Telomere und Telomerase – ihre Bedeutung als prognostischer ...
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MATERIAL <strong>und</strong> METHODEN 45<br />
2.2.1.6. Färbung der Actin-Filamente mittels Rhodamin-Phalloidin<br />
Phalloidin ist ein hochgiftiges Alkaloid, das aus dem Knollenblätterpilz Amanita<br />
phalloides isoliert wird. Durch seine spezifische Bindung an Actin-Filamente kann es<br />
in Form fluoreszierender Derivate (z.B. Rhodamin-Phalloidin) zur Anfärbung der<br />
Actin-Filamente von Zellen verwendet werden.<br />
Für die Phalloidin-Färbung wurden die Zellen in Kammern von „Chamber Slides“<br />
(aus Glas) kultiviert. Nach 2-tägiger Inkubation bei 37°C auf diesen speziellen<br />
Objektträgern wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen <strong>und</strong> anschließend 10<br />
min mit 4%iger Paraformaldehyd (PFA) -Lösung fixiert. Nachdem die Zellen<br />
wiederum dreimal mit PBS gewaschen worden waren, wurden die Zellen 5 min mit<br />
dem Detergens Triton X-100 (0,25% in PBS) behandelt. Nach erneutem dreimaligem<br />
Waschen mit PBS wurden die Zellen mit 200 µl Phalloidin-Lösung (5 µl 6,6 µM<br />
Phalloidin-Stammlösung in 200 µl PBS/BSA1%; BSA, Rinderserumalbumin) 1 h unter<br />
Lichtausschluss bei RT inkubiert. Um einen Fluoreszenzverlust von Rhodamin zu<br />
vermeiden, wurden die folgenden Arbeitsschritte in einem abgedunkelten Raum<br />
durchgeführt. Nach 3 Waschschritten mit PBS wurden die Zellen kurz mit 70%iges<br />
Ethanol behandelt, so dass sie anschließend mit Vectashield ® eingedeckt werden<br />
konnten. Die Auswertung dieser Färbung erfolgte mit Hilfe eines Fluoreszenz- bzw.<br />
konfokalen Lasermikroskops.<br />
2.2.1.7. Nachweis von p53<br />
Die WTS-Zelllinien wurden anhand von Cytospins auf <strong>ihre</strong>n p53-Status untersucht.<br />
Für die Präparation der Cytospins (1000 rpm, 8 min) wurden jeweils 10 4 Zellen der<br />
WTS-Zelllinien (10 4 Zellen/100 µl Zellkulturmedium) eingesetzt. Die Färbung des<br />
Tumorsuppressor-Proteins p53 erfolgte mit einem monoklonalen Antikörper der<br />
Firma DAKO, dessen Erkennungsstelle sich am N-Terminus zwischen den<br />
Aminosäuren 19 bis 26 des menschlichen p53-Proteins befindet. Mit Hilfe des<br />
Antikörpers kann der p53-Status (Wildtyp, mutierte Form) der Zellen festgestellt<br />
werden. Die mutierte Form ist durch eine bräunliche Färbung der Zellkerne vom<br />
Wildtyp zu unterscheiden.
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