Telomere und Telomerase – ihre Bedeutung als prognostischer ...

MATERIAL und METHODEN 63
RNA-Gele unter UV-Licht (302 nm). Die 28S rRNA- und die 18S rRNA-Bande der
Proben sollten als scharfe Banden im Gel zu detektieren sein, wobei die 28S rRNA-
Bande zweimal intensiver ist als die 18S rRNA-Bande. Die Ergebnisse wurden mit
Hilfe des Videodokumentationssystems festgehalten.
2.2.2.3.2. cDNA-Synthese
Die cDNA-Synthese erfolgte mit Hilfe des „TaqMan Reverse Transcription Reagents
kit“, indem mRNA als Ausgangsmaterial für die cDNA-Synthese diente. Hierfür
wurden 2 µg RNA je Probe in 38,5 µl RNase-freiem Wasser eingesetzt und
anschließend mit 61,5 µl Reverse Transkription (RT)-Reaktionsmix (siehe Tab. 2.9)
versetzt.
RT-Reaktionsmix
Reagenz µl pro Ansatz
10xTaqMan RT Puffer 10
25 mM MgCl2
22
2,5 mM dNTP Mix 20
50 µM Random Hexamere 5
RNase Inhibitor (20 U/µl) 2
Multi Scribe Reverse
Transkriptase (50 U/µl)
Tab. 2.9: Zusammensetzung des Reverse Transkription (RT)-Reaktionsmix für die cDNA-Synthese;
dNTP: Desoxynukleotidtriphosphat.
Die Hybridisierung der „Random Hexamere“ an die Ausgangs-DNA wurde für 10 min
bei 25°C durchgeführt, anschließend erfolgte die cDNA-Synthese für 60 min bei
48°C, bevor im letzten Schritt das Enzym für 5 min bei 95°C inaktiviert wurde.
2.2.2.3.3. Real-time TaqMan ® PCR
Die katalytische Untereinheit der Telomerase (hTERT) wurde durch real-time
TaqMan ® PCR quantifiziert.
Aufbauend auf den Arbeiten von Holland et al. (1991) und Lee et al. (1993) wurde die
TaqMan ® -Technologie entwickelt, welche die Möglichkeit bietet, PCR-Produkte
während ihrer Amplifikation zu detektieren.
2,5