Kapillarelektrophorese - TCI @ Uni-Hannover.de

Kapillaraffinitätselektrophorese (CAE)• Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen einemRezeptor und Liganden• Bestimmung von Bindungskonstanten und -stöchiometrie• Unterschied in der Mobilität zwischen Protein und demgebildeten Komplex‣ Ligand trägt eine Ladung‣ Molekulargewicht des Komplexes unterscheidet sich wesentlichvon der des ProteinsMicellarelektrokinetische ChromatographieMEKC• Hybridtechnik aus Elektrophorese und Chromatographie• Zusatz von Micellenbildnern (Detergenzien) zumPuffersystem pseudostationäre Phase aus geladenenMicellen• Trennung basierend auf Verteilung der Analyte zwischenLösung und MicelleninnerenPD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische ChemiePD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische ChemieElektropherogramm• Neutralmoleküle erhalten elektrophoretische Mobilität u i'⎛ k⎟ ⎞iu⎜i= uMC'⎝1+ki⎠‣ Abhängig von Mobilität der Micelle u MC und dem Kapazitätsfaktork‘ i• Kapazitätsfaktor k‘ i ist Verhältnis der Analytaufenthaltszeitin der mobilen zur pseudostationären Phase'k =iti− t0⎛ t ⋅⎜ −ito1⎝ tMC⎞⎟⎠• Auflösung R zweier KomponentenR =t01−'N α −1k2tMC⋅ ⋅ ⋅'{ 4 21 α31+k t2 0 '1+⋅k1SelektivitättMC14 44 24443EffizienzElektropherogrammRe tention• Verbesserung der Auflösung durch:‣ Steigende Micellbildnerkonzentration‣ Vergrößerung des Zeitfensters des Migrationsbereichs‣ Wahl unterschiedlicher Micellbildner‣ Änderung in der Zusammensetzung der wässrigen PhasePD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische ChemiePD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische ChemieKapillargelelektrophorese (CGE)VorteileNachteileSchnellere TrennzeitenKeine präparative ProbensammlungOnline-DetektionKeine parallele Trennung mehrerer ProbenGeringer Arbeits- und Geräteaufwand Nicht zweidimensional durchführbarPD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische ChemieIsoelektrische Fokussierung (CIEF)• Trennung nach unterschiedlichen Masse/Ladungs-verhältnissen• DNA-Moleküe und SDS-denaturierte Proteine besitzenbei unterschiedlichen Massen sehr ähnliche Masse/Ladungsverhältnissen• Gelmedium bewirkt einen Siebeffekt und behindert dieelektrophoretische Wanderung der größeren Molekülestärker als die der kleineren• Vergleich mit klassischen Gelelektrophorese• Trennung der Analyten nach ihrem isoelektrischen Punkt• Injektion der Probe in einem Ampholytgemisch in dieKapillare• Eine starke Säure wird an der Anode platziert (Anolyt),eine starke Base dient als Kathodenpuffer (Katholyt).• Anlegen der Spannung pH-Gradient Ampholyt-Ionen wandern entsprechend ihrem pI.• Bei pI = pH endet die elektrophoretische Wanderung.PD Dr. C. KasperAnode+DiffusionE-FeldKathode+ --Ladung desVerd.H 3PO4AnalytmolekülspH = pIVerd.NaOHTCIInstitut fürTechnische Chemie