Kasper I Zellkulturtechnik LS 2010 - TCI @ Uni-Hannover.de

NameQuelle: Fonds der Chemischen IndustrieTCI Institut fürTechnische ChemieNameTCI Institut fürTechnische Chemie

Zusammensetzung der ZelleNameTCI Institut fürTechnische ChemieWozu braucht man Zellkulturen in vitro?• Zur Nachbildung und Untersuchung der in vivo Verhältnisse• Klärung der Fragen:wie wachsen Zellenwann und warum hören sie damit aufwas benötigen zum Wachstumwie und wodurch tritt der Zelltod einEntwicklungs- und Differenzierungsvorgänge• Heute vor allem im Bereichen wie Tumorforschung und in vitroTests sowie für gentechnische VeränderungTCI Institut fürTechnische Chemie

Adhärente Zellen• verankerungsabhängig• wachsen auf Oberfläche in Monolayern• flach, länglichsubkonfluentkonfluentNameQuelle: Zell- und Gewebekultur, Toni Lindl, 2002TCI Institut fürTechnische ChemieSuspensions-Zellen• nicht verankerungsabhängig• durch ständiges Rühren in Suspensiongehalten• kugelförmig, glatte OberflächesuspendiertNameTCI Institut fürTechnische Chemie

NameQuelle: Animal cell Technology: From Biopharmaceutical to Gene Therapy, 2008 by Taylor and Francis groupTCI Institut fürTechnische ChemieNameAnlegen von Zellbänken Für Forschung und Entwicklungszwecke vorteilhaft Vorgeschrieben für die Produktion von Biopharmazeutika Aus einem Zellklon Erhalt eines reproduzierbaren Startpunktes um Anzahl der Passagen gering zu haltenSCB (safty cell bank) MCB (master cell bank) WCB working cell bank PPCB (post production cell bank) Ca. je 100 – 300 Vials pro Zellbank Startpunkt für die Produktion meist WCBTCI Institut fürTechnische Chemie

Kultivierung von SäugetierzellenZellkulturmedien/ZusätzeEquipment/KultivierungsgefäßeZellenAnalyseNameTCI Institut fürTechnische Chemie- Zellkulturmedien und Zusätze -NameTCI Institut fürTechnische Chemie

Zellkulturmedien Versorgung der Zellen mit ausreichend Nährstoffen zur Aufrechterhaltungdes Zellmetabolismus (Anpassung der Medienzusammensetzungan den Zelltyp)Sie enthalten:• Nährstoffe für die wichtigsten Zellfunktionen/ Stoffwechselvorgänge• Aminosäure für Proteinsynthese• Vitamine und Spurenelemente für Wachstum und Differenzierung• Salze etc. z.B. für Anheftung (z.B. Ca 2+ )NameTCI Institut fürTechnische Chemie• Temperatur: 37 °C• pH-Bereich: 6,8 - 7,5• NaHCO 3-Puffersystem/ Hepes-Puffer• CO 2Zufuhr (angepasst an die Menge von NaHCO 3) bei 37°C und 1,2 g/L NaHCO 3soll der pH-Wert 7,2 5 % CO 2Phenolrot (Farbstoffindikator) im Sauren gelb im Basischen pinkNameQuelle: Zell- und Gewebekultur, Toni Lindl, 2002TCI Institut fürTechnische Chemie

Zellkulturmedium• Puder—Lösung ansetzten und sterilisieren günstig• Konzentrat—auf gewünschte Konzentration mit deionisiertem Wasser(steril) verdünnen• Fertigmedium (flüssig)—direkter Einsatz teuer Lagerung bei + 4°C Zellkulturmedium NICHT autoklavieren(z.B Denaturierung von Proteinenmöglich) Sterilfiltration (0,2 µm Porengröße)NameTCI Institut fürTechnische ChemieZellkulturmedienMEM (Eagle 1959)DMEM (Dulbecco 1959)HAM´s F 12 (Ham 1965)RPMI (Moore 1967)NameTCI Institut fürTechnische Chemie

DME- und RPMI-1640 MediumNameTCI Institut fürTechnische ChemieGlukose für GlykolyseMediumzusätzeGlutamin als essentielle AminosäureProteine:Albumin Transport von Lipiden, Mineralien, GlobulineTransferrin Eisenbindung (Transportprotein)Insulin unterstützt Aufnahme von Glukose und ASFibronectin Glykoprotein, Unterstützt die Zellanhaftungetc.Antifoam Pluronic F 68, Antifoam C . . .NameAntibiotika/ Antimykotikum• Penicillin/ Streptomycin/ Neomycin gegen Bakterien• Amphotericin gegen PilzeTCI Institut fürTechnische Chemie

MediumzusätzeSerum Wachstumsfaktoren, Hormone, Adhäsionsmoleküle, ProteineBeispiele: Fötales Kälberserum (FCS), Serum neugeborener Kälber (NKS),Pferde- und Humanserum etc.Problem: Infektionspotential, Schwankungen der Seruminhaltsstoffe von Chargezu ChargeSerumersatzstoffe• serumfrei/ proteinfrei• natürlicher Herkunft (Soja, Erbse, Getreide)• synthetisch (z.B. Syn Q)NameVorteil chemisch definierter Medien gegenüber serumhaltiger Kultur: Arbeiten unter definierten und kontrollierten Bedingungen Vermeidung von Kontaminationen Vermeidung qualitativer/ quantitativer Schwankungen in den BestandteilenTCI Institut fürTechnische ChemieKontaminationen• Bakterien (meist beweglich)• Hefen („Perlenschnüre“)• Pilze (Fäden)• MycoplasmenNameTCI Institut fürTechnische Chemie

KontaminationenHefenSchimmel/PilzeMycoplasmenBakterienNameQuelle: Culture of Animal cells. R. Ian Freshney, 2000TCI Institut fürTechnische Chemie- Equipment und Kultivierungsgefäße -NameTCI Institut fürTechnische Chemie

ZellkulturequipmentSterilbank• ruhige Ecke (extra Raum)• Anschlüsse für Elektrik,Vakuum und Gas• UV-Lampe• tägliches Säubern mit 70 %IsopropanolNameTCI Institut fürTechnische ChemieFunktionsweise einer SterilbankSicherheitsklasse 1 Sicherheitsklasse 2 Produktschutz Produkt- u. PersonenschutzQuelle: Kultur tierischer Zellen, S.J. Morgan, D.C. Darling,1994NameTCI Institut fürTechnische Chemie

Arbeiten an der SterilbankName Handschuhe, 70 % IsopropanolTCI Institut fürTechnische ChemieSO NICHT !!!NameTCI Institut fürTechnische Chemie

Brutschrank/ Inkubator 37 o C, 5 % CO 2NameTCI Institut fürTechnische ChemieKryocontainer (Lagerung von Zellkulturen)Zellen können über mehrere Jahre inflüssigem Stickstoff bei -196 °C oderbei -80 °C für einige Monate gelagertwerden.Kryoröhrchen• Zellen werden in der exponentiellenWachstumsphase (hohe Vitalität)eingefroren• „Gefrierschutz“-Zusatz DMSONameTCI Institut fürTechnische Chemie

AutoklavName 121°C, 20 – 40 Min., 1 barTCI Institut fürTechnische ChemieZentrifugeNameTCI Institut fürTechnische Chemie

Kultivierungssysteme/ BioreaktorenNameTCI Institut fürTechnische ChemieAnforderungen an einen BioreaktorTemperaturkontrollepH-Wert KontrolleVersorgung mit SauerstoffVersorgung mit NährstoffenScherstressarme, homogene DurchmischungKeine StofftransportlimitierungenAusreichend Oberfläche für adhärentwachsende ZellenSterile BedingungenNameTCI Institut fürTechnische Chemie

Homogenen BioreaktorsystemeZellen + Kulturmediumsuspendierte ZellenHeterogene BioreaktorsystemeZellen + Träger + Kulturmediumadhärente ZellenNameTCI Institut fürTechnische ChemieIm Inkubator(nicht kontrolliert)SuspensionskulturBioreaktor (kontroliert)Spinner-Flasche Super-SpinnerRührkesselreaktorNameWave/Cultibag-Reaktor. . .TCI Institut fürTechnische Chemie

Adhärente KulturInkubator(nicht kontrolliert)Microcarrier• Dextran, Polysteren, Glas,Cellulose . . .• Durchmesser: 100 -300 µm• Dichte ~1.02 g/cm 3 . . .HohlfaserreaktorT-Flasche Roller-Bottle(statisch) (dynamisch)FestbettreaktorName. . .TCI Institut fürTechnische ChemieBegasungsarten- Oberflächenbegasung (blasenfrei)- Silikonschlauch- oder Membranbegasung (blasenfrei)- direkte Begasung (z.B. Sparger)aMögliche Interaktionen zwischen Zellen und Gasblasen,welche für die Zellschädigungen verantwortlich sein können.a) sehr hoher Scherstress beim Zerplatzen der Gasblasebb) durch die Scherkräfte zwischen den Gasblasen oder imSchaumNameTCI Institut fürTechnische Chemie

Beispiele für Rührer:Propeller (Marine Type)ScheibenrührerNameTCI Institut fürTechnische ChemieBeurteilung der Zellkultur(Analyse)NameTCI Institut fürTechnische Chemie

Beurteilung einer Zellkultur• Morphologie• Größe/ Zellzahl• Vitalität (Wachstumskurve)• Zellzyklusanalyse•Substratverbrauch (Glukose, Aminosäuren . . . )• Stoffwechselmetabolite (Laktat, NH+ 4 . . . )•. . .NameTCI Institut fürTechnische ChemieMikroskopMorphologieGröße/ ZahlNeubauerzählkammerNameTCI Institut fürTechnische Chemie

NameTCI Institut fürTechnische ChemieUnterschiedliche MorphologieNameTCI Institut fürTechnische Chemie

Wachstumskurve1602,50cell number [10 4 ]12080402,001,501,000,50concentration [g l -1 ]deadaliveglucoselactate00,000 2 4 6 8days• 1-2 Lag Phase• 3 exponentielle Phase• 4-6 stationäre Phase/Plateau• 7 AbsterbephaseNameTCI Institut fürTechnische ChemieZelltodDurch Nekrose: Zellschädigung durch z.B. mechanischeEinflüsse (Rührer)„normaler Zelltod“Durch Apoptose: „Programmierter Zelltod“NameTCI Institut fürTechnische Chemie

Apoptose/NekroseNameTCI Institut fürTechnische ChemieZellzyklusanalyseZellzyklus DNA-Gehalt Fluoreszenzmarkierung Mittels DurchflusszytometrieDNA-GehaltMessung des Signals(nach Färbung mit PI Propidiumjodid)NameTCI Institut fürTechnische Chemie

Glukose/ Laktat-BestimmungNameTCI Institut fürTechnische ChemieGlucose/ Laktat-BestimmungNameTCI Institut fürTechnische Chemie

- Kultivierungsmodi -NameTCI Institut fürTechnische ChemieKultivierungsmodi1. Batch-Kultur2. Fed-Batch-Kultur3. Perfusions-Kultur4. Chemostat-KulturNameTCI Institut fürTechnische Chemie

Das ideale SystemDer Organismus ist formalgesehen ein PerfusionssystemAbfallstoffe werden„kontinuierlich“ entferntNährstoffe werden„kontinuierlich“ zugeführtZellen werdenzurückgehaltenNameTCI Institut fürTechnische ChemieDas Perfusionssystem• Bedingungen für die Zellen sind immer optimal• Im Organismus:Aufbau von SpeichernGUT!GUT?• Für die Zellkultur bedeutet es, dass auseinem großen Angebot an Nährstoffenimmer nur das gerade Notwendigeverbraucht wird=> Verschwenderischer Umgang mit RohstoffenSCHLECHT!NameTCI Institut fürTechnische Chemie

Das Fed-Batch System• Kontinuierliche Nährstoffzufuhr ist gewährleistet• „Geringer“ technischer Aufwand• Einfache Prozesssteuerung• Toxische Metabolite akkumulieren im System• Reaktorvolumen begrenzt die KultivierungsdauerNameTCI Institut fürTechnische ChemieDie FütterungsstrategieDie Kultur wird mit einemMinimalmedium angeimpftDie Fütterung ersetzt nur dieverbrauchten Substrate⇒ Optimale Versorgungmit Nährstoffen⇒ Sehr gute KultivierungsbedingungenPROBLEM:Welche Nährstoffe müssen in welchen Mengenergänzt werden?NameTCI Institut fürTechnische Chemie

Kinetische Model• Bestimmung der VerbrauchsratenName=> Substratverbrauch in mg pro Zelle und Tag=> Mengenverhältnisse der Substrate=> Fütterungsmedium• Die Fütterungsrate wird durch die ermittelteZelldichte bestimmt und angepaßtPROBLEM:Die Verbrauchsraten sind nicht konstant und abhängigvon Umgebungsparametern!TCI Institut fürTechnische ChemieKinetisches Modell• Die Bestimmung der Verbrauchsraten erfolgt imBatch-Modus bei exponentiellem Wachstum=> Andere Bedingungen als im Fed-Batch-System=> Ungenaue Substratverhältnisse im Fütterungsmedium=> Keine optimale Fütterung• Änderungen in der Fütterungsrate veränderndie Kultivierungsbedingungen=> Keine optimale FütterungNameTCI Institut fürTechnische Chemie

Kinetisches Modell=> Nach jedem Versuchsdurchlauf müssen dieVerbrauchsraten neu berechnet und dasFütterungsmedium modifiziert werden=> Es sind sehr viele Versuchsdurchläufe notwendig,um das Fütterungsmedium anzupassen=> Sehr hoher AufwandNameTCI Institut fürTechnische ChemieStöchometrische ModelBestimmung der Zellzusammensetzung% GlukoseDie ZelleKern% DNAKernProtein LipideProtein% ProteinKohlenhydrateLipideKohlenhydrate% Lipid=> Anteile der Substrate in einer Zelle=> Zusammensetzung des Fütterungsmediums% ASPROBLEM:NameDie Fütterungsrate wird durch die ermittelteZunahme der Zellzahl bestimmtDie Zellzusammensetzung ist nicht konstant und abhängigvon Umgebungsparametern!TCI Institut fürTechnische Chemie

Stöchiometrisches ModellDurch Verwendung von Literaturdaten kann schnell eineZellzusammensetzung ermittelt werdenDurch eine Vielzahl von Literaturdaten kann leicht eineDurchschnittszusammensetzung ermittelt werden=> Das Fütterungsmedium ist für das exponentielleWachstum nicht optimal geeignet, stößt abernicht so schnell an seine Grenzen, wenn sichdie Kultivierungsbedingungen verändernNameTCI Institut fürTechnische ChemieStöchiometrisches ModellVorteil gegenüber dem kinetischen Model:Es stehen ausreichend Literaturdaten zu Verfügung,um ein gemitteltes Fütterungsmedium zu berechnen=> Schnellere Entwicklung des FütterungsmediumsNameTCI Institut fürTechnische Chemie

Stöchiometrisches ModellGlukose Ala Asp Asn Glu Gly Pro Ser Glutamin andere essentielleAminosäurenCarbohydrate Nukleotide zelluläreund LipideProteineEnergieproduktionZellmasseProduktStöchiometrische Gleichung:Name2010[ glucose θglc[ ] se] +∑ ∑ θa,,i[ amino oacids acids ] + ] ∑vj[ vita, [ vitamins ]i ∑θ,i= ]θ + θ + θ=θ20glc a i i v j ii= 1j=1i = 1j = 110[ ] [ ] [ ]massθpproduct+ θATPATP + W ⋅ ZPprotein+ W ⋅ ZDDNA+ W ⋅ ZRRNA+ W ⋅ ZLlipids+ W ⋅ ZCcarbohydratescell[ product ] + [ ATP] + [ W⋅ Z protein + W⋅ Z DNA + W⋅ Z RNA + W⋅ Z lipids + W⋅Z carbohydrates ]p ATP P D R L C cell massZ L , Z C , Z D and Z R = dry weight percentage of lipids,carbohydrates, DNA and RNAW= average dry cell weightq= stoichiometric coefficientTCI Institut fürTechnische Chemiekinetisch vs. stöchometrischErmittlung derVerbrauchsraten„kinetisch“Korrektur derVerbrauchsratenusw.Korrektur derVerbrauchsratenEine Vielzahl von Experimenten. Mit jedem Schritt wirddas Medium besser angepaßt.Experimente+„stöchiometrisch“MedienzusammensetzungKorrekturenNameLiteraturdatenTCI Institut fürTechnische Chemie

- Zelle als Produzent -NameTCI Institut fürTechnische ChemieProduktion rekombinanter Proteine Rekombinant DNA Technologie, 1970-1980 1982 rekombinantes Humaninsulin Posttranslationale ModifikationTierische Zellkultur• 1987 rekombinantes t-PA (Activase® Genentech,USA)• 60 -70 % aller rekombinanter Proteine in derPharmaindustrie (aus Tierzellkultur)• Produkttiter: > Gramm pro LiterNameTCI Institut fürTechnische Chemie

Zelllinien für dieProduktion rekombinanter Proteine schnelles Wachstum Wachstum in chemisch definiertem Medium Aufnahme von Expressionsvektoren (Beibehaltung in Kultur) Optimierung hinsichtlich Ihrer ProduktivitätUrsprungsorganismusZelllinien in der IndustrieHuman HEK 293MausChinese HamsterSyrian HamsterNSO, SP2/0, HybridomCHOBHKNameTCI Institut fürTechnische ChemieRekombinate Proteine für dentherapeutischen EinsatzNameTCI Institut fürTechnische Chemie

Rekombinante DNA-TechnologieEinbau eines fremden Gens in einen Expressionsvektorsowie die stabile Integration dieser Expressionsvektorenin die Wirts-Zelllinie.Optimierung der Kulturbedingungen dieser Zellen zurHerstellung des Produktes, für das das „fremde“ Gen codiert.Herstellung von Expressionssystemen, d.h.Organismen zu befähigen durch veränderte Geneneue Produkte zu produzieren.( Herstellung therapeutisch wirksamer Proteine)NameTCI Institut fürTechnische ChemieSchematischer Ablauf einer gentechnischenVeränderungNameTCI Institut fürTechnische Chemie

Schematischer Ablauf einer gentechnischenVeränderung (tierische Zellen)• Transkription der gewünschten DNA-Sequenz in mRNA• extrahieren der mRNA u. Transkription in cDNA• Einbau der cDNA in Vektoren• Vervielfältigung der Vektoren in Bakterien (Klonierung)• Isolierung der klonierten Kopien der cDNA• Einbau der klonierten cDNA in Expressionsvektor• Überführung des Expressionsvektors in Wirts-Zelllinie(Transfektion)transient zeitweiligstabil dauerhaft (ins Genom)• Selektion der transfizierten Zellen mit hoher TranskriptionsaktivitätNameTCI Institut fürTechnische ChemieQuelle: Animal cell Technology: From Biopharmaceutical to Gene Therapy, 2008 by Taylor and Francis groupNameTCI Institut fürTechnische Chemie

NameQuelle: Animal cell Technology: From Biopharmaceutical to Gene Therapy, 2008 by Taylor and Francis groupTCI Institut fürTechnische ChemieGentransfer in Säugetierzellen1. Physikalische Methoden• Elektroporation• Mikroinjektion (vor allem transgene Tiere)• Genkanone (Gold/Wolframpartikel – vor allem PflanzenEffizienz: 10 -7 )• Ca-Phosphat vermittelte Transfektion (Präzipitation)• Liposomen• kationische Lipide• Liganden (Protein-) vermittelter Gentransfer• . . .NameTCI Institut fürTechnische Chemie

Elektroporation• Zellmembran wird durch einenelektr. Impuls kurzfristigpermeabel und die DNA kannin die Zelle gelangen• Zeigt bei einigen Zelllinieneine hohe Effizienz (z.B.menschliche Lymphocyten)NameTCI Institut fürTechnische ChemieMikroinjektionDabei wird mit einerMikrokapillare eine DNA-Lösungdirekt in den Zellkern eingebracht.(deswegen eine hoheTransfektionseffizienz)Die Methode funktioniert aber nurex vivo.NameTCI Institut fürTechnische Chemie

GenkanoneDie Transfektion nutzt DNA-beschichteteWolfram und Goldpartikel,die mit hoherGeschwindigkeit auf dieZielzellen geschossenwerden.NameTCI Institut fürTechnische ChemieCa-Phosphat PräzipitationNameTCI Institut fürTechnische Chemie

2. Virale Methoden• retrovirale Vektoren (vor allem Gentherapie)• adenovirale Vektoren (leicht zu produzieren und stabil bei Lagerung– aber Immunreaktion!)• Herpesviren• Alphaviren (RNA-Virus – verursacht Proteinexpressiondirekt ohne über Translation/DNA)NameTCI Institut fürTechnische ChemieHybridom-Technik Herstellung monoklonaler AntikörperMilstein/Köhler 1975NameTCI Institut fürTechnische Chemie

Antikörper für den therapeutischen EinsatzNameTCI Institut fürTechnische ChemieMonoclonal Antibody ProductionNameTCI Institut fürTechnische Chemie

NameTCI Institut fürTechnische Chemie