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGTTAAA TTGCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGAAATCTAA- 

CAATGCGCTCATCGTCATCCTCGG CACCGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTT GCGGGATATCCGGATATAGTTCCTCCTTTCA 

CAAAAAA–CCCCTCAAGACCCGTTTA GAGGCCCCAAGGGGTTATGCT-AGTTAT-TGCTCAGCGGTGGCAGCAGCCAACTCAGCTT 

C-CTTTC-GGGCTTTGTTAGCAGCCGGATCCT-CAGTTGTACAGTTCATCC–ATGC-CA TGTGTAATCCCAGCA—-GC-TGTTACA—–AACTCAAGA- 

AGGACCATGTG—– GTCT-C–T-CTTTTC–GTTG—GGATCTTTCGAAAGGGCA-GATTGTGTGGACAG-G TAATGGTTGTCTGGTA—AAAGGACAGGGCCATCGCCAATTGGAGTA 

TGGTCTGCTAGTTGA-ACGCTTCCATCTTCAATGTTGTGGCGGGT—CTTGAAGTTCAC TTTGATTCCA-TTCTTTTGT-TTGTCTGCCATGA— 

TGTATACATTGTGTGAGTTATAG TTGTATTCCAATT-TGTGTCCCAGAATGTTGCCATCTTCCTTGAAGTCAATACCTTTTAA CTCGATTCTA– 

TTAACA–AGGGTATCACCTTCAAACTTGACTTCAGCA-CGTGTCTTG TAGTTG-CCGTCATC——-T–TTGAA–GAAGATGGTCCTTTCCTGTACATAACCT 

TCGGGCATGGCACTCTTGAAAAAGTCATGCCGTTTCATATGATCCGGGTATCTTGAAAAG CATTGAACACCATAG–CA-CA-GAGTA- 

GTGACTAG-TGTTGGCCATGGAACA-GGCA- GTTTGC-CAGTAGTGCAGA-TGAACTTCAGGGTAAGTTTTCCGTATGTTGCATCACCTTC 

ACCCTCTCCACTGACAGAGA-ACTTGTGGCCGTTAACATCACCATCTA-ATTCAACAAGA AT-TGGGACAACTCCAGTGAAGAGTTCTTCTCCT– 

TTGCTAGCCA–TA—TGT–AT ATCTCCTTCTTAAAGT–TAAACAAAATTATTTCTAGAGGGGAATTGTTATCCGCTCACA ATTCCCC- 

TATAGTGAGTCGTATTAATTTCGCGGGATCGAGATCTCGATCCTCTACGCCGG ACGCATCGTGGCCGGCATCACCGGCGCCACAGGT- 

GCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGA CATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGT 

GGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACC ATTCCTTGCGGCGGCGGTGCTCAA- 

CGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCA GGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGAGATCCCGGACACCATCGAATGG- 

CGCAAAACCTTTC GCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAAGAGAGTCAATTCAGGGTGGTGAATGTGAAACCAG TAACGTTATA- 

CGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGG TGAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGG- 

GAAAAAGTGGAAGCGGCGATGGCGG AGCTGAATTACATTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCT- 

GA TTGGCGTTGCCACCTCCAGTCTGGCCCTGCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTA AATCTCGCGCCGATCAACTGGGT- 

GCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGCG TCGAAGCCTGTAAAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGT- 

CAGTGGGCTGATCA TTAACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCTGCACTAATGTTC CGGCGTTATTTCTT- 

GATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATG AAGACGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCATCTGGTCGCATTGGGT- 

CACCAGCAAATCGCGC TGTTAGCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCTGGCTGGCATAAAT ATCTCACT- 

CGCAATCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTGGAGTGCCATGT CCGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGCTGAAT- 

GAGGGCATCGTTCCCACTGCGATGCTGG TTGCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGTCCGGGCT- 

GCGCG TTGGTGCGGATATCTCGGTAGTGGGATACGACGATACCGAAGACAGCTCATGTTATATCC CGCCGTTAACCACCATCAAA- 

CAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCT TGCTGCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTGTT- 

GCCCGTCTCACTGG TGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCG ATTCATTAAT-


GCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAAC GCAATTAATGTAAGTTAGCTCACTCATTAGGCAC- 

CGGGATCTCGACCGATGCCCTTGAGA GCCTTCAACCCAGTCAGCTCCTTCCGGTGGGCGCGGGGCATGACTATCGTCGCCGCACTT 

ATGACTGTCTTCTTTATCATGCAACTCGTAGGACAGGTGCCGGCAGCGCTCTGGGTCATT TTCGGCGAGGACCGCTTTCGCTGGAG- 

CGCGACGATGATCGGCCTGTCGCTTGCGGTATTC GGAATCTTGCACGCCCTCGCTCAAGCCTTCGTCACTGGTCCCGCCACCAAA- 

CGTTTCGGC GAGAAGCAGGCCATTATCGCCGGCATGGCGGCCGACGCGCTGGGCTACGTCTTGCTGGCG TTCGCGACGCGAG- 

GCTGGATGGCCTTCCCCATTATGATTCTTCTCGCTTCCGGCGGCATC GGGATGCCCGCGTTGCAGGCCATGCTGTCCAGGCAGGTAGAT- 

GACGACCATCAGGGACAG CTTCAAGGATCGCTCGCGGCTCTTACCAGCCTAACTTCGATCACTGGACCGCTGATCGTC ACGGC- 

GATTTATGCCGCCTCGGCGAGCACATGGAACGGGTTGGCATGGATTGTAGGCGCC GCCCTATACCTTGTCTGCCTCCCCGCGTTG- 

CGTCGCGGTGCATGGAGCCGGGCCACCTCG ACCTGAATGGAAGCCGGCGGCACCTCGCTAACGGATTCACCACTCCAAGAATTGGAG- 

CCA ATCAATTCTTGCGGAGAACTGTGAATGCGCAAACCAACCCTTGGCAGAACATATCCATCG CGTCCGCCATCTCCAGCAGC- 

CGCACGCGGCGCATCTCGGGCAGCGTTGGGTCCTGGCCAC GGGTGCGCATGATCGTGCTCCTGTCGTTGAGGACCCGGCTAGGCTGG- 

CGGGGTTGCCTTA CTGGTTAGCAGAATGAATCACCGATACGCGAGCGAACGTGAAGCGACTGCTGCTGCAAAA CGTCTGCGACCT- 

GAGCAACAACATGAATGGTCTTCGGTTTCCGTGTTTCGTAAAGTCTGG AAACGCGGAAGTCAGCGCCCTGCACCATTATGTTCCG- 

GATCTGCATCGCAGGATGCTGCT GGCTACCCTGTGGAACACCTACATCTGTATTAACGAAGCGCTGGCATTGACCCTGAGTGA TTTTTCTCTGGT- 

CCCGCCGCATCCATACCGCCAGTTGTTTACCCTCACAACGTTCCAGTA ACCGGGCATGTTCATCATCAGTAACCCGTATCGTGAG- 

CATCCTCTCTCGTTTCATCGGTA TCATTACCCCCATGAACAGAAATCCCCCTTACACGGAGGCATCAGTGACCAAACAGGAAA AAA- 

CCGCCCTTAACATGGCCCGCTTTATCAGAAGCCAGACATTAACGCTTCTGGAGAAAC TCAACGAGCTGGACGCGGATGAACAGG- 

CAGACATCTGTGAATCGCTTCACGACCACGCTG ATGAGCTTTACCGCAGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCT- 

GACACA TGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCC GTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGG- 

CGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTA GCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACT- 

GAGAGT GCACCATATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGG CGCTCTTCCGCTTCCTCGCT- 

CACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCG GTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGG- 

GATAACGCAGGA AAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTG GCGTTTTTC- 

CATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAG AGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATA- 

CCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTC GTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTT- 

CG GGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTT CGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCAC- 

GAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCC GGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGG- 

CAGCAGCC ACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGG TGGCCTAACTACGGC- 

TACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCA GTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAA- 

CAAACCACCGCTGGTAGC GGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGAT CCTTT- 

GATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATT TTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTT- 

CACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGT TTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCT- 

TAATC AGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCC GTCGTGTAGATAACTACGATA- 

CGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATA CCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAA- 

CCAGCCAGCCGGAAGG GCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGC CGGGAAGC- 

TAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCT GCAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTT- 

CATTCAGCTCCGGTTCCCAA CGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGT CCTC- 

CGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCA CTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCG- 

TAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTAC TCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGT- 

CA ACACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGT TCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAG- 

GATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCC ACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGT- 

GAGCA AAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATA CTCATACTCTTCCTTTTT- 

CAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGC GGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTT- 

CCGCGCACATTTCCC CGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAAT AGGCGTATCAC-

10 LIGATION IN SILICO 53 

GAGGCCCTTTCGTCTTCAAGAA 

10 Ligation in silico 

10.1 DNA-Sequenz des Plasmids pQBI63 und Lokalisation des 

GFP - Gens 

Lokalisation des codierten GFP-Gens: 325 – 1040 

Sequenz des Plasmids pQBI63 

TTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCT AACGCAGTCAGGCACCGTGTAT- 

GAAATCTAACAATGCGCTCATCGTCATCCTCGGCACCGTCACC CTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGG- 

GCCTCTTGCGGGATATCCGGATA TAGTTCCTCCTTTCAGCAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGC- 

TAGTTA TTGCTCAGCGGTGGCAGCAGCCAACTCAGCTTCCTTTCGGGCTTTGTTAGCAGCCGGATCCTCAGT TGTACAGTTCAT- 

CCATGCCATGTGTAATCCCAGCAGCTGTTACAAACTCAAGAAGGACCATGTGGT CTCTCTTTTCGTTGGGATCTTTCGAAAGGG- 

CAGATTGTGTGGACAGGTAATGGTTGTCTGGTAAAA GGACAGGGCCATCGCCAATTGGAGTATTTTGTTGATAATGGTCTGCTAGTT- 

GAACGCTTCCATCTT CAATGTTGTGGCGGGTCTTGAAGTTCACTTTGATTCCATTCTTTTGTTTGTCTGCCATGATGTATA CATTGTGT- 

GAGTTATAGTTGTATTCCAATTTGTGTCCCAGAATGTTGCCATCTTCCTTGAAGTCAA TACCTTTTAACTCGATTCTATTAACAAGGG- 

TATCACCTTCAAACTTGACTTCAGCACGTGTCTTGT AGTTGCCGTCATCTTTGAAGAAGATGGTCCTTTCCTGTACATAACCTTCGG- 

GCATGGCACTCTTGA AAAAGTCATGCCGTTTCATATGATCCGGGTATCTTGAAAAGCATTGAACACCATAGCACAGAGTAG TGAC- 

TAGTGTTGGCCATGGAACAGGCAGTTTGCCAGTAGTGCAGATGAACTTCAGGGTAAGTTTTC CGTATGTTGCATCACCTTCACCCTCT- 

CCACTGACAGAGAACTTGTGGCCGTTAACATCACCATCTA ATTCAACAAGAATTGGGACAACTCCAGTGAAGAGTTCTTCTCCTTT- 

GCTAGCCATATGTATATCTC CTTCTTAAAGTTAAACAAAATTATTTCTAGAGGGGAATTGTTATCCGCTCACAATTCCCCTATAGT GAGT- 

CGTATTAATTTCGCGGGATCGAGATCTCGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGGCATC ACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGG- 

CGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCT CGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGG- 

CAGGCCCCGTGGCCGGGGGA CTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCCTTGCGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCTA 

CTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGAGATCCCGGACACCATCGA ATGGCGCAAAACCTTTCG- 

CGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAAGAGAGTCAATTCAGGGTGGTGAA TGTGAAACCAGTAACGTTATACGATGTCGCAGAGTAT- 

GCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCG CGTGGTGAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGGGAAAAAGTGGAAGCG- 

GCGATGGCGGA GCTGAATTACATTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCGT TGCCACCT- 

CCAGTCTGGCCCTGCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGA TCAACTGGGTGCCAGCGTGGTGGTGT- 

CGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGAAGCCTGTAAAGCGGC GGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGGGCTGATCATTAAC- 

TATCCGCTGGATGACCAGGA TGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCTGCACTAATGTTCCGGCGTTATTTCTTGATGTCTCTGACCAGAC 

ACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATGAAGACGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCATCTGGTCGC ATTGGGTCACCAGCAAAT- 

CGCGCTGTTAGCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCT GGCTGGCTGGCATAAATATCTCACTCGCAATCAAATT- 

CAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTG GAGTGCCATGTCCGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGCTGAATGAGGGCATCGTT- 

CCCACTGCGAT GCTGGTTGCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGTCCGGGCTGCGCGT TGGTGCG- 

GATATCTCGGTAGTGGGATACGACGATACCGAAGACAGCTCATGTTATATCCCGCCGTT AACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCT- 

GCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAACTCTC TCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGT- 

GAAAAGAAAAACCACCCT GGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACA 

GGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTAAGTTAGCTCACTCATTAGG CACCGGGATCTCGACCGAT- 

GCCCTTGAGAGCCTTCAACCCAGTCAGCTCCTTCCGGTGGGCGCGGG GCATGACTATCGTCGCCGCACTTATGACTGTCTTCTTTAT- 

CATGCAACTCGTAGGACAGGTGCCGG CAGCGCTCTGGGTCATTTTCGGCGAGGACCGCTTTCGCTGGAGCGCGACGATGATCG- 

GCCTGTCGC TTGCGGTATTCGGAATCTTGCACGCCCTCGCTCAAGCCTTCGTCACTGGTCCCGCCACCAAACGTT TCGGCGAGAAG-


CAGGCCATTATCGCCGGCATGGCGGCCGACGCGCTGGGCTACGTCTTGCTGGCGT TCGCGACGCGAGGCTGGATGGCCTTCCCCAT- 

TATGATTCTTCTCGCTTCCGGCGGCATCGGGATGC CCGCGTTGCAGGCCATGCTGTCCAGGCAGGTAGATGACGACCATCAGGGA- 

CAGCTTCAAGGATCGC TCGCGGCTCTTACCAGCCTAACTTCGATCACTGGACCGCTGATCGTCACGGCGATTTATGCCGCCT CG- 

GCGAGCACATGGAACGGGTTGGCATGGATTGTAGGCGCCGCCCTATACCTTGTCTGCCTCCCCG CGTTGCGTCGCGGTGCATGGAG- 

CCGGGCCACCTCGACCTGAATGGAAGCCGGCGGCACCTCGCTAA CGGATTCACCACTCCAAGAATTGGAGCCAATCAATTCTT- 

GCGGAGAACTGTGAATGCGCAAACCAA CCCTTGGCAGAACATATCCATCGCGTCCGCCATCTCCAGCAGCCGCACGCGGCGCATCT- 

CGGGCAG CGTTGGGTCCTGGCCACGGGTGCGCATGATCGTGCTCCTGTCGTTGAGGACCCGGCTAGGCTGGCG GGGTTGCCTTACTGGT- 

TAGCAGAATGAATCACCGATACGCGAGCGAACGTGAAGCGACTGCTGCTG CAAAACGTCTGCGACCTGAGCAACAACATGAATGGTCTT- 

CGGTTTCCGTGTTTCGTAAAGTCTGGA AACGCGGAAGTCAGCGCCCTGCACCATTATGTTCCGGATCTGCATCGCAGGATGCTGCTGGCTACC 

CTGTGGAACACCTACATCTGTATTAACGAAGCGCTGGCATTGACCCTGAGTGATTTTTCTCTGGTC CCGCCGCATCCATACCGCCAGTTGTT- 

TACCCTCACAACGTTCCAGTAACCGGGCATGTTCATCATC AGTAACCCGTATCGTGAGCATCCTCTCTCGTTTCATCGGTATCATTAC- 

CCCCATGAACAGAAATCC CCCTTACACGGAGGCATCAGTGACCAAACAGGAAAAAACCGCCCTTAACATGGCCCGCTTTATCAG 

AAGCCAGACATTAACGCTTCTGGAGAAACTCAACGAGCTGGACGCGGATGAACAGGCAGACATCTG TGAATCGCTTCACGAC- 

CACGCTGATGAGCTTTACCGCAGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGG TGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGT- 

CACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAG CAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGC- 

CATGACCCAGTC ACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTG CACCA- 

TATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTT CCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCT- 

GCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACT CAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACG- 

CAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAG GCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCT- 

CCGCCCCC CTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGAT ACCAGGCGTTT- 

CCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGAT ACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGG- 

CGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCA GTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTT- 

CAGCCCGACCGCT GCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAG CAGC- 

CACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGT GGCCTAACTACGGCTACACTAGAAG- 

GACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCT TCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCAC- 

CGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTG 

10.2 DNA-Sequenz des Plasmids pQE-30 

CTCGAGAAATCATAAAAAATTTATTTGCTTTGTGAGCGGATAACAATTAT AATAGATTCAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACA- 

CAGAATTCATTAAAG AGGAGAAATTAACTATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCC GCATGCGAGCTCGGTACC- 

CCGGGTCGACCTGCAGCCAAGCTTAATTAGCT GAGCTTGGACTCCTGTTGATAGATCCAGTAATGACCTCAGAACTCCATCT GGATTTGTT- 

CAGAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATTGGTGAGA ATCCAAGCTAGCTTGGCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGGA 

GAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGATATATCCCAATGGCATCGTA AAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACC- 

TATAACCAG ACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAAAAATAA GCACAAGTTTTATCCGGCCTTTATT- 

CACATTCTTGCCCGCCTGATGAATG CTCATCCGGAATTTCGTATGGCAATGAAAGACGGTGAGCTGGTGATATGG GATAGTGTT- 

CACCCTTGTTACACCGTTTTCCATGAGCAAACTGAAACGTT TTCATCGCTCTGGAGTGAATACCACGACGATTTCCGGCAGTTTC- 

TACACA TATATTCGCAAGATGTGGCGTGTTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCT AAAGGGTTTATTGAGAATATGTTTTTCGTCT- 

CAGCCAATCCCTGGGTGAG TTTCACCAGTTTTGATTTAAACGTGGCCAATATGGACAACTTCTTCGCCC CCGTTTTCACCATGG- 

GCAAATATTATACGCAAGGCGACAAGGTGCTGATG CCGCTGGCGATTCAGGTTCATCATGCCGTTTGTGATGGCTTCCATGTCGG 

CAGAATGCTTAATGAATTACAACAGTACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGG CGTAATTTTTTTAAGGCAGTTATTGGTGCCCTTAAA- 

CGCCTGGGGTAATG ACTCTCTAGCTTGAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACT GGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGT- 

CGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGG ACAAATCCGCCCTCTAGAGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAA AACCTCTGACA- 

CATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGC GGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGG-


CG GGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTAT ACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACT- 

GAGAGTGCACCAT ATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAG GCGCTCTTCCGCTTCCTCGCT- 

CACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGC TGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACA GAAT- 

CAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAA GGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTT- 

CCATAGGCTCC GCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGA AACCCGACAGGACTATAAAGA- 

TACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCT CGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCT TTCTCCCTT- 

CGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTAT CTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCAC- 

GAACC CCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGT CCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGG- 

CAGCAGCCACTGGTAAC AGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTG GTGGCCTAACTACGGC- 

TACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTC TGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGC AAA- 

CAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGAT TACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTT- 

GATCTTTTCTACGG GGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATG AGATTATCAAAAAGGATCTT- 

CACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAG TTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACC AATGCT- 

TAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCA TCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATA- 

CGGGAGGG CTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCAC CGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAA- 

CCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGC AGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTG CCGGGAAGC- 

TAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTG TTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCT 

TCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCAT GTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTC- 

CGATCGTTGTCAGAA GTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAAT TCTCTTACTGTCATGCCATC- 

CGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTA CTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTT GCCCG- 

GCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAA GTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCT- 

CAAGGATCTT ACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGAT CTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGT- 

GAGCAAAAACAGGA AGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAAT ACTCATACTCTTCCTTTTT- 

CAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATT GTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATA GGGGTT- 

CCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAAC CATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCAC- 

GAGGCCCT TTCGTCTTCAC 

10.3 Schnittstelle für BamHI und PstHI 

Ergebnisse von Programm ”Resctriction Mappper”http://www.restrictionmapper.org 

Conformation: circular 

Enzymes: BamHI, PstI 

Noncutters: 

Name Sequence Site Length Overhang Frequency Cut Positions 

BamHI GGATCC 6 five prime 1 145 

PstI CTGCAG 6 three prime 1 183 

10.4 Primer-Sequenzen 

GFP04F 5’ - CTT TAA GAA GGA GAT GGA TCC GTG GCT AGC AAA 

GGA GAA G – 3’ 

GFP04R 5’ – GCT TTG TTA GCA GCC CTG CAG TCA GTT GTA CAG TTC 

ATC CAT G - 3’


10.5 Verdauen das GFP-Gen und den Vektor pQE-30 

4141 GAAAGCAGAA GTG271 ACGTC AGTCAACATGTCAAGTAGGTACGGTACACATTAGGG 

271 G TCAGTTGTACAGTTCATCCATGCCATGTGTAATCCC 

361 TCGTCGACAA TGTTTGAGTT CTTCCTGGTA CACCAGAGAG AAAAGCAACC CTAGAAAGCT TTCCCGTCTA ACACACCTGT 

CCATTACCAA 

361 AGCAGCTGTT ACAAACTCAA GAAGGACCAT GTGGTCTCTC TTTTCGTTGG GATCTTTCGA AAGGGCAGAT TGTGTGGACA 

GGTAATGGTT 

451 CAGACCATTT TCCTGTCCCG GTAGCGGTTA ACCTCATAAA ACAACTATTA CCAGACGATC AACTTGCGAA GGTAGAAGTT 

ACAACACCGC 

451 GTCTGGTAAA AGGACAGGGC CATCGCCAAT TGGAGTATTT TGTTGATAAT GGTCTGCTAG TTGAACGCTT CCATCTTCAA 

TGTTGTGGCG 

541 CCAGAACTTC AAGTGAAACT AAGGTAAGAA AACAAACAGA CGGTACTACA TATGTAACAC ACTCAATATC AACATAAGGT 

TAAACACAGG 

541 GGTCTTGAAG TTCACTTTGA TTCCATTCTT TTGTTTGTCT GCCATGATGT ATACATTGTG TGAGTTATAG TTGTATTCCA ATTTGTGT- 

CC 

631 GTCTTACAAC GGTAGAAGGA ACTTCAGTTA TGGAAAATTG AGCTAAGATA ATTGTTCCCA TAGTGGAAGT TTGAACTGAA 

GTCGTGCACA 

631 CAGAATGTTG CCATCTTCCT TGAAGTCAAT ACCTTTTAAC TCGATTCTAT TAACAAGGGT ATCACCTTCA AACTTGACTT 

CAGCACGTGT 

721 GAACATCAAC GGCAGTAGAA ACTTCTTCTA CCAGGAAAGG ACATGTATTG GAAGCCCGTA CCGTGAGAAC TTTTTCAGTA 

CGGCAAAGTA 

721 CTTGTAGTT CCGTCATCTT TGAAGAAGAT GGTCCTTTCC TGTACATAAC CTTCGGGCAT GGCACTCTTG AAAAAGTCAT GC- 

CGTTTCAT 

811 TACTAGGCCC ATAGAACTTT TCGTAACTTG TGGTATCGTG TCTCATCACT GATCACAACC GGTACCTTGT CCGTCAAACG 

GTCATCACGT 

811 ATGATCCGGG TATCTTGAAA AGCATTGAAC ACCATAGCAC AGAGTAGTGA CTAGTGTTGG CCATGGAACA GGCAGTTTGC 

CAGTAGTGCA 

901 CTACTTGAAG TCCCATTCAA AAGGCATACA ACGTAGTGGA AGTGGGAGAG GTGACTGTCT CTTGAACACC GGCAATTGTA 

GTGGTAGATT 

901 GATGAACTTC AGGGTAAGTT TTCCGTATGT TGCATCACCT TCACCCTCTC CACTGACAGA GAACTTGTGG CCGTTAACAT 

CACCATCTAA 

991 AAGTTGTTCTTAACCCTGTTGAGGTCACTTCTCAAGAAGAGGAAACGATCGGTG CCTAG 

991 TTCAACAAGAATTGGGACAACTCCAGTGAAGAGTTCTTCTCCTTTGCTAGCCAC G 

Schneiden des Vektors 

140 ATCAC G GATCCGCATGCGAGCTCGGTACCCCGGGTCGACCTGCA G CCAAGC 190 

140 TAGTG CCTAG GCGTACGCTCGAGCCATGGGGCCCAGCTG ACGTC GGTTCG 190 

10.6 seqenz des Zielplamid pQE-GFP 

1 CTCGAGAAAT CATAAAAAAT TTATTTGCTT TGTGAGCGGA TAACAATTAT AATAGATTCA ATTGTGAGCG GATAACAATT 

TCACACAGAA 

1 GAGCTCTTTA GTATTTTTTA AATAAACGAA ACACTCGCCT ATTGTTAATA TTATCTAAGT TAACACTCGC CTATTGTTAA AGTGTGTCTT 

91 TTCATTAAAG AGGAGAAATT AACTATGAGA GGATCGCATC ACCATCACCA TCACGGATCC GTGGCTAGCA AAGGAGAA-


GA ACTCTTCACT 

91 AG CACCGATCGT TTCCTCTTCT TGAGAAGTGA AGTAATTTC TCCTCTTTAA TTGATACTCT CCTAGCGTAG TGGTAGTGGT 

AGTGCCTAG 

181 GGAGTTGTCC CAATTCTTGT TGAATTAGAT GGTGATGTTA ACGGCCACAA GTTCTCTGTC AGTGGAGAGG GTGAAGGTGA 

TGCAACATAC 

181 CCTCAACAGG GTTAAGAACA ACTTAATCTA CCACTACAAT TGCCGGTGTT CAAGAGACAG TCACCTCTCC CACTTCCACT 

ACGTTGTATG 

271 GGAAAACTTA CCCTGAAGTT CATCTGCACT ACTGGCAAAC TGCCTGTTCC ATGGCCAACA CTAGTCACTA CTCTGTGCTA 

TGGTGTTCAA 

271 CCTTTTGAAT GGGACTTCAA GTAGACGTGA TGACCGTTTG ACGGACAAGG TACCGGTTGT GATCAGTGAT GAGACACGAT 

ACCACAAGTT 

361 TGCTTTTCAA GATACCCGGA TCATATGAAA CGGCATGACT TTTTCAAGAG TGCCATGCCC GAAGGTTATG TACAGGAAAG 

GACCATCTTC 

361 ACGAAAAGTT CTATGGGCCT AGTATACTTT GCCGTACTGA AAAAGTTCTC ACGGTACGGG CTTCCAATAC ATGTCCTTTC 

CTGGTAGAAG 

451 TTCAAAGATG ACGGCAACTA CAAGACACGT GCTGAAGTCA AGTTTGAAGG TGATACCCTT GTTAATAGAA TCGAGTTAAA 

AGGTATTGAC 

451 AAGTTTCTAC TGCCGTTGAT GTTCTGTGCA CGACTTCAGT TCAAACTTCC ACTATGGGAA CAATTATCTT AGCTCAATTT 

TCCATAACTG 

541 TTCAAGGAAG ATGGCAACAT TCTGGGACAC AAATTGGAAT ACAACTATAA CTCACACAAT GTATACATCA TGGCAGA- 

CAA ACAAAAGAAT 

541 AAGTTCCTTC TACCGTTGTA AGACCCTGTG TTTAACCTTA TGTTGATATT GAGTGTGTTA CATATGTAGT ACCGTCTGTT 

TGTTTTCTTA 

631 GGAATCAAAG TGAACTTCAA GACCCGCCAC AACATTGAAG ATGGAAGCGT TCAACTAGCA GACCATTATC AACAAAA- 

TAC TCCAATTGGC 

631 CCTTAGTTTC ACTTGAAGTT CTGGGCGGTG TTGTAACTTC TACCTTCGCA AGTTGATCGT CTGGTAATAG TTGTTTTATG 

AGGTTAACCG 

721 GATGGCCCTG TCCTTTTACC AGACAACCAT TACCTGTCCA CACAATCTGC CCTTTCGAAA GATCCCAACG AAAAGAGAGA 

CCACATGGTC 

721 CTACCGGGAC AGGAAAATGG TCTGTTGGTA ATGGACAGGT GTGTTAGACG GGAAAGCTTT CTAGGGTTGC TTTTCTCTCT 

GGTGTACCAG 

811 CTTCTTGAGT TTGTAACAGC TGCTGGGATT ACACATGGCA TGGATGAACT GTACAACTGA CTGCAGCCAA GCTTAATTAG 

CTGAGCTTGG 

811 GAAGAACTCA AACATTGTCG ACGACCCTAA TGTGTACCGT ACCTACTTGA CATGTTGACT GACGTCGGTT CGAATTAATC 

GACTCGAACC 

901 ACTCCTGTTG ATAGATCCAG TAATGACCTC AGAACTCCAT CTGGATTTGT TCAGAACGCT CGGTTGCCGC CGGGCGTTTT 

TTATTGGTGA 

901 TGAGGACAAC TATCTAGGTC ATTACTGGAG TCTTGAGGTA GACCTAAACA AGTCTTGCGA GCCAACGGCG GCCCGCAAAA 

AATAACCACT 

991 GAATCCAAGC TAGCTTGGCG AGATTTTCAG GAGCTAAGGA AGCTAAAATG GAGAAAAAAA TCACTGGATA TACCAC- 

CGTT GATATATCCC 

991 CTTAGGTTCG ATCGAACCGC TCTAAAAGTC CTCGATTCCT TCGATTTTAC CTCTTTTTTT AGTGACCTAT ATGGTGGCAA 

CTATATAGGG 

1081 AATGGCATCG TAAAGAACAT TTTGAGGCAT TTCAGTCAGT TGCTCAATGT ACCTATAACC AGACCGTTCA GCTGGATATT


ACGGCCTTTT 

1081 TTACCGTAGC ATTTCTTGTA AAACTCCGTA AAGTCAGTCA ACGAGTTACA TGGATATTGG TCTGGCAAGT CGACCTATAA 

TGCCGGAAAA 

1171 TAAAGACCGT AAAGAAAAAT AAGCACAAGT TTTATCCGGC CTTTATTCAC ATTCTTGCCC GCCTGATGAA TGCTCATCCG 

GAATTTCGTA 

1171 ATTTCTGGCA TTTCTTTTTA TTCGTGTTCA AAATAGGCCG GAAATAAGTG TAAGAACGGG CGGACTACTT ACGAGTAGGC 

CTTAAAGCAT 

1261 TGGCAATGAA AGACGGTGAG CTGGTGATAT GGGATAGTGT TCACCCTTGT TACACCGTTT TCCATGAGCA AACTGAAA- 

CG TTTTCATCGC 

1261 ACCGTTACTT TCTGCCACTC GACCACTATA CCCTATCACA AGTGGGAACA ATGTGGCAAA AGGTACTCGT TTGACTTTGC 

AAAAGTAGCG 

1351 TCTGGAGTGA ATACCACGAC GATTTCCGGC AGTTTCTACA CATATATTCG CAAGATGTGG CGTGTTACGG TGAAAACCTG 

GCCTATTTCC 

1351 AGACCTCACT TATGGTGCTG CTAAAGGCCG TCAAAGATGT GTATATAAGC GTTCTACACC GCACAATGCC ACTTTTGGAC 

CGGATAAAGG 

1441 CTAAAGGGTT TATTGAGAAT ATGTTTTTCG TCTCAGCCAA TCCCTGGGTG AGTTTCACCA GTTTTGATTT AAACGTGGCC 

AATATGGACA 

1441 GATTTCCCAA ATAACTCTTA TACAAAAAGC AGAGTCGGTT AGGGACCCAC TCAAAGTGGT CAAAACTAAA TTTGCAC- 

CGG TTATACCTGT 

1531 ACTTCTTCGC CCCCGTTTTC ACCATGGGCA AATATTATAC GCAAGGCGAC AAGGTGCTGA TGCCGCTGGC GATTCAGGTT 

CATCATGCCG 

1531 TGAAGAAGCG GGGGCAAAAG TGGTACCCGT TTATAATATG CGTTCCGCTG TTCCACGACT ACGGCGACCG CTAAGTC- 

CAA GTAGTACGGC 

1621 TTTGTGATGG CTTCCATGTC GGCAGAATGC TTAATGAATT ACAACAGTAC TGCGATGAGT GGCAGGGCGG GGCGTAATTT 

TTTTAAGGCA 

1621 AAACACTACC GAAGGTACAG CCGTCTTACG AATTACTTAA TGTTGTCATG ACGCTACTCA CCGTCCCGCC CCGCATTAAA 

AAAATTCCGT 

1711 GTTATTGGTG CCCTTAAACG CCTGGGGTAA TGACTCTCTA GCTTGAGGCA TCAAATAAAA CGAAAGGCTC AGTCGAAA- 

GA CTGGGCCTTT 

1711 CAATAACCAC GGGAATTTGC GGACCCCATT ACTGAGAGAT CGAACTCCGT AGTTTATTTT GCTTTCCGAG TCAGCTTTCT 

GACCCGGAAA 

1801 CGTTTTATCT GTTGTTTGTC GGTGAACGCT CTCCTGAGTA GGACAAATCC GCCCTCTAGA GCTGCCTCGC GCGTTTCGGT 

GATGACGGTG 

1801 GCAAAATAGA CAACAAACAG CCACTTGCGA GAGGACTCAT CCTGTTTAGG CGGGAGATCT CGACGGAGCG CGCAAAG- 

CCA CTACTGCCAC 

1891 AAAACCTCTG ACACATGCAG CTCCCGGAGA CGGTCACAGC TTGTCTGTAA GCGGATGCCG GGAGCAGACA AGCCCGT- 

CAG GGCGCGTCAG 

1891 TTTTGGAGAC TGTGTACGTC GAGGGCCTCT GCCAGTGTCG AACAGACATT CGCCTACGGC CCTCGTCTGT TCGGGCAGTC 

CCGCGCAGTC 

1981 CGGGTGTTGG CGGGTGTCGG GGCGCAGCCA TGACCCAGTC ACGTAGCGAT AGCGGAGTGT ATACTGGCTT AACTATG- 

CGG CATCAGAGCA 

1981 GCCCACAACC GCCCACAGCC CCGCGTCGGT ACTGGGTCAG TGCATCGCTA TCGCCTCACA TATGACCGAA TTGATACG- 

CC GTAGTCTCGT 

2071 GATTGTACTG AGAGTGCACC ATATGCGGTG TGAAATACCG CACAGATGCG TAAGGAGAAA ATACCGCATC AGGCGCTCTT


CCGCTTCCTC 

2071 CTAACATGAC TCTCACGTGG TATACGCCAC ACTTTATGGC GTGTCTACGC ATTCCTCTTT TATGGCGTAG TCCGCGAGAA 

GGCGAAGGAG 

2161 GCTCACTGAC TCGCTGCGCT CGGTCGTTCG GCTGCGGCGA GCGGTATCAG CTCACTCAAA GGCGGTAATA CGGTTATCCA 

CAGAATCAGG 2161 CGAGTGACTG AGCGACGCGA GCCAGCAAGC CGACGCCGCT CGCCATAGTC GAGTGAGTTT CCGCCAT- 

TAT GCCAATAGGT GTCTTAGTCC 

2251 GGATAACGCA GGAAAGAACA TGTGAGCAAA AGGCCAGCAA AAGGCCAGGA ACCGTAAAAA GGCCGCGTTG CTGG- 

CGTTTT TCCATAGGCT 

2251 CCTATTGCGT CCTTTCTTGT ACACTCGTTT TCCGGTCGTT TTCCGGTCCT TGGCATTTTT CCGGCGCAAC GACCGCAAAA 

AGGTATCCGA 

2341 CCGCCCCCCT GACGAGCATC ACAAAAATCG ACGCTCAAGT CAGAGGTGGC GAAACCCGAC AGGACTATAA AGATAC- 

CAGG CGTTTCCCCC 

2341 GGCGGGGGGA CTGCTCGTAG TGTTTTTAGC TGCGAGTTCA GTCTCCACCG CTTTGGGCTG TCCTGATATT TCTATGGTCC 

GCAAAGGGGG 

2431 TGGAAGCTCC CTCGTGCGCT CTCCTGTTCC GACCCTGCCG CTTACCGGAT ACCTGTCCGC CTTTCTCCCT TCGGGAAGCG 

TGGCGCTTTC 

2431 ACCTTCGAGG GAGCACGCGA GAGGACAAGG CTGGGACGGC GAATGGCCTA TGGACAGGCG GAAAGAGGGA AGC- 

CCTTCGC ACCGCGAAAG 

2521 TCATAGCTCA CGCTGTAGGT ATCTCAGTTC GGTGTAGGTC GTTCGCTCCA AGCTGGGCTG TGTGCACGAA CCCCCCGTTC 

AGCCCGACCG 

2521 AGTATCGAGT GCGACATCCA TAGAGTCAAG CCACATCCAG CAAGCGAGGT TCGACCCGAC ACACGTGCTT GGGGGG- 

CAAG TCGGGCTGGC 

2611 CTGCGCCTTA TCCGGTAACT ATCGTCTTGA GTCCAACCCG GTAAGACACG ACTTATCGCC ACTGGCAGCA GCCACTGG- 

TA ACAGGATTAG 

2611 GACGCGGAAT AGGCCATTGA TAGCAGAACT CAGGTTGGGC CATTCTGTGC TGAATAGCGG TGACCGTCGT CGGTGAC- 

CAT TGTCCTAATC 

2701 CAGAGCGAGG TATGTAGGCG GTGCTACAGA GTTCTTGAAG TGGTGGCCTA ACTACGGCTA CACTAGAAGG ACAGTATTTG 

GTATCTGCGC 

2701 GTCTCGCTCC ATACATCCGC CACGATGTCT CAAGAACTTC ACCACCGGAT TGATGCCGAT GTGATCTTCC TGTCATAAAC 

CATAGACGCG 

2791 TCTGCTGAAG CCAGTTACCT TCGGAAAAAG AGTTGGTAGC TCTTGATCCG GCAAACAAAC CACCGCTGGT AGCGGTGGTT 

TTTTTGTTTG 

2791 AGACGACTTC GGTCAATGGA AGCCTTTTTC TCAACCATCG AGAACTAGGC CGTTTGTTTG GTGGCGACCA TCGCCAC- 

CAA AAAAACAAAC 

2881 CAAGCAGCAG ATTACGCGCA GAAAAAAAGG ATCTCAAGAA GATCCTTTGA TCTTTTCTAC GGGGTCTGAC GCTCAGTGGA 

ACGAAAACTC 

2881 GTTCGTCGTC TAATGCGCGT CTTTTTTTCC TAGAGTTCTT CTAGGAAACT AGAAAAGATG CCCCAGACTG CGAGTCACCT 

TGCTTTTGAG 

2971 ACGTTAAGGG ATTTTGGTCA TGAGATTATC AAAAAGGATC TTCACCTAGA TCCTTTTAAA TTAAAAATGA AGTTTTAAAT 

CAATCTAAAG 

2971 TGCAATTCCC TAAAACCAGT ACTCTAATAG TTTTTCCTAG AAGTGGATCT AGGAAAATTT AATTTTTACT TCAAAATTTA 

GTTAGATTTC 

3061 TATATATGAG TAAACTTGGT CTGACAGTTA CCAATGCTTA ATCAGTGAGG CACCTATCTC AGCGATCTGT CTATTTCGTT 

CATCCATAGT


3061 ATATATACTC ATTTGAACCA GACTGTCAAT GGTTACGAAT TAGTCACTCC GTGGATAGAG TCGCTAGACA GATAAAGCAA 

GTAGGTATCA 

3151 TGCCTGACTC CCCGTCGTGT AGATAACTAC GATACGGGAG GGCTTACCAT CTGGCCCCAG TGCTGCAATG ATACCGC- 

GAG ACCCACGCTC 

3151 ACGGACTGAG GGGCAGCACA TCTATTGATG CTATGCCCTC CCGAATGGTA GACCGGGGTC ACGACGTTAC TATGGCGCTC 

TGGGTGCGAG 

3241 ACCGGCTCCA GATTTATCAG CAATAAACCA GCCAGCCGGA AGGGCCGAGC GCAGAAGTGG TCCTGCAACT TTATC- 

CGCCT CCATCCAGTC 3241 TGGCCGAGGT CTAAATAGTC GTTATTTGGT CGGTCGGCCT TCCCGGCTCG CGTCTTCACC AG- 

GACGTTGA AATAGGCGGA GGTAGGTCAG 

3331 TATTAATTGT TGCCGGGAAG CTAGAGTAAG TAGTTCGCCA GTTAATAGTT TGCGCAACGT TGTTGCCATT GCTACAGGCA 

TCGTGGTGTC 

3331 ATAATTAACA ACGGCCCTTC GATCTCATTC ATCAAGCGGT CAATTATCAA ACGCGTTGCA ACAACGGTAA CGATGTCCGT 

AGCACCACAG 

3421 ACGCTCGTCG TTTGGTATGG CTTCATTCAG CTCCGGTTCC CAACGATCAA GGCGAGTTAC ATGATCCCCC ATGTTGTGCA 

AAAAAGCGGT 

3421 TGCGAGCAGC AAACCATACC GAAGTAAGTC GAGGCCAAGG GTTGCTAGTT CCGCTCAATG TACTAGGGGG TACAA- 

CACGT TTTTTCGCCA 

3511 TAGCTCCTTC GGTCCTCCGA TCGTTGTCAG AAGTAAGTTG GCCGCAGTGT TATCACTCAT GGTTATGGCA GCACTGCATA 

ATTCTCTTAC 

3511 ATCGAGGAAG CCAGGAGGCT AGCAACAGTC TTCATTCAAC CGGCGTCACA ATAGTGAGTA CCAATACCGT CGTGACG- 

TAT TAAGAGAATG 

3601 TGTCATGCCA TCCGTAAGAT GCTTTTCTGT GACTGGTGAG TACTCAACCA AGTCATTCTG AGAATAGTGT ATGCGGCGAC 

CGAGTTGCTC 

3601 ACAGTACGGT AGGCATTCTA CGAAAAGACA CTGACCACTC ATGAGTTGGT TCAGTAAGAC TCTTATCACA TACGCCGCTG 

GCTCAACGAG 

3691 TTGCCCGGCG TCAATACGGG ATAATACCGC GCCACATAGC AGAACTTTAA AAGTGCTCAT CATTGGAAAA CGTTCTTCGG 

GGCGAAAACT 

3691 AACGGGCCGC AGTTATGCCC TATTATGGCG CGGTGTATCG TCTTGAAATT TTCACGAGTA GTAACCTTTT GCAAGAAGCC 

CCGCTTTTGA 

3781 CTCAAGGATC TTACCGCTGT TGAGATCCAG TTCGATGTAA CCCACTCGTG CACCCAACTG ATCTTCAGCA TCTTTTACTT 

TCACCAGCGT 

3781 GAGTTCCTAG AATGGCGACA ACTCTAGGTC AAGCTACATT GGGTGAGCAC GTGGGTTGAC TAGAAGTCGT AGAAAAT- 

GAA AGTGGTCGCA 

3871 TTCTGGGTGA GCAAAAACAG GAAGGCAAAA TGCCGCAAAA AAGGGAATAA GGGCGACACG GAAATGTTGA ATACT- 

CATAC TCTTCCTTTT 

3871 AAGACCCACT CGTTTTTGTC CTTCCGTTTT ACGGCGTTTT TTCCCTTATT CCCGCTGTGC CTTTACAACT TATGAGTATG 

AGAAGGAAAA 

3961 TCAATATTAT TGAAGCATTT ATCAGGGTTA TTGTCTCATG AGCGGATACA TATTTGAATG TATTTAGAAA AATAAACAAA 

TAGGGGTTCC 

3961 AGTTATAATA ACTTCGTAAA TAGTCCCAAT AACAGAGTAC TCGCCTATGT ATAAACTTAC ATAAATCTTT TTATTTGTTT AT- 

CCCCAAGG 

4051 GCGCACATTT CCCCGAAAAG TGCCACCTGA CGTCTAAGAA ACCATTATTA TCATGACATT AACCTATAAA AATAGGCGTA 

TCACGAGGCC 

4051 CGCGTGTAAA GGGGCTTTTC ACGGTGGACT GCAGATTCTT TGGTAATAAT AGTACTGTAA TTGGATATTT TTATCCGCAT


AGTGCTCCGG 

4141 CTTTCGTCTT CAC 

4141 GAAAGCAGAA GTG 

10.7 plasmidkarte erstellen

Protokoll f Â¨ur MolekularBiologische Praktikum - stinfwww

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