Aus der Psychiatrischen und Psychotherapeutischen Klinik der ...

Aus der Psychiatrischen und Psychotherapeutischen Klinik
der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Direktor: Prof. Dr. med. Johannes Kornhuber
Die Rolle verschiedener Polymorphismen
auf die Ausprägung des
menschlichen Chronotypen –
„Lerche“ und „Eule“
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Medizinischen Fakultät
der
Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
vorgelegt von
Philipp Prause
aus
München

Gedruckt mit Erlaubnis der
Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. Jürgen Schüttler
Referent: Prof. Dr. med. Stefan Bleich
Korreferent: Prof. Dr. med. Helge Frieling
Tag der mündlichen Prüfung: 15. Dezember 2010

Inhaltsverzeichnis
1 Zusammenfassung ...................................................................................... 1
1.1 Hintergrund und Ziele ........................................................................... 1
1.2 Methoden .............................................................................................. 1
1.3 Ergebnisse und Beobachtungen ........................................................... 1
1.4 Parktische Schlussfolgerungen ............................................................ 2
2 Summary ..................................................................................................... 3
2.1 Aims and Background ........................................................................... 3
2.2 Methods ................................................................................................ 3
2.3 Results and Observations ..................................................................... 3
2.4 Conclusion ............................................................................................ 4
3 Einleitung ..................................................................................................... 5
3.1 Grundsätzliche Überlegungen .............................................................. 5
3.2 Grundlagen des menschlichen Schlafes ............................................... 6
3.2.1 Sinn und Zweck des Schlafes ........................................................... 6
3.2.2 Schlaf im Allgemeinen ....................................................................... 7
3.2.3 Schlafeinleitung, Schlafphasen und Schlafaufrechterhaltung ........... 8
3.2.4 Schlaf – Wach – Rhythmus (die zirkadiane Periodik) ........................ 9
3.2.5 Schlafstörungen .............................................................................. 11
3.3 Clock – Gene ...................................................................................... 12
3.4 Lerche und Eule ................................................................................. 13
3.5 Untersuchte Gene und Polymorphismen ............................................ 14
3.5.1 Adenosinrezeptoren ........................................................................ 14
3.5.2 Polymorphismen, die in Zusammenhang mit psychiatrischen
Erkrankungen gesehen werden können .................................................... 18
3.5.3 Polymorphismen, die bereits in Hinblick auf den Chronotypen
untersucht worden sind .............................................................................. 23
3.5.4 Weitere Polymorphismen in Zusammenhang mit dem menschlichen
Schlaf 25
3.5.5 Polymorphismus C T 677 der Methylentetrahydrolatreduktase .. 25
4 Material und Methoden .............................................................................. 27
4.1 Chemikalien und Enzyme ................................................................... 27
4.1.1 Lösungen und Puffer ....................................................................... 27

4.1.2 Oligonukleotide ............................................................................... 27
4.1.3 Sonstige Geräte und Materialien ..................................................... 29
4.2 Vorgehen bei der Probandenauswahl................................................. 30
4.2.1 Rekrutierung der Probanden ........................................................... 30
4.2.2 Eingruppierung der Probanden mittels Fragebögen - Die deutsche
Übersetzung des Morningness-Eveningness-Questionnaires (D-MEQ) .... 30
4.2.3 Blutentnahme zur DNA – Gewinnung ............................................. 31
4.3 Mikrobiologische und molekularbiologische Methoden ....................... 31
4.3.1 Sterilisieren ..................................................................................... 31
4.3.2 DNA – Extraktion............................................................................. 32
4.3.3 Polymerase – Ketten – Reaktion (PCR) .......................................... 32
4.3.4 Übersicht über die verwendeten Primer .......................................... 34
4.3.5 Etablierung der PCR – Bedingungen .............................................. 34
4.3.6 PCR – Protokolle............................................................................. 35
4.3.7 PCR – Verdau ................................................................................. 36
4.3.8 DNA – Agarose – Laufpuffer ........................................................... 38
4.3.9 Verwendeter Standard .................................................................... 39
4.3.10 Ergebnisse der PCR – Etablierung .............................................. 40
5 Ergebnisse ................................................................................................. 42
5.1 Ergebnisse der Probandenrekrutierung .............................................. 42
5.1.1 Rücklauf der Fragebögen ................................................................ 42
5.1.2 Auswertung der D – MEQ ............................................................... 43
5.2 Fehlende Werte .................................................................................. 43
5.3 Zusammenhang zwischen Chronotyp und Alter ................................. 44
5.4 Ergebnisse der einzelnen Polymorphismen in Zusammenhang mit dem
D-MEQ .......................................................................................................... 44
5.4.1 Polymorphismus T C 3111 des hClock – Gens .......................... 44
5.4.2 Polymorphismus T C 1976 des A2A – Adenosinrezeptors........... 46
5.4.3 Der Insertions/Deletions – Polymorphismus des Angiotensin –
Coverting – Enzyms ................................................................................... 48
5.4.4 Polymorphismus der 5 – Hydroxytryptophan – Transporter – linked –
region 50
5.4.5 Der Single – Nucleotid – Polymorphismus im 5 – HT1A – Rezeptor
51
5.4.6 Polymorphismus der Catechol – O – Methyl – Transferase ............ 53

5.4.7 Polymorphismus C T der Methylentetrahydrofolatreduktase ...... 55
5.4.8 Polymorphismus C T 2592 des A2A – Adenosinrezeptors ........... 57
5.4.9 Polymorphismus G A 22 der Adenosindeaminase ..................... 58
5.4.10 Polymorphismus T G 716 des A1 – Adenosinrezeptors .......... 60
5.4.11 Polymorphismus C T 263 des A2A – Adenosinrezeptors ......... 62
6 Diskussion ................................................................................................. 64
6.1 Diskussion der Studienkollektives - Zusammensetzung der
Studienpopulation .......................................................................................... 64
6.2 Korrelation von Alter und Chronotypen ............................................... 64
6.3 Diskussion der Ergebnisse der einzelnen Polymorphismen in
Zusammenhang mit dem D-MEQ .................................................................. 65
6.3.1 Allgemeines .................................................................................... 65
6.3.2 Polymorphismus T C 3111 des hClock – Gens .......................... 65
6.3.3 Polymorphismus T C 1976 des A2A – Adenosinrezeptors........... 66
6.3.4 Der Insertions/Deletions – Polymorphismus des Angiotensin –
Coverting – Enzyms ................................................................................... 67
6.3.5 Polymorphismus der 5 – Hydroxytryptophan – Transporter – linked –
region 68
6.3.6 Der Single – Nukleotid – Polymorphismus im 5 – HT1A – Rezeptors
69
6.3.7 Polymorphismus der Catechol – O – Methyl – Transferase ............ 70
6.3.8 Polymorphismus C T der Methylentetrahydrofolatreduktase ...... 70
6.3.9 Polymorphismus C T 2592 des A2A – Adenosinrezeptors ........... 71
6.3.10 Polymorphismus G A der Adensosindeaminase ..................... 72
6.3.11 Polymorphismus T G 716 des A1 – Adenosinrezeptors .......... 72
6.3.12 Polymorphismus C T 263 des A2A – Adenosinrezeptors ......... 73
6.4 Probandenrekrutierung ....................................................................... 73
7 Literaturverzeichnis .................................................................................... 75
8 Abkürzungsverzeichnis .............................................................................. 79
9 Danksagung ............................................................................................... 81
10 Lebenslauf ................................................................................................. 82

1 Zusammenfassung
1.1 Hintergrund und Ziele
1
Schlaf ist für ein Leben in Gesundheit ein unverzichtbarer Bestandteil. Immer
mehr Menschen leider unter verschiedenen Schlafstörungen. Viele Studien
konnten die täglichen Erfahrungen belegen, dass ein gestörtes Schlafverhalten
zu körperlichem und seelischem Ungleichgewicht führt. So kann man auch in
Zusammenhang mit dem täglichen Leben und den sozialen Verpflichtungen
extreme Ausprägungen von Abend- und Morgentypen in gewisser Weise als
Störung im Schlafverhalten sehen. Dies hat uns veranlasst zu untersuchen, in
wie weit genetische Voraussetzungen für den menschlichen Chronotypen, also
die „innere Uhr“ des Menschen, verantwortlich sind.
1.2 Methoden
Nach den prinzipiellen Überlegungen über den Aufbau der Studie sowie über
die zu untersuchenden Polymorphismen wurden Probanden für unsere Unter-
suchungen rekrutiert. Hierfür bedienten wir uns zum Einen der Patientenkartei
der Schlafambulanz unserer Universität. Zum Anderen verteilten wir die
gleichen Fragebögen im Bekannten- und Kollegenkreis. Mittels dieses
Erhebungsbogens (der D-MEQ) über unterschiedliche Verhaltensweisen im
Tagesablauf konnten die Personen in die verschiedenen Kategorien
eingeordnet werden. Insgesamt wurde dann das EDTA-Blut von 83 Probanden
mit den unten aufgeführten Methoden aufbereitet, die DNA extrahiert und nach
Etablierung der verwendeten Protokolle mittels PCR verglichen. Im Anschluss
erfolgte die statistische Auswertung der Ergebnisse.
1.3 Ergebnisse und Beobachtungen
Insgesamt zeigte sich bei 4 der 12 untersuchten Polymorphismen ein
signifikanter Zusammenhang zwischen der Ausprägung des Chronotypen und
eines bestimmten Polymorphismus. Die Polymorphismen TC 3111 des
hClock – Gens, CT der Methylentetrahydrofolatreduktase, TG 716 des A1 –
Adenosinrezeptors, CT 263 des A2 – Adenosinrezeptors sowie der Single –

2
Nucleotid – Polymorphismus im 5HT1A – Rezeptors zeigten eine solche
Korrelation. Bei den anderen 8 Polymorphismen ließen sich zumindest in
unserer Studie keine signifikanten Zusammenhänge erkennen, auch wenn
solche in anderen, vorherigen Untersuchungen beschrieben wurden.
1.4 Praktische Schlussfolgerungen
Letztendlich konnte zumindest bei einem Teil der unserer Erkenntnis nach aus-
sichtsreichen Polymorphismen eine tatsächliche Auswirkung der genetischen
Ausstattung eines Menschen auf seinen Chronotypen gezeigt werden. Somit
konnte auch die These teilweise gestützt werden, dass der Mensch seinen Tag
– Nacht – Rhythmus nur bedingt und in gewissen Grenzen beeinflussen kann.
Ein Schwachpunkt unserer Studie war sicherlich, dass die Anzahl der
Probanden mit den beiden Extremvarianten des Chronotypen recht gering war
und dass ein großer Teil an psychiatrischen Erkrankungen wie z. B.
Depressionen litt. Dies müsste bei weiterführenden Untersuchungen mit
berücksichtigt werden, um noch allgemein gültigere Aussagen treffen zu
können.

2 Summary
2.1 Aims and Background
3
Sleep is an essential part of a healthy life. More and more people suffer from
various types of insomnia. Studies proved that a sleeping disorder can lead to
physical and psychological imbalances. In connection with social duties and
everyday life, people that are “early risers” or on the other end of the spectrum,
people considered “night owls” could be said to have a sleeping disorder. This
induced us to examine in what way the genetic code is responsible for the
human chronotypes, the inner clock of a person.
2.2 Methods
After general considerations about the construction of our study and the
polymorphisms which were to be examined, test persons were recruited.
Questionnaires were distributed among the patients of the sleep laboratory as
well as among friends and colleagues. With the help of this questionnaire (D-
MEQ), which included questions on different behaviours of daily routines,
people were placed into different categories. The EDTA blood of 83 test
persons was reprocessed with the method mentioned below and the DNA was
extracted. After the establishment of the protocols used, the samples were
compared to each other via PCR, followed by a statistical evaluation of the
results.
2.3 Results and Observations
Four of the twelve analysed polymorphisms showed a significant connection
between the characteristics of the chronotype and a certain polymorphism. The
polymorphism T C 3111 of the h-Clock gene, C T of the
Methylentetrahydrofolatreduktase, T G 716 of the A1 - Adenosinreceptor, C
T 263 of the A2 - Adenosinreceptor and the single nucleotid polymorphism of
the 5HT1A - receptor showed such a correlation. The other eight polymorphisms
didn’t show any significant connection, although those had been described in
earlier studies.

2.4 Conclusion
4
Eventually, at least some polymorphisms showed an actual effect on the
genetic code of the human chronotype. Therefore the thesis, that a person can
hardly control his day and night rhythm, has at least partially been proven. A
problem of our study was that the number of participants with an extreme form
of the chronotype was too small, and many of the test persons suffered from
psychological diseases such as depression. These factors should be
considered in future researches to achieve more accurate results.

3 Einleitung
3.1 Grundsätzliche Überlegungen
5
Schlaf ist für einen Menschen ein unverzichtbarer Bestandteil eines jeden
Tages. Im Normalfall verbringt er ca. 6-8 Stunden am Tag – und somit rund ein
Drittel seines Lebens – im Schlaf. Ein guter, das heißt ein erholsamer Schlaf, ist
für das körperliche und seelische Wohlbefinden unersetzbar. Dies wird meist
dann deutlich, wenn dieser einmal aufgrund unterschiedlicher Störfaktoren für
einen gewissen Zeitraum beeinträchtigt ist.
Mittlerweile leiden rund 30% der Bevölkerung in den westlichen
Industrieländern unter Schlafstörungen unterschiedlicher Art. Die
Konsequenzen davon sind sicherlich abhängig von der Ausprägung der
Schlafprobleme und können von allgemeiner Konzentrationsschwäche,
Muskelschmerzen über starke Reizbarkeit und Niedergeschlagenheit bis hin zu
einer stark verminderten Leistungsfähigkeit und ständigem Einschlafen unter
tags – auch während der Verrichtung der anfallenden Arbeiten – reichen.
Genau deshalb ist es von großem Interesse, den Schlaf, die möglichen
Störungen und deren Folgen genauer zu erforschen. Die größer werdende
Bedeutung der Schlafmedizin und der angestellten Untersuchungen spiegelt
dieses gesteigerte Interesse relativ klar wieder.
In dieser Arbeit soll untersucht werden, ob und wenn ja in welcher Form,
genetische Zusammenhänge bei der Morgen- und Abendpräferenz bestehen.
Hinweise darauf, dass eine innere Uhr existiert und dass sich genetische
Veränderungen auf das Schlafverhalten des Menschen auswirken, gibt es viele.
Die genauen Zusammenhänge und Mechanismen sind allerdings bisher noch
ziemlich unklar. Da Patienten, die eine Abweichung des in unserer Gesellschaft
normalen Schlafzyklus haben unter ganz massiven Problemen in ihrem Alltag,
in der Ausübung ihres Berufes, in der Freizeitgestaltung – ja in eigentlich allen
Lebenslagen – leiden, ist die Aufschlüsselung der Hintergründe dringend
notwendig. Denn nur so kann man in Zukunft diesen Patienten auch eine
fundierte und zielführende Hilfe anbieten.
Vergleichen wir das Gesamtverständnis von unserem Schlaf einmal mit einem
Mosaik. Hat ein Künstler erst mal all die kleinen Bausteine zusammengefügt
und betrachtet man dieses Werk dann einmal in der Gesamtheit, so kann man
ein wunderbares Kunstwerk betrachten. Die vielen kleinen Einzelteile mögen

6
alleine betrachtet vielleicht auf den ersten Blick unbedeutend erscheinen. Sieht
man aber das gesamte Bild wird deutlich, dass es auf jeden einzelnen Baustein
ankommt. In der Schlafforschung ist man in machen Bereichen noch dabei,
solche einzelnen, passenden Teile zu suchen und in einen
Gesamtzusammenhang zu bringen; manche Teile dieses Kunstwerkes sind
bereits sehr detailliert ausgearbeitet. Zur Fertigstellung des Mosaiks „Schlaf“
wird allerdings noch einiges an Forschung betrieben werden müssen.
So soll auch diese Arbeit dazu dienen, ein kleines Stückchen zum
Gesamtverständnis der Genetik der Schlafregulation beizutragen, vielleicht
auch Ansätze und Ideen zu weiteren Untersuchungen geben, um so
irgendwann einmal die Gesamtheit genau verstehen zu können.
3.2 Grundlagen des menschlichen Schlafes
3.2.1 Sinn und Zweck des Schlafes
Bislang konnte trotz intensiver Überlegungen und Untersuchungen noch nicht
eindeutig geklärt werden, warum genau der Mensch so dringend auf einen
regelmäßigen und guten Schlaf angewiesen ist, um sich langfristig körperlicher
und seelischer Gesundheit und Ausgewogenheit erfreuen zu können. Es gibt
lediglich verschiedene Theorien und Erklärungsansätze, von denen 4
weitverbreitete Hypothesen im Folgenden kurz dargestellt werden sollen.
Die regenerative Hypothese besagt, dass der menschliche Körper den Schlaf
in aller erster Linie zur Erholung seiner Organsysteme benötigt und begründet
dies mit der Tatsache, dass viele Funktionen unseres Körpers nach einer
Schlafphase wieder wesentlich besser funktionieren, als nach einer lange
dauernden Wachphase.
Eine zweite gängige Theorie ist die so genannte adaptive Hypothese. Diese
besagt – im Gegensatz zur regenerativen Hypothese – dass der Schlaf nicht
der Erholung dient, sondern vielmehr in seiner Länge genetisch determiniert ist,
um die Aufrechterhaltung eines ökologischen Gleichgewichtes zu
gewährleisten. Zur Erklärung wird hier eine Parallele zur Tierwelt gezogen.
Raubkatzen schlafen tagsüber besonders lange, um so den Beutetieren eine
Chance zur Fortpflanzung und damit zur Arterhaltung zu geben.

7
Des weiteren existiert eine Kalibrations – Hypothese, die besagt, dass der
Körper den Schlaf benötigt, um seine Systeme wieder in den ursprünglichen
Rhythmus zu versetzen. Im Laufe eines Tages kommt es demnach in den
Organsystemen zu Unregelmäßigkeiten, die durch eine ausreichende
Schlafperiode wieder ausgeglichen werden und so quasi alle Systeme wieder
rekalibriert werden und die ihnen auferlegten inneren Programme wieder von
Neuem beginnen zu laufen.
Den vierten gängigen Erklärungsansatz bietet die psychische Hypothese, die
sich auf die Tatsache bezieht, dass die Erlebnisse aus der Wachphase im
Schlaf verarbeitet werden, das Gehirn so von unnötigen Informationen befreit
wird, Erfahrungen im Traum verarbeitet werden und somit neue Erfahrungen –
positive wie negative – richtig eingeordnet werden können.
3.2.2 Schlaf im Allgemeinen
Das Schlafbedürfnis eines Menschen ist sehr unterschiedlich und hängt von
vielen verschiedenen physischen und psychischen Faktoren (allgemeiner
Gesundheitszustand, Stress, emotionale Beanspruchung, körperliche
Anstrengung, ...) ab. Daher ist es schwer, einen allgemeingültigen Zeitrahmen
festzulegen. Nach einer Studie von Jane E. Ferrie et al. [15] scheint eine
Schlafdauer von 6 bis 8 Stunden täglich das Gesündeste für den menschlichen
Organismus zu sein. In der genannten Studie wurde die Schlafdauer in Bezug
auf die Sterblichkeit untersucht. Hier zeigte sich, dass Abweichungen von der
Schlafdauer – sowohl mehr als auch weniger als 6 bis 8 Stunden – zu einer
erhöhten Mortalität führten.
Schlaf geht mit einigen Veränderungen unseres Organismus einher, über die in
der folgenden Auflistung ein kleiner Überblick gegeben werden soll:
• Herabgesetzte Herzfrequenz, erniedrigter arterieller Blutdruck und
verlangsamte Atmung
• Verminderter Muskeltonus und verminderte Reflexerregbarkeit
• Reduzierte Aktivität des Gastro – Intestinal - Traktes
• Teilweise eingeschränkte Drüsensekretion (z. B. die der Tränendrüsen,
nicht die der Schweißdrüsen)
• Herabgesetzte Körpertemperatur

3.2.3 Schlafeinleitung, Schlafphasen und Schlafaufrechterhaltung
8
Zu einer funktionierenden Schlafeinleitung ist das Zusammenspiel von drei
funktionellen Systemen, also Nervenzellgruppen, von wesentlicher Bedeutung.
Das Gehirn erfährt über den Hypothalamus, dass es dunkel wird und somit Zeit
zum Schlafen ist. Der Hypothalamus ist mit den Augen über die Sehbahn
verbunden und produziert infolge des weniger werdenden Lichteinfalls weniger
Histamin und Orexin, welches normalerweise antriebssteigernd wird.
Die Formatio reticularis wird zum aufsteigenden reticulären aktivierenden
System (ARAS) gezählt und gilt als Signalgeber für die Wachheit.
Normalerweise erregt die Formatio reticularis über ihre Neurotransmitter
Noradrenalin und Acetylcholin den Thalamus, welcher auch „Tor zum
Bewusstsein“ genannt wird. Beim Einschlafen können aber nun die Raphekerne
über den Transmitter Serotonin (5-HT) das noradrenerge System hemmen und
somit die Weckfunktion dieser Neuronengruppe beinträchtigen.
So wird also beim Einschlafen zum Einen die aktivierende Funktion der
Formatio reticularis reduziert und zum Anderen über Kerngebiete im Hirnstamm
mittels des Transmitters GABA die Aktivität des Thalamus direkt gebremst. Man
kann also sagen, dass der Körper das gleiche System über zwei verschiedene
Mechanismen – die direkte Aktivierung der Aufmerksamkeit und die über
hemmende Interneurone indirekte Reduktion der Aufmerksamkeit – in
unterschiedlicher Art und Weise beeinflussen kann und somit entweder
antriebssteigernd oder Schlaf einleitend wirken kann.
Um den Schlaf aufrecht erhalten zu können, variiert das Gehirn im Verlauf des
Schlafes in gewissen Abständen zwischen tiefen und weniger tiefen
Schlafphasen. Der Wechsel wird gegen Ende (also im Durchschnitt nach 6-8
Stunden) immer kürzer, bis es schlussendlich zum Erwachen kommt. Auch dies
geschieht durch das Zusammenspiel verschiedener Nervenzellverbände.
Der Schlaf kann durch verschiedene Kriterien des EEGs in vier Stadien (I-IV)
eingeteilt werden. Je tiefer der Schlaf ist, desto kleiner wird die Frequenz im
EEG. Schläft ein Mensch ein, durchläuft er innerhalb von ca. 30 Minuten die
vier Stadien (Non - REM - Schlaf oder orthodoxer Schlaf) bis hin zum Tiefschlaf.
Mehrmals pro Nacht kommt es dann zu Schlafphasen, in denen man zu Beginn
schnelle Augenbewegungen und Zuckungen einzelner Gliedmaßen
(Myoklonien) beobachten kann. Diese Phasen des REM - Schlafes (Rapid - Eye
- Movements) oder paradoxen Schlafes werden zum Morgen hin immer

9
häufiger. Während dieser Phase ist man ähnlich schwer erweckbar wie im
Tiefschlaf. Man wird jedoch häufig wach und kann sich dann an seine Träume
erinnern. Die genaue Funktion dieser Schlafphase ist ebenfalls noch nicht
genau geklärt. Sie scheint aber eine große Bedeutung für den Erholungswert
des Schlafes zu haben. Wird sie gestört, z. B. durch Lärm oder Medikamente,
kann diese Beeinflussung durch die gestörte Erholung zu Störungen des
Wohlbefindens führen. [22] [36]
3.2.4 Schlaf – Wach – Rhythmus (die zirkadiane Periodik)
P. Hamet et al. [17] beschreiben, dass die zirkadiane Periodik eines Menschen
durch eine innere Uhr festgelegt wird und die Schlafgewohnheiten des
Menschen somit durch bestimmte Gene beeinflusst werden. Die Periodendauer
beträgt ungefähr einen Tag und wird durch äußere Zeitgeber, wie z. B. soziale
Kontakte und Verpflichtungen, Mahlzeiten, Helligkeit und Dunkelheit, etc. mit
der Tag – Nacht – Folge synchronisiert. Durch Versuche mit Probanden konnte
belegt werden, dass es sich hierbei um einen angeborenen Eigenrhythmus
handelt, der auch funktioniert, wenn alle äußeren zeitgebenden Faktoren
ausgeschaltet werden. Unter diesen Versuchsbedingungen lag die
Periodendauer dann bei ungefähr 25 Stunden [17]. Die Tatsache, dass die
tageszeitlichen Schwankungen der Clock – Gene auch bei Schlaflosigkeit
weiter bestehen, belegt ebenfalls, dass es sich um einen sehr stabilen,
endogenen Rhythmus handeln muss. [29] [39]
Eine besondere Bedeutung scheint hierbei der paarig im Zwischenhirn
angelegte Nucleus suprachiasmaticus zu spielen (SCN), welcher direkt
Afferenzen aus der Retina erhält und in welchem die innere Uhr des Menschen
vermutet wird. Der SCN hat einen ausgeprägten Einfluss auf den Sympathikus
und stimuliert über ihn die Freisetzung des in den Abendstunden vermehrt
ausgeschütteten und zur Schlafeinleitung beitragenden Melatonins aus der
Hypophyse. Die höchste Blutkonzentration dieses Stoffes findet man in den
frühen Morgenstunden gegen 3 Uhr. Lincoln et al. [17] fanden im SCN und in
der Hypophyse des Schafes 7 Clock – Gene, die das Vorhandensein eines
inneren Zeitgebers wahrscheinlich erscheinen lassen. Man konnte hier zeigen,
dass die Aktivität der Tiere in einem inversen Zusammenhang mit der
Melatoninausschüttung stand und Prolaktin während der Lichtperioden verstärkt

10
ausgeschüttet wird. Dies ist ein weiterer Hinweis für den häufig postulierten
Zusammenhang zwischen der zirkadianen Periodik und den beiden Stoffen
Melatonin und Prolaktin.
Verschiedene Tierversuche haben gezeigt, dass eine funktionierende
zirkadiane Periodik unmittelbar an eine funktionierende Formatio reticularis
gebunden ist und dass das störungsfreie Zusammenspiel von
Nervenzellverbänden mit ihren Botenstoffen Acetylcholin, Serotonin und
Noradrenalin als oszillierender Zeitgeber funktioniert. Somit darf der Schlaf nicht
als eine allgemeine Reduktion der Hirnaktivität angesehen werden, sondern
muss vielmehr als spezifischer Aktivitätszustand dieses zentralen Organs
betrachtet werden. [22]
H. Okamura schreibt in einem Artikel im Journal of Endocrinology über die
erstaunliche Entdeckung, dass der Rhythmus der Gentranskription streng
harmonisiert ist und den Verhaltensrhythmus nahezu perfekt widerspiegelt,
sodass Veränderungen in der zirkadianen Periodik auch Änderungen im
Verhalten und in der Hormonsekretion zur Folge haben. Diese Erkenntnisse
über biologische Uhren bieten laut Okamura eine Brücke zwischen einzelnen
Genen und dem lebenden Organismus als Ganzem an. [29]
Auch dieser fein gesteuerte Regelkreis kann einmal aus unterschiedlichen
Gründen aus dem Gleichgewicht geraten und zu mehr oder weniger großen
Problemen führen. So spielt die Störung dieses natürlichen Rhythmus z. B. bei
der Übermüdung und verminderten Leistungsfähigkeit eines Schichtarbeiters
eine entscheidende Rolle. Der Review „Molecular Bases for Circadian Clocks“
von Jay C. Dunlap macht deutlich, dass äußere Faktoren diesen Regelkreis
zwar beeinflussen können, jedoch nicht notwendigerweise für ein Funktionieren
dieses endogenen Rhythmus vorhanden sein müssen [13]. Ein Beispiel hierfür
ist der Einfluss des chronischen Alkoholkonsums auf die zirkadiane Periodik,
die Cui Ping Chen et al. im Journal of Neurochemistry beschreiben. [12]
Insgesamt wird deutlich, dass das individuelle Schlafbedürfnis konstitutionell
vorgegeben ist und somit nicht durch Verhaltensänderung oder irgendeine
Form des Trainings ausgeschaltet oder dauerhaft verändert werden kann, ohne
dass der gesamte Organismus Schaden nehmen würde.

3.2.5 Schlafstörungen
11
Dass bei manchen Schlafstörungen ein starker genetischer Zusammenhang
besteht, wurde in Tierversuchen bereits in den frühen 70er Jahren beobachtet.
In den letzten Jahren konnten auch einige Genorte nachgewiesen werden, die
hierbei eine Rolle spielen, wie aus dem Review von Dunlap et. al zu entnehmen
ist [17]. In diesem Artikel wird auf eine Untersuchung von Dauvilliers et al.
Bezug genommen, in der in Zwillingsstudien auch bei Menschen wichtige
genetische Einflussfaktoren gefunden werden konnten. Selten liegen hierbei
jedoch monogenetische Ursachen zugrunde. Die meisten Schlafstörungen
müssen vielmehr als komplexe Folge verschiedener Gene, deren Interaktionen
und verschiedener Umwelteinflüsse betrachtet werden.
In den letzten Jahren wurde auch der Zusammenhang zwischen
Schlafstörungen und chronischen körperlichen oder psychiatrischen
Krankheiten immer deutlicher. Man vermutet, dass mehr als die Hälfte der
Schlafstörungen auf psychische Ursachen zurückzuführen sind. Man kann
prinzipiell vier große Gruppen der Schlafstörungen unterscheiden, die sich auch
in der International Classification of Sleep Disorders (ICSD) widerspiegeln und
hier kurz genannt werden sollen:
Bei Dyssomnien ist der Schlaf auf unterschiedliche Art und Weise
beeinträchtigt. Er kann sowohl in Hinblick auf die Dauer als auch in der Qualität
oder im Ablauf gestört sein. Dadurch kann es zu einer Reihe von Folgen, wie
Einschlafstörungen oder auch Durchschlafstörungen mit Tagesmüdigkeit
kommen. Die daraus resultierenden Schlafdefizite werden zusammenfassend
als Insomnien bezeichnet. Kommt es zu einer gesteigerten Tagesschläfrigkeit,
spricht man von Hypersomnien. Die Ätiologie dieser Schlafstörungen ist sehr
komplex und beinhaltet medikamentöse ebenso wie psychologische Einflüsse,
aber auch psychiatrische Störungen. Viele genetische Studien wurden bis heute
dazu durchgeführt. Interessant ist hierbei der Bericht über eine Missens-
Mutation in der β3-Untereinheit des GABA - Rezeptors. Patienten, die für
diesen Clock - Genotypen homozygot (CC) waren, waren auch häufiger von
den verschiedenen Formen der Insomnie betroffen. [17]
Zur zweiten Übergruppe der Schlafstörungen zählt man die sogenannten
Parasomnien. Dieser Begriff wird bei Schlafstörungen verwendet, die zu
Abweichungen eines normalen Schlafablaufes führen, ohne jedoch das Ein-

12
oder Durchschlafen zu betreffen. Beispiele hierfür sind das nächtliche
Zähneknirschen oder das Schlafwandeln.
Die dritte Gruppe der hier klassifizierten Schlafstörungen umfasst alle die
Störungen, die durch körperliche oder psychiatrisch bedingte
Erkrankungen hervorgerufen werden.
In Klasse vier der Schlafstörungen fallen alle vorgeschlagenen
Schlafstörungen. Gemeint sind z. B. extreme Kurz- oder Langschläfer. Hier ist
noch nicht endgültig geklärt, ob es sich nur um Extremvarianten eines normalen
Schlafes handelt, oder ob diese Formen als Schlafstörung mit Krankheitswert
zu betrachten sind.
3.3 Clock – Gene
Man weiß heute, dass sogenannte Clock - Gene einen Einfluss auf das
Schlafverhalten eines Menschen haben. „Clock - Gene" sind definiert als Gene,
deren Proteinprodukte notwendige Komponenten für die Generation und
Regulation von zirkadianen Rhythmen sind. [17]
Es konnten mittlerweile mehrere solcher Clock – Gene identifiziert werden, die
einen Einfluss auf die zirkadiane Periodik haben. Clock und BMAL1 dienen als
positive Regulatoren des Regelkreises, die Gene der CRY - Familie, Period
genes (Per) und assoziierte Proteine dienen der negativen Regulation.
Die Tatsache, dass diese Genprodukte auch bei Schlaflosigkeit im Körper
zirkulieren belegt, dass es sich bei der zirkadianen Periodik – wie oben bereits
erläutert – um einen endogenen Rhythmus handeln muss.
Die meisten Produkte der Clock - Gene sitzen im SCN, wo sie ihre Funktion
erfüllen und in engem Zusammenhang mit der Ausschüttung von Melatonin und
Prolaktin stehen. [17]
C. Johansson et al. beschreiben einen Zusammenhang zwischen der
zirkadianen Periodik und saisonaler Depression (SAD). In ihrer Studie fanden
sie eine Korrelation zwischen Morgentypen bzw. Tagfaltern und SAD, was eine
Verbindung zwischen der inneren Uhr des Menschen und dem Auftreten von
Depressionen vermuten lässt. [20]

3.4 Lerche und Eule
13
Das Hauptaugenmerk soll in dieser Arbeit auf den möglichen genetischen
Unterschied zwischen den beiden Extremausprägungen der zirkadianen
Periodik, nämlich dem Morgentyp („Lerche“) und dem Abendtyp („Eule“), gelegt
werden.
Der Morgentyp hat seinen Leistungszenit bereits in den frühen Morgenstunden,
kann hier sowohl körperliche wie auch geistige Höchstleistung vollbringen, fühlt
sich fit und ist bereits nach dem Aufstehen hellwach und ausgeruht. Am Abend
ist er allerdings deutlich früher als der Durchschnitt sehr müde und hat ein
verstärktes Schlafbedürfnis zu Zeiten, in denen andere noch munter sind. Sein
Schlaf – Wach – Rhythmus ist insgesamt nach vorne verlagert, sodass er im
Durchschnitt bereits gegen 19 Uhr am Abend ins Bett geht und bereits morgens
um 4 Uhr wieder erwacht. Der erste Zusammenhang zwischen dem seltenen
familiären ASPS (Advanced sleep phase syndrom) und einer Genmutation
wurde 2001 im zentralen Clock - Gen Per2 nachgewiesen. [17]
Grundsätzlich gegenteilig verhält sich der Abendtyp („Eule“). Dieser, auch als
Nachtschwärmer bezeichnete Mensch, hat einen nach hinten verschoben Tag –
Nacht – Rhythmus und bevorzugt teilweise, erst nachts um 4 Uhr ins Bett zu
gehen und dafür bis in die späten Morgenstunden zu schlafen. Dieser Typ hat
seinen Leistungshöhepunkt teilweise erst sehr spät am Abend und kann
morgens quasi keine großen Leistungen, egal welcher Art, vollbringen. Bei dem
sogenannten DSPS (Delayed sleep phase syndrom) wurde ein Zusammenhang
mit den Genen Per3 und dem HLA-Antigen DR1 nachgewiesen. [17]
V. Natale et al. konnten in groß angelegte Studien zeigen, dass es offensichtlich
einen Zusammenhang zwischen dem Chronotypen und dem Geburtsmonat
gibt. Sie fanden heraus, dass es unter den Menschen, die in den Monaten April
bis September geboren wurden, wesentlich weniger Morgentypen gab – die
Werte im Morningness – Eveningness – Questionnaire (MEQ) also niedriger
ausfielen, als bei denen, die in den Monaten Oktober bis März auf die Welt
kamen. In diesem Artikel beschreiben sie auch einen Zusammenhang mit dem
Lebensalter. Ältere Menschen neigen offensichtlich wesentlich häufiger zum
Morgentyp als jüngere Personen. [18]
Egal ob es sich nun um eine Lerche oder Eule handelt, beide haben mitunter
sehr starke Probleme in der Bewältigung des alltäglichen Lebens. Es fällt ihnen
häufig schwer, einer normalen Arbeit nachzugehen oder enge soziale Kontakte

14
zu pflegen, da sich ihr Tagesrhythmus zu sehr von dem der Normalbevölkerung
unterscheidet. Der Leidensdruck dieser Personen ist teilweise sehr groß, da
dieses Schlafverhalten allen Anschein nach konstitutionell festgelegt ist und
somit auch nicht verändert werden kann, ohne dass der Körper dadurch
Schaden erleidet, die Leistungsfähigkeit abnimmt, die Personen unter
Stimmungsschwankungen leiden, oder eine ganze Reihe anderer
schwerwiegender physischer und psychischer Konsequenzen erleiden.
Durch die hier beschriebenen Beispiele familiärer Häufungen konnte im Jahre
2001 gezeigt werden, dass offensichtlich ein Zusammenhang zwischen den
verschiedenen Ausprägungen der zirkadianen Rhythmik und den sogenannten
Clock - Genen existiert. Diese Vermutung greifen S. Taheri und E. Migbot in
ihrer Review „The genetics of sleep disorders“ auf und belegen dies mit den
Ergebnissen aus Studien mit Nagetieren und Drosophilia. [39]
3.5 Untersuchte Gene und Polymorphismen
3.5.1 Adenosinrezeptoren
3.5.1.1 Bedeutung von Adenosin für den menschlichen Schlaf
Adenosin ist ein zu den Purinen zählendes Nukleosid, welches aus der Base
Adenin und dem Zucker β-D-Ribose zusammengesetzt ist. Es ist nicht nur
Bestandteil von Nukleinsäuren und den energiereichen Verbindungen ATP und
ADP, es ist auch ein wichtiges Signalmolekül.
Adenosin wirkt als inhibitorischer Neurotransmitter und blockiert somit vor allem
die Ausschüttung von aktivierenden und belebenden Neurotransmittern (z. B.
Noradrenalin, Dopamin oder Acetylcholin).
Thekkar M. et. al beschreiben, dass Adenosininjektionen bei Ratten zu einer
deutlichen Schlafinduktion geführt haben [38]. Hier wurde gezeigt, dass der
Adenosinspiegel bei länger andauerndem Schlafentzug ansteigt und über die
beschriebene inhibitorische Wirkung im ZNS die Schlafhomöostase beeinflusst.
[27] [37]

15
3.5.1.2 Die Adenosindeaminase (ADA)
Das Enzym Adenosindeaminase ist am Metabolismus vom Adenosin zum
Inosin beteiligt. Beim Menschen findet man die Region, welche für die
genetische Verschlüsselung der Adenosindeaminase verantwortlich ist, auf
Chromosom 20.
Wie oben bereits erwähnt, hat Adenosin einen entscheidenden Einfluss auf die
Schlafhomöostase, weswegen naheliegend ist, dass Veränderungen an dem
hier beleuchteten Enzym bzw. an dessen Aktivität auch den Schlaf des
Menschen beeinflussen können.
3.5.1.3 Bedeutung der Adenosinrezeptoren
Derzeit sind 4 verschiedene Adenosin – Rezeptortypen bekannt (A1, A2A, A2B,
A3). Die A1 – Rezeptoren werden im gesamten ZNS exprimiert, wohingegen die
A2-Rezeptoren vor allem in zwei Kerngebieten der Basalganglien vorkommen
(dorsal: Nucleus caudatus/Putamen, ventral: Nucleus accumbens).
Adenosin hat über die verschiedenen Rezeptoren offensichtlich einen Einfluss
auf die Schlafhomöostase. Auf die unterschiedlichen Wirkweisen wird später bei
der Beleuchtung der einzelnen Polymorphismen genauer eingegangen.
Im Folgenden werden die verschiedenen, von uns untersuchten
Adenosinrezeptoren und die Adenosindeaminase genauer diskutiert.
3.5.1.3.1 Polymorphismus T C 1976 des A2A – Adenosinrezeptors
Der A2A – Adenosinrezeptor steht in Zusammenhang mit zentralnervösen
Effekten von Substanzen (wie z. B. Adenosin, Prostaglandin D2, GABA,
Histamin, Koffein, etc.) die den Wachzustand und den Schlaf des Menschen
beeinflussen.
Der hier diskutierte Rezeptortyp scheint laut Ebisawa T. et. al [5] unter anderem
bei den über Prostaglandin D2 vermittelten Schlaf induzierenden Effekten
mitzuwirken.
Des Weiteren wurde der A2A - Adenosin – Rezeptor bislang häufig mit
Angststörungen in Verbindung gebracht, da Koffein - ein potenter Antagonist
am A2AAR – solche Panikattacken – wie im Versuch an Mäusen belegt -
herbeiführen kann.

16
C. Hohoff et al. führten Studien zur durch Amphetamine ausgelösten
Angstreaktionen durch und konnte zeigen, dass der hier untersuchte
Polymorphismus A2AAR1976T>C mitunter eine Rolle spielte [18]
K. Alsene et al. lit [1] untersuchten ebenfalls den Zusammenhang zwischen
koffeininduzierten Panikattacken und verschiedenen Adenosinrezeptoren. Für
die beiden Varianten 1976T/T des A2AAR konnte eine signifikant höhere
Angststeigerung nachgewiesen werden als in den anderen Genvarianten. Für
andere Adenosinrezeptoren konnte dies zumindest in der hier zitierten Studie
nicht belegt werden.
P. Lam et al. [23] konnten die gefundene Verbindung zwischen der
Genvariante, A2AAR1976T>C und dem Auftreten von Panikstörungen nicht
bestätigen. In dieser Studie wir die Vermutung angestellt, dass es sich hierbei
eventuell um eine Variante handeln könnte, die nicht in jeder ethnischen
Population gleich verteilt ist. Während einige Studien – wie z. B. die von Decker
et al. [23] in der westlichen Bevölkerung einen Zusammenhang vermuten
lassen, konnte dieser in keiner Studie mit Probanden asiatischer Herkunft
bestätigt werden.
3.5.1.3.2 Polymorphismus C T 2592 des A2A – Adenosinrezeptors
Dieser ist einer der beiden Adenosinrezeptoren, den K. Alsene et al. [1] in
Zusammenhang mit unterschiedlichen Ausprägungen der Angstreaktion auf
Koffein, abhängig vom Genotyp, bringen konnten. Patienten mit der
2592Tins/Tins – Variante des A2AAR zeigten eine signifikant stärker ausgeprägte
Reaktion.
C. Hohoff et al. führten - wie oben bereits erwähnt - Studien zur durch
Amphetamine ausgelösten Angstreaktionen durch und konnten zeigen, dass die
1976C/T - und 2592C/Tins – Polymorphismen hierbei mitunter eine wichtige
Rolle spielen könnten. [18]
Der Polymorphismus A2AAR2592C>T scheint wohl laut Rétey J. et. al [31] nicht
nur für die bisher mehrfach untersuchte Angststeigerung auf Koffein und
Amphetamine relevant zu sein, er verändert wohl auch die Expression der A2A –
Adenosinrezeptoren. Dies wiederum könnte dann auch wieder einen Einfluss
auf das Schlafverhalten haben.

17
3.5.1.3.3 Polymorphismus C T 263 des A2A – Adenosinrezeptors
Betracht man die A2 – Rezeptoren im Allgemeinen, so beschreibt R. Basheer
[5], dass dieser Rezeptortyp mitunter einen über Prostaglandin D2 vermittelten,
Schlaf induzierenden Effekt haben könnte.
3.5.1.3.4 Polymorphismus T G 716 des A1 – Adenosinrezeptors
M. Mahesh et al. [40] veröffentlichten im Jahr 2003 die im Experiment mit
Ratten in Bezug auf die Schlafregulation gefundene Schlüsselrolle von
Adenosin über den A1 – Rezeptor. Dag Stenberg et al. [37] nehmen Bezug auf
pharmakologische Untersuchungen, die den Einfluss des A1 – Rezeptors
gezeigt haben und fand heraus, dass Schlafentzug bei Mäusen zur Erhöhung
des Adenosinspiegels führte. Auch R. Basheer von der Harvard Medical School
and Boston VA Healthcare System [5] befasst sich mit diesem für den Schlaf so
wichtigen endogenen Faktor. Er beschreibt, dass Adenosin – ein Nebenprodukt
des Energiestoffwechsels - Schlaf induzierend wirkt, indem es über den A1 –
Rezeptor weckende Neurone im Gehirn hemmt. Der Versuch, bei dem Ratten
Adenosin direkt in das zentrale Nervensystem injiziert worden ist, zeigte
bezogen auf die Schlafinduktion den gleichen Effekt, wie der A1 - Rezeptor -
Antagonist Cyclohexyladenosin.
Aufgrund dieser Ergebnisse liegt der Verdacht nahe, dass es bei den
verschiedenen Schlaftypen eventuell auch Unterschiede in den Genen des A1 –
Rezeptors geben könnte.
Im Gegensatz zu manchen A2 – Rezeptoren konnten K. Alsene et al. [1] keine
Unterschiede im Ansprechen auf Koffein bei verschiedenen Genvarianten des
hier diskutierten Polymorphismus A1AR716T>G finden.
3.5.1.1 Polymorphismus G A 22 der Adenosindeaminase
M. Mackiewicz et al. [26] beschreiben, dass Adenosin als wichtiger Regulator
unseres Schlafes anzusehen ist. Hierbei ist die Adenosindeaminase das
entscheidende Enzym für den Adenosinspiegel im Blut. So könnten Variationen
im ADA – Gen wichtig für ihre Aktivität, damit für die vorherrschenden Spiegel
und somit eine entscheidende Rolle in der Schlafregulation spielen.

18
J. Rétey et al. [31] führten zu diesem Gen Untersuchungen bezüglich der
Schlaftiefe und der Schlafdauer durch. Die Ergebnisse belegten die
Anfangshypothese, dass der Schlaf von Patienten mit dem Genotyp G/A durch
mehr „slow – wave – Schlaf“ charakterisiert wäre, wesentlicher tiefer sei und die
Patienten nachts deutlich seltener erwachen, als Personen mit G/G. Der Grund
hierfür wurde in der verminderten Enzymaktivität gesehen, die durch den
verminderten Metabolismus von Adenosin zu Inosin zu erhöhten extrazellulären
Adenosinspiegeln im ZNS und somit zu einem tieferen Schlaf führten.
Der von uns untersuchte Polymorphismus ADA22G>A war auch die in der
gerade genannten Studie von Rétey et al. am häufigsten gefundene Variante.
Dieser Basenaustausch hat zur Folge, dass an Codon 8 des ADA-Proteins ein
Aspartat durch ein Asparagin ausgetauscht wird.
Ob dieser Polymorphismus in der Prävalenz der Insomnie eine Rolle spielt,
konnte hier nicht gezeigt werden und Bedarf weiterer Untersuchungen.
Diese Erkenntnisse veranlassten uns dazu, einmal nachzusehen, ob
Polymorphismen der ADA auch in Zusammenhang mit dem Chronotyp stehen
könnten.
3.5.2 Polymorphismen, die in Zusammenhang mit psychiatrischen
Erkrankungen gesehen werden können
Es gibt einige Polymorphismen, die bisher häufig in Zusammenhang mit
unterschiedlichen psychiatrischen Erkrankungen untersucht worden sind.
Für unsere Studien sind in erster Linie jene von Bedeutung, deren
Krankheitserscheinungen in engem Zusammenhang mit dem Schlafverhalten
stehen könnten. Die sind zum Einen die Polymorphismen, die in Bezug auf
Depression und den unterschiedlichen Therapieformen (Lichttherapie,
Schlafentzugstherapie, etc.) stehen, zum Anderen sind es diejenigen, die in
Hinblick auf Panikreaktionen bei Koffeinkonsum und bekannter Angststörung
untersucht worden sind.
Zu diesen für uns relevanten Polymorphismen gehören auch zum Teil die
bereits oben diskutierten Genvarianten A2AAR1976T>C und A2AAR2592C>T.
Diese werden im folgenden Abschnitt nicht mehr explizit erwähnt.

19
3.5.2.1 Der Insertions/Deletions - Polymorphismus des Angiotensin-
Converting-Enzym-Genes
Beim Angiotensin – Coverting – Enzym handelt es sich um eine
Carboxypeptidase, die in der Regulation des arteriellen Blutdruckes und bei der
Aufrechterhaltung des Elektrolytgleichgewichtes eine entscheidende Rolle
spielt. ACE spaltet Angiotensin zu Angiotensin II. Dies führt zum Einen zu einer
starken Gefäßkontraktion, zum Anderen wirkt es als Aldosteron –
stimulierendes Peptid. Das ACE wird in verschiedenen Geweben, wie
vaskulären Endothelzellen, renalen Epithelzellen und Leydigzellen gebildet und
kann sowohl membrangebunden im vaskulären Endothel als auch frei im
Plasma zirkulierend vorkommen.
Betrachtet man die Funktion dieses Enzyms wird deutlich, dass hier
Genvarianten, die die Plasmakonzentration beeinflussen, eine entscheidende
Bedeutung bei unterschiedlichen Krankheiten wie KHK, arterieller Hypertonie,
Herzinfarktrisiko, etc. haben könnten.
T. C. Baghai et al. [2] untersuchten den Einfluss funktioneller Polymorphismen
des ACE-Gens auf den Erfolg partiellen Schlafentzugs bei Patienten mit
Depression. Patienten mit dem Genotyp D/D hatten deutlicher weniger Rezidive
nach dieser Therapie als Patienten mit dem Genotyp I/I, die in der Studie
niedrigere ACE – Plasmakonzentrationen zeigten. Eine mögliche Erklärung
hierfür könnte ein Einfluss des ACE I/D Polymorphismus auf das dopaminerge
und/ oder serotinerge System (welche beide eng mit dem menschlichen Schlaf
gekoppelt sind) sein.
J. Zhang et al. [42] beschreiben, dass bei Patienten mit einem Schlafapnoe –
Syndrom häufiger der Genotyp I/D oder I/I zu finden ist. Auch A. Barceló et al.
[4] befassten sich mit dieser Thematik und fand bei Schlafapnoe – Patienten
deutlich höhere ACE – Plasmaspiegel. Höhere ACE-Plasmaspiegel werden in
der medizinischen Literatur im Übrigen auch beim chronischen
Müdigkeitssyndrom erwähnt.
3.5.2.2 Das serotonerge System
5-Hydroxytryptamin (5-HT = Serotonin) ist ein biogenes Amin, welches sowohl
peripher als auch zentral als Neurotransmitter fungiert. Es wird vor allem im
zentralen Nervensystem in zwei Schritten aus dem L-Tryptophan synthetisiert.

20
Durch die zytosolische Tryptophanhydroxylase entsteht aus dem L-Tryptophan
5 – Hydroxytryptophan, welches wiederum durch die 5-
Hydroytryptamindecarboxylase zum Serotonin decarboxyliert wird.
Serotonin wirkt im ZNS als Hauptneurotransmitter und beeinflusst unter
anderem die Schmerzwahrnehmung und den Schlaf – Wach – Rhythmus.
Der Serotonintransporter (5-HTT) zählt zur Gruppe der NaCl – abhängigen
Neurotransmittertransporter, welche im präsynaptischen Spalt an der
Plasmamembran lokalisiert sind. Seine Aufgabe ist es, die
Serotoninkonzentration in eben diesem Spalt zu regulieren.
Derzeit sind sieben Rezeptorfamilien bekannt. 5-HT2A- und 5-HT2C-Rezeptoren
findet man als postsynaptische Rezeptoren im ZNS. 5-HT1B- und 5-HT1A-
Rezeptoren fungieren als präsynaptische Autorezeptoren.
Der Serotonintransporter wurde in der Literatur schon oft in Zusammenhang mit
Schlaf und Depression erwähnt. Strobel A. et al. [38] zeigten in ihrer Studie,
dass der 5-HT1A-Rezeptor eine wichtige Rolle bei Angst- und depressiven
Störungen spielt. Benedetti et al. [8] beobachteten z. B. ein unterschiedliches
Ansprechen der verschiedenen Genotypen auf Schlafentzug bei bipolarer
Depression und unterschiedliche Erfolge auf eine Lichttherapie [6]. Die
genannten Studien seien hier beispielhaft für viele weitere Untersuchungen
dieses Zusammenhanges genannt.
Das hier Beschriebene veranlasste uns, den Rezeptor auch in Hinblick auf
unterschiedlich ausgeprägte Chronotypen zu untersuchen.
3.5.2.2.1 Polymorphismen der 5-Hydroxytryptophan-Transporter-
linked-region
Lesch et al. [25] gelang bereits im Jahr 1993 die Isolation der cDNA, die für die
Codierung des 5-HTT – Gens in Thrombozyten und im dorsalen Raphekern
verantwortlich ist. Der Sertonintransporter im Gehirn und das Serotonin –
Aufnahme Protein werden von demselben Gen codiert, welches dem
menschlichen Chromosom 17 zugeordnet ist. Die hier beschriebene Region
17q11.1-q12 besteht aus 14 Exons und hat eine Länge von 31.000
Basenpaaren.
Lesch beschreibt in dieser Arbeit im zweiten Intron der proximalen 5’ -
Regulatorregion eine repetitive Sequenz über 17 Basenpaare. Dieser Sequenz

21
folgte eine Bindungsstelle für den Transskriptionsfaktor AP – 1. Und hier konnte
dann an 2 Allelen ein Polymorphismus bestimmt werden, welcher – verursacht
durch eine Deletion – aus 44 Basenpaaren besteht. Das kurze Allel (S)
beschreibt Lesch mit 14, das lange Allel (L) mit 16 Repetitionen. Diese Sequenz
wurde dann als 5-Hydroytryptophan-Transporter-linked-region (5-HTTLPR)
bezeichnet.
Diese Variante wurde schon vielfach auch in Hinblick auf Schlafverhalten und
Schlafintensität untersucht. Allerdings war dies bisher zumeist in Verbindung
mit Depression und deren Therapie. Weit über 100 Arbeiten über den
Zusammenhang der 5-HTTLPR mit psychiatrischen Erkrankungen wurden
bereits publiziert.
Laut Baghai TC et. al [3] haben die unterschiedlichen Varianten von 5-HTTLPR
zwar keinen Einfluss auf das Outcome bei partiellem Schlafentzug, Von
Schantz M. et. al [34] fanden allerdings ein besseres Ansprechen der
Depression auf die Therapie mit totalem Schlafentzug.
Benedetti F. et. al [6] beschreiben einen positiven Effekt der langen
Genvariante (LL + LS) von 5-HTTLPR auf die Lichttherapie bei Depression.
Dies könnte eventuell an der bei diesen Genformen erhöhten Dichte und
Aktivität von 5-HTT liegen.
Bei dem homozygot kurzen Genotyp (SS) konnte durch [21] eine signifikant
höhere Depressivität und Suizidalität bei Familienangehörigen gefunden
werden, sodass man sagen kann, dass die s-Variante mit negativer
Emotionalität und Psychopathologien in Verbindung zu stehen scheint.
BH Brummet et al. [11] befassten sich mit der Hypothese, dass ein bestimmter
Genotyp des 5 – HTTLPR mit der Schlafqualität unter Einfluss von Stress
assoziiert sein könnte. Ihre Ergebnisse zeigten, dass eventuell ein
Zusammenhang zwischen dem S – Allel und Schlafstörungen als Antwort auf
chronischen Stress bestehen könnte.
Auch in der medikamentösen Therapie der Depression mit serotinergen
Medikamenten gibt es Unterschiede im Therapieerfolg. So zeigten laut
Benedetti F. et. al [8] Träger des Genotypen L/L ein durchweg besseres
Ansprechen der medikamentösen Therapie.
Da man weiß, dass Schlaf und die Regulation der zirkadianen Periodik auch mit
von der Lichteinstrahlung und der damit verbundenen Hormonfreisetzung
abhängen, liegt die Vermutung nahe, dass der Genotyp dieses

22
Serotonintransporters mitunter eine Rolle im Schlaf – Wach – Rhythmus spielen
könnte.
3.5.2.2.2 Der Single Nucleotid Polymorphism im 5 – HT1A-Rezeptor
Bei Patienten, die unter einer Depression leiden, sind die Serotoninspiegel
häufig erniedrigt und rund 80 % dieser Menschen leiden auch gleichzeitig unter
Schlafstörungen. Dass das serotonerge System über die sogenannte
hypnogene Zone in den Raphe – Kernen eine zentrale Rolle in der Auslösung
des synchronen Schlafes spielt ist hinreichen bekannt. [33]
Einer der wichtigsten Vertreter der Polymorphismen im 5 – Hydroxytryptamin –
System ist der Single Nucleotid Polymorphism (SNP) im 5 - HT1A – Rezeptor. A.
Strobel et al. [38] untersuchten, ob ein Zusammenhang zwischen der
Expression dieses Rezeptors und Merkmalen der Depression und Angststörung
existiert. Interessant war hierbei die Tatsache, dass offensichtlich Träger des G
– Allels signifikant häufiger Probleme hatten, als homozygote Träger des C –
Allels.
Nun wurde dieser Neurotransmitter häufig mit Depression und Schlaf in
Verbindung gebracht. Bisher wurde unseres Wissens nach dieser Single
Nucleotid Polymorphism allerdings noch nie in Verbindung mit einem möglichen
Einfluss auf den menschlichen Chronotypen untersucht. Da das ganze
serotonerge System für den Schlaf so wichtig ist, ist ein Zusammenhang mit der
Ausprägung des Chronotypen naheliegend, sodass eine Untersuchung dieses
Polymorphismus im 5 – HT – System als sehr aufschlussreich und
vielversprechend anzusehen ist.
3.5.2.2.3 Polymorphismen der Catechol – O – Methyl – Transferase
Auch die Catechol – O – Methyltransferase zählt zu den Enzymen, die in
Zusammenhang mit psychiatrischen Erkrankungen zu sehen ist.
Es handelt sich hierbei um ein magnesiumabhängiges Enzym, welches sowohl
peripher als auch zentral ausgeschüttet wird. Es katalysiert den Transfer eine
Methylgruppe vom S – Adenosylmethionin auf Katecholamine. Dadurch werden
die Katecholamine in den sympathischen Nervenendigungen der Zielorgane
deaktiviert.

23
Dass Katecholamine, wie z. B. das Dopamin bei Morbus Parkinson, eine
zentrale Rolle bei neurologischen Erkrankungen einnehmen, ist mittlerweile
hinreichend bekannt. Die Studienlage über den Zusammenhang von Morbus
Parkinson und Tagesschläfrigkeit zeigt allerdings noch eine sehr
unterschiedliche Datenlage zur Rolle des COMT – Genotyps. B. Frauscher et
al. [16] beschreiben, dass in ihren erhobenen Daten ein Zusammenhang
zwischen dem L – Allel und dem Auftreten von Tagesschläfrigkeit zu erkennen
ist; I. Rissling et al. [32] konnten im Jahr 2006 die zuvor von seinem Kollegen B.
Frauscher veröffentlichte Assoziation des L – Allels mit Tagesschläfrigkeit bei
Morbus Parkinson nicht bestätigen. Seiner Datenlage nach bestehe kein
klinisch relevanter Einfluss des COMT – Genotyps auf die Tagesschläfrigkeit
bei der hier untersuchten Grunderkrankung.
Diese konträre Datenlage hat uns veranlasst, den Polymorphismus einmal
näher unter dem Aspekt des menschlichen Chronotyps zu beleuchten und in
unsere Studie mit einzuschließen.
3.5.3 Polymorphismen, die bereits in Hinblick auf den Chronotypen
untersucht worden sind
3.5.3.1 Polymorphismus T C 3111 des hClock – Gens
Wie eingangs erwähnt, ist der Nucleus suprachiasmaticus der entscheidende
Schrittmacher, der viele zirkadiane Rhythmen verschiedener Säuger steuert.
King et al. und Gekakis et al. fanden in Untersuchungen bei Mäusen, dass
bestimmte Punktmutationen im Clock – Gen zu einer verminderten Aktivität der
Clockproteine (welche dynamisch reguliert werden) führt und dadurch die aktive
Periode der Mäuse verlängert wird. Diese Untersuchungen lassen die
Vermutung zu, dass das hClock – Gene mitunter prädisponierend für
Schlafstörungen sein könnte. T. Iwase [19] et al. konnten zwar in ihrer Studie
keinen statistisch signifikanten Zusammenhang zum DSPS nachweisen, wie er
von vielen Autoren propagiert wird, eine Verbindung zu anderen
Schlafstörungen scheint allerdings möglich, sodass eine weitere Untersuchung
des T3111C Polymorphismus sicherlich als sinnvoll betrachtet werden kann.
A. Sarretti et al. führte Studien zu dem möglichen Einfluss des 3111T/C Clock –
Gen – Polymorphismus auf Schlafstörungen bei Patienten mit Depression und

24
bipolarer Persönlichkeitsstörung durch und fand ein signifikant höheres
Auftreten von Insomnie bei Patienten mit der C Variante. A. Sarretti beschreibt,
dass die C Variante – so wie von Katzenberg et al. 1998 veröffentlicht –
wiederum mit einem vermehrten Auftreten von Abendtypen auch bei gesunden
Probanden einhergeht, nur dass es eben hier zu keinen klinischen Symptomen
des nach hinten verschobenen Schlaf – Wach – Rhythmus kommt.
Interessant ist in diesem Zusammenhang, dass der hier untersuchte
Polymorphismus die Aminosäuresequenz des humanen Clock – Gens nicht
verändert. Nichtsdestotrotz kann er wichtig für die Stabilität der Transkription
sein.
R. Benedetti et al. [7] nahmen die Vielzahl an Veröffentlichungen bezüglich der
angeblich erhöhten Zahl von Abendtypen bei Trägern eines C - Allels auf dem
Clock – Gen zum Anlass, eine Verbindung zwischen dem C - Allel und
möglichen zirkadianen Stimmungsschwankungen zu untersuchen. Dieser
Zusammenhang konnte in ihrer Untersuchung nicht bestätigt werden. Allerdings
fanden sie überraschenderweise bei Trägern mindestens eines C Allels eine
signifikant höhere Zahl an Krankheitsepisoden bei bipolarer Depression.
Neben T. Ebisawa et al. [14] halten viele andere Wissenschaftler einen
Zusammenhang von Clock – Polymorphismen mit Veränderungen in der
zirkadianen Rhythmik für möglich. Ein eindeutiger Zusammenhang konnte
allerdings bisher weder bestätigt, noch widerlegt werden, sodass die meisten
Autoren – auch die hier ausführlicher erwähnten - eine weitere Untersuchung
dieser Thematik zur Klärung der genauen Hintergründe empfehlen.
3.5.3.2 Polymorphismus Val Gly 647 des humanen Period 3 –
Gens
Wenngleich Shearman et al. [35] bei Studien mit Mäusen beobachteten, dass
eine funktionierende zirkadiane Periodik nicht an das Vorhandensein von
mPer3 gebunden sei, so konnten C. Johansson et al. [20] in Studien beim
Menschen zeigen, dass ein Zusammenhang zwischen dem Chronotyp und
hPer3 647 Val/Gly besteht. Die Ergebnisse der Untersuchungen mit
verschiedenen Polymorphismen zeigten einen Verbindung zwischen
Genpolymorphismen der zirkadianen Periodik und dem Auftreten von
Depression und Abendtypen.

25
Der hPer – Polymorphismus wird in der Literatur sehr häufig mit dem Abendtyp
in Verbindung gebracht. P. Hamet et al. [17], T. Ebisawa et al. [14] und M.
Schantz et al. [34] beschreiben eine signifikante Korrelation zwischen der
« Eule » sowie dem DSPS und dem Vorhandensein des S - Allels.
D. Boivin et al. beschreiben 2003, dass alle hPer – Gene signifikant positiv mit
der Melatoninproduktion korrelieren und dass die Schwankungen der Clock –
Gene unabhängig von Schlaf, Licht und Dunkelheit vorhanden sind, was dafür
spricht, dass die innere Uhr des Menschen endogener Natur ist.
3.5.4 Weitere Polymorphismen in Zusammenhang mit dem
menschlichen Schlaf
Es gibt sicherlich noch eine Vielzahl von Polymorphismen, die man in
Zusammenhang mit dem menschlichen Chronotypen hätte untersuchen
können. Aufgrund dessen, dass der Homocysteinspiegel einer deutlichen,
zirkadianen Periodik unterliegt und dies auch einen Zusammenhang mit dem
Chronotypen vermuten lässt, haben wir den im folgenden beschriebene
Polymorphismus der Methylentetrahydrofolat – Reduktase in unsere
Untersuchungen mit einbezogen.
3.5.5 Polymorphismus C T 677 der Methylentetrahydrolatreduktase
Wie D. Boensch et al. [9] beschreiben, synthetisiert die Methylentetra-
hydrolatreduktase (MTHFR) 5 – Methyltetrahydrofolsäure und ist somit der
entscheidende Kohlenstoff – Donator bei der Remethylierung von Homocystein
zu Methionin. Eine Mutation am Nukleotid 677 (CT) führt nun dazu, dass an
der Aminosäure 223 statt des Alanins ein Valin eingefügt wird und das Enzym
somit thermolabil wird. Da das System nun nicht mehr so effektiv arbeiten kann,
führt diese Mutation zu höheren Homocysteinspiegeln. Immerhin verliert das
Enzym aufgrund dieser Mutation ungefähr 50% seiner Aktivität.
D. Boensch et al. [10] veröffentlichten 2007 eine Studie über die Rhythmik des
menschlichen Homocysteinspiegels. Die Untersuchungen zeigten eine
hochsignifikante 24 – Stunden – Rhythmik mit einem deutlichen Homocystein –
Peak in den Abendstunden.

26
Homocystein scheint den menschlichen Schlaf entscheidend zu beeinflussen.
Die Rhythmik der Homocysteinausschüttung sei laut Lavie L. et. al [24] völlig
unabhängig von Schlaf – und Wachzustand des Menschen oder von seiner
Nahrungszufuhr. Homocystein ist zusätzlich als wichtiger kardiovaskulärer
Risikofaktor bekannt. Aufgrund dieser Erkenntnisse wurden in der genannten
Studie mögliche Einflüsse auf die Gesundheit von Schichtarbeitern postuliert.
Geht man nun davon aus, dass der Homocysteinspiegel - wie oben
beschrieben - den menschlichen Schlaf beeinflusst und eine Mutation am
Nukleotid 677 den Homocysteinspiegel verändert, dann könnte dieser
Polymorphismus auch Auswirkungen auf die zirkadiane Rhythmik des
menschlichen Schlafes haben.
Aufgrund dieser noch sehr neuen Erkenntnisse und der Tatsache, dass unseres
Wissens nach dieser Polymorphismus noch nie in Hinblick auf Morgen – und
Abendtyp untersucht worden ist, haben wir uns entschieden, die MTHFR 677 in
unsere Studie mit aufzunehmen.

4 Material und Methoden
4.1 Chemikalien und Enzyme
27
Die für die Versuche benötigten Chemikalien und Enzyme werden von den
Firmen Bio-Rad, Quiagen, peqLab Biotechnology, GeneCraft Germany, TIB
Molekularbiologie Berlin, PE Applied Biosystems, BioLabs New England und
Roth bezogen. Die Lösungen werden mit deionisiertem Wasser in Eppendorf –
Cups angesetzt und bei –20°C aufbewahrt.
4.1.1 Lösungen und Puffer
Hier sind nur die Lösungen und Puffer aufgeführt, die bei mehreren Versuchen
verwendet werden. Spezifische Lösungen, Primer, Puffer und Enzyme werden
bei den entsprechenden Punkten angegeben.
10 mM dNTP Mix: je 10 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP
10x Taq-Polymerase-Puffer: BioTherm, 15mM MgCl2
100bp DNA-Ladder: 1µg/10µl
Taq-Polymerase: Supratherm, Genecraft
EtBr: 1%
10x TBE - Puffer: 108g Tris – KCL, 55g Borsäure, 40ml 0,5mM EDTA
(pH 8,0), auf 1 Liter doppelt destilliertes Wasser
auffüllen
6x Ladepuffer: 0,25% Bromphenol, 0,25% Xylene Cyanol FF, 30%
4.1.2 Oligonukleotide
Glycerin
Die Sequenzen der verwendeten Oligonukleotide sind von 5’ nach 3’ notiert. Zur
Verwendung bei der PCR werden die gelieferten Oligonukleotide in
deionisiertem Wasser gelöst und dann zusammen mit Wasser in einem
Verhältnis von 1:5 (40 µl Primer und 160 µl H2O) bei –20°C aufbewahrt.
SNPR1A-F: GGC TGG ACT GTT AGA TGA TAA CG

28
SNPR1A-mod-R: GGA AGA AGA CCG AGT GTG TCA T
hClockT3111C-F: TCC AGC AGT TTC ATG AGA TGC
hClockT3111C-R: GAG GTC ATT TCA TAG CTG AGC
hPer3M1037T-F: CAA AAT TTT ATG ACA CTA CCA GAA TGG CTG AC
hPer3M1037T-R: AAC CTT GTA CTT CCA CAT CAG TGC CTG G
COMT-F: CTC ATC ACC ATC GAG ATC AA
COMT-R: CCA GGT CTG ACA ACG GGT CA
HTTLPR-F: GGC GTT GCC GCT CTG AAT GC
HTTLPR-R: GAG GGA CTG AGC TGG ACA ACC AC
MTHFR677neu-F: TGA AGG AGA AGG TGT CTG CGG GA
MTHFR677neu-R: AGG ACG GTG CGG TGA GTC TGG G
A1AR716-F: ATC GCC CTG GTC TCT GTG
A1AR716-R: GAC CCG GAG GTA GAG GTC C
A2AAR263-F: TAC CCA GAG GCA ACC AGA TAA A
A2AAR263-R: CGA AAA GCC CAT TTC TAC CAA A
A2AAR1976_T_-F: CGG AGG CCC AAT GGC TAT
A2AAR1976_C_-F: CGG AGG CCC AAT GGC TAC
A2AAR1976-R: GTG ACT GGT CAA GCC AAC CA

29
A2AAR2592-F: CAG AGG TGA CAT TTG ACT TTC TT
A2AAR2592-R: CCT GGG ACT GAG AAG TGG AT
ADA22_G_-F: CCC AGA CGC CCG CCT TCG
ADA22_A_-F: CCC AGA CGC CCG CCT TCA
ADA22-R: GAA CTC GCC TGC AGG AGC C
ACE-F: CTG GAG ACC ACT CCC ATC CTT TCT
ACE-R: GAC GTG GCC ATC ACA TTC GTC AGA T
ACEint-F: TGG GAC CAC AGC GCC CGC CAC TAC
ACEint-R: TCG CCA GCC CTC CCA TGC CCA TAA
4.1.3 Sonstige Geräte und Materialien
Zur PCR wird der Thermocycler und der iCycler von Bio-Rad verwendet.
Das Wasser wird mit dem Reinstwassersystem Typ HP 6 UV/UF von TKA-LAB
aufbereitet und dann autoklaviert.
Zum Zentrifugieren wird die Eppendorf Zentrifuge 5415 R verwendet.
Für die teilweise notwendigen Verdaue werden die Platten in einen Brutschrank
von Heraeus gelegt.
Als Waage dient das Modell 470 von Kern.

30
Als Autoklav wird der H1clave HV-85 von Wolf verwendet. Die Materialien
werden im Anschluss in einem Temperaturschrank von Memmert erwärmt und
getrocknet.
Folgende Pipetten-Modelle werden verwendet: Eppendorf Research (2,5µl,
10µl, 100µl, 1000µl) und Eppendorf Research Pro (5-100µl). Pipettenspitzen
werden ebenfalls von Eppendorf bezogen.
Das Agarosegel wird in entsprechende Gelschlitten gelegt, an die
Spannungsquelle EPS 2A200 von Hoefer angelegt und anschließend mit dem
Geld Doc 2000 von Bio-Rad betrachtet und fotografiert.
4.2 Vorgehen bei der Probandenauswahl
4.2.1 Rekrutierung der Probanden
Die Probanden der von uns durchgeführten Studie werden aus
unterschiedlichen Bereichen rekrutiert. Der Großteil stammt aus dem
Patientenkollektiv der Schlafambulanz der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg. Dazu werden alle ehemaligen Patienten der
Schlafambulanz angeschrieben, deren Adressen anhand der Patientenakten
ausfindig gemacht werden können. Insgesamt werden so 311 potenzielle
Probanden für unsere Studie kontaktiert und gebeten, die beigefügten
Fragebögen D-MEQ und ESS (hierzu unter 7.2.2 mehr) ausgefüllt
zurückzusenden. Des Weiteren werden 14 Studenten einer anderen Studie und
29 Personen aus dem eigenen Bekanntenkreis gebeten die Fragebögen
auszufüllen und sich gegebenenfalls als Proband für unsere Untersuchungen
zur Verfügung zu stellen. Somit ergibt sich ein potenzieller Probandenpool von
insgesamt 354 Personen unterschiedlichen Alters und Geschlechts.
4.2.2 Eingruppierung der Probanden mittels Fragebögen - Die
deutsche Übersetzung des Morningness-Eveningness-
Questionnaires (D-MEQ)
Zur genauen Eingruppierung der Probanden werden die bereits oben
erwähnten, etablierten Fragebögen verwendet.

31
Zur Ermittlung der subjektiven zirkadianen Phasenlage (Chronotyp) wird die
deutsche Übersetzung des Morningness-Eveningness-Questionnaires (D-MEQ)
von Horne und Östberg, dessen Validität durch Griefahn et al. 2001 überprüft
wurde, verwendet. Der Test beinhaltet 19 Fragen, deren Antwortmöglichkeiten
mit einem entsprechenden Punktwert versehen sind, wobei insgesamt
mindestens 16, jedoch maximal 86 Punkte vergeben werden können. Die
Fragen beziehen sich auf bevorzugte Aufsteh- und Bettgehzeiten, Müdigkeit
und Appetit am Morgen, bevorzugte Zeiten für körperliche und geistige
Betätigungen, Reaktionen auf Veränderungen der gewöhnlichen Bettgehzeiten,
bevorzugte Arbeitszeiten und eine Selbsteinschätzung bezüglich des
Chronotypens.
Anhand des Fragebogens lassen sich dann die Probanden in folgende 5
Gruppen einteilen: definitiver Abendtyp (16-30 Punkte), moderater Abendtyp
(31-42 Punkte), neutraler bzw. normaler Typ (43-58 Punkte), moderater
Morgentyp (59-70 Punkte) und definitiver Morgentyp (71-86 Punkte).
4.2.3 Blutentnahme zur DNA – Gewinnung
Nach Auswertung der beiden Fragebögen werden alle Personen gebeten, sich
zu einer Blutentnahme in der Ambulanz der Poliklinik vorzustellen. Nach
mehreren Terminen kann so bei 83 Personen, die dann das endgültige
Studienkollektiv ausmachen, nach erfolgter Aufklärung und Einwilligung das
benötigte EDTA – Blut entnommen werden und bis zur endgültigen
Aufbereitung bei – 20°C eingefroren werden.
4.3 Mikrobiologische und molekularbiologische Methoden
4.3.1 Sterilisieren
Um ein sauberes und Kontaminationsfreies Arbeiten zu ermöglichen ist ein
vorheriges sterilisieren aller verwendeten Gefäße, Pipettenspitzen und
Eppendorfcups unumgänglich. Hierfür werden die Materialien für 30 Minuten bei
125°C autoklaviert und danach im Heißluftschrank be i ca. 70°C getrocknet.

4.3.2 DNA – Extraktion
32
Zur Gewinnung der DNA aus dem entnommenen Blut wird das DNA Blood Mini
Kit von QiAmp Cat. No. 51 106 verwendet und nach folgendem Protokoll
vorgegangen:
1) 20 µl Protease K (Quiagen) in ein Eppendorf – Cup geben
2) 200 µl Blut dazugeben
3) 200 µl Lysepuffer AL zufügen und 15 Sekunden vortexen
4) bei 56°C für 10 Minuten inkubieren
5) kurz bei 8000 rpm zentrifugieren und flüssigen Überstand abpipettieren;
Niederschlag verwerfen
6) den flüssigen Überstand zu 200 µl 96 – 100%igen Ethanol zugeben und
15 Sekunden vortexen
7) kurz bei 8000 rpm zentrifugieren
8) Alles auf eine Säule aufgeben, 1 Minute bei 8000 rpm zentrifugieren;
danach abzentrifugierte Flüssigkeit verwerfen und neue Collection Tube
verwenden
9) 500 µl Waschpuffer AW 1 (muss mit Ethanol versetzt sein) dazugeben, 1
Minute bei 8000 rpm zentrifugieren; danach abzentrifugierte Flüssigkeit
verwerfen und neue Collection Tube verwenden
10)500 µl Waschpuffer AW 2 (muss mit Ethanol versetzt sein) dazugeben
und 3 Minuten bei 14000 rpm zentrifugieren
11)Säule in ein Eppendorfcup stellen, 200 µl Auswaschpuffer AE dazugebe;
1 Minute bei Raumtemperatur inkubieren und dann 1 Minute 30
Sekunden bei 8000 rpm zentrifugieren
12)Fertig extrahierte DNA in Eppendorfcup bei –20°C einfrieren
4.3.3 Polymerase – Ketten – Reaktion (PCR)
Diese molekularbiologische Methode dient der in vitro - Amplifizierung von
Nukleinsäure-Fragmenten. Dafür wird der DNA – Doppelstrang zunächst auf
90°C erhitzt und dadurch denaturiert. Das Gemisch w ird dann auf ca. 50°C
abgekühlt und es werden zwei Oligonucleotide zugesetzt. Diese sind der
Sequenz an den beiden 5’ -Enden komplementär. Die beiden Einzelstränge
werden nun durch Zusatz von Desoxyribonucleotiden und einer Polymerase zu
Doppelsträngen komplimentiert. Da dieser aus drei Schritten bestehende

33
Zyklus mehrfach wiederholt wird, ergibt sich so eine exponentielle Zunahme der
amplifizierten DNA – Moleküle auf das bis zu 10 5 -fache. Die Polymerase wird
aus thermophilen Bakterien isoliert, die auch bei Temperaturen bis zu 95°C
noch stabil sind. Das von uns verwendetet Enzym stammt aus dem Organismus
namens Thermus aquaticus, was ihm den Namen Taq – Polymerase verliehen
hat.
Die PCR ist eine sehr empfindliche Methode und birgt aufgrund der enorm
hohen Amplifikationsfähigkeit eine große Fehlerquelle durch Kontamination des
PCR-Ansatzes mit fremder DNA, weswegen ein besonders sauberes Arbeiten
mit vorher sterilisierten Pipettenspitzen und Gefäßen unbedingt erforderlich ist.
Standardbedingungen für einen PCR – Ansatz von 25 µl:
Wasser 18,5 µl
DNA 1,0 µl
Primer F 1,0 µl
Primer R 1,0 µl
10 mM dNTP mix 1,0 µl
10x Taq – Polymerase – Puffer 2,5 µl
Taq Polymerase 0,3 µl
Das Pipettieren des PCR-Ansatzes sollte immer auf Eis erfolgen und die
Polymerase erst ganz zum Schluss dazugegeben werden, um ein vorzeitiges
Starten der Reaktion zu verhindern.
Die PCR wird in 96-well-Platten mit dem Thermocycler der Firma BioRad
gemacht.

34
4.3.4 Übersicht über die verwendeten Primer
Temperatur Verdau
Enzym zum
Verdau
zugehöriger
Puffer Agarosegel Laufzeit
A2AAR1976T>C 61 °C nein - - 2% 1h
A2AAR2592C>T 56 °C ja Mbo II NEB 2 2% 1h
A2AAR263 58 °C ja BseNI B 2% 1h
A1AR716T>C 58° C ja Aci I NEB 3 3% 1,5h
ADA22G>A 61 °C nein - - 2% 1h
ACE 59 °C nein - - 2% 1h
ACEint 66 °C nein - - 2% 1h
HTTLPR 63 °C nein - - 3% 1,5h
SNPR1A 58 °C ja BseGI Tango 2% 1h
COMT 61 °C ja Nla III
hClock3111T>C 58 °C ja Bsp1286 I
NEB 4 und
BSA 6-8% 1,5h
NEB 4 und
hper3M1037 ja NcoI NEB 3
BSA 2% 1h
MTHFR677C>T 60 °C ja Hinf I NEB 2 2% 1h
Tabelle 1: Übersicht der verwendeten Primer
4.3.5 Etablierung der PCR – Bedingungen
Teilweise sind zwar die optimalen Bedingungen für die PCR aus Veröffentlichen
bekannt. Diese müssen aber trotzdem erst überprüft und auf die im Labor
herrschenden Bedingungen und auf die Geräte genau abgestimmt werden.
Daher werden zuerst mit jedem Primer PCRs mit vorgegebenen
Temperaturgradienten durchlaufen, um die optimalen Temperaturen und Zeiten
herauszufinden. Der Temperaturgradient wird beim ersten Durchgang immer +/-
5°C um die vorbeschriebene Optimaltemperatur gelegt . Nach Ende der PCR
werden die PCR-Produkte auf ein Agarosegel aufgetragen und nach
Durchlaufen des angelegten elektrischen Feldes im UV-Licht sichtbar gemacht
und fotografiert. Bei nicht eindeutigen Ergebnissen wird dann die exakte
Temperatur durch immer enger werdende Gradienten eingegrenzt und ermittelt.
Das Protokoll, welches im Allgemeinen zur Ermittlung der optimalen
Temperatur verwendet wird, kann der unten stehenden Tabelle entnommen
werden. Lediglich für den Polymorphismus ACEint muss von diesem Gradienten

35
nach oben abgewichen werden, da die vorbeschriebene Temperatur bei über
64°C liegt.
Zur Verifizierung der Ergebnisse wird dann bei der jeweilig ermittelten
Temperatur ein Testlauf mit 10 verschiedenen, zufällig ausgewählten DNAs
gemacht.
4.3.6 PCR – Protokolle
allgemeiner
Gradient zur
Denaturierung 40 PCR - Zyklen
1 PCR -
Zyklus Kühlung
Temp Dauer Temp Dauer Temp Dauer Temp Dauer Temp Dauer Temp
Etablierung 95°C 3 Min 95°C
A2AAR1976T>C 95°C 3 Min 95°C
A2AAR2592C>T 95°C 3 Min 95°C
A2AAR263 95°C 3 Min 95°C
A1AR716T>C 95°C 3 Min 95°C
ADA22G>A 95°C 3 Min 95°C
ACE 95°C 3 Min 95°C
ACEint 95°C 3 Min 95°C
HTTLPR 95°C 3 Min 95°C
SNPR1A 95°C 3 Min 95°C
COMT 95°C 3 Min 95°C
hClock3111T>C 95°C 3 Min 95°C
hper3M1037 95°C 3 Min 95°C
Tabelle 3: PCR-Protokolle
MTHFR
30
Sek
30
54-
64°C
Sek 61°C
30
Sek 56°C
30
Sek 58°C
30
Sek 58°C
30
Sek 61°C
30
Sek 59°C
30
Sek 66°C
30
Sek 63°C
30
Sek 58°C
30
Sek 61,5°C
30
Sek 58°C
30
Sek
30
Sek 72°C
30
Sek 72°C
30
Sek 72°C
30
Sek 72°C
30
Sek 72°C
30
Sek 72°C
30
Sek 72°C
30
Sek 72°C
30
Sek 72°C
30
Sek 72°C
30
Sek 72°C
30
Sek 72°C
30
Sek 72°C
30
Sek 72°C 7 Min 16°C
30
Sek 72°C 7 Min 16°C
30
Sek 72°C 7 Min 16°C
30
Sek 72°C 7 Min 16°C
30
Sek 72°C 7 Min 16°C
30
Sek 72°C 7 Min 16°C
30
Sek 72°C 7 Min 16°C
30
Sek 72°C 7 Min 16°C
45
Sek 72°C 7 Min 16°C
30
Sek 72°C 7 Min 16°C
30
Sek 72°C 7 Min 16°C
30
Sek 72°C 7 Min 16°C
45
Sek 72°C 7 Min 16°C
677 Denaturierung 2 PCR - Zyklen 30 PCR - Zyklen Kühlung
95°C
10
Min 94°C
40
Sek 58°C
Tabelle 4: PCR-Protokoll MTHFR677
40
Sek 72°C
70
Sek 94°C
40
Sek 60°C
40
Sek 72°C
70
Sek 16°C

4.3.7 PCR – Verdau
4.3.7.1 Verwendete Enzyme
4.3.7.1.1 NcoI
36
spaltet an folgender Stelle: 5’…C ▼ CATGG…3’
wird in 10mM Tris-HCL (pH 7,4 bei 25°C), 50 mM KCL , 0,1 mM EDTA,
200µg/ml BSA und 50% Glycerol bereitgestellt
4.3.7.1.2 Bsp1286 I
spaltet an folgender Stelle: 5’…GDGCH ▼ C…3’
wird in 50mM KCL, 10mM Tris-HCL (pH 7,4), 0,1 mM EDTA, 1mM DTT,
400µg/ml BSA und 50% Glycerol bereitgestellt
4.3.7.1.3 BseG I
spaltet an folgender Stelle: 5’…GGATGNN ▼ …3’
wird in 1ml 10x Buffer Tango TM bereitgestellt
4.3.7.1.4 Hinf I
spaltet an folgender Stelle: 5’…GGATGNN ▼ …3’
wird in 1ml 10x Buffer Tango TM bereitgestellt
4.3.7.1.5 Aci I
spaltet an folgender Stelle: 5’…C ▼ CGC…3’
wird in 100mM NaCl, 10mM Tris-HCL (pH 7,4 bei 25°C ), 0,1 mM EDTA,
1mM DTT, 200µg/ml BSA und 50% Glycerol bereitgestellt
4.3.7.1.6 BseNI
spaltet an folgender Stelle: 5’…ACTGGN ▼ …3’

37
wird in einem Verdünnungspuffer bereitgestellt: 10 mM Tris-HCL (pH 7,4
bei 25°C), 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,2 mg/ ml BSA und
50%igem Glycerol
4.3.7.1.7 Mbo II
spaltet an folgender Stelle: 5’…GAAGA (N)8 ▼ …3’
wird in 50mM KCl, 10mM Tris-HCL (pH 7,4), 0,1 mM EDTA, 1mM DTT,
200µg/ml BSA und 50% Glycerol bereitgestellt
4.3.7.2 Verwendete Puffer
4.3.7.2.1 1x Buffer Tango TM
33mM Tris-acetat (pH 7,9), 10mM Magnesiumacetat, 66mM
Kaliumacetat, 01mg/ml BSA
Die Lösung muss noch mit einem Verdünnungspuffer versetzt werden:
10mM Tris-HCl (pH 7,4 bei 25°C), 100mM KCl, 1mM ED TA, 1mM DTT,
0,2mg/ml BSA und 50%igem Glycerol.
4.3.7.2.2 1x Buffer B
10mM Tris-HCl (pH 7,5), 10mM MgCl2, 0,1 mg/ml BSA
4.3.7.2.3 1x NEBuffer 2
50mM NaCl, 10mM Tris-HCl, 10mM MgCl2, 1mM DTT, pH 7,9 bei 25°C
4.3.7.2.4 1x NEBuffer 3
100mM NaCl, 50mM Tris-HCl, 10mM MgCl2, 1mM DTT, pH 7,9 bei 25°C

4.3.7.2.5 1x NEBuffer 4
38
50mM Kaliumacetat, 20mM Tris-HCl, 10mM Magnesiumacetat, 1mM
DTT, pH 7,9 bei 25°C
4.3.7.2.6 BSA
20 mM KPO4, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 5% Glycerol, pH 7,0 bei 25°C
4.3.7.3 Protokolle PCR – Verdau
Enzym zum
Verdau zugehöriger Puffer
Temperatur für
Verdau
Mindestdauer des
Verdaus
A2AAR2592C>T Mbo II NEB 2 37°C 4 Std
A2AAR263 BseNI B 37°C 12 Std
A1AR716T>C Aci I NEB 3 37°C 4 Std
SNPR1A BseGI Tango 37°C 12 Std
COMT Nla III NEB 4 und BSA 37°C 4 Std
hClock3111T>C Bsp1286 I NEB 4 und BSA 37°C 4 Std
hper3M1037 NcoI NEB 3 37°C 4 Std
MTHFR677C>T Hinf I NEB 2 37°C 12 Std
Tabelle 5: Protokolle PCR-Verdau
4.3.8 DNA – Agarose – Laufpuffer
Laufpuffer: 1x TBE
Ladepuffer: 6x
EtBr: 1%
Bei den meisten PCR-Produkten wird ein 2%iges Agarosegel verwendet. Nur
bei HTTLPR und A1AR716T>C ist zur besseren Unterscheidung der einzelnen
Banden ein 3%iges Gel und bei COMT ein 6-8%iges Gel besser geeignet.
Konzentration Agarosegel Agarose 1x TBE
2% 4g 200ml
3% 6g 200ml
6% 12g 200ml
8% 16g 200ml
Tabelle 6: Übersicht Agarosegele

39
Die Agarose (peqGOLD Universal Agarose peqLAB Biotechnology) wird im
Laufpuffer aufgekocht, bis sie klar und frei von Flocken oder Blasen ist. Nach
kurzer Abkühlzeit wird sie mit 12 µl EtBr versetzt und in einen horizontalen
Gelschlitten gegossen. Durch Einsetzen zweier Kämme mit je 20 Zähnen in die
noch flüssige Agarose werden die nötigen Probetaschen geformt. Sobald das
Gel getrocknet und gehärtet ist, können diese beiden Kämme wieder
entnommen werden. 5µl des PCR-Produktes werden nun noch mit 2µl 6x
Ladepuffer versetzt und dann in die Taschen eingefüllt.
Zur Auftrennung der einzelnen DNA-Fragmente entsprechend ihrer Länge wir
nun eine Spannungsquelle an die geschlossene Elektrophoresewanne
angeschlossen und – bei dem 2%igen Gel – mit konstant 120 V für 1 Stunde
laufen gelassen. Die durch das EtBr eingefärbte DNA kann unter der UV-Lampe
in dem von uns verwendeten Gel Doc 2000 sichtbar gemacht und abfotografiert
werden.
4.3.9 Verwendeter Standard
Um die Bilder der Gelelektrophorese auswerten zu können, wird zur
Vergleichbarkeit und Einschätzung der Bruchstückgröße ein 100bp – Standard
verwendet.
Abbildung 1: 100bp - Standard

40
4.3.10 Ergebnisse der PCR – Etablierung
Nachdem von allen Primern als erstes die breit gefächerten Gradienten
gemacht wurden und die Temperaturen dann gegebenenfalls noch in immer
enger gefassten Gradienten ermittelt werden konnten, wurde für jeden
Polymorphismus das optimale PCR-Protokoll entworfen. Dieses wurde dann
noch in Testläufen mit 10 verschiedenen, willkürlich ausgewählten DNAs
verifiziert. Das Protokoll sah für hClockT3111, SNPR1A, COMT, A1AR716,
A2AAR263, A2AAR2592, ACE, ACEint, A2AAR1976_T_, A2AAR1976_C_.
ADA22_G_ und ADA22_A_ folgendermaßen aus:
Zunächst einen ersten Denaturierungsschritt bei 95°C für 3 Minuten; es
folgen 40 PCR-Zyklen (95°C für 30 Sekunden, X°C für 30 Sekunden und
72°C für 30 Sekunden) und 1 PCR-Zyklus (72°C für 7 Minuten). Nach
Ende der PCR wird der Heizblock auf 16°C herunterge kühlt.
Lediglich die Temperatur X°C unterscheidet sich un d ist der unten
stehenden Tabelle zu entnehmen
Das Protokoll für httlpr musste geringfügig verändert werden:
Auch hier muss als erstes ein Denaturierungsschritt bei 95°C für 3
Minuten erfolgen; es folgen 40 PCR-Zyklen (95°C für 30 Sekunden, 63°C
für 30 Sekunden und 72°C für 45 Sekunden) und 1 PCR -Zyklus (72°C für
7 Minuten). Wie bei allen anderen PCRs wird nach Ende der eigentlichen
PCR der Heizblock auf 16°C heruntergekühlt.
Etwas stärker variiert wurde das Protokoll für ein optimales Ergebnis des
mthfr677neu:
Wie immer beginnt das Protokoll mit einem ersten Denaturierungsschritt
bei 95°C für 10 Minuten; es folgen 2 PCR-Zyklen (94 °C für 40 Sekunden,
58°C für 40 Sekunden und 72°C für 70 Sekunden) und 30 PCR Zyklen
(94°C für 40 Sekunden, 60°C für 40 Sekunden und 72° C für 70
Sekunden). Im Anschluss an die eigentliche PCR folgt dann wieder das
Herunterkühlen des Heizblockes auf 16°C.

41
Für den hPer3M1037 – Polymorphismus konnte trotz intensiver Bemühungen
kein Protokoll festgelegt werden, bei dem die PCR fehlerfrei funktioniert hat. Es
wurden mehrfach verschiedene Temperaturen ausprobiert, dem PCR – Ansatz
wurde MgCl2 beigemengt, die Zeiten im PCR – Protokoll wurden variiert und es
wurde ein komplett neuer Primer bestellt. Auch mit den neu angesetzten
Primern konnte leider kein befriedigendes Ergebnis erzielt werden. Die
Ergebnisse der PCR waren sowohl unverdaut als auch verdaut nicht
verwertbar.
Die spezifischen Temperaturen und Besonderheiten der einzelnen
Polymorphismen sind in der folgenden Tabelle noch einmal zusammengefasst:
Temperatur Verdau
Enzym zum
Verdau
zugehöriger
Puffer Agarosegel Laufzeit
A2AAR1976T>C 61 °C nein - - 2% 1h
A2AAR2592C>T 56 °C ja Mbo II NEB 2 2% 1h
A2AAR263 58 °C ja BseNI B 2% 1h
A1AR716T>C 58° C ja Aci I NEB 3 3% 1,5h
ADA22G>A 61 °C nein - - 2% 1h
ACE 59 °C nein - - 2% 1h
ACEint 66 °C nein - - 2% 1h
HTTLPR 63 °C nein - - 3% 1,5h
SNPR1A 58 °C ja BseGI Tango 2% 1h
COMT 61 °C ja Nla III
hClock3111T>C 58 °C ja Bsp1286 I
NEB 4 und
BSA 6-8% 1,5h
NEB 4 und
hper3M1037 ja NcoI NEB 3
BSA 2% 1h
MTHFR677C>T 60 °C ja Hinf I NEB 2 2% 1h
Tabelle 7: Übersicht Temperaturen und Besonderheiten der Polymorphismen

5 Ergebnisse
42
5.1 Ergebnisse der Probandenrekrutierung
5.1.1 Rücklauf der Fragebögen
Wie bereits unter Punkt 7.2.1 beschrieben, wurden insgesamt 354 Personen
angeschrieben und gebeten, die beiden ausgefüllten Fragebögen
zurückzusenden. Insgesamt haben 154 Personen die Fragebögen vollständig
ausgefüllt zurückgegeben. Nicht alle potenziellen Probanden waren bereit, sich
einer Blutentnahme zu unterziehen oder aufgrund der teilweise sehr großen
Entfernungen dafür nicht extra in die Poliklinik der Universität Erlangen-
Nürnberg zu kommen. Somit konnten insgesamt 83 Personen als Probanden
für unsere Studie gewonnen werden.
Die genaue deskriptive Verteilung nach Geschlecht, Alter und Test-Score ist zur
besseren Übersicht in den folgenden Tabellen zusammengefasst.
Gesamtkollektiv aller ausgewerteten Fragebögen:
weiblich männlich niedrigster Wert höchster Wert Mittelwert
Geschlecht 75 (48,7 %) 79 (52,3 %)
Alter 17 83 42,74
D-MEQ 19 79 52,06
Tabelle 8: Übersicht aller ausgewerteter Fragebögen
Auswertung des endgültigen Studienkollektivs:
weiblich männlich niedrigster Wert höchster Wert Mittelwert
Geschlecht 41 (49,4 %) 42 (50,6 %)
Alter 20 83 45,83
D-MEQ 19 79 51,58
Tabelle 9: Übersicht des endgültigen Studienkollektivs
Sowohl das Alter als auch der D – MEQ - Score sind normal verteilt. Der
Vergleich der beiden Tabellen zeigt auch, dass die von uns untersuchten
Probanden sehr gut das Gesamtkollektiv der ausgewerteten Fragebögen
widerspiegeln.

5.1.2 Auswertung der D – MEQ
43
Insgesamt haben, wie oben bereits beschrieben, 154 Personen diesen
Fragebogen ausgefüllt und zurückgegeben. Die Auswertung ergab 27 Abend-,
79 Neutral- und 48 Morgentypen.
Die detaillierte und untergliederte Aufschlüsselung der endgültigen
Studienpopulation ist aus Gründen der besseren Übersicht wieder in einer
Tabelle zusammengefasst.
Morgentyp
34%
Verteilung der Schlaftypen
N ormaltyp
39%
Abendtyp
27%
Abbildung 2: grafische Darstellung der Verteilung der Schlaftypen
Definition über Score endgültige Probanden entspricht
definitiver Abendtyp 16 bis 30 4 4.8 %
moderater Abendtyp 31 bis 42 18 21.7 %
Neutraltyp 43 bis 58 33 39.8 %
moderater Morgentyp 59 bis 70 23 27.7 %
definitiver Morgentyp 71 bis 86 5 6.0 %
Tabelle 10: Übersicht über die Verteilung der Schlaftypen in der endgültigen Studienpopulation
5.2 Fehlende Werte
Bei den Versuchen konnten mit der DNA mancher Probanden trotz mehrfacher
Wiederholung der PCR keine verwertbaren Banden erzeugt werden. Ein

44
systematischer Fehler bei der Aufbereitung der DNA aus dem EDTA - Blut
konnte allerdings ausgeschlossen werden, da es keine Probe gab, bei der es in
allen untersuchten Polymorphismen zu einem Ausfall kam.
5.3 Zusammenhang zwischen Chronotyp und Alter
Ein interessanter Zusammenhang konnte zwischen dem Alter und dem
Schlaftyp gefunden werden. Fasst man die Probanden in die drei Hauptgruppen
des Schlaftypus zusammen zeigt sich, dass Menschen des Abendtyps
hochsignifikant (Univariate ANOVA: F = 13.95, df = 2, p < 0.001) jünger sind,
als diejenigen in den beiden anderen Gruppen.
N Altersdurchschnitt
Abendtyp 22 31.09 +/- 10.01
Normaltyp 32 47.56 +/- 15.40
Morgentyp 27 52.30 +/- 16.41
Tabelle 11: Altersdurchschnitt in den 3 Hauptgruppen der Schlaftypen (in dieser Tabelle sind
nur 81 Probanden erfasst, da zwei der Befragten ihr Alter nicht angaben)
5.4 Ergebnisse der einzelnen Polymorphismen in Zusammenhang mit
dem D-MEQ
5.4.1 Polymorphismus T C 3111 des hClock – Gens
Für den T C 3111 SNP des hClock-Gens fand sich folgende Verteilung in
unserer Stichprobe:
Wildtyp: T/T (n = 47)
Heterozygote Form: T/C (n = 31)
Variante: C/C (n = 3)
Diese Verteilung zeigt keine Abweichung vom Hardy-Weinberg-Equilibrium
(Pearson’s F=0.09; P=0.44): Es konnten 81 der 83 Probanden erfolgreich
genotypisiert werden.
Es zeigte sich kein signifikanter Effekt des Genotyps auf den D-MEQ-
Summenwert (ANOVA: F(2;78)=1,637; P=0,201) (Abbildung 3)

45
Abbildung 3
Bei der Analyse auf Allelebene zeigte sich ein signifikanter Zusammenhang
zwischen Chronotyp und hClock-Allel (Chi-Quadrat (2): 9,740; P=0.045).
Abbildung 4 verdeutlicht, dass das mutierte Allel häufiger bei moderaten und
definitiven Abendtypen auftritt.
Abbildung 4

46
Abbildung 5: Gelelektrophorese hClock T → C 3111
5.4.2 Polymorphismus T C 1976 des A2A – Adenosinrezeptors
Bei der Untersuchung des Polymorphismus T C 1976 des A2A-
Adenosinrezeptors zeigte sich in unserer Stichprobe folgende Verteilung:
Wildtyp: T/T (n = 31)
Heterozygote Form: T/C (n = 30)
Variante: C/C (n = 22)
Diese Verteilung stand in Einklang mit dem Hardy-Weinberg-Equilibrium
(Perason’s F=0.26; P=0.014). Von den 83 Proben konnten alle erfolgreich
genotypisiert werden.
Es zeigte sich kein signifikanter Effekt des Genotyps auf den D-MEQ-
Summenwert (ANOVA: F(2;80)=0,285; P=0,753) (Abbildung 6)
Abbildung 6

47
Die Analyse auf Allelebene zeigte keinen signifikanten Zusammenhang
zwischen Chronotyp und dem A2AR1976-Allel (Chi-Quadrat (2): 7,184;
P=0.126). Abbildung 7 verdeutlicht dies in grafischer Form.
Abbildung 7
Abbildung 8: Gelelektrophorese des Polymorphismus A2AAR1976C
Abbildung 9: Gelelektrophorese des Polymorphismus A2AAR1976T

48
5.4.3 Der Insertions/Deletions – Polymorphismus des Angiotensin –
Coverting – Enzyms
Für den Insertions/Deletions - Polymorphismus des Angiotensin – Coverting –
Enzyms fand sich folgende Verteilung in unserer Stichprobe:
Wildtyp: ACE/ACE (n = 23)
Heterozygote Form: ACE/ACEint (n = 32)
Variante: ACEint/ACEint (n = 22)
Hier zeigte sich keine Abweichung vom Hardy-Weinberg-Equilibrium (Pearson’s
F=0.168; P=0.138): Es konnten 76 der 83 Probanden erfolgreich genotypisiert
werden.
Es zeigte sich kein signifikanter Effekt des Genotyps auf den D-MEQ-
Summenwert (ANOVA: F(2;74)=0,494; P=0,62) (Abbildung 10)
Abbildung 10
Analysiert man die Daten auf Allelebene, zeigte sich kein signifikanter
Zusammenhang zwischen Chronotyp und dem ACE/ACEint-Allel (Chi-Quadrat
(2): 5,131; P=0.274). Die Ergebnisse sind in Abbildung 11 zusammengestellt.

49
Abbildung 11
Abbildung 12: Gelelektrophorese des Polymorphismus ACE
Abbildung 13: Gelelektrophorese des Polymorphismus ACEint

5.4.4 Polymorphismus der 5 – Hydroxytryptophan – Transporter –
linked – region
50
Bei der Analyse des Polymorphismus der 5-HTTLPR zeigte sich folgende
Verteilung in unserem Probandenkollektiv:
Wildtyp: L/L (n = 29)
Heterozygote Form: L/S (n = 36)
Variante: S/S (n = 16)
Die Analyse war mit dem Hardy-Weinberg-Equilibrium in Einklang zu bringen
(Pearson’s F=0.0.087; P=0.43). Es konnten 80 der 83 Probanden erfolgreich
genotypisiert werden.
Es zeigte sich kein signifikanter Effekt des Genotyps auf den D-MEQ-
Summenwert (ANOVA: F(2;78)=0,338; P=0,715) (Abbildung 14)
Abbildung 14
Bei der Analyse auf Allelebene ließ sich kein signifikanter Zusammenhang
zwischen Chronotyp und 5-HTTLPR-Allel nachweisen (Chi-Quadrat (2): 1,640;
P=0.802). Die Ergebnisse sind in Abbildung 15 dargestellt.

51
Abbildung 15
Abbildung 16: Gelelektrophorese des Polymorphismus 5-HTTLPR
5.4.5 Der Single – Nucleotid – Polymorphismus im 5 – HT1A – Rezeptor
Für den Single – Nucleotid – Polymorphismus im 5 – HT1A – Rezeptor fand sich
folgende Verteilung in unserer Stichprobe:
Wildtyp: L/L (n = 34)
Heterozygote Form: L/S (n = 15)
Variante: S/S (n = 20)
Diese Verteilung zeigt keine Abweichung vom Hardy-Weinberg-Equilibrium
(Pearson’s F=0.546; P=5.626): Es konnten 68 der 83 Probanden erfolgreich
genotypisiert werden.

52
Es zeigte sich ein signifikanter Zusammenhang zwischen D-MEQ
Summenscore und dem 5-HT1A-Genotyp (ANOVA: F(2;66)=4,002; P=0,023).
Heterozygote Träger der Variante hatten höhere Werte (59,93 +/- 11,25) als
homozygote Träger des Wildtyps (51,76 +/- 8,84; P=0.02 (Bonferroni). Es
zeigten sich keine signifikanten Unterschiede zu homozygoten Trägern der
Variante (55,25 +/- 8,87). (Abbildung 17)
Bei der Analyse auf Allelebene zeigte sich ein signifikanter Zusammenhang
zwischen Chronotyp und SNPR1HT1AR-Allel (Chi-Quadrat (2): 12,652; P=0.05).
Abbildung 18 stellt die Ergebnisse in grafischer Form dar.
Abbildung 17

53
Abbildung 18
Abbildung 19: Gelelektrophorese des 5-HT1A-Rezeptors
5.4.6 Polymorphismus der Catechol – O – Methyl – Transferase
Die Untersuchung der COMT lieferte folgende Verteilung der Stichprobe:
Wildtyp: L/L (n = 9)
Heterozygote Form: L/S (n = 57)
Variante: S/S (n = 8)
Diese Verteilung ist nicht mit dem Hardy-Weinberg-Equilibrium in
Zusammenhang zu bringen (Pearson’s F=-0.540; P=3.282): Es konnten 73 der
83 Probanden erfolgreich genotypisiert werden.

54
Ein signifikanter Effekt des Genotyps auf den D-MEQ-Summenwert konnte
nicht nachgewiesen werden (ANOVA: F(2;71)=0,229; P=0,796) (Abbildung 20)
Abbildung 20
Bei der Analyse auf Allelebene zeigte sich ebenfalls kein signifikanter
Zusammenhang zwischen Chronotyp und COMT-Allel (Chi-Quadrat (2): 8,547;
P=0.073). Abbildung 21 stellt die Ergebnisse in grafischer Form dar.
Abbildung 21

55
Abbildung 22: Gelektrophorese des Polymorphismus COMT
5.4.7 Polymorphismus C T der Methylentetrahydrofolatreduktase
Die Untersuchung des C --> T Polymorphismus der MTHFR zeigte folgende
Verteilung der Stichproben:
Wildtyp: L/L (n = 30)
Heterozygote Form: L/S (n = 20)
Variante: S/S (n = 6)
Diese Verteilung zeigt keine Abweichung vom Hardy-Weinberg-Equilibrium
(Pearson’s F=0.125; P=0.349): Es konnten 56 der 83 Probanden erfolgreich
genotypisiert werden.
Es konnte kein signifikanter Effekt des Genotyps auf den D-MEQ-Summenwert
nachgewiesen werden (ANOVA: F(2;55)=3,068; P=0,055) (Abbildung 23)
Abbildung 23

56
Bei der Analyse auf Allelebene zeigte sich allerdings ein hochsignifikanter
Zusammenhang zwischen Chronotyp und MTHFR-Allel (Chi-Quadrat (2):
15,317; P=0.004). Abbildung 24 stellt die Ergebnisse in grafischer Form dar.
Abbildung 24
Abbildung 25: Gelelektrophorese des Polymorphismus MTHFR677

5.4.8 Polymorphismus C T 2592 des A2A – Adenosinrezeptors
57
In unseren Stichproben zeigte sich beim Polymorphismus C --> T 2592 des A2A-
Adenosinrezeptors folgende Verteilung:
Wildtyp: L/L (n = 30)
Heterozygote Form: L/S (n = 45)
Variante: S/S (n = 8)
Diese Verteilung zeigt keine Abweichung vom Hardy-Weinberg-Equilibrium
(Pearson’s F=-0.166; P=0.129): Es konnten alle 83 Probanden erfolgreich
genotypisiert werden.
Es zeigte sich kein signifikanter Effekt des Genotyps auf den D-MEQ-
Summenwert (ANOVA: F(2;80)=0,479; P=0,621) (Abbildung 26)
Abbildung 26
Bei der Analyse auf Allelebene zeigte sich ebenfalls kein signifikanter
Zusammenhang zwischen Chronotyp und Adenosinrezeptor 2 2592-Allel (Chi-
Quadrat (2): 5,569; P=0.234). Abbildung 27 stellt die Ergebnisse in grafischer
Form dar.

58
Abbildung 27
Abbildung 28: Gelelektrophorese des Polymorphismus C → T 2592 des A2A-Adenosinrezeptors
5.4.9 Polymorphismus G A 22 der Adenosindeaminase
Folgende Verteilung der Stichproben konnte bei dem Polymorphismus G --> A
22 der Adenosindeaminase gesehen werden:
Wildtyp: G/G (n = 55)
Heterozygote Form: G/A (n = 9)
Variante: A/A (n = 4)
Diese Verteilung zeigt keine Abweichung vom Hardy-Weinberg-Equilibrium
(Pearson’s F=0.394; P=0.001): Es konnten 68 der 83 Probanden erfolgreich
genotypisiert werden.

59
Es konnte kein signifikanter Effekt des Genotyps auf den D-MEQ-Summenwert
nachgewiesen werden (ANOVA: F(2;65)=0,075; P=0,928) (Abbildung 29)
Abbildung 29
Auch bei der Analyse auf Allelebene zeigte sich kein signifikanter
Zusammenhang zwischen Chronotyp und ADA22-Allel (Chi-Quadrat (2): 4,285;
P=0.369). Abbildung 30 stellt die Ergebnisse in grafischer Form dar.
Abbildung 30

60
Abbildung 31: Gelektrophorese des Polymorphismus ADA22G
Abbildung 32: Gelektrophorese des Polymorphismus ADA22A
5.4.10 Polymorphismus T G 716 des A1 – Adenosinrezeptors
Für den T G 716 Polymorphismus des A1Adenosinrezeptor-Gens fand sich
folgende Verteilung in unserer Stichprobe:
Wildtyp: T/T (n = 43)
Heterozygote Form: T/G (n = 32)
Variante: G/G (n = 8)
Diese Verteilung zeigt keine Abweichung vom Hardy-Weinberg-Equilibrium
(Pearson’s F=0,062; P=0.571): Es konnten alle 83 Probanden erfolgreich
genotypisiert werden.
Es zeigte sich kein signifikanter Effekt des Genotyps auf den D-MEQ-
Summenwert (ANOVA: F(2;80)=0,568; P=0,569) (Abbildung 33)

61
Abbildung 33
Bei der Analyse auf Allelebene zeigte sich kein signifikanter Zusammenhang
zwischen Chronotyp und A1Adenosinrezeptor-Allel (Chi-Quadrat (2): 0,775;
P=0.942).
Abbildung 34

62
Abbildung 35: Gelelektrophorese des Polymorphismus T → G 716 des A1-Adenosinrezeptors
5.4.11 Polymorphismus C T 263 des A2A – Adenosinrezeptors
Die Analysen des C T 263 Polymorphismus des A2AAdenosinrezeptor-Gens
zeigte folgende Verteilung der Stichproben;
Wildtyp: L/L (n = 36)
Heterozygote Form: L/S (n = 33)
Variante: S/S (n = 14)
Eine Abweichung vom Hardy-Weinberg-Equilibrium war nicht zu sehen.
(Pearson’s F=0,144; P=0.187): Alle 83 Probanden konnten erfolgreich
genotypisiert werden.
Es zeigte sich kein signifikanter Effekt des Genotyps auf den D-MEQ-
Summenwert (ANOVA: F(2;80)=0,637 P=0,531) (Abbildung 36)
Abbildung 36

63
Bei der Analyse auf Allelebene zeigte sich kein signifikanter Zusammenhang
zwischen Chronotyp und A2AAdenosinrezeptor-Allel (Chi-Quadrat (2): 1,464;
P=0.833).
Abbildung 37
Abbildung 38: Gelelektrophorese des Polymorphismus C T 263 des A2A–Adenosinrezeptors

6 Diskussion
6.1 Diskussion der Studienkollektives - Zusammensetzung der
Studienpopulation
64
Endgültig nahmen an der Studie insgesamt 83 Personen unterschiedlichen
Alters, Geschlechts und Vorgeschichte teil. Wie aus Punkt 8.1.2 ersichtlich, war
die Stärke der 3 Hauptgruppen ähnlich. Allerdings war das Probandenkollektiv
der beiden Extremvarianten, nämlich der definitive Morgen- und Abendtyp, sehr
klein. Dennoch folgte die Studienpopulation einer Normalverteilung. Die
entsprechend moderat ausgeprägten Schlaftypen lagen zum Teil sehr nahe an
der Grenze zum Normaltyp, sodass Übergänge mitunter fließend sind.
Menschen mit einer extremen Ausprägung ihres Chronotypen sind sehr selten
zu finden. Um dem gerade beschriebenen Problem entgegenwirken zu können,
müsste man bei einer weiteren Studie eine wesentlich größere Zahl Probanden
rekrutieren. Nur so könnte man auch für die definitiven Morgen- und
Abendtypen eine aussagekräftige Gruppengröße erreichen.
6.2 Korrelation von Alter und Chronotypen
Der Zusammenhang zwischen dem Alter eines Menschen und seinem
Chronotypen wird häufig beschrieben. Die hierzu veröffentlichten Daten
konnten wir in unserer Studie bestätigen. Auch in unserem Studienkollektiv hat
sich gezeigt, dass Menschen des Abendtyps hochsignifikant jünger sind, als
diejenigen in den anderen Gruppen.
In großen Studien wurde auch eine Veränderung des Schlaftyps in den
verschiedenen Lebensphasen gezeigt. Während Kinder und ältere Menschen
[28] eher dem Morgentyp zuzurechnen sind, so sind Jugendliche und junge
Erwachsene deutlich häufiger als „Eulen“ einzustufen. Dieser Zusammenhang
scheint so deutlich und stark ausgeprägt zu sein, dass manche
Chronobiologen, wie z. B. Prof. Dr. Till Roenneberg von der Universität
München raten, den Schulbeginn weiter nach hinten in den Vormittag zu
verlegen, da jüngere Menschen später am Tag deutlich leistungsfähiger seien.
Diese oben zitierte Assoziation von Lebensalter und Chronotypen konnten auch
wir mit unserem Probandenkollektiv bestätigen. Dies wirft die Frage auf, was
hierfür der Auslöser sein könnte. Selbst wenn sich der Chronotyp im Laufe des

65
Lebens offensichtlich verändert, kann die innere Uhr des Menschen trotzdem
genetisch festgelegt sein. Es wäre sogar möglich, dass auch die Veränderung
des Chronotypen bereits in unseren Genen bestimmt ist. Es wäre sicherlich
interessant, den hinter dieser Modifikation steckenden Mechanismus in
weiteren Studien zu erforschen.
6.3 Diskussion der Ergebnisse der einzelnen Polymorphismen in
Zusammenhang mit dem D-MEQ
6.3.1 Allgemeines
Für alle der nachfolgend genannten Polymorphismen wurden Kreuztabellen
erstellt, um einen möglichen kategorialen Zusammenhang zwischen Chronotyp
und den untersuchten Polymorphismen zu finden. Da die Stichproben nicht
ausreichend groß für 3 Genotypen x 5 Chronotypen-Felder-Tafel war, wurde die
kategoriale Auswertung auf Ebene der Allele durchgeführt.
6.3.2 Polymorphismus T C 3111 des hClock – Gens
Dieser untersuchte Genabschnitt ist bezogen auf Schlaf und auch im
Zusammenhang mit dem menschlichen Chronotypen in der Literatur zwar
häufig erwähnt; die Bedeutung wird allerdings sehr kontrovers diskutiert.
Pavel Hamet et al. [17] erforschten intensiv die genetischen Hintergründe der
inneren Uhr von Säugern. Die Abkürzung Clock steht für „Circadian Locomotor
Output Cycle Kaput“. Dieses auch von Katzenberg et al. eingehend beforschte
Gen bildet zusammen mit dem Gen Bmal einen im Zytoplasma befindlichen
Komplex, der unter anderem die auch in der Einleitung beschriebenen Period –
Gene (z. B. hPer3) und Cry - Gene als wichtige Angriffspunkte hat. Diese
wiederum hemmen die Aktivität des Clock – Bmal – Komplexes, was
demzufolge eine Erniedrigung der Per- und Cry mRNA – Level zur Folge hat.
Somit entsteht ein wirksamer negativer Rückkoppelungsmechanismus. Diese
wellenförmige Ausschüttung der einzelnen Komponenten scheint laut Hamet et
al. durch den Lichteinfluss entscheidend gesteuert zu werden. Wenn man diese
komplizierten, ineinandergreifenden Mechanismen betrachtet, so wird deutlich,

66
dass man den Einfluss der einzelnen Gene nicht separat voneinander, sondern
vielleicht nur in einem Gesamtzusammenhang verstehen kann.
Wenn man nun aber die Ergebnisse unserer Untersuchungen des h-
Clock311T>C – Polymorphismus betrachtet, so zeigte bei der Analyse auf
Allelebene, dass das mutierte Gen wesentlich häufiger bei den Abendtypen zu
finden ist.
Unumstritten scheint zu sein, dass es einen Zusammenhang zwischen diesem
Clock – Gen und dem Chronotyp des Menschen gibt. Welcher Art diese
Assoziation ist, scheint aber noch immer sehr umstritten. So finden wir
Veröffentlichungen, in denen die C-Variante des hClock –Gens signifikant
häufiger bei Eulen zu finden ist [7]. Iwase T. et. al besagen genau das
Gegenteil [19]. Dieser Zusammenhang soll sowohl für depressive als auch für
psychisch gesunde Menschen gelten, was für die Zusammensetzung unseres
Studienkollektives von Vorteil wäre, da wir sowohl psychisch kranke als auch
gesunde Personen untersucht haben.
In Einklang zu bringen mit unseren Untersuchungsergebnissen sind auch die
von King et al gefundenen Hinweise (die in dem Übersichtsartikel von Iwase T.
et. al [19] zitiert wurden), dass dieses Gen in irgendeiner Form mit
entscheidend bei verschiedenen Schlafstörungen sei.
Alles in allem ist jedoch die Datenlage für dieses Clock – Gen noch so
unterschiedlich, dass eine weitere Untersuchung der Zusammenhänge als
durchaus sinnvoll zu betrachten ist. Auch muss man sich, wie oben diskutiert,
für zukünftige Studien überlegen, ob man die Gene des beschriebenen
Regelkreises einmal in ihrer Gesamtheit betrachtet.
6.3.3 Polymorphismus T C 1976 des A2A – Adenosinrezeptors
Die Literaturrecherche zeigte, dass dieser Polymorphismus offensichtlich in
Zusammenhang mit der Auslösung von Panikattacken zu sehen ist. Die
genauen Hintergründe zu den Adenosinrezeptoren wurden bereits in der
Einleitung beschrieben, weswegen hier auf eingehende Erläuterungen der
biologischen Hintergründe verzichtet wird.
K. Alsene et al. [1] und C. Hohoff et al. [18] konnten in ihren Untersuchungen
zeigen, dass der Wildtyp anscheinend mit einer stärker ausgeprägten
Panikreaktion unter Koffeineinfluss reagiert hat.

67
Alle A2AAR scheinen für zentralnervöse Effekte von Substanzen wie z. B.
Adenosin, Prostaglandin D2, GABA, Histamin, Koffein und Amphetamin, die den
Wachheitsgrad des Menschen in unterschiedlicher Richtung beeinflussen, mit
verantwortlich zu sein. Die Tatsache, dass Substanzen, die uns aus dem
alltägliche Leben bekannt sind, nachweislich den Grad der Wachheit steuern
können, legt die Vermutung nahe, dass Veränderungen an den
verantwortlichen Genen auch einen Einfluss auf die von uns untersuchte 24 –
Stunden – Periodik haben könnten.
In unseren Untersuchungen lies sich weder ein Effekt des Genotypen auf den
D-MEQ-Summenwert nachweisen, noch zeigte sich ein signifikanter
Zusammenhang bei der Analyse auf Allelebene.
Der Polymorphismus A2AAR1976T>C in der 3‘-untranslated region sei mit der
Variante A2AAR2592C>T laut verschiedener Studien verknüpft und könne zu
Veränderungen der A2AA – Rezeptor – Expression führen [31]. Vielleicht kann
also eine definitive Aussage zum Einfluss der genetischen Varianten nur in
Zusammenhang mit dem A2AAR2592C>T – Polymorphismus getroffen werden.
Wie bereits erwähnt waren Probanden mit extremen Ausprägungen der
Schlaftypen – also die Lerchen und Eulen – in unserer Studienpopulation
zahlenmäßig recht schwach vertreten. Dies und der bereits von P. Lam et al.
[23] vermutete Zusammenhang zwischen der ethnischen Herkunft und der
Ausprägung dieses Polymorphismus lassen uns zu dem Schluss kommen, dass
eine weiterführende Untersuchung dieser Zusammenhänge unter
Berücksichtigung der hier aufgetretenen Unschärfen als durchaus
empfehlenswert anzusehen ist.
6.3.4 Der Insertions/Deletions – Polymorphismus des Angiotensin –
Coverting – Enzyms
Das Angiotensin – Converting – Enzym ist eines der Enzyme, die bezogen auf
den menschlichen Schlaf bisher relativ wenig untersucht worden sind. Die
bisherigen Studien befassten sich überwiegend mit dem Erfolg der
Schlafentzugstherapie bei schwerer Depression und mit dem Schlafapnoe –
Syndrom. Die zuletzt genannte Erkrankung zeigt laut A. Barceló et al. [4]
deutlich erhöhte ACE – Spiegel im Blutplasma, was die kardialen Auswirkungen
des Schlafapnoe – Syndroms mit erklären könnte.

68
Da auch bei diesem Enzym wieder ein offensichtlicher Zusammenhang zum
menschlichen Schlaf besteht, und der auf einer Deletion auf Intron 16
beruhende ACE/ID Polymorphismus zu einer ca. 50%igen Verminderung der
Enzymaktivität führt, könnte eine dieser Genvarianten auch den menschlichen
Chronotypen beeinflussen. Hierzu wurden unseres Wissens nach noch keine
eingehenden Untersuchungen durchgeführt, was uns dazu veranlasste, den
Insertions/Deletions - Polymorphismus des Angiotensin-Converting-Enzym-
Genes in unsere Studie einzuschließen.
Bei unserem Studienkollektiv konnte allerdings kein Zusammenhang zwischen
Genotyp und D-MEQ-Summenwert nachgewiesen werden. Auch die Analyse
auf Allelebene zeigte keinen signifikanten Zusammenhang zwischen Chronotyp
und Allel.
Es wäre allerdings doch empfehlenswert, die Untersuchungen mit einer etwas
anders zusammengesetzten Studienpopulation, in der vor allem die definitiven
Ausprägungen der verschiedenen Schlaftypen stärker vertreten sind, zu
wiederholen. Da die Übergänge gerade in den moderat ausgeprägten Lerchen
und Eulen an den definierten Grenzen sehr fließend sind, müssten zukünftige
Untersuchungen mit einer wesentlich größeren Studienpopulation durchgeführt
werden. So könnte man vermutlich aufgrund der Menge der Probanden auch
ausreichend viele Menschen mit einer extremen Ausprägung ihres Chronotypen
rekrutiert werden, was wiederum zu aussagekräftigeren
Untersuchungsergebnissen führen könnte.
6.3.5 Polymorphismus der 5 – Hydroxytryptophan – Transporter –
linked – region
Die Hintergründe zu diesem Polymorphismus wurden in der Einleitung schon
eingehend diskutiert.
Da der peripher und zentral wirkende Transmitter Serotonin (5-HT) als biogenes
Amin im zentralen Nervensystem als Hauptneurotransmitter agiert und
nachweislich unter Anderem den Schlaf in entscheidender Weise beeinflusst, ist
ein Zusammenhang der zirkadianen Periodik und somit mit dem menschlichen
Chronotypen naheliegend.
Viele Untersuchungen haben auch gezeigt, dass einige der Hauptsymptome
der Depression (v.a. gedrückte Stimmungslage, Müdigkeit, Aktivitätsminderung,

69
Schlafstörungen, etc.) wohl in engem Zusammenhang mit Fehlregulationen des
Serotoninhaushaltes stehen.
Gerade der hier untersuchte Polymorphismus wurde besonders häufig in
Zusammenhang mit Depression und den unterschiedlichen Erfolgen von
Schlafentzug bei dieser Erkrankung untersucht.
Auch die Lichttherapie hatte bei den verschiedenen Genotypen unterschiedliche
Ansprechraten gezeigt. Brummet BH et. al schreiben sogar davon, dass Träger
eines S – Allels unter einer deutlich schlechteren Schlafqualität litten, als
Probanden, die das S – Allel nicht trugen. [11]
Selbst Untersuchungen zum Ansprechen der pharmakologischen Therapie der
Depression mit serotinergen Medikamenten zeigte Unterschiede bei den
verschiedenen Genotypen. Homozygote Träger des L – Allels profitierten
insgesamt wesentlich mehr von einer solchen medikamentösen Therapie als
alle Anderen.
Trotz der problemlosen Untersuchung dieses Gens und der minimalen Ausfälle
konnte keine statistisch signifikante Korrelation von einem Genotyp mit
irgendeiner Ausprägung des Chronotypen gesehen werden. Bei der bisher
schwachen Datenlage bezüglich des von uns untersuchten Aspektes und der
sehr wichtigen Rolle dieses Serotonintransportes auf den menschlichen Schlaf
sollte dies in Zukunft sicherlich noch intensiv beforscht werden, um
schlussendlich eine klare und valide Aussage über die Rolle dieses
Polymorphismus auf die innere Uhr des Menschen zu bekommen.
6.3.6 Der Single – Nukleotid – Polymorphismus im 5 – HT1A –
Rezeptors
Die Grundlagen des serotinergen Systems wurden bereits eingehend
beschrieben, weswegen hier nur noch kurz auf das Ergebnis des speziellen
Polymorphismus eingegangen wird.
Der postulierte Zusammenhang zwischen dem Genotyp dieses wichtigen
Polymorphismus im 5 – Hydroxytryptamin – Systems und dem menschlichen
Chronotypen konnte in unserer Studie hochsignifikant nachgewiesen werden.
Heterozygote Träger der Variante hatten im D-MEQ deutlich höhere Werte als
homozygote Träger des Wildtyps.

70
Auch bei Betrachtung der Ergebnisse auf Allelbasis konnte eine deutliche
Korrelation zwischen dem Wildtyp und dem normalen Chronotypen sowie dem
moderatem Morgentypen gesehen werden.
Da bei der Untersuchung dieses Polymorphismus die DNA vieler Probanden
keine verwertbaren Ergebnisse geliefert hat, kann dies die Auswertung
eventuell beeinflusst haben. Das Fehlen von 21 Werten entspricht immerhin
einem Ausfall von insgesamt 25.3% der Studienpopulation. Trotz dieser
Unschärfe zeigten sich jedoch solch hochsignifikanten Werte, dass die
Ergebnisse durchaus als valide angesehen werden können.
Um auszuschließen, dass dadurch ein möglicher Zusammenhang übersehen
wurde, wäre eine weitere Untersuchung dieses Polymorphismus anzuraten.
6.3.7 Polymorphismus der Catechol – O – Methyl – Transferase
Die Auswertung unserer Studienpopulation hat gezeigt, dass es offensichtlich
keinen direkten Zusammenhang zwischen dem Chronotyp und der Ausprägung
einer pathologischen Tagesschläfrigkeit gibt. Daher wäre es denkbar, dass der
bisher häufig mit Tagesmüdigkeit in Verbindung gebrachte Polymorphismus,
nicht in Zusammenhang mit einem bestimmten Schlaftyp steht, auch wenn der
Einfluss der COMT auf Katecholamine, welche für den Körper eine Art
weckende Funktion ausüben können, diesen Verdacht aufwerfen könnte.
Zwar spielt die Catechol – O – Methyltransferase eine wichtige Rolle bei
Depression und Schlaf. Bei unseren Testungen konnte jedoch keine signifikante
Korrelation eines Genotyps mit einem bestimmten Chronotypen belegt werden.
6.3.8 Polymorphismus C T der Methylentetrahydrofolatreduktase
Vor allem die von D. Boensch et al. durchgeführten Untersuchungen zur Rolle
der MTHFR 677 in Bezug auf den Homocysteinspiegel des Menschen [9], [10]
ließen die Untersuchungen dieses Polymorphismus in Zusammenhang mit dem
menschlichen Chronotypen als aussichtsreich erscheinen. Die Mutation am
Nukleotid 677 (CT) führt nun wie in der Einleitung beschrieben dazu, dass an
der Aminosäure 223 statt des Alanins ein Valin eingefügt wird, was wiederum
aufgrund der Thermolabilität zu einem deutlichen Aktivitätsverlust des Enzymes
führt. Der Homocysteinspiegel beeinflusst wie mehrfach beschrieben den

71
menschlichen Schlaf. Wenn die Enzymaktivität der MTHFR reduziert und somit
die 24 – Stunden – Rhythmik des Homocysteinspiegels verändert wird, so wäre
eine Beeinflussung des Schlafverhaltens eines Menschen mit einem
entsprechenden Genotypen naheliegend.
Dieser vermutete Einfluss der MTHFR 677 auf den menschlichen Chronotyp
konnte nicht belegt werden, was aber auch in Zusammenhang mit den
Problemen in der Etablierung der PCR – Protokolle und der
Versuchsdurchführung gesehen werden könnte.
Allerdings zeigte die Auswertung der Ergebnisse auf Allelbasis, dass das
mutierte Allel beim definitiven Abendtyp und beim moderaten Morgentyp
überrepräsentiert war. Dieser statistisch signifikante Effekt ist allerdings schwer
zu deuten, sodass aufgrund der Schwierigkeiten der Messmethode eine
gewisse Vorsicht bei der Interpretation angezeigt ist.
Aufgrund der vielen Ausfälle konnten nur 56 Probanden (das entspricht gerade
mal 56.63% des Gesamtkollektivs) analysiert werden. Auffällig war hierbei, dass
zu einem großen Teil Abendtypen von den Ausfällen betroffen waren. Von den
in die Studie eingeschlossenen „Eulen“ konnten nur 9 sinnvoll ausgewertet
werden. Die Validität dieser Ergebnisse muss kritisch hinterfragt werden, da nur
40.91% der möglichen Abendtypen in die Auswertung einfließen konnten.
Im Nachhinein war es nicht mehr möglich einen eventuell ursächlichen
Zusammenhang herzustellen, warum die Ausfälle bei der PCR vor allem die
Abendtypen betroffen haben. Daher wäre eine erneute Untersuchung dieses
Polymorphismus sinnvoll.
6.3.9 Polymorphismus C T 2592 des A2A – Adenosinrezeptors
Verschiedene Genotypen dieses Adenosin – Rezeptors reagieren bei
Angststörungen unterschiedlich auf Amphetamine [18]. Auf die Schlafkontinuität
und – Architektur scheint dieser Polymorphismus laut J.V. Rétey et al. [31]
keine entscheidenden Auswirkungen zu haben. R. Basheer et al. [5] schreiben
von den möglichen Schlaf induzierenden Effekten, die das Prostaglandin D2
über den A2AR ausüben könnte, weswegen auch ein Einfluss auf den Schlaftyp
denkbar wäre. Nicht nur die Ergebnisse der Literaturrecherche, die uns zu der
Untersuchung dieses Polymorphismus veranlasst haben, auch die von uns
gefundenen Zusammenhänge zwischen dem A2AAR 1976 und dem Chronotyp

72
lassen die Vermutung zu, dass vielleicht mehrere Rezeptortypen des für den
Schlaf so wichtigen Adenosinsystems ihren Einfluss auf die Ausprägung des
Schlaftyps haben könnten.
Weswegen in unseren Untersuchungen keine Korrelation belegt werden konnte
bleibt offen. Es könnte sein, dass dieser Rezeptortyp keinen direkten Einfluss
auf den menschlichen Schlaf hat. Somit könnten wir die Ergebnisse von J. V.
Rétey et al. [31] bestätigen. Es könnte aber auch sein, dass diese
Genveränderung eben nur in Zusammenhang mit dem Polymorphismus T C
1976 des A2AA – Rezeptors gesehen werden kann. Unter Umständen spielen
aber noch weitere Faktoren in diesen Zusammenhang mit hinein, die bei
unserem Studiendesign völlig unberücksichtigt geblieben sind.
Aufgrund der auch in der Einleitung mehrfach veröffentlichten Einflüsse dieses
Adenosin – Rezeptors auf den menschlichen Schlaf, sind weitere intensivere
Untersuchungen dieser möglichen Zusammenhänge anzuraten.
6.3.10 Polymorphismus G A der Adensosindeaminase
Die bisher in Zusammenhang mit dem menschlichen Schlafverhalten für uns
relevanten Studien wurden bereits in Kapitel 1 dieser Arbeit zusammengefasst.
Von besonderem Interesse war für uns die Tatsache, dass unterschiedliche
Genotypen unterschiedliche Enzymaktivitäten der Adenosindeaminase zeigten,
was die Schlaftiefe, die Schlafqualität und das nächtliche Erwachen beeinflusst.
Auch in Zusammenhang mit Insomnien wurde der Polymorphismus ADA22G>A
erwähnt.
In unserer Studie konnten wir keinerlei Hinweis dafür finden, dass der
Polymorphismus G A 22 der Adenosindeaminase irgendeine Bedeutung in
Hinblick auf den menschlichen Chronotypen haben könnte.
6.3.11 Polymorphismus T G 716 des A1 – Adenosinrezeptors
Da es in diesem Fall nach mehreren Versuchsreihen nur einen einzigen Ausfall
gab, scheinen diese Daten durchaus valide zu sein. Weswegen der eingangs
vermutete Zusammenhang zwischen dem Adenosinrezeptor und dem
Chronotyp nicht gesehen werden konnte, bedarf aufgrund der bereits in der

73
Einleitung erörterten Rolle von Adenosin in der Schlafregulation einer weiteren
gründlichen Untersuchung.
Die Frage, ob unter Umständen auch ethnische Hintergründe, wie diese schon
mehrfach bei genetischen Untersuchungen beschrieben worden sind, mit in das
Studiendesign einfließen sollten, müsste bei künftigen Untersuchungen neu
diskutiert werden.
6.3.12 Polymorphismus C T 263 des A2A – Adenosinrezeptors
Insgesamt findet man über diesen Polymorphismus sehr wenig Literatur in
Bezug auf den menschlichen Schaf. R. Basheer et. al beschreiben diesen
Rezeptor einmal in Zusammenhang mit der Schlaf induzierenden Wirkung von
Prostaglandin D2. [5]
Dass die Adenosin A2A-Rezeptoren insgesamt betrachtet als ein wichtiger
Bestandteil des menschlichen Schlafes angesehen werden, muss hier nicht
nochmals diskutiert werden.
Entscheidend ist, dass wir in unserer Untersuchung keine Korrelation zwischen
einem Chronotypen und einem bestimmten Genotypen sehen konnten.
Bei der allgemeinen Bedeutung der Adenosin – Rezeptoren in Zusammenhang
mit Schlaf könnte man diese Experimente vielleicht noch unter
unterschiedlichen Bedingungen, mit unterschiedlichen Studienpopulationen und
gegebenenfalls optimierten Versuchsprotokollen wiederholen. Die schon öfter
zitierten Differenzen bei der Auswertung verschiedener ethnischer Populationen
spielt mitunter auch hierbei eine Rolle. Es könnte durchaus sein, dass die
Ergebnisse zum Beispiel bei asiatischen Probanden anders aussehen würden.
6.4 Probandenrekrutierung
Betrachtete man abschließend mit Kenntnis der Untersuchungsergebnisse die
Probandenrekrutierung, so muss man sagen, dass die Zusammensetzung
unseres Studienkollektives nicht ganz optimal war.
Ein sehr großer Teil der Probanden wurde aus Patienten der Schlafambulanz
der Universität Erlangen – Nürnberg rekrutiert, die alle unter unterschiedlich
stark ausgeprägten Schlafstörungen, teilweise auch unter Depressionen oder
anderen psychiatrischen Erkrankungen litten. Nur ein geringer Prozentsatz der

74
untersuchten Personen hatte diesbezüglich keine Anamnese. Mitunter hat diese
Konstellation Einfluss auf die Ergebnisse unserer Untersuchungen gehabt.
Ein weiterer Aspekt, der zur kritischen Auseinandersetzung mit den
Ergebnissen gehört ist die Frage, ob man bei der Zusammensetzung der
Probanden verschiedene Faktoren der Herkunft, der Lebensgewohnheiten und
der Persönlichkeitsstruktur in die Selektionskriterien mit einbeziehen sollte. So
konnte in manchen Studien gezeigt werden, dass die ethnische Herkunft bei der
Ausprägung mancher genetischer Merkmale durchaus von entscheidender
Bedeutung sein könne [30]. Bereits erwähnt wurde der Zusammenhang von
Depression oder Alkoholismus mit dem Schlafverhalten. Diese beiden Punkte
spielen bei vielen unserer Probanden zumindest in der Anamnese eine Rolle
und müssten bei weiterführenden Untersuchungen Berücksichtigung finden.

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8 Abkürzungsverzeichnis
°C = Grad Celsius
µl = Mikroliter
5-HT = 5-Hydroxytryptamin
79
5-HTT = 5-Hydroxytryptamin-transporter
5-HTTLPR = 5-Hydroxytryptamin-transporter-linked-region
ACE = Angiotensiv-Converting-Enzyme
ADA = Adenosindeaminase
ADP = Adenosindiphosphat
ANOVA = analysis of variance
ARAS = aufsteigendes retikuläres aktivierendes System
ASPS = Advanced Sleep Phase Syndrome
ATP = Adenosintriphosphat
BMAL = Brain and Muscle arnt-like proteine
bp = base pairs
cDNA = complementary Desoxyribonucleinacid
COMT = Catechol-O-Methyl-Transferase
CRY-Gen = cryptochrome-Gen
CTP = Cytidintriphosphat
D = Deletion
D-MEQ = Deutsche Übersetzung des Morningness-Eveningness-
Questionnaire
DNA = Desoxyribonucleinacid
DSPS = Delayed Sleep Phase Syndrome
EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure
EEG = Elektroenzephalographie
ESS = Epworth Sleepiness Scale
Et al. = et alia
EtBr = Ethidiumbromid
g = Gramm
GABA = Gamma-Aminobutyric acid
Gly = Glycin
GTP = Guanosintriphosphat
h = Stunden

80
HCl = Chlorwasserstoff (Salzsäure)
hClock-Gen = human Clock-Gen
HLA = Human Leukocyte Antigen
I = Insertion
ICSD = International Classification of Sleep Disorders
KHK = koronare Herzkrankheit
l-Allel = long Allel
MEQ = Morningness-Eveningness-Questionnaire
mg = Milligramm
MgCl2 = Magnesiumchlorid
min = Minuten
ml = Milliliter
mM = Millimol
MTHFR = Methylentetrahydrolatreduktase
NaCl = Natriumchlorid
PCR = Polymerase Chain Reaction
Per-Gen = Period-Gen
pH = potentia hydrogenii
REM = Rapid-Eye-Movements
rpm = rounds per minute
SAD = seasonal affective disorder
s-Allel = short Allel
SCN = Nucleus suprachiasmaticus
sek = Sekunden
Taq = Thermus aquaticus
TTP = Tyrosintriphosphat
UV-Licht = Ultraviolett-Licht
V = Volt
Val = Valin
z.B. = zum Beispiel
ZNS = Zentralnervensystem

9 Danksagung
81
Zunächst möchte ich mich bei Herrn Professor Dr. Kornhuber bedanken, dass
mir die Möglichkeit gegeben wurde, eine wissenschaftliche Arbeit an der
Psychiatrischen und Psychotherapeutischen Klinik der Universität Erlangen –
Nürnberg durchführen zu können. Dadurch hatte ich die Möglichkeit unter
erfahrener Anleitung experimentelle wissenschaftliche Fertigkeiten zu erlangen.
Auch in Hinblick auf ein intensives Zusammenarbeiten in einem Team, in dem
sich jeder auf den anderen Verlassen muss, war es eine sehr hilfreiche und
gute Erfahrung.
Danken möchte ich auch Herrn Professor Dr. Bleich, der sich für diese Arbeit
als Doktorvater zur Verfügung gestellt hat.
Ein ganz besonderer Dank gilt Herrn Professor Dr. Frieling, der sich mit viel
Einsatz und Geduld in die Betreuung meiner Arbeit eingebracht hat. Dank
seiner vielen unterstützenden Gespräche und hilfreichen, konstruktiven Kritiken
war die Erstellung dieser Dissertationsschrift überhaupt erst möglich.
Herrn PD Dr. Bönsch möchte ich für die anfängliche Unterstützung in der
Planung und Durchführung der Studie sowie für die hilfreiche Einarbeitung in
die Laborarbeit bedanken.
Ein weiterer Dank geht an alle Mitarbeiter des Labors, die mit viel Geduld und
Hilfsbereitschaft bei allen aufgetretenen Problemen zur Seite standen.
Nicht zuletzt gilt ein besonderer Dank meiner Frau Christina, für die
entgegengebrachte Geduld und die erforderlichen zugestandenen zeitlichen
Freiräume sowie meinen Eltern Rita und Dieter Prause, für die nicht nur
finanzielle Unterstützung während des gesamten Studiums. Ohne die
langjährige Unterstützung und Begleitung wäre mein Studium und die
Promotion nicht möglich gewesen.

10 Lebenslauf
82
Persönliche Daten: Philipp Prause
Schulausbildung
Geboren am 15.04.1981 in München
Verheiratet mit Christina Prause, geb. Spörl
Eltern: Rita Prause und Dieter Prause
Bruder: Roland Prause
09/1987-07/1990 Rothbuchenschule München
09/1990-07/1991 Holzgartenschule Nürnberg
09/1991-06/2000 Pirckheimer-Gymnasium Nürnberg
Hochschulausbildung
10/2001-09/2004 Vorklinisches Studium der Humanmedizin an
der Universität Erlangen-Nürnberg
28.09.2004 Ärztliche Vorprüfung
10/2004-07/2007 Klinisches Studium der Humanmedizin an
der Universität Erlangen-Nürnberg
08/2007-07/2008 Praktische Jahr an der Medizinischen Klinik 5
des Klinikums Nürnberg, an der Klinik für
Abdominal-, Viszeral- und Thoraxchirurgie und
an der Klinik für Unfall- und orthopädische
Chirurgie am Klinikum Nürnberg sowie an der
Anästhesiologischen Klinik der Universität
Erlangen-Nürnberg
20.11.2008 Zweite Ärztliche Prüfung nach neuer
Approbationsordnung
Approbation 24. November 2008
Assistenzarzt
seit 01. Januar 2009 Innere Medizin
Kreisklinik Weißenburg
Leiter: Dr. med. Peter Jatzwauk