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Die Funktion von Genen der posterioren Gruppe
und die Etablierung eines genomweiten RNAi-Screens
in Tribolium castaneum.
Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.
vorgelegt von
Christian Schmitt-Engel
aus Schwetzingen

Als Dissertation genehmigt
von der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung: 23. Juli 2010
Vorsitzende/r der Promotionskommission: Prof. Dr. Bänsch
Erstberichterstatter/in: Prof. Dr. Klingler
Zweitberichterstatter/in: Prof. Dr. Frasch

Danke!
Obwohl als letztes verfasst, wird diesem Abschnitt nur die Position zu Beginn dieser Ar-
beit gerecht, denn die hier erwähnten haben zu allem Folgenden auf unterschiedlichste aber
oft wesentliche Art und Weise beigetragen. Außerdem findet so der interessierte Leser
schneller sein Ziel ;-).
Zuallererst möchte ich mich herzlich bei Prof. Martin Klingler und Dr. Michael Schopp-
meier bedanken. Bei Martin nicht nur für die offizielle Betreuung und die „Endabnahme“
meiner Arbeit, sondern auch für die vielfältige Unterstützung während der letzten Jahre. Bei
Michael für die großartige Betreuung von Anfang bis Ende. Für Hilfen und Kritik, für Ideen
und Erklärungen, für die ermöglichten Chancen und die immerwährende Unterstützung, ganz
viel Freiraum und seinen persönlichen Einsatz, egal ob im Lab, an nicht endenden Stapeln
Papier oder vielem mehr, das nicht immer direkt mit der Arbeit zu tun hatte.
Vielen Dank an Prof. Manfred Frasch für die Übernahme des Zweitgutachtens und die
Akzeptanz eines engen Zeitplans, und an Prof. Helmut Brandstätter und Prof. Robert Slany
für die Abnahme der mündlichen Prüfung, ebenfalls unter terminlichem Entgegenkommen.
Robert und seiner Arbeitsgruppe möchte ich außerdem für die EMSA-Hilfe und die gute
Nachbarschaft danken.
Niko Koniszewski gebührt großer Dank für die Hilfe bei den pupalen Injektionen des iBeet-
le-Pre-Screens und Prof. Gregor Bucher für die Möglichkeit diesen durchzuführen.
Bei Niko, Kay Kotkamp, Doro Musazzi, Irene Schnellhammer und auch Michael möchte ich
mich für eine tolle Laboratmosphäre mit viel Spaß, Trockeneis, diversen Musikrichtungen und
fachlichen oder unsachlichen Diskussionen bedanken. Auch vielen Dank an meine Mit-
Doktoranden Daniel Bäumer, Jochen Trauner und Jutta Distler für eine tolle Zeit und gegensei-
tige Unterstützung wann immer sie nötig war, und an die „Kleinen“ Nadi Ströhlein und Tobi
Merkel für viel Spaß und frischen Wind.
Prof. Jürgen Büning und Dr. Ralph Rübsam danke ich für Anstöße, Hilfestellungen und
Wortgefechte über die Jahre hinweg, Alex Cerny und Markus Weber für diverse tribolistische
Starthilfen.
Vielen Dank auch an Maria Ricca, Claudia Obermeier, Angela Bruns, Tina Loy, Marian-
ne Zeidler und Thomas Messingschlager dafür, dass sie den Lehrstuhl am Laufen halten.
Auch den momentanen und ehemaligen Mitgliedern der AGs vom anderen Gang
(Frasch, Nguyen und Schambony) danke für das sehr gute Arbeitsklima (abgesehen vom
Fliegenfutterkocharoma) und die Nachbarschaftshilfen.
Schließlich kann ich allen meinen Eltern – Stief- und Schwiegereltern explizit einge-
schlossen - nicht genug danken! Für die Unterstützung, den Ansporn, die Hilfen, die guten
Ratschläge und den Rückhalt, der so viel Wert ist! Meinen Geschwistern danke fürs Mitlei-
den und Mitfreuen.
Nina, danke für deine Geduld, fürs Beine und fürs Mut machen, und für noch viel mehr!

Inhaltsverzeichnis
Summary.....................................................................................................................1
Zusammenfassung......................................................................................................3
Abbildungsverzeichnis.................................................................................................5
Tabellenverzeichnis.....................................................................................................7
Abkürzungen ...............................................................................................................8
Allgemeine Einleitung................................................................................................11
I. Kapitel: Die Funktion von Genen der posterioren Gruppe in Tribolium ......15
1. Einleitung............................................................................................................15
1.1. Die Embryonalentwicklung der Insekten......................................................15
1.2. Drosophila melanogaster als genetisches Referenzsystem ........................19
1.3. Tribolium castaneum als Modell für vergleichende Studien der
Embryonalentwicklung ................................................................................23
1.3.1. Die Tribolium-Embryogenese..............................................................23
1.3.2. Molekulare Mechanismen der Tribolium-Entwicklung .........................24
1.4. nanos und pumilio – pleiotrop und konserviert ............................................32
1.4.1. nanos und pumilio in Drosophila .........................................................32
1.4.2. nanos und pumilio sind evolutionär alte Gene.....................................34
1.4.3. Der nanos-pumilio-Repressionskomplex.............................................37
1.5. Ziele des ersten Kapitels der vorliegenden Arbeit .......................................39
2. Ergebnisse..........................................................................................................41
2.1. Im Tribolium-Genom konnten eindeutige Orthologe zu nanos und pumilio
identifiziert werden ......................................................................................41
2.1.1. Tribolium nanos...................................................................................41
2.1.2. Tribolium pumilio .................................................................................44
2.2. nanos und pumilio werden maternal und zygotisch exprimiert ....................45
2.2.1. Die Expression des Tribolium pumilio-Orthologs.................................45
2.2.2. nanos-Expression ist nur in vitro nachweisbar ....................................47
2.3. pRNAi für nanos und pumilio führt zu Veränderungen der larvalen
Morphologie ................................................................................................49
2.3.1. Defekte nach nanos pRNAi .................................................................50
2.3.2. Defekte nach pumilio pRNAi................................................................52
2.3.3. nanos/pumilio-Doppel-RNAi führt zu stärkeren Phänotypen ...............54
2.4. Frühembryonale Defekte führen zu einem vorzeitigen Abbruch der
Segmentierung in nanos/pumilio-RNAi-Embryonen....................................57

Inhaltsverzeichnis
2.4.1. Die Segmentbildung aus der Wachstumszone ist gestört................... 57
2.4.2. nanos/pumilio-RNAi induziert Defekte in frühen embryonalen Stadien
.......................................................................................................62
2.4.3. nanos und pumilio sind nötig für die Expression eines terminalen
Zielgens.............................................................................................. 66
2.5. Durch nanos/pumilio-RNAi verursacht Defekte in anterioren
Segmentanlagen ........................................................................................ 67
2.5.1. Markergen-Expression zeigt Kopfdefekte in embryonalen Stadien..... 67
2.6. Ein Effekt von nanos und pumilio auf die Ausbildung von Proteingradienten
im Blastoderm ist nicht nachweisbar........................................................... 72
2.7. Die Beteiligung von brain-tumor am nanos/pumilio-Repressionskomplex ist
fraglich........................................................................................................ 75
2.7.1. Tribolium brain-tumor.......................................................................... 77
2.7.2. Expression von brat............................................................................ 77
2.7.3. brat-RNAi führt zu ähnlichen, aber von nos/pum RNAi abgrenzbaren
Phänotypen ........................................................................................ 79
2.8. pumilio-RNAi führt zu weiteren Phänotypen................................................ 84
2.8.1. pum-RNAi führt zum Verlust der primordialen Keimzellen.................. 84
2.8.2. Parentale RNAi gegen pumilio führt zu einer Eiablegehemmung....... 85
2.8.3. pumilio spielt eine Rolle für die Entwicklung larvaler Extremitäten ..... 87
2.8.4. Larvale RNAi gegen pumilio resultiert in einem Entwicklungsblock.... 88
3. Diskussion.......................................................................................................... 91
3.1. Das Zusammenspiel von nanos und pumilio und dem terminalen System ist
wesentlich für die posteriore Segmentierung in Tribolium .......................... 91
3.2. Das Auftreten anteriorer Phänotypen illustriert die Beteiligung von NANOS
und PUMILIO an den regulatorischen Interaktionen im Tribolium-
Blastoderm.. ............................................................................................... 98
3.3. Wo wirken nanos und pumilio? ................................................................. 105
3.4. Das Zusammenspiel von terminalen und posterioren Signalen stellt
möglicherweise einen konservierten Mechanismus dar ........................... 111
3.5. Die antero-posteriore Achse im Tribolium-Blastoderm.............................. 114
4. Material und Methoden..................................................................................... 123
4.1. Klonierung................................................................................................. 123
4.2. Expressionsanalysen ................................................................................ 124

Inhaltsverzeichnis
4.2.1. in situ Hybridisierung.........................................................................125
4.2.2. Antikörperproduktion und Immunohistochemische Färbungen..........126
4.2.3. Qualitative RT-PCR...........................................................................127
4.3. RNAi-Experimente.....................................................................................128
II. Kapitel: Entwicklung und Machbarkeitsstudie eines genomweiten RNAi-
Screen-Projekts in Tribolium.....................................................................131
1. Einleitung..........................................................................................................131
1.1. Tribolium als eigenständiges Modellsystem ..............................................131
1.2. Die Limitierungen des “candidate gene approach” ....................................134
1.3. RNAi-Screens als Alternative zu klassischen genetischen Ansätzen........136
1.4. iBeetle – ein genomweiter RNAi-Screen....................................................139
1.4.1. Das iBeetle Konzept..........................................................................139
1.4.2. „Enhancer trap“-Stämme erlauben die Detektion zusätzlicher
Phänotypen.......................................................................................141
1.4.3. Die iBeetle-Einzelprojekte und ihre Themen .....................................144
1.5. Ziele des zweiten Kapitels dieser Arbeit....................................................148
2. Ergebnisse........................................................................................................149
2.1. Wie kann ein genomweiter RNAi-Screen verwirklicht werden? .................149
2.1.1. Die Analyse vieler unterschiedlicher Prozesse erfordert zwei parallele
Screen-Ansätze und exakt definierte Zeitintervalle ...........................149
2.1.2. Arbeitsteilung und unterschiedliche Arbeitspläne erlauben optimale
Ressourcennutzung und hohen Durchsatz .......................................157
2.2. Das Screening-Schema ermöglicht die Identifizierung interessanter
Phänotypen mit hoher Sensitivität.............................................................164
2.3. Es konnten für nahezu alle Prozesse neue Kandidatengene identifiziert
werden ......................................................................................................170
2.3.1. Defekte der Ovario- oder Oogenese .................................................173
2.3.2. Defekte während der Embryonalentwicklung ....................................178
2.3.3. Defekte postembryonaler Prozesse ..................................................181
2.3.4. Bisher unbekannte Phänotypen der Positiv-Kontrollen .....................187
3. Diskussion ........................................................................................................189
3.1. Ein genomweiter RNAi-Screen in Tribolium ist technisch möglich.............189
3.1.1. Sowohl pupale als auch larvale RNAi sind im Screenmaßstab
durchführbar......................................................................................189

Inhaltsverzeichnis
3.1.2. Die Auswertungen erlauben die Analyse der zu untersuchenden
Prozesse mit hoher Sensitivität......................................................... 191
3.1.3. iBeetle ist mit den vorgegebenen zeitlichen Rahmenbedingungen
realisierbar........................................................................................ 194
3.2. Der Pilotscreen illustriert die Chancen und Risiken des Hauptscreens..... 195
3.2.1. Technische Verbesserungen könnten die Effizienz des Hauptscreens
noch erhöhen.................................................................................... 195
3.2.2. Der Pilot-Screen zeigt kritische Aspekte der Screen-Durchführung auf
.....................................................................................................196
3.2.3. Der Pilot-Screen macht die Effektivität eines RNAi-Screens deutlich198
3.2.4. Der Pilot-Screen suggeriert eine hohe Zahl an Tribolium-Genen deren
Verlust zu Letalität in unterschiedlichen Stadien führt ...................... 201
3.2.5. Die Auswertung und Kategorisierung der Phänotypen ist von größter
Bedeutung für den Erfolg des Screens............................................. 203
3.2.6. iBeetle hat sehr gute Chancen, seine Ziele zu erreichen.................. 206
4. Material und Methoden..................................................................................... 209
4.1. Synthese doppelsträngiger RNA komplementär zu zufällig gewählten cDNA
Klonen ...................................................................................................... 209
4.2. Detaillierte Durchführungsanweisung zum iBeetle Screening Schema..... 210
4.2.1. Verwendete Stämme ........................................................................ 211
4.2.2. Pupale Injektion und darauf folgende Auswertungen........................ 212
4.2.3. Larvale Injektion und darauf folgende Auswertungen....................... 216
Allgemeine Diskussion............................................................................................ 221
Anhang ................................................................................................................... 225
1. Sequenzen................................................................................................... 225
2. Ergänzende Ergebnisse zu nanos/pumilio pRNAi........................................ 228
3. Zeitaufwand der iBeetle-Arbeitschritte ......................................................... 230
4. Alublöcke für larvale Injektionen .................................................................. 231
5. Zusammenfassung der Ergebnisse des iBeetle Pilot-Screens..................... 232
6. Liste der im Pilot-Screen injizierten Fragmente............................................ 233
7. Definition der im Pilot-Screen zu dokumentierenden Phänotypen ............... 239
Literatur................................................................................................................... 242

Summary
Summary
Tribolium castaneum is an outstanding model for comparative developmental bi-
ology and is well on the way to become an important system for Insect biology in
general. This is largely due to its amenability for systemic RNA interference, allowing
straightforward functional studies.
In the first chapter of this thesis I used these techniques to analyze the function of
the posterior group genes nanos and pumilio in early embryonic patterning of Tri-
bolium. In the second chapter I present the development and testing of a procedure
using RNAi for a genomewide screen to identify new developmental gene functions.
In the long germ insect Drosophila, localized polarity cues serve as starting points
for the antero-posterior regionalization of the embryo. The posterior to anterior
NANOS gradient is part of this system and – in concert with PUMILIO - crucial for the
formation of abdominal segments. To elucidate to which degree this system is con-
served in short-germ embryogenesis, I analyzed nanos and pumilio function in Tri-
bolium. I could show that both genes are indeed involved in abdomen formation in
Tribolium as well. However, this is apparently not due to a role in blastodermal re-
gionalization, but related to an interaction with the terminal system. In addition, I
found an effect of nanos and pumilio on the formation of anterior segments. This
unexpected influence on head patterning appears to be mediated by an impact on
the formation of anterior Gap-Gene expression domains. Thus, the function of Tri-
bolium nanos and pumilio differs from their Drosophila orthologs, which may be due
to the special needs of short germ development.
The candidate gene approach, which has been very successful throughout the
last decade, is conceptually limited for the in depth analysis of Tribolium biology. To
overcome these limitations and to further transform Tribolium into a primary model of
basic insect research, the German Tribolium community is initiating a genomewide
RNAi screen: iBeetle. In the second part of my thesis, I present the development of
the iBeetle screening procedure, which allows rapid and efficient screening of gene
functions for embryonic and postembryonic developmental processes, ranging from
embryonic axis formation to the development of odoriferous glands.
To test this concept, I designed and performed a pilot-screen, which demon-
strated that important developmental genes can be detected with high sensitivity and
that the approach is suitable to reveal unknown gene function with high frequency.
1

Summary
2
Thus, I could show that a genomewide RNAi Screen in Tribolium is feasible and
that iBeetle should be an ambitious but highly productive approach and will provide a
unique resource to all insect researchers.

Zusammenfassung
Zusammenfassung
Tribolium castaneum ist ein herausragendes Modellsystem der vergleichenden
Entwicklungsbiologie (EvoDevo) und entwickelt sich seit der Sequenzierung seines
Genoms zum wichtigen Forschungsobjekt unterschiedlicher Zweige der Insektenbio-
logie. Dies wurde unter anderem durch die Nutzbarkeit einer systemischen RNA-
Interferenzantwort zur einfachen Analyse von Genfunktionen möglich.
Im ersten Kapitel dieser Arbeit verwendete ich diese Methoden, um die Rolle von
nanos und pumilio, in Drosophila beides Gene der posterioren Gruppe, für die frühe
embryonale Musterbildung in Tribolium zu untersuchen. Im zweiten Kapitel stelle ich
die Entwicklung und Erprobung einer Methode vor, die RNAi für einen genomweiten
Screening-Ansatz zur Identifizierung neuer Entwicklungsgene nutzt.
Die antero-posteriore Regionalisierung des Langkeim-Embryos von Drosophila
melanogaster wird durch lokalisierte Polaritätsfaktoren initiiert. Daran ist der von
posterior nach anterior verlaufende NANOS-Gradient beteiligt, der gemeinsam mit
PUMILIO wesentlich für die Ausbildung abdominaler Segmentanlagen ist. Um he-
rauszufinden inwieweit diese Zusammenhänge auch in Kurzkeim-Insekten konser-
viert sind, habe ich die Rolle von nanos und pumilio in Tribolium untersucht. Ich
konnte zeigen, dass beide Gene tatsächlich auch in Tribolium eine Rolle für die
abdominale Segmentierung spielen. Allerdings ist dies offenbar nicht auf eine Funkti-
on innerhalb der blastodermalen Regionalisierung, sondern vielmehr auf eine Inter-
aktion mit dem terminalen System zurückzuführen. Außerdem konnte ich einen
Effekt von nanos und pumilio auf die Bildung anteriorer Segmente nachweisen.
Dieser unerwartete Einfluss auf die Musterbildung innerhalb der Kopfanlage scheint
durch eine Beteiligung an der Regulation anteriorer Gap-Gen-Domänen vermittelt zu
werden. Die Aufgaben der Tribolium-Orthologen zu nanos und pumilio unterscheiden
sich somit von ihrer Rolle in Drosophila, was vermutlich auf die speziellen Erforder-
nisse der Kurzkeim-Entwicklung zurückzuführen ist.
Der Kandidaten-Gen-Ansatz, der im ersten Teil dieser Arbeit verfolgt wurde und
während der letzten zehn Jahre äußerst erfolgreich war, stößt bei der detaillierten
Analyse vieler Prozesse der Tribolium-Biologie an immanente Grenzen. Um diese zu
überwinden und Tribolium als Modellsystem weiter zu etablieren, haben deutsche
Tribolium-Wissenschaftler einen genomweiten RNAi-Screen auf den Weg gebracht:
iBeetle. Im zweiten Teil dieser Arbeit stelle ich die Entwicklung eines Konzepts zur
3

Zusammenfassung
praktischen Durchführung des iBeetle-Screens vor, das die effiziente Analyse emb-
ryonaler und postembryonaler Entwicklungsprozesse von der embryonalen Achsen-
determination bis zur Entwicklung der Stinkdrüsen erlaubt. Um dieses zu testen,
habe ich einen Pilot-Screen entworfen und durchgeführt, der demonstriert, dass
durch diesen Ansatz wichtige Entwicklungsgene mit hoher Sensitivität und unbe-
kannte Genfunktionen in hoher Zahl detektiert werden können.
4
Ich konnte also zeigen, dass ein genomweiter RNAi-Screen in Tribolium machbar
ist und iBeetle ein ambitioniertes aber äußerst vielversprechendes Projekt und eine
wichtige Grundlage für zukünftige, genorientierte Insektenforschung sein wird.

Abbildungsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Postembryonale Entwicklungsstadien von Tribolium castaneum..................14
Abb. 2: Unterschiedliche Enwicklungsmodi: Lang- und Kurzkeim.............................18
Abb. 3: Vereinfachtes Cladogramm ausgewählter Insektengruppen.........................18
Abb. 4: Von Gradienten zu Streifen: Die Ebenen der Drosophila-Segmentierungs-
kaskade..............................................................................................................22
Abb. 5: Frühe Gradienten und Aktivitäten im Tribolium-Blastoderm..........................31
Abb. 6: Sequenzvergleich der funktionellen Domänen von NANOS- und PUMILIO-
Proteinen unterschiedlicher Spezies..................................................................43
Abb. 7: Expression des Tribolium pumilio-Gens........................................................46
Abb. 8: nanos ist in allen getesteten Entwicklungsstadien exprimiert........................48
Abb. 9: Pupale RNAi gegen nanos und pumilio führt zu einer Reduktion larvaler
Segmente...........................................................................................................51
Abb. 10: nanos- und pumilio-RNAi führen auch zu Kopfdefekten..............................54
Abb. 11: Verteilung der phänotypischen Klassen nach nanos- und pumilio-RNAi
Experimenten.....................................................................................................55
Abb. 12: Verteilung der anterioren Defekte nach nanos/pumilio-RNAi......................56
Abb. 13: nos/pum-RNAi führt zu einem Zusammenbruch der Segmentbildung aus der
Wachstumszone.................................................................................................60
Abb. 14: Die Expression von Markergenen zeigt Veränderungen posteriorer
Blastodermbereiche ...........................................................................................64
Abb. 15: nos/pum-RNAi führt zu Veränderungen anteriorer Gewebe in embryonalen
Stadien...............................................................................................................71
Abb. 16: OTD-1-Expression nach nanos/pumilio-RNAi .............................................74
Abb. 17: Sequenzvergleich von BRAT-Proteinen......................................................76
Abb. 18: Expression des Tribolium brain-tumor-Gens...............................................78
Abb. 19: brain-tumor-RNAi führt zu embryonalen Defekten ......................................83
Abb. 20: vasa-Expression verdeutlicht das Fehlen der PGCs nach nos/pum-RNAi..85
Abb. 21: pumilio-RNAi führt zu einer Eiablagehemmung ..........................................86
Abb. 22: pumilio spielt eine Rolle in der Extremitätenentwicklung.............................88
Abb. 23: Larvale pumilio-RNAi führt zu einem Entwicklungsblock kurz vor der
pupalen Ecdysis.................................................................................................89
5

Abbildungsverzeichnis
Abb. 24: Schema der Funktion von nanos und pumilio in frühen Tribolium-
6
Embryonen ...................................................................................................... 110
Abb. 25: Für iBeetle verwendete Käferstämme ...................................................... 143
Abb. 26: Überblick über den iBeetle-Screening Ablauf ........................................... 151
Abb. 27: Arbeitsplan für pupale Injektionen und darauffolgende Auswertungen..... 159
Abb. 28: Arbeitsplan 1 für larvale Injektionen und darauffolgende Auswertungen.. 161
Abb. 29: Arbeitsplan 2 für larvale Injektionen und darauffolgende Auswertungen.. 164
Abb. 30: Zusammenfassung der Ergebnisse des iBeetle Vorscreens .................... 169
Abb. 31: Zusammenfassung der Ergebnisse durch pupale Injektionen.................. 171
Abb. 32: Zusammenfassung der Ergebnisse durch larvale Injektionen .................. 172
Abb. 33: Defekte der Oogenese nach pupaler Injektion ......................................... 174
Abb. 34: Defekte der Ovariogenese bzw. der Oogenese nach larvaler Injektion.... 177
Abb. 35: Morphologisch feststellbare Defekte der Embryonalentwicklung nach
pupaler Injektion .............................................................................................. 180
Abb. 36: Defekte in larvalen oder pupalen Stadien................................................. 185
Abb. 37: In adulten Tieren auftretende Effekte ....................................................... 186
Abb. 38: Bisher unbekannte Phänotypen der Positvkontrollen............................... 188
Abb. 39: Zusammenfassung der Sequenzierungsergebnisse der Matrizen zur
dsRNA-Synthese ............................................................................................. 210
Abb. 40: Sequenzvergleich veröffentlichter und potentieller NRE........................... 227
Abb. 41: Verteilung der abdominalen Phänotypen nach pRNAi.............................. 229
Abb. 42: Maße der für die larvalen Injektionen verwendeten Aluminiumblöcke...... 231

Tabellenverzeichnis
Tabellenverzeichnis
Tab. 1: Sequenzidentität unterschiedlicher nanos Zink-Finger..................................44
Tab. 2: Legeleistung nach pumilio-RNAi ...................................................................86
Tab. 3: Primer und PCR-Bedingungen....................................................................123
Tab. 4: Verwendete Erst- und Zweitantikörper ........................................................127
Tab. 5: Primer und Bedingungen der RT-PCR........................................................128
Tab. 6: Primer für dsRNA Matrize ...........................................................................129
Tab. 7: Verwendete dsRNA.....................................................................................129
Tab. 8: Verwendete Positivkontrollen......................................................................165
Tab. 9: PCR zur Synthese der Matrize für die dsRNA-Synthese.............................209
Tab. 10: Verteilung der Phänotypen nach nanos- und pumilio-RNAi ......................228
Tab. 11: Ausprägung der Kopfdefekte nach nanos- und pumilio-RNAi ...................228
Tab. 12: Abdominale Phänotypen nach nos/pum-pRNAi ........................................229
Tab. 13: Zeitaufwand der iBeetle-Arbeitsschritte.....................................................230
Tab. 14: Zusammenfassung der Ergebnisse des iBeetle Vorscreens.....................232
7

Abkürzungen
Abkürzungen
8
AS: Aminosäure
bp: Basenpaar
cDNA: Copy DNA; durch eine Reverse Transkriptase Reaktion von RNA
kopierte DNA
DIC: Differential interference contrast = Differenzieller Interferenzkon-
trast
DNA: Desoxyribonukleinsäure
dsRNA: doppelsträngige Ribonukleinsäure
EtOH: Ethanol
GFP: Green Fluorescent Protein
HGSC: Human Genome Sequencing Center
ISH: in-situ-Hybridisierung
JH: Juvenilhormon
kDa: Kilodalton; Einheit des Molekulargewichts von Biomolekülen
NCBI: National Center for Biotechnology Information
NRE: Nanos Response Element
OT: Objektträger
PCR: Polymerase Chain Reaction; Methode zur spezifischen Amplifi-
kation von DNA-Fragmenten
pfu: plaque forming units
PGCs: Primordiale Keimzellen, embryonale Vorläufer der Keimbahn–
zellen
pRNAi: RNAi Interferenz durch Injektion von pupalen Stadien
RACE: Rapid Amplification of cDNA Ends
RNAi: RNA-Interferenz
Tc: Tribolium castaneum
UTR: Nichttranslatierter Bereich der mRNA
WT: Wildtyp, ohne RNAi Behandlung
Gene:
Antp: Antennapedia
bcd: bicoid

at: brain-tumor
cad: caudal
eve: even-skipped
gt: giant
hb: hunchback
kni: knirps
Kr: Krüppel
nos: nanos
otd-1: orthodenticle-1
pum: pumilio
tll: tailless
tor: torso
tsl: torso-like
vas: vasa
wg: wingless
zen-1 bzw. -2: zerknüllt-1 bzw. -2
Abkürzungen
9

Allgemeine Einleitung
Allgemeine Einleitung
Die Mitglieder der artenreichsten Tiergruppe unserer Erde, die Insekten, sind seit
Jahrhunderten viel untersuchte Forschungsobjekte. Über nahezu alle Bereiche der
Biologie wird und wurde an Insekten geforscht und somit ist auch zu ihrer Entwick-
lung und Fortpflanzung eine Fülle von Fakten verfügbar. Die morphologischen und
zellbiologischen Erkenntnisse über die Entwicklung der Insekten konnten vor allem
im Laufe der vergangenen 30 Jahre durch vielfältige genetische und molekularbiolo-
gische Forschungen ergänzt und erweitert werden. Initiiert und vorwärts getrieben
wurden diese Forschungen von Wissenschaftlern, die sich mit der Taufliege Dro-
sophila melanogaster beschäftigten, welche sich so zu einem der wichtigsten Mo-
dellsysteme der modernen Lebenswissenschaften entwickelt hat. Allein vier wichtige
Nobelpreise für Physiologie und Medizin wurden für Forschungen an Drosophila
vergeben (http://nobelprize.org/), zuletzt 2004 an Linda Buck und Richard Axel, die
für die Entdeckung der Familie der Geruchsrezeptoren in Maus und Fliege geehrt
wurden (Buck und Axel, 1991). Den Grundstein der modernen Drosophila-Forschung
legte aber schon Thomas Hunt Morgan 1911 und in den darauf folgenden Jahren, in
denen er die Chromosomentheorie der Vererbung beweisen konnte, wofür er 1933
den Nobelpreis erhielt (Morgan, 1911; 1915). 1945 wurde dann Hermann Muller
ausgezeichnet, ein Schüler Morgans, weil er zeigte, dass Röntgenstrahlen Mutatio-
nen auslösen können (Muller, 1927). Schließlich wurde der Nobelpreis für Medizin
1995 an Christiane Nüsslein-Volhard, Eric Wieschaus und Edward Lewis verliehen,
die mit ihren genetischen Untersuchungen und großangelegten Mutagenese-Screens
Ende der 70er und in den 80er Jahren die genetische Musterbildung des Drosophila-
Embryos in einer umfassenden Art und Weise entschlüsseln konnten (Nüsslein-
Volhard und Wieschaus, 1980; Nüsslein-Volhard et al., 1987). Diese Arbeiten legten
den Grundstein für die moderne Insektenentwicklungsbiologie.
Eben jene moderne, molekularbiologische Insekten-Entwicklungsbiologie ist seit
etlichen Jahren nicht mehr auf Drosophila beschränkt. In einigen Arten unterschiedli-
cher Insektenordnungen wird heute versucht, aufbauend auf der umfangreichen
Datenbasis der Fliegen-„Community“ neue Erkenntnisse zur Evolution entwicklungs-
biologischer Prozesse zu erlangen und diese Arten als unabhängige Modellsysteme
zu etablieren. Eines der erfolgreichsten Systeme dieser Art ist der rote Reismehlkäfer
Tribolium castaneum (Abb. 1; Klingler, 2004). Tribolium hat sich in den vergangenen
11

Allgemeine Einleitung
Jahrzehnten zu einem konkurrenzfähigen Modellsystem für genetische und verglei-
chende entwicklungsbiologische Fragestellungen entwickelt. Vor allem seit der
Sequenzierung des Genoms wird er nun zunehmend auch als Forschungsobjekt für
viele andere Bereiche der Insektenbiologie verwendet (Roth und Hartenstein, 2008;
Tribolium Genome Sequencing Consortium, 2008).
12
Tribolium castaneum gehört zur Familie der Tenebrionidae, der Schwarzkäfer,
und damit zu einer großen Familie der artenreichsten Ordnung, den Coleoptera mit
über 350 000 beschriebenen Arten (http://tolweb.org/Coleoptera). Innerhalb der über
20 000 Arten der Tenebrionidae finden sich 33 Tribolium Spezies (Sokoloff, 1972).
Tribolium castaneum gehört hierbei einer Gruppe indo-orientalischen Ursprungs an,
gilt heute allerdings als Kosmopolit, da er sich als synanthroper Getreideschädling
auf der ganzen Welt verbreitet hat (Sokoloff, 1972; Klingler, 2004; Angelini und
Jockusch, 2008). Diese Synanthropie und die damit in Zusammenhang stehende
einfache Haltung ist eines der Argumente für Tribolium als geeignetes Insekten-
Modellsystem. Außerdem hat Tribolium eine relativ kurze Generationszeit und eine
hohe Reproduktionsrate. Für die moderne molekularbiologische Forschung ist aber
vor allem die genetische Zugänglichkeit und die Verfügbarkeit grundlegender Metho-
den von Bedeutung, die in den letzten 20 Jahren deutlich vorangetrieben wurde und
Tribolium heute zum wichtigsten Insekten-System neben Drosophila macht. Das
verhältnismäßig kleine Genom wurde mittlerweile sequenziert, annotiert und steht
über eine Web-Seite zur Verfügung (Brown et al., 1990; Tribolium Genome Sequen-
cing Consortium, 2008; Kim et al., 2010a). Genetische Karten (Beeman und Brown,
1999; Lorenzen et al., 2005), Mutanten aus chemischer und Transposon-
Mutagenese (Beeman et al., 1989; Sulston und Anderson, 1996; Maderspacher et
al., 1998; Trauner et al., 2009), mehrere Transformationssysteme (Lorenzen et al.,
2003; Pavlopoulos et al., 2004), transgene Marker (Berghammer et al., 1999b),
unterschiedliche Laborstämme, viele „Enhancer-trap“-Linien (Lorenzen et al., 2003;
Pavlopoulos et al., 2004; Trauner et al., 2009), Transkriptom- und Proteom-Daten
(Park et al., 2008; Morris et al., 2009) sowie detaillierte Beschreibungen der Biologie
und Morphologie (Sokoloff, 1972; Handel et al., 2000; Trauner und Büning, 2007)
sind verfügbar. Besonders wichtig ist außerdem, dass in Tribolium durch systemi-
sche RNA-Interferenz (RNAi) Gene zu verschiedensten Entwicklungszeitpunkten
einfach inaktiviert werden können. Dabei ist vor allem die Möglichkeit parentaler
RNAi, also die Induktion von RNA-Interferenz in den Nachkommen behandelter

Allgemeine Einleitung
Tiere, hervorzuheben (Brown et al., 1999b; Bucher et al., 2002; Tomoyasu und
Denell, 2004; van der Zee et al., 2006). Zusätzlich zu diesen methodischen Argu-
menten machen einige weitere Punkte Tribolium zu einem interessanten For-
schungsobjekt. Zunächst ist er als Vorratsschädling von wirtschaftlichem Interesse
und damit die Eindämmung seiner Verbreitung Gegenstand aktueller Forschung (z.B.
(Abubakar et al., 2000; Missios et al., 2000; Warchalewski et al., 2000; Arakane et
al., 2008). Außerdem weist seine Embryonalentwicklung einige Aspekte von großem
Interesse auf. Von vergleichenden Untersuchungen der Kurzkeim-Entwicklung Tribo-
liums mit der Langkeim-Embryogenese von Drosophila erhofft man sich Erkenntnisse
über die anzestralen Prozesse der Insektenentwicklung und die Evolution der unter-
schiedlichen Mechanismen der Segmentierung (s. I.1.1). Zudem entwickeln sich in
Tribolium, anders als in der Fliege, bereits während der Embryonalentwicklung
Beine, und der Kopf der Larve weist die anzestrale Ausstattung beißend-kauender
Mundwerkzeuge auf. Drosophila-Larven hingegen haben keine Beine und eine
extrem abgeleitete Kopfkapsel (Bate und Martinez Arias, 1993) was die Untersu-
chung der Entwicklung dieser Strukturen erschwert. Diese Vorteile von Tribolium als
Modellsystem wurden auch in dieser Arbeit genutzt und es wurde zudem versucht
diese zu erweitern.
Im ersten Kapitel wurde die Rolle von nanos und pumilio für die Embryonalent-
wicklung Triboliums untersucht. Jene beiden Gene spielen in Drosophila eine zentra-
le Rolle für die Regionalisierung in frühen embryonalen Stadien. Die dort ablaufen-
den Prozesse weisen in Tribolium viele Unterschiede zur Situation bei Drosophila auf
und sind noch nicht gut verstanden. In diesem Teil der Arbeit wurde also ein klassi-
scher Kandidatengenansatz verfolgt, indem versucht wurde die Rolle zweier aus
Drosophila bekannter Gene in Tribolium aufzuklären. Dieser Ansatz war zwar in der
Vergangenheit sehr erfolgreich, und konnte auch hier mit Erfolg angewendet werden,
offenbarte aber auch im Rahmen dieser Arbeit seine Schwächen. Gerade für die
frühe Entwicklung des Tribolium-Embryos ist klar, dass wesentliche Faktoren, die
diese Prozesse steuern, nicht aus Drosophila bekannt sind, da sie dort möglicher-
weise keine Rolle spielen, oder sich ihre Funktion im Laufe der Evolution verändert
hat. Ein neuer Ansatz um diese Einschränkung zu überwinden, wird im zweiten
Kapitel dieser Arbeit verfolgt. Dort wurde die Methodik eines genomweiten RNAi-
Screens in Tribolium erarbeitet, auf seine Durchführbarkeit und Effektivität getestet
und für die großangelegte Anwendung optimiert. Innerhalb dieses Screens sollen alle
13

Allgemeine Einleitung
Tribolium-Gene auf ihre Funktion in mehreren embryonalen und postembryonalen
Prozessen auf effiziente, sensitive Weise getestet werden. Durch solche molekulare
„forward genetics“-Methoden sollen bisher unbekannte Gene entdeckt werden, deren
Funktion für die Embryogenese möglicherweise im Laufe der Evolution der Frucht-
fliege verloren ging oder sich geändert hat. Außerdem erlaubt die Architektur des
Screens auch die Analyse postembryonaler Prozesse, wie der Metamorphose, und
legt einen Schwerpunkt auf die Etablierung neuer Forschungsfelder.
14
Abb. 1: Postembryonale Entwicklungsstadien von
Tribolium castaneum
A letztes Larvenstadium kurz vor der Verpuppung, laterale
Ansicht
B Puppe mittleren Alters, ventrale Sicht
C dorsale Sicht eines adulten Käfers
D ventrale Sicht eines adulten Käfers
Die gezeigten Tiere tragen eine Mutation des vermillion
Gens, weshalb ihnen die typische schwarze Augenpigmentierung
fehlt (Lorenzen et al., 2002).
Anterior ist links.

I. Kapitel:
I. 1. Einleitung
Die Funktion von Genen der posterioren Gruppe in Tri-
bolium
1. Einleitung
1.1. Die Embryonalentwicklung der Insekten
Die Embryonalentwicklung vieler Arten unterschiedlicher Insektengruppen wurde
in der Vergangenheit analysiert und zunächst morphologisch beschrieben (Sander,
1996). In den letzten Jahren komplettieren zunehmend auch molekularbiologische
Arbeiten an einer wachsenden Zahl verschiedener Spezies das Verständnis dieser
Prozesse (Peel et al., 2005; Rosenberg et al., 2009).
Die Entwicklung der Insekten beginnt zumeist mit der Eiablage, der Großteil der
Arten ist ovipar. In der Regel werden große, dotterreiche Eier bei der Ablage befruch-
tet und die Entwicklung initiiert (Chapman, 1998). Insekteneier sind bereits bei der
Oviposition deutlich sichtbar polarisiert. So liegt beispielsweise am anterioren Ende
meist eine oder mehrere Mikropylen, durch die Spermien eintreten (Counce, 1973).
Auch die Form vieler Insekteneier zeigt bereits Asymmetrien: der posteriore Pol ist
oft stumpfer als der anteriore, die ventrale Seite häufig konvex (Dettner, 2003). Diese
äußeren Anzeichen von Polarität sind Ausdruck der bereits während der Oogenese
angelegten und in der Oozyte manifesten Körperachsen des zukünftigen Embryos
(Sander, 1976; Riechmann und Ephrussi, 2001). Insekteneier durchlaufen meist eine
superfizielle Furchung, während derer in vielen Insektengruppen zunächst keine
Zellmenbranen gebildet werden. Die meisten der anfangs im Dotter liegenden Zell-
kerne wandern im Laufe der Entwicklung in die Peripherie und bilden dort eine
Schicht aus Zellkernen, das Blastoderm. Dieses kann bereits zellularisiert sein (z.B.
Blastodermscheibe bei Schistocerca, (Ho et al., 1997), oder aber es bleibt vorerst als
syncytiales Blastoderm bestehen und bildet erst später Zellgrenzen aus (z.B. Dro-
sophila, (Foe und Alberts, 1983). Diese Form der unvollständigen Furchung erlaubt,
dass sich Moleküle ohne begrenzende Zellmembranen frei innerhalb des Periplas-
mas des frühen Insektenembryos ausbreiten können (Hülskamp und Tautz, 1991;
Klingler und Tautz, 1999). Während dieser frühen Furchungsteilungen finden bereits
15

I. 1. Einleitung
wichtige Musterbildungsprozesse statt, die in der Folge meist zur Bildung einer
Embryonalanlage und der Anlage extraembryonaler Membranen führen (Anderson,
1972a; b). Das Verhältnis dieser beiden embryonalen Anlagen zueinander kann in
unterschiedlichen Insektenarten massiv variieren und steht in Zusammenhang mit
unterschiedlichen Strategien der Segmentierung (Davis und Patel, 2002). Man unter-
scheidet hierbei zwischen Kurz- und Langkeim-Embryogenese (Abb. 2; Krause,
1939; Sander, 1976). Der zusätzliche Begriff des Intermediärkeims ist in der aktuel-
len Literatur weniger gebräuchlich, seine frühere Verwendung macht allerdings
deutlich, dass die Charakteristika beider Strategien nicht immer klar voneinander
abgegrenzt werden können und Übergangsformen auftreten.
16
In einem Langkeim-Embryo werden alle Segmentanlagen noch vor der Gastrula-
tion während blastodermaler Entwicklungsstadien angelegt. Die Embryonalanlage
nimmt meist den größten Teil des Blastoderms ein und die Anlage der extraembryo-
nalen Hüllen ist weniger stark ausgeprägt (Krause, 1939; Sander, 1976). Prominente
Beispiele für Langkeim-Insekten sind die Taufliege Drosophila melanogaster oder die
Honigbiene Apis meliferra (Krause, 1939; Anderson, 1972b; Turner und Mahowald,
1977; Fleig und Sander, 1986). Kurzkeimembryonen hingegen bilden am posterioren
Pol oder innerhalb der posterioren Hälfte des Embryos eine Embryonalanlage aus,
innerhalb derer nur relativ wenige, anteriore Segmentanlagen vor Einsetzen der
Gastrulation spezifiziert werden. Die noch fehlenden Segmentanlagen entstehen
nach Bildung des Keimrudiments aus einer posterioren Wachstumszone. Dabei
werden in einer anterior-nach-posterioren Progression neue Segmentanlagen gebil-
det, wobei sich der Keim in antero-posteriorer Richtung verlängert (Krause, 1939;
Sander, 1976; Davis und Patel, 2002). Somit bestehen die wesentlichsten Unter-
schiede zwischen Lang- und Kurzkeimembryonen in der blastodermalen „fate-map“
(Abb. 2), die entweder nur wenige oder nahezu alle Segmentanlagen aufweist, und in
der Bildung abdominaler Segmente, die entweder innerhalb eines zellulären Systems
(Kurzkeim-Wachstumszone) oder in einem syncytialen Blastoderm (Langkeim)
stattfindet. Beispiele für Kurzkeim-Insekten sind der Amerikanische Grashüpfer
Schistocerca americana, die Wanze Oncopeltus fasciatus oder der Rote Reismehlkä-
fer Tribolium castaneum (Butt, 1949; Sokoloff, 1972; Patel et al., 1989). Die Kurz-
keimentwicklung wird gemeinhin als der basalere, also evolutionär ältere Modus
angesehen. So finden sich Langkeimembryonen nur innerhalb der holometabolen
Insekten, während Vertreter des Kurzkeimmodus in beiden Taxa zu finden sind (Abb.

I. 1. Einleitung
3; Davis und Patel, 2002). Meist geht Langkeimembryogenese einher mit meroisti-
scher Oogenese, also dem Vorhandensein von Nährzellen, die die Oozyte begleiten
(Büning, 1994), und einer verhältnismäßig schnellen Entwicklung, so dass spekuliert
wurde, ob sowohl die simultane Bildung der Segmentanlagen als auch das Vorhan-
densein von Nährzellen in der Oogenese eine kürzere Generationszeit ermöglichen
(Büning, 1994; Davis und Patel, 2002). Das Auftreten beider Embryogenesestrate-
gien in verschiedenen Gruppen innerhalb der holometabolen Insekten legt die mehr-
fach unabhängige Entstehung eines der beiden Typen nahe (Abb. 3; Davis und
Patel, 2002). Entweder der Langkeim-Modus entstand an der Basis der Holometabo-
len, was eine voneinander unabhängige, sekundäre Entwicklung des Kurzkeim-
Modus in Hymenopteren, Käfern und Lepidopteren erfordert, oder die Langkeimemb-
ryogenese selbst ist mehrfach unabhängig entstanden. Dass der Wechsel zwischen
diesen Strategien im Verlauf der Evolution mehrfach geschehen konnte, legt nahe,
dass dies nur wenige Änderungen der Musterbildungssysteme benötigt.
Nachdem alle Segmentanlagen gebildet sind, ähneln sich die meisten Insekten-
embryonen sehr, der gestreckte Keimstreifen repräsentiert also eine Art phylotypi-
sches Stadium (Sander, 1983; Slack et al., 1993; Tautz und Schmid, 1998; Peel et
al., 2005). Hier ist die morphologische und genetische Varianz innerhalb der Insekten
vergleichsweise gering: Segmentpolaritätsgene sind in segmentalen Streifen expri-
miert (Martinez-Arias et al., 1988), Hox-Gene definieren Körperabschnitte und vermit-
teln segmentale Identität (Lawrence und Morata, 1994), und auch die dorso-ventrale
Position der meisten Organanlagen ist ausgeprägt (Heming, 2003). In hemimetabo-
len Insekten findet nun auch die Katatrepsis statt, die „Ausrollung“ des vorher in den
Dotter hineingewachsenen Keimstreifs (Wheeler, 1893; Anderson, 1972a; Panfilio,
2008). Es folgt dann die weitere Differenzierung der Gewebe, die Organogenese und
der dorsale Rückenschluss, bei dem die beiden Seiten der Keimstreifen um den
Dotter herumwachsen und an der dorsalen Mittelllinie schließlich miteinander ver-
schmelzen (Anderson, 1972a; b).
17

I. 1. Einleitung
18
Abb. 2: Unterschiedliche Enwicklungsmodi:
Lang- und Kurzkeim
Gezeigt sind die „fate maps“ eines Drosophila-
(A) und eines Tribolium-Embryos (B) in einer
Schemadarstellung in fortgeschrittenen Blastodermstadien.
Die Unterschiede zwischen Langkeim
(A) und Kurzkeim (B) werden vor allem in
Bezug auf die Anlagen der extraembryonalen
Membranen (Serosa und Amnion bzw. Amnioserosa)
und die abdominalen Segmentanlagen
deutlich.
(A) nach (Hartenstein, 1993), (B) nach (Kotkamp et al.,
2010) PGCs: primordiale Keimzellen (Schröder, 2006),
Ant. Kopf: Anteriorer Kopf, WZ: Wachstumszone
Abb. 3: Vereinfachtes Cladogramm
ausgewählter Insektengruppen
Langkeimembryogenese tritt nur in den
holometabolen Gruppen auf (rote Punkte),
während die Kurzkeimembryogenese
über mehrere Gruppen hinweg auftritt
(gelb). Die bekannten Kurzkeime der
Lepidoptera und Hymenoptera wurden
bisher auch als Intermediärkeime bezeichnet,
folgen also keiner extremen
Kurzkeimembryogenese.
Abbildung verändert nach (Davis und Patel,
2002; Savard et al., 2006b).

I. 1. Einleitung
1.2. Drosophila melanogaster als genetisches Referenzsystem
In den 70er und 80er Jahren des letzten Jahrhunderts wurde durch die Arbeiten
von Nüsslein-Volhard, Wieschaus, Lewis und ihrer Kollegen die Grundlage der
heutigen, molekularen Entwicklungsbiologie geschaffen. Durch systematische Muta-
genese-Screens an Drosophila melanogaster und die darauf folgende Auswertung
der Mutanten wurden die Grundzüge der Drosophila Entwicklung entschlüsselt, und
die Embryogenese der Taufliege als Referenzsystem der Insektenembryologie
etabliert.
Nüsslein-Volhard und ihre Kollegen fanden heraus, dass die Segmentierung des
Drosophila-Embryos durch regulative Interaktionen einer Kaskade von Gengruppen
gesteuert wird (Abb. 4). Diese Kaskade wird von maternalen Genprodukten initiali-
siert, die bereits während der Oogenese in der Oozyte deponiert und lokalisiert
werden (St Johnston und Nüsslein-Volhard, 1992; Riechmann und Ephrussi, 2001).
In prävitellogenetischen Oogenese-Stadien werden dabei mRNAs aus den Nährzel-
len in die Oozyte transportiert, während der Oozytenkern am posterioren Pol zu
liegen kommt (van Eeden und St Johnston, 1999). Dort kommt es zu einem Signal-
austausch der Oozyte mit den posterioren Follikelzellen (Lopez-Schier, 2003), wobei
die Aktivierung des EGF-Rezeptors TORPEDO durch den TGF-ähnlichen Faktor
GURKEN für die Determination der posterioren Follikelzellen nötig ist (Gonzalez-
Reyes et al., 1995; Roth und Lynch, 2009). Diese wiederum induzieren daraufhin in
der Oozyte eine Repolarisierung des Mikrotubuliskeletts, vermittelt durch ein bisher
unbekanntes Signal (Riechmann und Ephrussi, 2001; Roth und Lynch, 2009). Durch
Transposition in Richtung der nun vor allem am anterioren Pol liegenden Mikrotubuli-
Minus-Enden wird bicoid-mRNA am dort lokalisiert (Driever und Nüsslein-Volhard,
1988b; Weil et al., 2006). Am posterioren Pol akkumuliert hingegen die Oskar-
mRNA, die dort die Bildung des Polplasmas steuert (Ephrussi et al., 1991). Hierbei
wird auch die nanos-mRNA am posterioren Pol lokalisiert (Wang und Lehmann,
1991). Nach der Eiaktivierung bilden sich ausgehend von diesen lokalisierten
mRNAs NANOS- und BICOID-Proteingradienten entlang der antero-posterioren
Achse. Diese initialen Gradienten vermitteln die Bildung nachgeschalteter Protein-
gradienten. So inhibiert das NANOS-Protein gemeinsam mit einem ubiquitären
Kofaktor, PUMILIO (Barker et al., 1992), die HUNCHBACK-Expression von der
ubiquitären maternalen hunchback-mRNA im posterioren Teil des Embryos
19

I. 1. Einleitung
(Hülskamp et al., 1989; Irish et al., 1989a). BICOID reprimiert seinerseits von anterior
die Expression von CAUDAL, so dass ein posterior-nach-anteriorer CAUDAL-
Gradient entsteht (Dubnau und Struhl, 1996; Rivera-Pomar et al., 1996). Der Ausfall
dieser maternalen Gene hat weitreichende Folgen. So fehlen in bicoid-Mutanten
beispielsweise Kopf und Thorax (Driever und Nüsslein-Volhard, 1988b), in nanos-
Mutanten das Abdomen (Lehmann und Nüsslein-Volhard, 1991).
20
Nach Bildung dieses Koordinatensystems beginnt die zygotische Genexpression,
wobei die Gradienten entlang der antero-posterioren Achse die Grundlage für die
räumlich begrenztere Expression der nachgeschalteten Gap-Gene bilden (Rivera-
Pomar und Jäckle, 1996). Hierbei aktiviert BCD unter anderem die zygotische
hunchback-Expression in einer anterioren Expressionsdomäne (Tautz, 1988; Driever
und Nüsslein-Volhard, 1989; Struhl et al., 1989). Auch andere Gap-Gene, wie knirps,
giant oder Krüppel, werden durch die maternalen Gradienten im syncytialen Blasto-
derm reguliert (Schulz und Tautz, 1994; Simpson-Brose et al., 1994). Weitere Inter-
aktionen untereinander, sowohl aktivierend als auch reprimierend, führen dann zu
definierten, entlang der ap-Achse räumlich begrenzen Expressionsdomänen
(Hülskamp et al., 1990; Bronner und Jäckle, 1991; Kraut und Levine, 1991a; b;
Margolis et al., 1995; Schulz und Tautz, 1995). Diese überspannen meist mehrere
spätere Segmentanlagen des Embryos und sind für deren Ausbildung essentiell. Am
posterioren Pol des Blastoderms werden die Gap-Gene huckebein und tailless
exprimiert, deren Aktivierung auf ein zusätzliches maternales Musterbildungssystem
zurückzuführen ist: das terminale System (Weigel et al., 1990; Furriols und Casano-
va, 2003). Dabei wird die Rezeptor-Tyrosin-Kinase TORSO an den Polen des Emb-
ryos aktiviert, was zu einer Inaktivierung der Repressoren groucho und capicua führt,
und die Expression von tll und hkb erlaubt (Klingler et al., 1988; Sprenger et al.,
1989; Paroush et al., 1997; Jimenez et al., 2000).
Durch die Integration der teilweise überlappenden, lokal begrenzten gap-
Proteingradienten werden dann im zellulären Blastoderm über spezifische Enhancer-
Elemente die einzelnen Domänen der Paar-Regel-Gene aktiviert (Pankratz und
Jäckle, 1990; Klingler und Gergen, 1993; Langeland et al., 1994; Reinitz und Sharp,
1995; Fujioka et al., 1999). Sie sind zunächst in Streifen exprimiert, die ungefähr eine
Segmentanlage überspannen, aber nur in jeder zweiten Anlage ausgebildet werden,
wobei die Domänen der drei primären Paar-Regel-Gene even-skipped, runt und hairy
gegeneinander verschoben sind (Frasch et al., 1987; Carroll et al., 1988; Gergen und

I. 1. Einleitung
Butler, 1988). Interaktionen dieser Faktoren untereinander führen zur Präzisierung
dieser Domänen und der Expression von sekundären Paar-Regel-Genen (Harding et
al., 1986; Manoukian und Krause, 1992; Gutjahr et al., 1993; Klingler und Gergen,
1993; Gutjahr et al., 1994; Hartmann et al., 1994). Einige dieser Gene sind im späte-
ren Verlauf in zusätzlichen Streifen zwischen denen mit doppelsegmentaler Periodizi-
tät exprimiert und weisen so sekundär ein segmentales Muster auf (Macdonald et al.,
1986; Carroll et al., 1988; Duffy et al., 1991). Die Streifenmuster der verschiedenen
Paar-Regel-Gene machen eine exakte Regulierung der Segmentpolaritäts-Gene
möglich, deren Funktion schließlich die Segmentanlagen definiert (DiNardo und
O'Farrell, 1987; Lawrence et al., 1987; Ingham et al., 1988). Dabei sind die Gene
wingless und engrailed in nebeneinander liegenden Zellreihen exprimiert und erhal-
ten dieses Muster durch gegenseitige Aktivierung über die Signalmoleküle
WINGLESS und HEDGEHOG (DiNardo et al., 1985; Baker, 1988; Sanson, 2001).
Zwischen beiden Domänen wird eine Parasegmentgrenze etabliert, die späteren
Segmentgrenzen entwickeln sich posterior der engrailed Streifen (Martinez-Arias und
Lawrence, 1985; Martinez-Arias et al., 1988; Lawrence und Struhl, 1996).
Die Identität der so gebildeten Segmentanlagen wird in der Folge durch die Akti-
vität unterschiedlicher Kombinationen von Hox-Genen vermittelt (Lewis, 1978).
Homeobox-Gene sind eine Gruppe hochkonservierter Transkriptionsfaktoren, die
zumindest innerhalb der Bilateria an der Etablierung unterschiedlicher Identitäten
entlang der Antero-posterioren Achse beteiligt sind (Garcia-Fernandez, 2005). Diese
als Hox-Gene bezeichneten Homeobox-Gene liegen innerhalb genomischer Cluster
und die antero-posteriore Abfolge ihrer Expressionsdomänen entspricht dabei der
Anordnung der entsprechenden Gene auf der genomischen Sequenz (Kolinearität).
Bei Drosophila spaltete sich der Hox-Komplex in zwei Komplexe auf: den Antenna-
pedia- und den Bithorax-Komplex (Lawrence und Morata, 1994). Die Position und die
Grenzen der Hox-Genexpression werden vor allem durch die Aktivität der gap- und
der Paar-Regel-Gene festgelegt (Harding und Levine, 1988; Irish et al., 1989b; Jack
und McGinnis, 1990; Casares und Sanchez-Herrero, 1995).
21

I. 1. Einleitung
Abb. 4: Von Gradienten zu Streifen: Die Ebenen der Drosophila-Segmentierungs-
kaskade
Schematische Darstellung der Proteinexpressionsdomänen im Drosophila Blastoderm. „Step
1“ zeigt maternale Gradienten, die im Fall von NANOS und BICOID durch Diffusion vom Ort
der lokalisierten mRNA ausgehen, und dann die Expression von HUNCHBACK bzw.
CAUDAL im posterioren respektive anterioren Bereich des Embryos reprimieren. „Step 2“:
Basierend auf der Regulation durch die maternalen Gradienten und auf Interaktionen untereinander
entstehen die zygotischen Gap-Gen-Domänen, deren Proteinkonzentrationen von
den Maxima ihrer mRNA-Expressionsdomänen aus diffundieren und kurzreichende Gradienten
bilden.
Im nächsten Schritt („Step 3“) führen die teilweise überlappenden Gap-Gen-Domänen zur
Expression der primären Paar-Regel-Gene in einem doppelsegmentalen Muster. Diese
regulieren sich gegenseitig und die Expression der sekundären Paar-Regel-Gene.
Diese sich wiederholende Abfolge von streifenförmigen Paar-Regel-Gen-Domänen führt in
„Step 4“ zur segmentalen Expression der Segmentpolaritäts-Gene und damit der Ausprägung
von Parasegment- und späteren Segmentgrenzen.
Abbildung leicht verändert aus (Peel et al., 2005).
Ebenso wie die Etablierung der anteroposterioren Achse hängt auch die Festle-
gung der dorso-ventralen Achse in Drosophila von Prozessen während der Oogene-
se ab (Roth, 2003). Nachdem durch die posteriore Lage des Oozytenkerns termina-
les Follikelzellschicksal determiniert wurde, wird dieser zu einer peripheren, anterio-
ren Position transportiert, wodurch wiederum durch das GURKEN-EGF-Rezeptor-
Signal die Festlegung dorsaler Schicksale initiiert wird (Gonzalez-Reyes et al., 1995;
Roth et al., 1995). In der Folge der EGF-Rezeptor-Aktivierung wird die Expression
von pipe in ventralen Follikelzellen aktiviert (Nilson und Schupbach, 1998; Sen et al.,
1998; Peri et al., 2002). PIPE wiederum bedingt eine Proteasekaskade im Perivitel-
linraum, die zur Aktivierung des TOLL Rezeptors in der Oozytenmembran durch den
Liganden SPÄTZLE führt (Moussian und Roth, 2005). Dies führt in der Folge dann
22

I. 1. Einleitung
zur Phosphorylierung und Degradierung von CACTUS und zur Translokation des NF-
!B Transkriptionsfaktors DORSAL in den Zellkern der ventralen Energiden des
syncytialen Blastoderm-Embryos in Form eines ventro-dorsalen Gradienten (Roth et
al., 1989; Moussian und Roth, 2005). Hohe DORSAL Konzentrationen aktivieren
dann beispielsweise snail und twist in der ventral liegenden Mesodermanlage
(Govind und Steward, 1991; Ip et al., 1992), während mittlere Konzentrationen z.B.
short-gastrulation und rhomboid in der Anlage des neurogenen Ektoderms der latera-
len Blastodermbereiche aktivieren (Rusch und Levine, 1996). In der dorsalen Anlage
des Ektoderms werden zerknüllt und decapentaplegic (dpp) exprimiert, die von
dorsal reprimiert werden (Rusch und Levine, 1996; Roth, 2003).
Die Ausbildung der Körperachsen des Drosophila Embryos basiert also auf A-
symmetrien, die dem Ei in Form von lokalisierten mRNAs und räumlich begrenzter
Rezeptoraktivierung mit auf den Weg gegeben werden. Diese Vorraussetzungen
erlauben die schnelle Etablierung des segmentalen Bauplans, durch Interaktionen
diffundierender Faktoren im syncitialen Blastoderm, wobei die Komplexität der ent-
stehenden Muster von Ebene zu Ebene der Segmentierungskaskade zunimmt.
1.3. Tribolium castaneum als Modell für vergleichende Studien
der Embryonalentwicklung
1.3.1. Die Tribolium-Embryogenese
Wie bei allen Insekten beginnt auch die Tribolium-Entwicklung mit einer Reihe
früher Kernteilungen, wie in Drosophila gefolgt von der Bildung eines zunächst
syncytialen Blastoderms (Handel et al., 2000). Die erste sichtbare Differenzierung
des Embryos manifestiert sich in einer weiträumigeren Verteilung der Zellkerne
innerhalb der Serosaanlage ungefähr 9 Stunden nach Eiablage bei 30 °C, d.h. kurz
nach der Vollendung der letzten synchronen Kernteilung (des dreizehnten Mitose-
zyklus, (Handel et al., 2000). Ungefähr die Hälfte des Blastoderms trägt dabei zur
Serosaanlage, die andere zur Embryonalanlage bei. Innerhalb dieser werden blasto-
dermal außer der prägnathalen Kopfanlage noch die Segmentanlagen des
Gnathums und des ersten thorakalen Segments angelegt (Patel et al., 1994), wahr-
scheinlich ist auch zumindest die Anlage des zweiten thorakalen Segments noch ein
Produkt blastodermaler Musterbildung (Schoppmeier und Schröder, 2005). Wenig
23

I. 1. Einleitung
später bildet sich eine Invagination am posterioren Pol des Embryos, deren dorsaler
Rand im weiteren Verlauf als posteriore Amnionfalte die Embryonalanlage in anterio-
rer Richtung überwächst. Dabei sinkt der posteriore Teil der kondensierenden Emb-
ryonalanlage tief in den Dotter ein, wobei die entstehenden Kopflappen weiterhin
dem Dotter aufliegen (Handel et al., 2000). Zu diesem Zeitpunkt beginnt die Gastru-
lation, also die Invagination des Mesoderms, in einem medianen Bereich des Embry-
os (Handel et al., 2005). Am posterioren Ende des Keimrudiments, der am tiefsten
im Dotter liegenden Stelle des Übergangs von Embryo- zu Amnionanlage, entsteht
die posteriore Wachstumszone. Das Keimrudiment wird nun auch von einer anterio-
ren Amnionfalte überwachsen, wodurch sich das entstehende Serosafenster über
dem nun bereits elongierenden und dem Dotter wieder aufliegenden Keimstreif
schließt. Beim Schluss des Serosafensters trennen sich Amnion und Serosa und
umgeben Embryo und Dotter (Serosa) bzw. die „ventrale“ Seite des Embryos (Amni-
on; (van der Zee et al., 2005). Der Keimstreif elongiert nun, bis aus der Wachstums-
zone 10 abdominale Segmentanlagen gebildet wurden, während die Differenzierung
der Segmentanlagen in anterior-nach-posteriorer Progression fortschreitet und
beispielsweise Extremitätenknospen gebildet werden (Brown et al., 1994b; Schröder
et al., 2008). Schließlich verkürzt und kompaktiert sich der Keimstreif und eine Fusi-
on von Amnion und Serosa leitet den dorsalen Rückenschluss ein, bei dem der
Embryo den Dotter umwächst (van der Zee et al., 2005).
1.3.2. Molekulare Mechanismen der Tribolium-Entwicklung
24
Basierend auf den gewonnnen Erkenntnissen aus Drosophila wurden innerhalb
der letzten zwei Jahrzehnte auch die molekularen Grundlagen der Tribolium-
Segmentierung intensiv erforscht (Brown und Denell, 1996; Denell, 2008; Schröder
et al., 2008). Dabei traten sowohl große Ähnlichkeiten, als auch deutliche Unter-
schiede der beteiligten Mechanismen zu Tage. Prinzipiell scheinen die späten Pro-
zesse der Segmentierungskaskade, also die Bildung der Parasegmentgrenzen durch
die Segmentpolaritäts-Gene und die Etablierung der Segmentidentität durch die Hox-
Gene den höchsten Grad an Konservierung aufzuweisen. Auch in Tribolium werden
Parasegmentgrenzen durch Segmentpolaritäts-Gene wie wingless und engrailed
festgelegt (Brown et al., 1994c; Nagy und Carroll, 1994). Im Zuge der Entwicklung
als Kurzkeiminsekt entstehen diese aber größtenteils sukzessive während der Keim-
streifstreckung und nicht wie bei Drosophila zeitgleich. Auch die Expression der Hox-

I. 1. Einleitung
Gene ist in Tribolium größtenteils konserviert (Shippy et al., 1998; Bennett et al.,
1999; Brown et al., 1999a; Shippy et al., 2000; Curtis et al., 2001; Nie et al., 2001;
Berghammer, 2003; Bäumer, 2006), der Hox-Komplex ist allerdings nicht in zwei
Komplexe aufgespalten (Beeman et al., 1989; Stuart et al., 1991; Denell, 2008;
Shippy et al., 2008). Nur geringe Abweichungen der Expressionsdomänen zwischen
Drosophila und Tribolium treten auf. Beispielsweise wird sex-combs-reduced in
Tribolium strikt in Parasegment 2 exprimiert, während die Expression in Drosophila
nicht exakt mit den Kompartmentsgrenzen assoziiert ist (Riley et al., 1987; Curtis et
al., 2001). Das Ultrabithorax-Ortholog Ultrathorax hat zudem eine zusätzliche frühe,
transiente Expressionsdomäne im ersten thorakalen Segment, die in Drosophila fehlt
(Bennett et al., 1999). Auch die Funktion der Hox Gene scheint weitgehend konser-
viert zu sein, wobei allerdings kleinere Unterschiede auftreten. So zeigen sich bei-
spielsweise bei Verlust der anterioren Hox-Gene in Tribolium tendentiell Transforma-
tionen, wo bei Drosophila eher Differenzierungsdefekte auftreten (Rogers und Kauf-
man, 1997; Brown et al., 2000; Shippy et al., 2000; Curtis et al., 2001). Dies könnte
allerdings der abgeleiteten Morphologie des Drosophila-Gnathums geschuldet sein
(Brown et al., 2000).
Im Gegensatz zu diesen konservierten Prozessen, zeigen die Systeme der Paar-
Regel-Gene und der Gap-Gene größere Unterschiede zwischen Fliegen- und Käfer-
embryonen. Die hierbei größte Diskrepanz zwischen Tribolium und Drosophila be-
dingt sich aus den Unterschieden zwischen der Lang- und der Kurzkeim-
Embryogenese. Während in Drosophila die doppel-segmentalen Paar-Regel-
Domänen nahezu gleichzeitig im Blastoderm gebildet werden und somit direkt von
der Regulation durch maternale und Gap-Gene abhängen (Klingler und Tautz, 1999),
werden die meisten Paar-Regel-Gen-Domänen in Tribolium während der Keimstreif-
Elongation innerhalb der Wachstumszone gebildet (Brown und Denell, 1996). Dies
geschieht durch einen Regulationskreis wechselseitiger Interaktionen der primären
Paar-Regel-Gene innerhalb der Wachstumszone. Während in Drosophila die Gene
even-skipped, runt und hairy als primäre Paar-Regel-Gene bezeichnet werden, sind
es in Tribolium even-skipped, runt und odd-skipped, die den anderen Paar-Regel-
Genen (paired und sloppy-paired) übergeordnet sind (Ingham und Gergen, 1988;
Patel et al., 1994; Brown und Denell, 1996; Choe et al., 2006; Choe und Brown,
2007). Die etablierten Paar-Regel-Gen-Domänen regulieren dann wie bei Drosophila
die segmentale Expression der Segmentpolaritäts-Gene (Choe et al., 2006; Choe
25

I. 1. Einleitung
und Brown, 2007; 2009). Der Verlust eines der primären Paar-Regel-Gene führt zu
einem frühen Abbruch der Segmentierung, während durch RNAi gegen paired oder
sloppy-paired der Verlust der ungeradzahligen bzw. geradzahligen Segmente verur-
sacht wird (Maderspacher et al., 1998; Choe et al., 2006; Choe und Brown, 2007).
hairy und fushi-tarazu werden in Tribolium zwar auch in einem Paarregel Muster
exprimiert, sie scheinen aber keine essentielle Funktion für die Segmentierung zu
haben (Sommer und Tautz, 1993; Brown et al., 1994a; Aranda et al., 2008).
26
Obwohl spekuliert wurde, dass der Paar-Regel-Gen-Regelkreis auch für die Bil-
dung der Segmentanlagen im Blastoderm verantwortlich sei (Choe et al., 2006), ist
zum jetzigen Zeitpunkt nicht vollständig klar, wie die Paar-Regel-Gen-Domänen im
Blastoderm gebildet werden. So gibt es beispielsweise Hinweise auf die Beteiligung
der Gap-Gene hunchback und giant sowie des wichtigen posterioren Faktors
CAUDAL an der Etablierung einzelner Paar-Regel-Gen-Domänen (Cerny, 2007;
Schoppmeier et al., 2009), was zumindest auf die Beteiligung streifenspezifischer
Regulationsprozesse hinweist.
Das Muster der Gap-Gen-Expression in Tribolium zeigt prinzipielle Ähnlichkeiten
zur Situation in Drosophila (Hülskamp und Tautz, 1991). So bilden knirps, giant und
hunchback jeweils eine gnathale und weiter posterior liegende Domänen innerhalb
der Embryonalanlage aus, während Krüppel nur in einer Domäne exprimiert ist
(Sommer und Tautz, 1993; Wolff et al., 1995; Bucher und Klingler, 2004; Cerny et al.,
2005; Cerny et al., 2008; Marques-Souza et al., 2008). Trotz dieser prinzipiellen
Ähnlichkeit finden sich deutliche Unterschiede in der Expression der einzelnen Gene.
Beispielsweise zeigen sowohl die hunchback- als auch die giant-Expression eine
maternale, ubiquitäre Komponente (Wolff et al., 1995; Bucher und Klingler, 2004).
Außerdem sind die Expressionsdomänen der Tribolium-Gap-Gene meist im Ver-
gleich zu den Drosophila-Orthologen relativ zu den Segmentanlagen etwas verscho-
ben (Wolff et al., 1995; Bucher und Klingler, 2004; Cerny et al., 2005; Cerny et al.,
2008; Marques-Souza et al., 2008). Zudem treten Unterschiede auf, die durch die
Kurzkeimentwicklung Triboliums bedingt sind. Die posterioren Domänen von giant
und knirps, und die Krüppel-Domäne werden am posterioren Pol initiiert und differen-
zieren sich im Verlauf der Entwicklung aus, während die posteriore hunchback-
Domäne erst im Laufe der Keimstreifstreckung entsteht (Wolff et al., 1995; Bucher
und Klingler, 2004; Cerny et al., 2008).

I. 1. Einleitung
Die frühe Regulation der Tribolium-Gap-Gene ist noch größtenteils unverstanden,
es ist aber bekannt, dass Interaktionen untereinander zumindest für die Ausbildung
der Domänen in Keimrudimentstadien wichtig sind (Cerny et al., 2005; Cerny, 2007;
Marques-Souza et al., 2008). Auch hier zeigen sich Unterschiede zur Situation in
Drosophila (Niessing et al., 1997). So ist beispielsweise KRÜPPEL notwendig für die
Aktivierung der posterioren der beiden embryonalen Domänen von giant und repri-
miert die posteriore hunchback-Domäne (Cerny, 2007), sie interagieren also anders
als in Drosophila (Niessing et al., 1997). Andere Interaktionen wiederum finden sich
in beiden Spezies, wie beispielsweise die GIANT-abhängige Repression von Kr
(Rivera-Pomar und Jäckle, 1996; Cerny, 2007). Zumindest das Prinzip der gegensei-
tigen Regulation der Gap-Gene scheint also konserviert zu sein, wobei die Art der
Interaktionen deutlicher Plastizität unterliegt.
Der Verlust der Drosophila-Gap-Gene geht meist mit Segmentdeletionen einher,
die im Zusammenhang mit den Expressionsdomänen stehen (Hülskamp und Tautz,
1991; Rivera-Pomar und Jäckle, 1996). Dies ist in Tribolium weniger deutlich. Wäh-
rend kni-RNAi zwar zu Deletionen von Segmenten im Einflussbereich seiner anterio-
ren Domäne führt, kommt es nach giant, krüppel oder hunchback-RNAi vor allem zu
homeotischen Transformationen und posterioren Segmentierungsabbrüchen (Bucher
und Klingler, 2004; Cerny et al., 2005; Cerny et al., 2008; Marques-Souza et al.,
2008). Somit scheint eine Aufgabe der Gap-Gene in Tribolium die Positionierung der
Hox-Gen-Expressionsdomänen zu sein, eine Funktion, die sie auch in Drosophila
erfüllen, deren Effekte dort aber durch die segmentalen Deletionen in Kutikula-
Phänotypen weniger deutlich zu Tage treten (White und Lehmann, 1986; Harding
und Levine, 1988; Irish et al., 1989b; Riley et al., 1991; Casares und Sanchez-
Herrero, 1995). Auch in Tribolium gibt es Einflüsse der Gap-Gene auf die Expression
der Paar-Regel-Gene, also auf die frühe Bildung der Segmentanlagen. So haben
beispielsweise gt- und hb-RNAi subtile Effekte auf blastodermale Paar-Regel-Gen-
Expression, während GIANT, HUNCHBACK und KRÜPPEL die Ausbildung von
Paar-Regel-Domänen in Keimstreifstadien beeinflussen (Bucher und Klingler, 2004;
Cerny et al., 2005; Cerny, 2007; Marques-Souza et al., 2008).
Außer diesen „kanonischen“ Gap-Genen konnte in Tribolium auch ein neues Gen
mit Charakteristiken eines Gap-Gens beschrieben und so der Wert von Tribolium als
zusätzlichem Modellsystem unterstrichen werden (Savard et al., 2006a). mille-pattes
wird in einer Kopf- und zwei posterioren Domänen exprimiert und RNAi-Experimente
27

I. 1. Einleitung
führen zu Transformationen abdominaler Segmente zu thorakalem Schicksal sowie
zum Abbruch der Segmentierung (Savard et al., 2006a). Die Besonderheit dieses
Gen liegt in der Tatsache, dass es für eine polycistronische mRNA kodiert, die wahr-
scheinlich zu Expression von vier kurzen Peptiden führt, deren Funktionsweise noch
unklar ist (Savard et al., 2006a; Hashimoto et al., 2008).
28
Über die Etablierung initialer Asymmetrien innerhalb des frühen Tribolium-
Embryos bzw. die Interaktionen maternaler Komponenten ist noch verhältnismäßig
wenig bekannt. Ein großer Unterschied der maternalen Systeme in Drosophila und
Tribolium ist das Fehlen des anterioren Morphogens bicoid im Käfer-Genom, das
sich erst innerhalb der Dipteren entwickelte (Stauber et al., 1999; Brown et al., 2001).
Es wurde postuliert, dass die Gene orthodenticle-1 und hunchback in Tribolium die
instruktive Funktion von BCD für die Entwicklung des Kopfes und des Thorax erset-
zen könnten (Schröder, 2003). Beide sind als maternale mRNAs ubiquitär im frühen
Embryo vorhanden und werden dann zunächst von posterior reprimiert (Wolff et al.,
1995; Schröder, 2003). Die Expression von HB zieht sich in der Folge auf die Sero-
saanlage und eine gnathale Expressionsdomäne zurück (Wolff et al., 1995), während
otd-1-Expression zunächst auf die anteriore Hälfte des Embryos und dann auf eine
Kopfdomäne begrenzt wird (Li et al., 1996; Schröder, 2003; Schinko et al., 2008). Als
mögliche Effektoren der posterioren Repression wurden Orthologe der Gene nanos
und pumilio vorgeschlagen (Wolff et al., 1995; Schröder, 2003), die Gegenstand
dieser Arbeit sind. Aufgrund von Doppel-RNAi-Experimenten entstand der Eindruck,
hb und otd-1 wären notwendig für die Spezifizierung der Segmente des Kopfs und
des Thorax, sowie des Großteils der abdominalen Segmente (Schröder, 2003).
Neuere Arbeiten konnten aber zeigen, dass weder hb noch otd-1 eine wesentliche
Rolle für die initiale Anlage der gnathalen Segmentanlagen spielen (Marques-Souza
et al., 2008; Kotkamp et al., 2010) und sie somit keine bcd-Funktion in diesen Berei-
chen ersetzen. Während hb wie weiter oben beschrieben eine Funktion als Gap-Gen
erfüllt, spielt otd-1 neben seiner zygotischen Funktion als Kopf-Gap-Gen (Schinko et
al., 2008) schon in sehr frühen Stadien als ubiquitärer Faktor eine Rolle für die Aus-
bildung der dorso-ventralen Achse und der ventralen Anlage des anterioren Kopfes
sowie der Anlage der Serosa bzw. der Positionierung der Embryo/Serosa-Grenze
(Kotkamp et al., 2010). Diese Funktionen scheinen aber nicht mit einem postulierten
transienten antero-posterioren Gradienten von OTD in Zusammenhang zu stehen
(Kotkamp et al., 2010). Die Wirkung von OTD-1 auf die Ausbildung der Serosa wird

I. 1. Einleitung
wahrscheinlich über die Aktivierung des Hox3-Homologs zerknüllt-1 vermittelt, einem
entscheidenden Faktor für die Entwicklung der Serosaanlage (Falciani et al., 1996;
van der Zee et al., 2005; Kotkamp et al., 2010). Nachdem in Tribolium nicht Kopf und
Thorax, sondern die Anlage der extraembryonalen Membranen die anteriorsten
Schicksale im Blastoderm darstellen, könnte man diese Funktion von ZEN-1 für die
Serosa möglicherweise mit der permissiven Funktion von bcd in Drosophila verglei-
chen (van der Zee et al., 2005). Wie die instruktiven Funktionen von bcd bei der
Segmentierung von Tribolium realisiert werden, bleibt dabei unklar, der posteriore
Faktor CAUDAL scheint aber in diesem Zusammenhang eine Rolle zu spielen (s.u.).
Die Aktivierung von zen-1 hängt nicht ausschließlich von der OTD-1-Aktivität,
sondern auch von Faktoren des terminalen System ab (Schoppmeier und Schröder,
2005; Koniszewski, 2007). Der zusätzliche Einfluss des TORSO-Signalwegs auf die
zen-1-Aktivierung dürfte dabei die räumliche Spezifität vermitteln. Ähnlich wie in
Drosophila (Furriols und Casanova, 2003) führt wahrscheinlich auch in Tribolium
torso-like-Expression an den anterioren und posterioren Polen des Follikelepithels
während der späten Oogenese zur Aktivierung des maternal ubiquitär exprimierten
torso-Rezeptors, was nicht nur wichtig für die Ausprägung der Serosa, sondern auch
für die Bildung abdominaler Segmente notwendig ist (Schoppmeier und Schröder,
2005). Nach torso- oder torso-like-RNAi kommt es zum Verlust aller abdominalen
und des dritten thorakalen Segments. Der torso-Signalweg spielt hier also eine
wichtigere Rolle als bei Drosophila (Furriols und Casanova, 2003). Er initiiert am
posterioren Pol die Expression von Genen wie tll, gt, oder wingless und sorgt offen-
bar für die Etablierung der posterioren Wachstumszone (Schröder et al., 2000;
Schoppmeier und Schröder, 2005; Koniszewski, 2007).
In späteren Keimrudimentstadien hängt auch die posteriore Expression von cau-
dal vom terminalen System ab (Schoppmeier und Schröder, 2005). cad spielt als
wesentlicher posteriorer Faktor auch eine wichtigere Rolle für die Embryogenese in
Tribolium als in Drosophila (Macdonald und Struhl, 1986; Copf et al., 2004). Eben-
falls zunächst maternal ubiquitär exprimiert, wird CAUDAL später durch die Aktivität
der zygotischen Faktoren MEX-3 und ZEN-2 auf die posteriore Hälfte des Embryos
begrenzt, bleibt später in der Wachstumszone aktiv und ist für die Ausbildung aller
Segmentanlagen des Embryos mit Ausnahme des anterioren Kopfes nötig (Schulz et
al., 1998; Copf et al., 2004; Schoppmeier et al., 2009). Wie dabei die Expression von
mex-3 aktiviert wird, ist unbekannt. CAD ist also neben allen Wachstumszonen-
29

I. 1. Einleitung
abhängigen Segmenten auch nötig für die Ausbildung aller blastodermaler Segment-
anlagen mit Ausnahme des anterioren Kopfes. Dieser Befund unterstützt die Idee,
dass Kurz-Keim-Embryonen durch ein posteriores Musterbildungszentrum mögli-
cherweise ausreichende räumliche Information erhalten, um auf ein zusätzliches
anteriores Zentrum verzichten zu können. Dieser Vorstellung folgend könnte CAD als
posteriores Morphogen die Segmentierung der Embryonalanlage steuern. Tatsäch-
lich fehlen die entsprechenden eve-Domänen nach RNAi, es konnte jedoch gezeigt
werden, dass dies eher auf eine Beteiligung innerhalb streifenspezifischer Regulati-
onsmechanismen als auf eine übergeordnete Morphogenfunktion zurückzuführen ist
(Schoppmeier et al., 2009). Somit bleibt unklar, ob in Tribolium ein klassisches
Morphogen existiert, oder die frühe Musterbildung stärker auf regulatorischen Inter-
aktionen zygotischer Faktoren beruht. In Bezug auf die antero-posteriore Positionsin-
formation im Tribolium-Blastoderm bleiben also noch viele Fragen offen.
30
Auch die Ausbildung der dorso-ventralen Achse des frühen Tribolium-Embryos
wurde anhand vergleichender Studien mit Drosophila-Orthologen untersucht. Ebenso
wie bei der Ausbildung der ap-Achse scheint hier eine größere Abhängigkeit von
zygotischen Regulationsprozessen im Vergleich zu maternaler Kontrolle vorhanden
zu sein (Fonseca et al., 2009). Ähnlich wie in Drosophila (Moussian und Roth, 2005)
wird auch in Tribolium durch maternal Toll-Aktivierung DORSAL in ventralen Berei-
chen aktiviert (Chen et al., 2000; Nunes da Fonseca et al., 2008), der DORSAL
Gradient ist aber viel dynamischer und wird nur transient ausgebildet. Hierbei sind
zygotische regulatorische feedback-loops beteiligt, die offenbar ein selbstorganisie-
rendes System darstellen, das durch die maternalen Toll-Signale lediglich seine
Orientierung erhält (Nunes da Fonseca et al., 2008). In der Folge dieser Polarisie-
rung wird ventral der BMP-Antagonist short-gastrulation aktiviert, der die decapen-
taplegic Aktivität auf dorsale Bereiche beschränkt und somit die Konservierung des
BMP-Signals für dorsales Schicksal auch in Tribolium aufzeigt (van der Zee et al.,
2006; Nunes da Fonseca et al., 2008). Interessanterweise ist die frühe Expression
von otd-1 für diese ventrale Aktivierung von sog nötig und zeigt damit eine Verknüp-
fung der ap- und dv-Systeme in Tribolium (Kotkamp et al., 2010). Diese Verknüp-
fung scheint in Tribolium deutlich stärker zu sein als in Drosophila. So erhält die vom
antero-posterioren System abhängige Serosa-Embryo-Grenze durch das dorso-
ventrale System eine dorso-ventrale Asymmetrie (van der Zee et al., 2006). Damit in
Zusammenhang stehend, hängt in Tribolium, anders als in Drosophila und ähnlich

I. 1. Einleitung
wie in Vertebraten, der anteriore Kopf in hohem Maße von dorso-ventraler Musterbil-
dung ab und stellt somit kurioserweise eine ventrale Anlage dar (van der Zee et al.,
2006; Kotkamp et al., 2010).
Abb. 5: Frühe Gradienten und Aktivitäten im Tribolium-Blastoderm
Schematische Darstellung einer blastodermalen „fate-map“ in Verbindung mit der Darstellung
einiger wichtiger Faktoren.
Während CAUDAL für die Entwicklung der meisten embryonalen Segmentanlagen wesentlich
ist, und die TORSO-Aktivität neben der posterioren Wachstumszone auch die Entwicklung
der Serosa massiv beeinflusst, erfüllt maternal ubiquitäres OTD-1 zwar einige wichtige
Funktionen, sein transienter Gradient vermittelt aber nur wenig oder keine räumliche Information.
HB ist indes vor allem für die spätere Regulation der Hox-Gen-Domänen wichtig.
WZ: Wachstumszone. Für diese Abbildung wurden Daten aus diversen im Text besprochenen Veröffentlichungen
integriert.
31

I. 1. Einleitung
1.4. nanos und pumilio – pleiotrop und konserviert
1.4.1. nanos und pumilio in Drosophila
32
Mutanten der Gene NANOS und PUMILIO tragen, wurden bereits in Screens für
letale Mutationen maternaler Faktoren im Rahmen der Arbeiten von Nüsslein-
Volhard, Wieschaus und ihren Mitarbeitern isoliert (Nüsslein-Volhard et al., 1987).
Aufgrund ihres ähnlichen abdominalen Phänotyps wurden diese und einige weitere
Mutanten als „posteriore Gruppe“ bezeichnet. NANOS und PUMILIO stellten sich als
die Effektoren dieser posterioren Gen-Gruppe heraus (Lehmann und Nüsslein-
Volhard, 1991; Wang und Lehmann, 1991; Barker et al., 1992), deren Funktion
tatsächlich für die Ausbildung des Abdomens nötig ist, während Faktoren wie
OSKAR, STAUFEN, VASA und TUDOR die Lokalisierung der NANOS/PUMILIO
Aktivität vermitteln (Lehmann und Nüsslein-Volhard, 1991; Wang et al., 1994).
Maternale pumilio-mRNA und das resultierende Protein sind außer im posterior
liegenden Polplasma auch innerhalb des übrigen präblastodermalen Embryos vor-
handen (Barker et al., 1992; Macdonald, 1992), wohingegen die Expression des
NANOS-Proteins auf das Polplasma beschränkt wird und somit die räumliche Spezi-
fität des Komplexes vermittelt (Wang und Lehmann, 1991; Gavis und Lehmann,
1992; Wang et al., 1994). nanos-mRNA wird dabei während der Oogenese in die
Oozyte transportiert (Wang et al., 1994) und dort am posterioren Pol gebunden
(Forrest und Gavis, 2003). Während unlokalisierte nanos-mRNA später im Großteil
des Embryos abgebaut wird (Smibert et al., 1996; Bergsten und Gavis, 1999; Daha-
nukar et al., 1999; Smibert et al., 1999), kann im Polplasma NANOS-Protein synthe-
tisiert werden (Gavis und Lehmann, 1994; Dahanukar und Wharton, 1996), das von
dort nach anterior diffundiert und einen Gradienten bildet (Gavis und Lehmann, 1992;
Wang et al., 1994). Beide Gene sind in späteren Stadien der Entwicklung auch in
neuronalen Geweben und den Ovaren exprimiert (Barker et al., 1992; Forbes und
Lehmann, 1998; Wharton et al., 1998; Menon et al., 2004; Wang und Lin, 2004; Ye et
al., 2004; Brechbiel und Gavis, 2008).
Die posteriore Aktivität des NANOS/PUMILIO-Komplexes verhindert die Transla-
tion der maternalen hunchback-mRNA in den posterioren Bereichen des präblasto-
dermalen Drosophila-Embryos (Hülskamp et al., 1989; Irish et al., 1989a; Struhl,
1989; Barker et al., 1992; Murata und Wharton, 1995; Wharton et al., 1998; Sonoda

I. 1. Einleitung
und Wharton, 1999). Dadurch ist die Expression posteriorer gap-Domänen und die
Aktivierung abdominaler Paar-Regel-Gen-Domänen möglich (Enslee und Riddiford,
1981; Frasch und Levine, 1987; Gaul et al., 1987; Struhl, 1989; Hülskamp et al.,
1990; Eldon und Pirrotta, 1991; Kraut und Levine, 1991a; b). nanos und pumilio sind
also für die Ausbildung abdominaler Segmente nötig, so dass die Mutation eines der
beiden Gene zum Verlust des Abdomens in betroffenen Larven führt (Nüsslein-
Volhard et al., 1987; Irish et al., 1989a; Barker et al., 1992). Diese Notwendigkeit von
nanos und pumilio für die Embryonalentwicklung erwächst allerdings nur aus dem
Vorhandensein maternaler hb-mRNA. Embryonen, denen sowohl NANOS-Aktivität
als auch maternale hb-mRNA fehlt, können sich zu adulten Tieren entwickeln
(Hülskamp et al., 1989; Irish et al., 1989a; Struhl, 1989). Zusätzlich zu dieser Funkti-
on sind nanos und pumilio in der Lage, die Translation des anterioren Faktors bicoid
zu reprimieren, und in diesem Zusammenhang wahrscheinlich den zeitlichen Verlauf
des bicoid-mRNA-Abbaus zu regulieren (Driever und Nüsslein-Volhard, 1988b;
Wharton und Struhl, 1989; Wang und Lehmann, 1991; Gamberi et al., 2002).
NANOS und PUMILIO sind als Komponenten des Polplasmas nicht nur an der
Ausbildung der embryonalen AP-Achse beteiligt, sondern spielen auch eine Rolle für
die Entwicklung der primordialen Keimzellen (PGCs; Kobayashi et al., 1996; Asaoka-
Taguchi et al., 1999; Parisi und Lin, 1999). In nanos- oder pumilio-Mutanten werden
zwar Polzellen gebildet (Lehmann und Nüsslein-Volhard, 1991), diese sind aber nicht
in der Lage, die Wanderung in die entstehende Gonadenanlage zu durchlaufen
(Kobayashi et al., 1996; Asaoka-Taguchi et al., 1999). NANOS und PUMILIO sind in
diesem Zusammenhang nötig, um die Identität der PGCs zu erhalten (Gilboa und
Lehmann, 2004). Hierbei kontrollieren sie beispielsweise die mitotische Aktivität
durch die Regulation der CyclinB-Expression (Asaoka-Taguchi et al., 1999; Kadyrova
et al., 2007). Außerdem hemmen sie in den primordialen Keimzellen die transkriptio-
nelle Aktivität, sie reprimieren die Expression somatischer Gene und verhindern den
Eintritt in die Apoptose (Asaoka et al., 1998; Deshpande et al., 1999; Schaner et al.,
2003; Sato et al., 2007). Selbst in adulten Tieren spielen NANOS und PUMILIO noch
eine Rolle für die Keimbahn: Sie sorgen für den Erhalt der Keimbahnstammzellen im
Ovar, indem sie ihre Differenzierung in Cystoblasten unterdrücken (Lin und Sprad-
ling, 1997; Forbes und Lehmann, 1998; Bhat, 1999; Gilboa und Lehmann, 2004;
Wang und Lin, 2004; Szakmary et al., 2005; Kim et al., 2010b).
33

I. 1. Einleitung
34
Weitere postembryonale Funktionen erfüllen nanos und pumilio in neuronalen
Geweben. So wurde gezeigt, dass pumilio eine Rolle für das Langzeitgedächtnis
spielt (Dubnau et al., 2003), und dass beide Gene in die Entwicklung peripherer
Neuronen bzw. deren Verzweigungen involviert sind (Ye et al., 2004; Brechbiel und
Gavis, 2008). Außerdem sind sie für die Aktivität an larvalen neuro-muskulären
Endplatten und Motoneuronen nötig (Schweers et al., 2002; Mee et al., 2004; Menon
et al., 2004; Muraro et al., 2008; Menon et al., 2009). Man kann davon ausgehen,
dass außer diesen bisher bekannten Funktionen noch etliche weitere Prozesse von
einer regulativen Aktivität zumindest PUMILIOs abhängen. So wurden in einem
genomweiten Screen nach PUMILIO-assoziierten mRNAs mehrere Hundert poten-
tielle Ziel-mRNAs isoliert (Gerber et al., 2006).
1.4.2. nanos und pumilio sind evolutionär alte Gene
Sowohl NANOS als auch PUMILIO zeichnen sich durch klar definierte Protein-
domänen aus, die die Identifizierung von Orthologen vereinfacht. Die funktionelle
Domäne des NANOS-Proteins ist eine spezielle Zink-Finger Struktur am C-Terminus
des Proteins, die sich klar von anderen Zink-Finger-Proteinen unterscheiden lässt
(Curtis et al., 1997). PUMILIO enthält eine spezielle RNA-bindende Domäne, für die
das Drosophila-Protein gemeinsam mit einem C. elegans-Homolog namensgebend
ist: die Puf-Domäne (Wickens et al., 2002). Diverse homologe Gene von nanos und
pumilio wurden in etlichen Arten untersucht, wobei nur in wenigen Studien auch
funktionelle Aspekte untersucht wurden.
Innerhalb der Insekten gibt es, abgesehen von einem Hinweis auf ubiquitäre Ex-
pression in der Heuschrecke Schistocerca americana (Lall et al., 2003), keinerlei mir
bekannte Studien zu pumilio-Orthologen. Die Expression von nanos-Orthologen
wurde aber in mehreren Arten untersucht. In Langkeiminsekten wie den Dipteren
(Curtis et al., 1995) oder auch den Hymenopteren Apis und Nasonia (Dearden, 2006;
Olesnicky und Desplan, 2007) scheint die posteriore Lokalisation maternaler nanos-
mRNA konserviert zu sein. Allerdings ist in den Moskitos Anopheles gambiae und
Culex quinquefasciatus auch eine transiente anteriore Lokalisierung von nanos-
mRNA, und in der Winterschwebfliege Episyrphus balteatus sogar eine zusätzliche
ubiquitäre Komponente nachweisbar (Goltsev et al., 2004; Juhn et al., 2008; Lemke
und Schmidt-Ott, 2009). In Episyrphus wurden auch die einzigen funktionellen Insek-
ten-Studien zu nanos außerhalb Drosophilas durchgeführt, die aber keinen Effekt

I. 1. Einleitung
des nanos-Verlusts auf die Segmentierung nachweisen konnten (Lemke und
Schmidt-Ott, 2009). In Schistocerca americana wird NANOS zygotisch an posteriorer
Position exprimiert (Lall et al., 2003), und im Seidenspinner Bombyx mori zeigen gar
vier nanos-Orthologe diverse unterschiedliche Expressionsmuster (Nakao et al.,
2008). In einigen Arten ist außerdem eine Expression in den Polzellen bzw. den
primordialen Keimzellen beschrieben: in den Dipteren (Curtis et al., 1995; Goltsev et
al., 2004; Juhn et al., 2008; Lemke und Schmidt-Ott, 2009), in Bombyx (Nakao et al.,
2008), Apis (Dearden, 2006), Schistocerca (Lall et al., 2003) oder Acyrtosiphon
(Chang et al., 2006; Chang et al., 2009). Das nanos-Gen ist also innerhalb der Insek-
ten konserviert, seine Expression unterliegt allerdings einigen Variationen, wobei
eine posteriore Expression und die Assoziation mit der Keimbahn konserviert zu sein
scheinen. Eine Konservierung der posterioren Musterbildungsfunktion lässt sich aus
diesen Daten allerdings nicht ableiten. Hierfür ist die Variabilität der Muster zu groß
und es fehlen funktionelle Studien um fundierte Aussagen machen zu können. In
Arthropoden außerhalb der Insekten sind meines Wissens weder nanos- noch pumi-
lio-Orthologe beschrieben.
nanos und pumilio außerhalb der Arthropoden
Dass beide Gene innerhalb des Tierreichs konserviert sind, und somit nicht erst
während der Evolution der Insekten entstanden, zeigen etliche Untersuchungen an
Arten außerhalb der Arthropoden. So finden sich pumilio-Homologe sogar in Saccha-
romyces cerevisiae, Dictyostelium und Trypanosoma cruzi (Souza et al., 1999;
Olivas und Parker, 2000; Hoek et al., 2002b; Saint-Georges et al., 2008; Droll et al.,
2010). Die Expression von nanos-Homologen in drei Cnidaria-Arten (Mochizuki et al.,
2000; Torras et al., 2004; Extavour et al., 2005; Torras und Gonzalez-Crespo, 2005)
ist ebenso wie in einigen Arten der Lophotrochozoa (Planaria: Dugesia japonica,
Schmidtea mediterranea (Salvetti et al., 2005; Sato et al., 2006; Handberg-Thorsager
und Salo, 2007; Wang et al., 2007); Annelida: Capitella sp. (Dill und Seaver, 2008),
Helobdella robusta (Pilon und Weisblat, 1997; Kang et al., 2002; Agee et al., 2006);
Mollusca: Illyanassa obsoleta (Rabinowitz et al., 2008), Haliotis asinina (Alexandrea
et al., 2010) mit der Keimbahn oder Keimbahnvorläuferzellen assoziiert, wobei häufig
zusätzliche Expressionsdomänen in somatischen Geweben und in Helobdella ro-
busta (Annelida, Agee et al., 2006) und Ilyanassa obsoleta (Mollusca, Rabinowitz et
al., 2008) sogar wichtige Funktionen für die Embryonalentwicklung beschrieben
wurden. Ein pumilio-Gen in Dugesia japonica spielt außerdem eine Rolle für den
35

I. 1. Einleitung
Erhalt der adulten Stammzellen, den Neoblasten (Salvetti et al., 2005). In C. elegans
gibt es mehrere pumilio- und nanos-Homologe, die ebenfalls sowohl in der Keimbahn
an Prozessen wie dem „hermaphroditic switch“ und dem Erhalt der primordialen
Keimzellen und Keimbahnstammzellen beteiligt sind, als auch Funktionen in somati-
schen Vorgängen erfüllen (Zhang et al., 1997; Kraemer et al., 1999; Subramaniam
und Seydoux, 1999; Crittenden et al., 2002; Walser et al., 2006; Nolde et al., 2007;
Kaye et al., 2009). Bei der Adaption von olfaktorischen Neuronen wurde für eines der
Puf-Domänen-Proteine (FBF-1) im Gegensatz zu den meisten anderen funktionellen
Zusammenhängen interessanterweise eine Rolle als translationaler Aktivator beo-
bachtet (Kaye et al., 2009). In Vertebraten sind die Funktionen bzw. Expressions-
muster von nanos- und pumilio-Homologen ebenfalls vor allem mit der Keimbahn in
beiden Geschlechtern und auch mit neuronalen Geweben assoziiert (Mosquera et
al., 1993; MacArthur et al., 1999; Koprunner et al., 2001; Nakahata et al., 2001;
Spassov und Jurecic, 2002; Jaruzelska et al., 2003; Moore et al., 2003; Tsuda et al.,
2003; Draper et al., 2007; Lee et al., 2008; Aoki et al., 2009; Kusz et al., 2009; Sada
et al., 2009). Hierbei ist als interessant zu erwähnen, dass die Regulation von Cyc-
linB, die in primordialen Keimzellen in Drosophila durch NOS und PUM vermittelt
wird (Kadyrova et al., 2007), in Xenopus für die Oozytenaktivierung wichtig zu sein
scheint (Nakahata et al., 2003; Pique et al., 2008), wobei hier ebenfalls die Beson-
derheit auftritt, dass PUMILIO, zumindest in bestimmten, artifiziellen Zusammenhän-
gen, auch aktivierenden Einfluss auf die Translation bestimmter mRNAs nehmen
kann (Pique et al., 2008).
36
Die Gene nanos und pumilio sind also evolutionär konserviert, wobei sich pumi-
lio-Homologe sogar in Protozoen, Hefen und Pflanzen finden (Olivas und Parker,
2000; Hoek et al., 2002a; Francischini und Quaggio, 2009) und vor allem in Arten mit
mehreren Paralogen für diverse RNA-Regulationsprozesse herangezogen wurden.
Die Untersuchung zahlreicher nanos-Homologen in Arten unterschiedlichster Tier-
gruppen und auch die weniger umfangreichen Studien zu pumilio-Homologen legen
nahe, dass eine Rolle für die Entwicklung der Keimbahn und ihrer Funktion von
Cnidariern bis hin zu Vertebraten konserviert ist und somit möglicherweise die ur-
sprüngliche Funktion von nanos und pumilio innerhalb des Tierreichs darstellt. Dabei
weisen funktionelle Studien aus Caenorhabditis elegans, Planarien, Zebrafisch und
Maus darauf hin, dass nanos-Homologe am Erhalt der primordialen und der späteren
Keimzellpopulationen beteiligt sind.

I. 1. Einleitung
Außerdem zeigen nanos-Homologe in einigen Arten maternale und im Verlauf
der Entwicklung weitere somatische Expressionsmuster, denen vereinzelt auch
wichtige Funktionen zugeordnet werden konnten (Agee et al., 2006; Rabinowitz et
al., 2008). Insgesamt scheinen diese somatischen Aspekte aber diverser und es
scheint fraglich, ob sie alle auf einen gemeinsamen Ursprung zurückzuführen sind
(Extavour et al., 2005). Die Beteiligung von nanos- und pumilio-Genen an neuronalen
Prozessen in C. elegans und Drosophila (Muraro et al., 2008; Kaye et al., 2009),
sowie die Expression in Gehirngewebe in Maus und Fisch (Haraguchi et al., 2003;
Aoki et al., 2009) lässt hingegen vermuten, dass hier ein konservierter Funktionszu-
sammenhang besteht, der durch weitere Arbeiten an Nicht-Modell-Organismen
untersucht werden sollte.
1.4.3. Der nanos-pumilio-Repressionskomplex
Neben den Arbeiten in Drosophila haben auch viele der Studien in anderen Sys-
temen dazu beigetragen die Funktionsweise von NANOS und PUMILIO zu verste-
hen. Sowohl NANOS als auch PUMILIO sind RNA-bindende Proteine, die zumindest
in Drosophila (Sonoda und Wharton, 1999), Caenorhabditis (Subramaniam und
Seydoux, 1999; Hansen et al., 2004) und Xenopus miteinander in einem Komplex
wirken (Nakahata et al., 2001). Dabei bindet NANOS mit seiner speziellen CCHC-
Zink-Finger-Domäne sequenzunabhängig an RNA und wirkt somit nur als Kofaktor
(Curtis et al., 1995; Curtis et al., 1997), der durch den sequenz-spezifisch bindenden
Partner PUMILIO rekrutiert wird (Sonoda und Wharton, 1999). Die RNA-Binde-
Domäne von PUMILIO besteht aus Puf-Wiederholungseinheiten, die in dieser Form
hoch-konserviert in pumilio-Homologen auftreten (Zamore et al., 1997; Wharton et
al., 1998; Edwards et al., 2001; Wickens et al., 2002). Die Kristalltruktur der Puf-
Domäne des humanen PUMILIO-1-Proteins zeigt, dass die einzelnen Einheiten der
Domäne dabei jeweils ein spezifisches Nukleotid einer „Core-Sequenz“ der Ziel-RNA
binden (Wang et al., 2002). Einige Nukleotide dieser „Core“-Sequenz sind ebenfalls
über Speziesgrenzen hinweg hochkonserviert (White et al., 2001; Bernstein et al.,
2005; Gerber et al., 2006). Die Spezifität einzelner Paraloge innerhalb einer Spezies
wird dabei beispielsweise durch benachbarte wesentliche Nukleotide, oder in die
„Core“-Sequenz eingeschobene Basen vermittelt (Cheong und Hall, 2006; Gupta et
al., 2008; Wang et al., 2009). Die Zielsequenz in den Drosophila hunchback-, bicoid-
oder Cyclin-B-mRNAs, das Nanos-Response-Element, besteht aus zwei sogenann-
37

I. 1. Einleitung
ten Boxen, A und B, die jeweils Varianten dieser „Core“-Sequenz darstellen (Wharton
und Struhl, 1991; Kadyrova et al., 2007). Diese werden wohl tatsächlich von zwei
PUMILIO-Proteinen, wahrscheinlich kooperativ, gebunden (Gupta et al., 2009). Im
Falle der Regulation der Drosophila hb-mRNA, nicht aber beispielsweise der Cyclin-
B-mRNA, kommt zu dem tripartiten Komplex aus Ziel-mRNA, PUMILIO und NANOS
noch ein weiteres Protein, BRAIN-TUMOR hinzu, das selbst keine RNA-Interaktion
eingeht (s. 2.7; Sonoda und Wharton, 2001).
38
Der an mRNA gebundene PUMILIO-Komplex reguliert die Proteinexpression auf
unterschiedliche Weise. So führt der NANOS/PUMILO-Komplex in Drosophila zur
Deadenylierung von hb- und bcd-mRNAs (Wharton und Struhl, 1991; Wreden et al.,
1997; Gamberi et al., 2002) und requiriert den Deadenylase-Komplex POP2/CCR4
zur Regulation von Cyclin-B (Kadyrova et al., 2007), eine Interaktion, die auch für ein
Saccharomyces-pum-Homolog beschrieben wurde (Goldstrohm et al., 2006;
Goldstrohm et al., 2007). Zusätzlich zu dieser PolyA-abhängigen Regulation, zeigen
andere Arbeiten, dass der PUMILIO-Komplex auch über Cap-abhängige Prozesse
auf die initiation der Translation wirkt (Chagnovich und Lehmann, 2001). So vermittelt
beispielsweise BRAT durch die Bindung an EHP eine Repression der Cap-
abhängigen Translationsinitiation an der hb-mRNA (Cho et al., 2006). Ähnliche
Prozesse sind für die Drosophila Oogenese (Verrotti und Wharton, 2000) sowie in
Saccharomyces (Deng et al., 2008) und Xenopus (Cao et al., 2010) beschrieben.

1.5. Ziele des ersten Kapitels der vorliegenden Arbeit
I. 1. Einleitung
Tribolium castaneum etabliert sich gegenwärtig zu einem wichtigen Insekten-
Modell-System der Entwicklungsbiologie. Viele Aspekte der frühen Embryogenese
und Segmentierung sind in den letzten Jahren untersucht worden und zeigten Ähn-
lichkeiten und Unterschiede zu der sehr gut untersuchten Entwicklung von Drosophi-
la auf. Besonders die frühen Prozesse der Embryonalentwicklung scheinen sich
dabei deutlich zu unterscheiden und sind in Tribolium noch wenig verstanden
(Tribolium Genome Sequencing Consortium, 2008).
Ziel dieser Arbeit war, die Tribolium-Orthologen der Drosophila-Gene nanos und
pumilio auf ihre Funktion in der frühen Tribolium-Embryonalentwicklung zu untersu-
chen und so einen Beitrag zur Aufklärung dieser Prozesse zu leisten. In Drosophila
sind NANOS und PUMILIO als Effektoren der Gruppe der maternalen posterioren
Gene für die Ausbildung abdominaler Segmente nötig (Nüsslein-Volhard et al.,
1987).
Im Vergleich mit der Situation in anderen Insektenarten wird die Aufklärung der
Funktion von nanos und pumilio in Tribolium dazu beitragen auch die Evolution der
frühen Insektenembryogenese besser zu verstehen (Peel et al., 2005; Fonseca et al.,
2009; Rosenberg et al., 2009). Besonders interessant ist dies im Zusammenhang mit
der Evolution der unterschiedlichen Entwicklungsmodi der Insekten, dem Kurz- und
dem Langkeim-Typus, für die Tribolium bzw. Drosophila beispielhafte Vertreter
darstellen (Krause, 1939).
Dabei stellt sich die Frage, ob nanos und pumilio auch bei der Kurzkeimembryo-
genese Triboliums eine Rolle für die posteriore Segementierung erfüllen. Mit dem
maternalen Faktor caudal und dem terminalen System sind bereits wesentliche
Einflüsse der posterioren Musterbildung bekannt und es ist zu klären, inwieweit
nanos und pumilio hierbei noch zusätzlich benötigt werden (Copf et al., 2004;
Schoppmeier und Schröder, 2005).
Darüber hinaus ist von Interesse, ob NANOS und PUMILIO in Tribolium durch
translationelle Repression maternaler Faktoren, wie z.B. HUNCHBACK oder
ORTHODENTICLE-1, auf die blastodermale Regionalisierung wirken. Wenn eine
solche zu Drosophila vergleichbare Funktion besteht, bleibt zu klären, ob bzw. wie
diese mit der postblastodermalen abdominalen Segmentierung in Tribolium in Zu-
sammenhang stehen könnte.
39

I. 1. Einleitung
40
Um diese Fragen zu klären, sollten durch die in Tribolium etablierten RNA-
Interferenz-Methoden die Effekte des Funktionsverlusts beider Gene analysiert
werden. Einflüsse auf die Expression verschiedener im Blastoderm aktiver Faktoren
und die Morphologie der schlupfreifen Larve sollten helfen, die Rolle von nanos und
pumilio innerhalb der frühen Musterbildung von Tribolium einzuordnen.

2. Ergebnisse
I. 2. Ergebnisse
2.1. Im Tribolium-Genom konnten eindeutige Orthologe zu nanos
und pumilio identifiziert werden
Die Identifizierung und molekularbiologische Bearbeitung von Kandidatengenen
in Tribolium hat sich durch die Sequenzierung des Genoms (Tribolium Genome
Sequencing Consortium, 2008) extrem vereinfacht. Während in nicht sequenzierten
Arten die putative Sequenz des jeweiligen Gens aus bekannten homologen Sequen-
zen deduziert werden muss und mit Hilfe eines möglichst breit angelegten Primer-
gemischs ein Fragment durch PCR amplifiziert wird, erlaubt ein sequenziertes Ge-
nom die „in silico“ Identifizierung der Sequenzen über Homologiesuchen (tBLASTx;
(Altschul et al., 1997) gefolgt von der Verwendung von genspezifischen Primern in
der PCR. Auf diese Art und Weise konnten auch die Tribolium-Orthologe der Dro-
sophila Gene nanos und pumilio identifiziert und „kloniert“ werden (s. 4.1).
2.1.1. Tribolium nanos
Das Tribolium-nanos-Gen (TC030446) liegt auf der zweiten Komplementati-
onsgruppe. Es wurde im Rahmen der automatischen Annotation des NCBI (National
Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) nicht erfasst, die
Integration mehrerer Genvorhersageprogramme am HGSC (Human Genome Se-
quencing Center, http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/) des Baylor College of Medicine zu
so genannten GLEAN Genmodellen hingegen erlaubte die automatische Annotierung
des größten Teils der nanos kodierenden Sequenz. Die Vorhersage dieses Genmo-
dells (GLEAN_01298) erkannte allerdings ein im richtigen Leserahmen liegendes
Intron nicht, wodurch 5’ der für nanos kodierenden Sequenz mehrere hundert Ba-
senpaaren (bp) fälschlicherweise als sinntragend annotiert wurden. Durch Rapid
Amplification of cDNA Ends (RACE) Experimente im Rahmen meiner Diplomarbeit
(Schmitt, 2005) konnte aber gezeigt werden, dass in vivo jenes kleine Intron (49 bp)
gespleißt wird. Erst dieser Vorgang bringt die Nukleotide des Startcodons (ATG) in
direkte Folge, während der fälschlich annotierte 5’ Bereich nun nicht mehr in einem
durchgängigen Leserahmen mit der kodierenden Sequenz liegt. Die Exongrenze liegt
also genau im nanos Startcodon (A - TG). Diese Besonderheit erschwerte, bzw.
verhinderte die korrekte automatische Annotierung. 3’ der kodierenden Sequenz
41

I. 2. Ergebnisse
konnten durch verschiedene PCR-Experimente unter Verwendung von cDNA als
Matrize noch 382 Nukleotide untranslatierte Sequenz in der mRNA identifiziert wer-
den, so dass nun 1081 Nukleotide der nanos-mRNA bekannt sind (s. Anhang). 453
bp kodieren für ein kleines putatives NANOS-Protein mit 149 Aminosäuren (AS)
Länge und einem Molekülgewicht von ca. 17,4 Kilodalton (kDa). Diese Größe ist
durchaus vergleichbar mit den Proteinen anderer Insektenarten, wie z.B. dem Ortho-
log der Heuschrecke Schistocerca americana mit 177 AS (AAO38523) oder Apis
meliferra (NP_001035321, 120 AS).
42
NANOS ist ein RNA-bindendes Protein, mit einer Zink-Finger-Domäne des
CCHC-Typs im C-terminalen Bereich (Curtis et al., 1995; Curtis et al., 1997; Arriza-
balaga und Lehmann, 1999). Sie liegt im Falle des Tribolium-Proteins zwischen den
Cysteinen 68 und 119. NANOS-Proteine sind über Speziesgrenzen relativ gering
konserviert (Abb. 6, Tab. 1; Curtis et al., 1995; Curtis et al., 1997) und somit wohl
verhältnismäßig schnell evolvierend. Innerhalb der aus zwei Zink-Fingern bestehen-
den funktionellen Domäne liegt die Sequenzidentität zwischen den Tribolium und
Drosophila-Proteinen bei 46% (Abb. 6, A). Auch hier ist die Größenordnung ähnlich
wie bei Vergleichen von NANOS-Proteinen anderer Insektenarten (Tab. 1). Die
charakteristische Struktur der Zink-Finger Domäne erlaubt jedoch eine eindeutige
Identifizierung der Orthologen. Die wesentlichen Aminosäuren der beiden Zink-
Finger sind bezüglich ihrer Identität und ihrer Lage zueinander innerhalb des gesam-
ten Tierreichs hoch konserviert (Abb. 6). Diese klar definierte Struktur ist auch durch
intensive Sequenzsuchen nach einzelnen Teilbereichen im Tribolium-Genom nur
einmal zu identifizieren, Tribolium besitzt also nur ein einziges nanos-Ortholog.
Für die RNAi-Experimente im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Fragment des na-
nos-Gens verwendet, das den Großteil der kodierenden Sequenz und 382 bp nicht
translatierte Sequenzen des 3’ Bereichs enthält (gesamt: 810 bp).

I. 2. Ergebnisse
Abb. 6: Sequenzvergleich der funktionellen Domänen von NANOS- und PUMILIO-
Proteinen unterschiedlicher Spezies
A Ein Sequenzvergleich der CCHC-Zink-Finger-Domänen von NANOS-Proteinen aus
unterschiedlichen Spezies zeigt die hohe Konservierung der charakteristischen funktionellen
Aminosäuren (*). Je drei Cysteine und ein Histidin komplexieren ein Zink Atom und bilden
wahrscheinlich zwei strukturelle Einheiten der RNA-Binde-Domäne (Curtis et al., 1997).
B Die PUM-puf-Domäne weist eine hohe Sequenzkonservierung innerhalb des Tierreichs
auf. Sie besteht aus acht Wiederholungseinheiten (puf-domain repeats), die je eine Base des
Nanos-Response-Element binden (Edwards et al., 2001; Wang et al., 2002). Die geschweifte
Klammer weist auf ein Tripeptid hin, dessen Insertion die Bindung der Vertebratenproteine
an Drosophila NANOS verhindert, und somit die Bedeutung des C-terminalen Bereichs für
die Ausbildung des ternären Komplex deutlich macht (Sonoda und Wharton, 1999).
Identische Aminosäuren in allen Spezies in rot, andere in blau.
Tc nos: Tribolium castaneum NANOS (TC030446), Dm nos: Drosophila melanogaster NANOS
(NP_476658), Sa nos: Schistocerca americana NANOS (AAO38523), Nv nos: Nasonia vitripennis
NANOS (NP_001128394), Hs nos1: Homo sapiens NANOS-1 (NP_955631), Hro nos: Helobdella
robusta NANOS (AAB63111), Nvect nos: Nematostella vectensis NANOS (AAW29070); Tc pum:
Tribolium castaneum PUMILO (TC005073), Dm pum: Drosophila melanogaster PUMILIO
(AAB59189), Sa pum: Schistocerca americana PUMILIO (AAO38522), Nv pum: Nasonia vitripennis
PUMILIO (predicted, XP_001607089), Xl pum1: Xenopus laevis PUMILIO-1 (NP_001081119), Hs
pum1: Homo sapiens PUMILIO-1 (AAG31807), Hym pum: Hydra magnipapillata PUMILIO (predicted,
XP_002162083)
43

I. 2. Ergebnisse
Tab. 1: Sequenzidentität unterschiedlicher nanos Zink-Finger
44
vs.
Schistocerca
NOS
Nasonia NOS Tribolium NOS
Drosophila NOS 48 % 57 % 46 %
Tribolium NOS 42 % 44%
Nasonia NOS 60 %
Gezeigt ist der Anteil identischer Aminosäuren der Zink-Finger-Domänen je
zweier NANOS-Proteine im Vergleich.
2.1.2. Tribolium pumilio
Auch ein pumilio-Ortholog konnte eindeutig im Tribolium-Genom identifiziert wer-
den (TC005073). Dieses Gen liegt in einem Bereich, der während der bioinformati-
schen Aufbereitung der Sequenzdaten des Genomsequenzierungsprojekts nicht
eindeutig einer Komplementationsgruppe zugeordnet werden konnte. Allerdings liegt
das gesamte Gen innerhalb eines so genannten Contigs, wird also nicht durch Lü-
cken in der Genomsequenz unterbrochen. Sowohl die automatische Annotierung des
NCBI als auch die des HGSC postulieren Genmodelle für pumilio, welche sich aller-
dings hinsichtlich der 5’ liegenden Exons und des Translationsstarts unterscheiden.
Die von NCBI vorhergesagte kodierende Region beginnt innerhalb des fünften
GLEAN-Introns mit einem ATG 33 bp 5’ des sechsten GLEAN-Exons. Das GLEAN
Modell (GLEAN_05073) ist somit um 5 Exons, genauer gesagt 1026 bp bzw. 342 AS,
länger als die NCBI Annotation (XP_967865) und wird durch Sequenzvergleiche mit
PUMILIO-Proteinen anderer Spezies etwas besser unterstützt (nicht gezeigt). Für
diese Arbeit sind die Diskrepanzen aber unerheblich, da für sämtliche Experimente
ein Gen-Fragment verwendet wurde, das für den bestkonservierten Bereich des
Proteins, die von den Unterschieden unberührte Puf-Domäne, kodiert (Gabbrielli,
1957; Zamore et al., 1997; Edwards et al., 2001; Wang et al., 2001). Die 887 bp
dieses Fragments liegen innerhalb der Exons 11 bis 14. Das GLEAN Modell postu-
liert für das pumilio-Gen 14 kodierende Exons, die in ein Protein mit einem Moleku-
largewicht von angenommenen 120,9 kDa translatiert werden. Die hoch konservierte
Puf-Domäne besteht aus acht sich wiederholenden Einheiten und liegt am C-
terminus zwischen His764 und Lys1047. Die Aminosäureidentität zwischen Tribolium
und Drosophila in diesem Bereich liegt bei 87%, und auch die Ähnlichkeit zu Ortho-
logen phylogenetisch weiter entfernterer Spezies ist sehr hoch (Abb. 6 B). Die Puf-

I. 2. Ergebnisse
Domäne vermittelt die Bindung an das NRE („nanos response element“) in den Ziel-
mRNAs sowie die Bildung des aktiven ternären Repressionskomplexes. Hierfür ist
vor allem der C-terminale Bereich wesentlich, wo eine Insertion von drei AS, die im
Laufe der Evolution in den Vertebraten PUMILIO-Proteinen entstand, die Bildung des
Komplexes mit NANOS und RNA verhindert (Sonoda und Wharton, 1999). Auch für
pumilio ist klar, dass das Tribolium-Genom kein weiteres Gen mit deutlicher Ähnlich-
keit zu anderen pumilio-Genen enthält und somit als einziges Ortholog anzusehen
ist.
2.2. nanos und pumilio werden maternal und zygotisch exprimiert
2.2.1. Die Expression des Tribolium pumilio-Orthologs
Wie schon in meiner Diplomarbeit beschrieben (Schmitt, 2005) ist die Expression
von pumilio im Wesentlichen zwischen Tribolium und Drosophila konserviert (Abb. 7).
Schon während der Oogenese wird pumilio-RNA in der Oozyte deponiert, die wahr-
scheinlich vor allem von den Nährzellen synthetisiert wurde (Abb. 7, A). Innerhalb
des abgelegten Eis und der frühen Embryonalstadien ist die pumilio-RNA ubiquitär
verteilt (Abb. 7, B, C). Dies ist vergleichbar der Situation bei Drosophila (Barker et al.,
1992; Macdonald, 1992), allerdings wird dort das pumilio-Transkript auch posterior
im Polplasma angereichert. Ein solches Polplasma konnte bisher in Tribolium nicht
identifiziert werden, was das Fehlen einer höheren Konzentration im posterioren
Bereich des Eis erklären könnte. Die einzige lokale Anreicherung lässt sich in einem
Areal um den maternalen Vorkern beobachten (Abb. 7, B, C, Pfeil). Dieser Bereich
entspricht dem Ooplasma (Grünfelder, 1998), dem um den Oozytenkern konzentrier-
ten Cytoplasma der Eizelle. Dort sind offenbar auch mRNAs in höherer Konzentrati-
on vorhanden als im restlichen, überwiegend von Dotter gefüllten Teil des Eis, was
somit also zu einer unspezifischen Lokalisierung vieler maternaler RNAs führt. Ein
ähnlicher Effekt kann auch für die maternalen RNAs für giant und eagle beobachtet
werden (Schmitt-Engel, unveröffentlicht; (Bucher et al., 2005).
Erst im Zuge der Differenzierung des Blastoderms konzentriert sich die pumilio-
Expression in der embryonalen Anlage, wobei die Expression innerhalb der Sero-
saanlage zurückgeht (Abb. 7, D, E). Im wachsenden und voll gestreckten Keimstreif
wird die Expression in allen embryonalen Geweben aufrechterhalten und in den
Anlagen der segmentalen Extremitäten verstärkt (Abb. 7, F).
45

I. 2. Ergebnisse
Abb. 7: Expression des Tribolium pumilio-Gens
A, B, D, F Nachweis von pumilio-mRNA durch in-situ-Hybridisierung (rot in A und A’).
C,E Nukleäre Färbung mit Hoechst 33342. Grün in A und A’: Immunfluoreszenz gegen
Alpha-Tubulin.
A Im Ovar ist das pumilio Transkript in Oozyten, in den Nährzellen und im Follikelepithel
nachweisbar. Einzig die jüngsten ca. 3 Zellreihen der aus dem präfollikulären Gewebe
hervorgehenden, sich differenzierenden Follikelzellen sind frei von pumilio-Expression
(Linien in A’). Gezeigt ist eine einzelne Ovariole. Je fünf bis sechs Ovariolen bilden eine
Hälfte des paarig aufgebauten Ovars. Nährzellen im Tropharium (T) produzieren RNAs und
verschiedene Proteine für die die wachsenden Oozyten (*), die von somatischen Follikelzellen
(FE) umgeben sind (Büning, 1998; Trauner und Büning, 2007). Die Abbildung F wurde
freundlicherweise von Daniel Bäumer zur Verfügung gestellt.
In sehr frühen Stadien (B) ist pumilio RNA innerhalb des gesamten Embryos nachweisbar
und im Bereich um den maternalen Vorkern angereichert (siehe Text). Im differenzierten
Blastoderm (laterale Ansicht, D) nimmt das Expressionsniveau in der Serosa ab, in voll
gestreckten Keimstreifen (ventrale Ansicht, F) erhöht es sich in den Anlagen der segmentalen
Körperanhänge.
In allen Abbildungen ist anterior links.
pum: pumilio-in-situ-Hybridisierung, S: Serosa, E: Embryoanlage, Md: Mandibuläre Segmentanlage,
Mx: Maxilläre Segmentanlage, Lb: Labiale Segmentanlage, T1: erstes thorakales Segment, A“X“: xtes
abdominales Segment
46

2.2.2. nanos-Expression ist nur in vitro nachweisbar
I. 2. Ergebnisse
Trotz intensiver Bemühungen konnte ich nanos-mRNA-Expression nicht durch
das standardmäßige in situ-Hybridisierungs-Protokoll nachweisen. Auch unterschied-
lichste Variationen der Methode, wie die Verwendung unterschiedlicher Genfragmen-
te als Matrize für die Sondensynthese, hydrolytisch fragmentierte Sonden, stärke-
re/schwächere Fixierungen, Amplifikationsschritte und unterschiedliche Detektions-
methoden führten zu keinem spezifischen Nachweis (vgl. 4.2). Der Vergleich mit
Embryonen, die nicht mit Sonde behandelt, oder mit der sense-Sonde inkubiert
wurden zeigt, dass eine sehr spät einsetzende Färbung in Dotter und embryonalen
Geweben als unspezifische Hintergrungfärbung zu werten ist (nicht gezeigt). Das
Vorhandensein schwacher, ubiquitärer Expression auf dem Niveau des Hintergrund-
signals kann allerdings nicht vollständig ausgeschlossen werden. Ein Polyklonales
Kaninchenserum gegen zwei Peptide des Tribolium NANOS-Proteins (produziert von
der Firma Eurogentec, Köln, Deutschland/Seraing, Belgien) waren nach umfangrei-
chen Tests ebenfalls nicht geeignet, um die Expression von NANOS-Protein in situ
oder auch im Western-Blot zu detektieren. Im Gegensatz zu diesen Methoden war es
allerdings möglich, die Expression von nanos-mRNA in vitro nachzuweisen (Abb. 8).
Durch eine RT-PCR Strategie mit exonischen Primern und verschiedenen cDNAs als
Matritzen (vgl. 4.2.3) konnte ich zeigen, dass nanos über alle getesteten Entwick-
lungsstadien hinweg exprimiert wird. Der Nachweis in unbefruchteten Eiern (Abb. 8,
B, Ansatz 1) zeigt das Vorhandensein maternaler RNA in den Oozyten. Während der
ersten 30 Stunden der Embryonalentwicklung bleibt nanos dann durchgehend kon-
stant exprimiert (Abb. 8, A). Auch in späteren Entwicklungsstadien, also sowohl in
larvalen, pupalen und adulten Tieren, ist mRNA-Expression nachweisbar (Abb. 8, B).
Dies könnte sowohl mit einer Funktion für die Entwicklung und Funktion der Gona-
den, als auch mit einer Rolle für die Entwicklung und Aktivität peripherer Neuronen in
Zusammenhang stehen. Beide Funktionszusammenhänge sind bei Drosophila
bekannt (siehe Einleitung; Kobayashi et al., 1996; Forbes und Lehmann, 1998;
Schweers et al., 2002; Dubnau et al., 2003; Wang und Lin, 2004; Ye et al., 2004).
Eine Quantifizierung der vorhandenen mRNA erlaubt diese Methode allerdings nicht.
Stärkere Signale können zwar ein Hinweis auf eine erhöhte Expression sein, könnten
aber auch auf Schwankungen der Templatequalität zurückzuführen sein.
Obwohl das Vorhandensein der nanos-mRNA in vitro zweifelsfrei gezeigt werden
konnte, war es nicht möglich die räumliche Verteilung in whole mount Färbungen
47

I. 2. Ergebnisse
darzustellen. Möglicherweise unterschreitet das embryonale Expressionsniveau von
Tribolium nanos die Detektionsschwelle der whole-mount in-situ-Hybridisierung.
Abschließend bleibt also unklar, ob die nanos-Aktivität auch in Tribolium durch eine
posteriore Lokalisierung der RNA-Expression räumlich begrenzt wird.
Abb. 8: nanos ist in allen getesteten Entwicklungsstadien exprimiert
UV-Transilluminationsaufnahme der gelelektrophoretisch aufgetrennten Produkte mehrerer
RT-PCRs. Die Ergebnisse für ein Fragment des nanos Gens und eines des ribosomalen
Proteins 49 (Konopova und Jindra, 2007) als Positiv-Kontrolle und Referenzwert sind gezeigt.
A In embryonalen Stadien von 0-30 Stunden Entwicklungsalter bei ca. 30 °C ist nanos
durchgehend exprimiert. Die stärkere Amplifikation in dem 0-30 h Ansatz ist möglicherweise
auf Qualitätsschwankungen der Ausgangs RNA zurückzuführen.
B Auch in nicht befruchteten Eiern von unbegatteten Weibchen, sowie Larven verschiedenen
Alters, männlichen und weiblichen Puppen und männlichen und weiblichen Adulten lässt sich
nanos RNA nachweisen.
C Kontrollen zeigen, dass keinerlei Verunreinigungen durch genomische DNA auftraten.
Sowohl ohne RNA Matrize als auch ohne Reverse Transkriptase kann keine Amplifikation
erfolgen, was zeigt, dass weder die Reaktionsreagenzien noch die Ausgangs-RNA verunreinigt
sind. Die forward-Primer beider Fragmente liegen auf einer Exon-Grenze, was effektiv
die Amplifikation von genomischer DNA verhindert, während Primer innerhalb der Exons
problemlos ein genomisches nanos Fragment liefern.
48

I. 2. Ergebnisse
2.3. pRNAi für nanos und pumilio führt zu Veränderungen der
larvalen Morphologie
Für funktionelle Studien in Tribolium steht die ausgeprägte systemische RNA-
Interferenz-Antwort als sehr effektives Werkzeug zur Verfügung (Brown et al., 1999b;
Bucher et al., 2002; Tomoyasu und Denell, 2004; Arakane et al., 2008). Ein für die
Praxis wesentlicher Vorteil der systemischen RNAi ist die Möglichkeit der parentalen
RNAi, bei der weibliche Puppen mit doppelsträngiger RNA (dsRNA) injiziert werden
(pRNAi). Der RNAi-„knock-down“-Effekt wird so auch in deren Nachkommen indu-
ziert und erlaubt die Untersuchung der Auswirkungen auf die embryonale Musterbil-
dung. Diese Nachkommen werde ich zur Vereinfachung im Folgenden RNAi-Larven
oder -Embryonen nennen. Die parentale RNAi wurde hier genutzt, um die Expressi-
onsniveaus der nanos und/oder pumilio-mRNAs während der Embryonalentwicklung
zu reduzieren und aus den daraus resultierenden Defekten auf ihre Funktion zu
schließen. Diese Defekte lassen sich in den meisten Fällen gut anhand der Morpho-
logie der schlupfreifen Larve analysieren. Die Kutikula der schlupfreifen Larve (Abb.
9, A) spiegelt die Morphologie des Tieres exakt wieder und erlaubt die Differenzie-
rung vieler einzelner Körperbereiche. Deutlich zu erkennen ist die Gliederung in Kopf
(Caput), den Thorax mit seinen drei Beinpaaren und das Abdomen. Am Kopf lassen
sich die Mundwerkzeuge und andere Kopfanhänge gut erkennen. Auf die anteriorste
Struktur, das Labrum, folgen die paarigen Antennen, Mandibeln und Maxillen, sowie
das sekundär fusionierte Labium, das den Präoralraum um die Mundöffnung nach
ventral abschließt (Abb. 10, A). Der Prothorax ist etwas länger als die beiden ande-
ren thorakalen Segmente, und der Mesothorax trägt ein laterales Paar Stigmen (Abb.
9, A). Die abdominalen Segmente 1 bis 8 tragen je ein Paar laterale Stigmen und
sind kaum voneinander zu unterscheiden. Die beiden letzten abdominalen Segmente
(9 und 10) fusionieren mit dem Telson und bilden eine terminale Struktur mit dorsa-
len, vom neunten Abdominalsegment abgeleiteten, Urogomphi und ventral liegenden
Nachschiebebeinchen, den Pygopodien, die als Anhänge des zehnten Abdominal-
segments gelten (Abb. 9, A; Sokoloff, 1972).
49

I. 2. Ergebnisse
2.3.1. Defekte nach nanos pRNAi
50
Zur Erzeugung nanos-pezifischer „knock-down“-Phänotypen wurde dsRNA eines
810 bp-Fragments, das den Großteil der kodierenden Sequenz und Teile des 3’
UTRs enthält, in weibliche Puppen injiziert.
Die Reduktion des nanos-mRNA-Niveaus während der Embryogenese führt zu
zweierlei Defekten. Am offensichtlichsten ist eine deutliche Verkürzung der schlupf-
reifen Larven, verursacht durch eine Reduktion der abdominalen Segmente (Abb. 9,
B). Die abdominalen Segmente sind anhand der Morphologie der Kutikula gut zu
erkennen (Abb. 9, A). In den meisten Fällen verbleiben fünf oder sechs von diesen
Abdominalsegmenten, seltener sind drei oder 4 verbliebene Segmente erkennbar (s.
Anhang, Abb. 41, Tab. 12). Meist sind die noch vorhandenen Segmente allerdings
deutlich gestört. So treten beispielsweise teilweise Segmentfusionen mit Verände-
rungen des Setae-Musters auf (Abb. 9, B). Auch schwächere Phänotypen mit sieben
oder acht verbliebenen Abdominalsegmenten treten auf (nicht gezeigt, Anhang, Abb.
41, Tab. 12). Die terminalen Strukturen (Urogomphi, Pygopodien, Abb. 9, A) sind in
der Regel vorhanden, aber häufig nicht deutlich zu erkennen. Mit dem Großteil der
abdominalen Segmente scheinen also die meisten aus der posterioren Wachstums-
zone gebildeten Segmente (Schröder et al., 2008).
Zusätzlich zu diesen abdominalen, also posterioren Defekten, treten überra-
schenderweise auch Veränderungen in anterioren Segmenten auf. Hierbei sind
Deletionen und Transformationen der Kopfsegmente (Abb. 10, B; Anhang, Tab. 11)
zu beobachten. Am häufigsten treten Transformationen der Labialpalpen zu thoraka-
ler Identität auf. Dies zeigt sich in schwächerer Ausprägung im Vorhandensein einer
distalen Klaue an den Labialpalpen, kann aber auch zur Ausbildung nahezu vollstän-
diger Beine führen (Abb. 10, B). Ferner gibt es Deletionen von antennalen und man-
dibulären Extremitäten, die auf den teilweisen oder vollständigen Verlust der zugehö-
rigen Segmente hindeuten. Die Deletionen erscheinen hier als der seltenere, stärke-
re Effekt, wobei intermediäre Phänotypen beide Aspekte zeigen.
Das Auftreten von phänotypischen Veränderungen nach nanos-RNAi ist nicht
hoch penetrant, allein 45% der sich entwickelnden Larven zeigen keine Defekte
(Abb. 11, Tab. 10). Kopfdefekte sind weniger häufig als die Reduktion von abdomina-
len Segmenten, so dass oft abdominale Deletionen ohne Kopfdefekte, aber sehr
selten Kopfdefekte ohne abdominale Reduktion auftreten (Tab. 10). Das bedeutet

I. 2. Ergebnisse
einerseits, dass die Bildung von abdominalen Segmenten sensitiver auf die Redukti-
on des nanos-Expressionsniveaus reagiert und andererseits, dass die Kombination
beider Effekte den stärkeren Phänotyp darstellt.
Abb. 9: Pupale RNAi gegen nanos und pumilio führt zu einer Reduktion larvaler Seg-
mente
Epifluoreszenzaufnahmen der Kutikulas schlupfreifer Larven aus lateraler Sicht.
A Wildtyplarve. Kopf, drei thorakale Segmente mit Beinen, acht abdominale und der Terminus
mit Urogomphi und Pygopodien sind gut zu erkennen.
B nos-RNAi-Larve. Das Abdomen ist deutlich verkürzt, nur ein Abdominalsegment ist normal
gebildet. Es folgen zwei bis drei irreguläre Segmente, die ventral miteinander fusionieren und
dorsal Veränderungen des Setae-Musters aufweisen (weiße Linie). Eine partielle Transformation
der Labialpalpen zu thorakaler Identität ist an der distalen Klaue erkennbar (Pfeilspitze).
C pum-RNAi-Larve. Drei Abdominalsegmente sind normal ausgebildet, es folgen zwei
deformierte Segmente, der Terminus ist vorhanden (Pfeil). Die Beine sind verkürzt und
unförmig (Pfeilspitze). Der Kopf ist verkleinert.
D nos/pum-RNAi-Larve. Zwei normal ausgebildetete Abdominalsegmente gefolgt von zwei
bis drei deformierten, abdominalen Segmenten. Der Kopf ist deutlich verkleinert.
Anterior ist in allen Abbildungen links, der Größenstandard zeigt 100 !m.
T1: erstes thorakales Segment, A“X“: x-tes abdominales Segment, Ur: Urogomphi, Py: Pygopodien.
51

I. 2. Ergebnisse
2.3.2. Defekte nach pumilio pRNAi
52
Zur Analyse der pumilio-Funktion wurde dsRNA eines 887 bp Fragments, das die
konservierte Puf-Domäne überspannt, in weibliche Puppen injiziert und deren Nach-
kommen analysiert.
Die durch pum-RNAi hervorgerufenen Defekte (Abb. 9) sind den nanos Phänoty-
pen im Wesentlichen identisch. Wiederum ist der auffälligste Effekt eine Reduktion
der abdominalen Segmente auf vier bis sieben (s. Anhang, Abb. 41, Tab. 12), die in
aller Regel unterschiedliche Defekte aufweisen, wie sie schon oben für nanos be-
schrieben wurden. Auch nach pumilio-RNAi finden sich Veränderungen der Kopf-
segmente (Abb. 10, C). Es treten ebenfalls Transformationen auf, wobei hier die
Mandibeln von unvollständigen Transformationen betroffen sind. Diese werden zu
einer anderen gnathalen Identität transformiert, was durch das Auftreten von Arealen
sensorischer Organe auf der Mandibel deutlich wird (Abb. 10, C). Solche Areale
finden sich normalerweise an den distalen Enden der Palpen von maxillären oder
auch labialen Segmenten. Zusätzlich zu diesen Effekten zeigen pum-RNAi Larven
auch Verkürzungen aller segmentalen Extremitäten (Abb. 9, Pfeilspitze in C; Abb.
22). Auf diesen pumilio-spezifischen Phänotyp werde ich später nochmals zurück-
kommen (s. 2.8.3). Erwähnt sei allerdings, dass sich die Ausbildung der segmentalen
Gliedmaßen, ebenso wie die Bildung der abdominalen Segmente, sehr sensitiv
gegenüber dem RNAi-Effekt zeigt. Beide Effekte treten gemeinsam, also mit gleicher
Häufigkeit auf (nicht gezeigt). Im Falle der pumilio-RNAi bedeutet das: im weitaus
größten Teil der Nachkommen (81,5 %, s. Anhang Tab. 10). Auch nach pum-RNAi
wird klar, dass Kopfsegmente weniger häufig betroffen sind und somit eine Kombina-
tion aus Kopf- und abdominalen Defekten den stärksten Phänotyp darstellt.
Die nahezu identischen Effekte nach nanos- oder pumilio-RNA-Interferenz legen
nahe, dass beide Proteine wie in Drosophila auch in Tribolium in einem Komplex
wirken. Die Penetranz beider RNAi-Phänotypen differiert allerdings. Während pumi-
lio-RNAi bei 81,5 % der entwickelten Larven zu Defekten führt, ist das nach nanos-
RNAi nur bei 51,4 % der Fall (s. Anhang, Tab. 10). pumilio-RNAi scheint also effekti-
ver zu spezifischen Phänotypen zu führen als nanos-RNAi. In beiden Experimenen
zeigt sich außerdem, dass abdominale Defekte deutlich häufiger sind als das Auftre-
ten gnathaler Veränderungen. Die Bildung abdominaler Segmente reagiert demnach
sensitiver auf die Reduktion der mRNA-Niveaus beider Gene als die Musterbildung

I. 2. Ergebnisse
des Kopfes. Außerdem reagiert sie empfindlicher auf den Abbau der pumilio- als auf
den der nanos-mRNA. Begleitet wird dieser Befund von der Tatsache, dass nur
dsRNA des längsten nos-Fragments zu Defekten führte (s. 4.1).
Bekanntermaßen führt RNAi gegen verschiedene Gene nicht in allen Fällen mit
gleicher Effizienz zu Funktionsverlustphänotypen (Kennerdell und Carthew, 1998).
Diese Effektivitäts-unterschiede könnten auf unterschiedliche Ursachen zurückzufüh-
ren sein. Einerseits ist denkbar, dass die RNAi-Maschinerie (Meister und Tuschl,
2004) für verschiedene dsRNAs bzw. mRNAs nicht gleich effizient arbeitet und somit
das mRNA-Niveau unterschiedlich stark gesenkt wird. Zellkulturstudien an humanen
Zellen zeigen, dass schon verschiedene siRNAs gegen die gleiche mRNA sehr
unterschiedliche Effekte auf das mRNA-Niveau haben können (Holen et al., 2002).
Die Autoren spekulieren, dass mRNA-bindende Proteine eine Ursache dieser Positi-
onseffekte sein könnten. In Drosophila wird die nanos-mRNA lokalisiert und translati-
onell reguliert, was durch postulierte und teilweise untersuchte RNA-bindenden
Faktoren vermittelt wird (Wharton und Struhl, 1989; Bergsten und Gavis, 1999;
Bergsten et al., 2001; Zaessinger et al., 2006; Jain und Gavis, 2008). Möglicherweise
hemmt die Bindung solcher Faktoren die RNA-Interferenz in Tribolium. Andererseits
sind unterschiedliche Prozesse sicherlich nicht gleich empfindlich gegenüber der
Reduktion der einen oder anderen mRNA auf ein bestimmtes Niveau. Das bedeutet,
dass die Schwellenwerte für die Ausprägung unterschiedlicher Phänotypen differie-
ren, und von dem jeweiligen Gen und dem betroffenen Gewebe abhängen. Dies
könnte auch der Grund für die Unterschiede in der Ausprägung der anterioren Defek-
te in den RNAi-Experimenten sein.
Die unterschiedliche Penetranz der Effekte insgesamt, sowie der Kopf- und der
abdominalen Defekte legt nahe, dass durch die RNAi-Experimente kein vollständiger
„knock-down“ erreicht wird. Um dies zu erreichen wurde versucht, den vollständigen
Funktionsverlust durch gleichzeitige Inhibierung beider Genprodukte zu erreichen.
53

I. 2. Ergebnisse
Abb. 10: nanos- und pumilio-RNAi führen auch zu Kopfdefekten
Epifluoreszenzaufnahmen der Kopfkutikulas schlupfreifer Larven aus ventraler oder anteroventraler
Sicht.
A Wildtyp. Die paarigen Antennen, Mandibeln und Maxillen, die fusionierten Labialpalpen
und das Labrum sind deutlich zu erkennen.
B nos RNAi Larve. Eine Antenne ist deletiert, die Labialpalpen sind zu beinähnlichen Anhängen
transformiert (Pfeil)
C pum RNAi Larve. Die Mandibeln sind teilweise zu einer anderen gnathalen Identität transformiert,
erkennbar an einem sensorischen Feld ähnlich dem distalen Ende der Maxille
(Pfeil). Sämtliche Kopfanhänge sind verkürzt.
D nos/pum RNAi Larve. Antennen und Mandibeln sind deletiert, die Labialpalpen sind nicht
fusioniert und zu thorakalem Chrakter transformiert, erkennbar an dem Vorhandensein einer
kleinen distalen Klaue am Labialpalpus (Pfeil).
Anterior ist in allen Abbildungen oben.
Lr: Labrum/labrale Segmentanlage, Ant: Antenne/antennale Anlage, Oc: Okulare Segmentanlage, Md:
Mandibel/mandibuläre Segmentanlage, Mx: Maxille/maxilläre Segmentanlage, Lb: Labium/labiale
Segmentanlage, T: thorakale Identität
2.3.3. nanos/pumilio-Doppel-RNAi führt zu stärkeren Phänotypen
54
Auch in den Nachkommen von Tieren, denen dsRNAs komplementär zu nos und
pum injiziert wurden, finden sich sowohl abdominale Defekte als auch Veränderun-
gen der Kopfsegmente (Abb. 9, Abb. 10). Insofern gleichen sie den Larven in Einzel-
RNAi-Experimenten. Allerdings wird schnell deutlich, dass die beobachteten Phäno-
typen insgesamt stärker und höher penetrant sind (Abb. 11, Abb. 12; s. Anhang Tab.
10, Tab. 11). Das bedeutet, dass Larven, die Segmentierungsabbrüche in Kombina-
tion mit Kopfdefekten zeigen, deutlich häufiger auftreten, als in der Einzel-RNAi.
Während die ohnehin sensitivere Bildung der abdominalen Segmente auch in der

I. 2. Ergebnisse
Doppel-RNAi in vergleichbarem Maße gestört ist (Abb. 9, D), treten die Deletionen
von Kopfanhängen deutlich häufiger auf. Insgesamt zeigen 80% aller entwickelten
Larven den starken Phänotyp, also die Kombination von anterioren und posterioren
Defekten (Abb. 11; s. Anhang Tab. 10). Auch die beobachteten Kopfphänotypen sind
dramatischer. So treten hier bei 60 % aller entwickelten Larven Deletionen der an-
tennalen und mandibulären Segmente auf (Abb. 10, D, Abb. 12; s. Anhang Tab. 11),
d.h. sie zeigen den stärksten in der Einzel-RNAi beobachtbaren Defekt. Somit kann
davon ausgegangen werden, dass nanos/pumilio Doppel-RNAi dem vollständigen
Funktionsverlust von nanos und pumilio näher kommen als die Einzel-RNAi-
Experimente.
Abb. 11: Verteilung der phänotypischen Klassen nach nanos- und pumilio-RNAi
Experimenten
Gezählt wurden entwickelte Larven - zu Grunde liegende Zahlen finden sich in Tab. 10.
Schwache Phänotypen: Larven mit reduzierter Zahl an Abdominalsegmenten, oder Veränderungen
der Mundwerkzeuge. Starke Phänotypen: Larven mit anterioren und posterioren
Defekten. Unspezifische Phänotypen: Hintergrund von in unbehandelten Tieren auftretenden
Defekten, Unklar: Larven die wegen Präparationsartefakten nicht auswertbar waren. Als
Kontrolle wurde dsRNA komplementär zur mRNA eines fluoreszenten Proteins einer Koralle
(Discosoma sp., DsRed, Clontech) in vergleichbarer Konzentration verwendet.
55

I. 2. Ergebnisse
Abb. 12: Verteilung der anterioren Defekte nach nanos/pumilio-RNAi
Gezählt wurden alle Larven, die phänotypische Veränderungen aufwiesen. Transformationen
bedeuten im Falle von nos-RNAi meist Transformationen labialer Palpen zu beinähnlichen
Strukturen, bei pum- und nos/pum-RNAi in der Regel Transformationen von Mandibeln hin
zum Charakter anderer gnathaler Anhänge, vermutlich der Maxille. Bei Deletionen sind in
aller Regel Antennen oder Mandibeln betroffen. Nicht in allen Fällen sind beide Anhänge
eines Segments betroffen.
56
Injektionen in adulte Käfer, sowie pum-dsRNA Injektionen in präblastodermalen
Embryonalstadien ergaben keine deutlich abweichenden, stärkeren oder höher
penetranten Effekte (nicht gezeigt). Adulte Doppel-RNAi führte zu höherer Legeleis-
tung als pupale Injektionen, aber zu schwächeren Phänotypen. Auch eine Kombina-
tion aus pupaler nanos- und adulter pumilio-Injektion führte nicht zu den stärksten
Effekten.
Die Reduktion des Expressionsniveaus von nanos und pumilio führt also sowohl
zu posterioren als auch zu anterioren Defekten. Dies ist überraschend, da beide
bisher als Gene der posterioren Gruppe beschrieben wurden (siehe Einleitung; (St
Johnston und Nüsslein-Volhard, 1992). In Drosophila ist diese posteriore Funktion
außerdem auf sehr frühe Prozesse der Embryonalentwicklung zurückzuführen. Um
zu untersuchen, ob dies für die Effekte der hier beschriebenen RNAi-Experimente
ebenso gilt, ist die Analyse embryonaler Stadien notwendig.

I. 2. Ergebnisse
2.4. Frühembryonale Defekte führen zu einem vorzeitigen Ab-
bruch der Segmentierung in nanos/pumilio-RNAi-Embryonen
Die bereits erläuterten morphologischen Defekte der larvalen Kutikula nach na-
nos- und pumilio-RNAi könnten auf zwei unterschiedliche Arten während der Embry-
onalentwicklung hervorgerufen werden. Entweder sie sind das Produkt von Fehlern
während der Segmentbildung, also im Laufe der embryonalen Musterbildung, oder
sie entstehen in der Folge irregulärer Prozesse während der nachfolgenden Gewe-
bedifferenzierung. Zwischen diesen Alternativen kann durch die morphologische
Analyse embryonaler Stadien unterschiedlichen Alters, bzw. durch die Anwendung
molekularer Marker mit informativen Expressionsmustern unterschieden werden.
2.4.1. Die Segmentbildung aus der Wachstumszone ist gestört
Zur Analyse der frühen Segmentbildung eignet sich die Expression des Segment-
Polaritäts-Gens wingless. Das Expressionsmuster von wingless scheint innerhalb der
Insekten hoch konserviert zu sein (Peel et al., 2005). In Drosophila bilden die anein-
ander angrenzenden Domänen von wingless und engrailed Kompartmentsgrenzen,
sie definieren die Parasegmente (Martinez-Arias et al., 1988). In Tribolium wird wg
zunächst in zwei okularen und einer posterioren Domäne im Blastoderm exprimiert
(Nagy und Carroll, 1994). Im Laufe der Keimstreifstreckung werden paarige segmen-
tale Streifen in antero-posteriorer Progression gebildet und ebenfalls paarige Domä-
nen in unterschiedlichen Bereichen des anterioren Kopfes angelegt. Die bereits im
Blastoderm sichtbare posteriore Domäne in der Wachstumszone wird aufrechterhal-
ten und die endet schließlich in der Proktodeumsanlage (Abb. 13, A; Nagy und
Carroll, 1994). Die segmentalen Streifen bleiben auch während der weiteren Diffe-
renzierung des Embryos erhalten und lassen somit auch zu späteren Zeitpunkten
noch Rückschlüsse auf die Segmentbildung zu. Das Alter der Embryonen kann
anhand der Entwicklung der Beinanlagen und der gnathalen Extremitäten sowie der
wg-Expression im Kopf gut abgeschätzt werden.
In nos/pum-RNAi Embryonen sind segmentale wg-Domänen zwar nachweisbar,
sie zeigen aber Veränderungen der aus der Wachstumszone hervorgehenden Seg-
mente an (Abb. 13, B). Zum einen wird deutlich, dass nicht alle abdominalen wg-
Domänen gebildet werden, zum anderen zeigen die vorhandenenen wg-Streifen
irreguläre Muster. Meist sind die anterioren ein bis drei wg-Domänen im abdominalen
57

I. 2. Ergebnisse
Teil des Embryos, ebenso wie die thorakalen Segmente, noch normal ausgeprägt
(Abb. 13, B). Die posterior davon liegenden Segmente weisen nun, in Abhängigkeit
von der Stärke des jeweiligen RNAi-Effekts, unterschiedlich starke Veränderungen
des Expressionsmusters auf. Diese Veränderungen reichen bis zu Deletionen und
räumlich vollkommen irregulärer Orientierung einzelner Domänen, die meist auch mit
morphologischen Veränderungen der Segmentanlagen einhergehen (Abb. 13, B).
Solche Segmentanlagen entwickeln sich wahrscheinlich zu den in larvalen Kutikulas
noch feststellbaren, irregulären Abdominalsegmenten (s. Abb. 9). Schließlich kommt
es zum Abbruch der Segmentierung, was durch eine verminderte Zahl der Abdomi-
nalsegmentanlagen deutlich wird. Die Einzel-RNAi-Experimente gegen nanos oder
pumilio führen in dieser Hinsicht zu mit der Doppel-RNAi vergleichbaren Effekten
(Abb. 13, C, D).
58
Die abdominalen Defekte, die in larvalen Stadien anhand der Kutikula beobacht-
bar sind, sind also nicht auf späte, sekundäre Differenzierungsprozesse zurückzufüh-
ren, sondern werden in der Tat schon durch Störungen in früheren Stadien der
Embryogenese hervorgerufen. Es kommt zu unregelmäßig gebildeten wg-Domänen
und zu einem Segmentierungsabbruch, was einen Einfluss auf die Funktion der
Wachstumszone nahe legt.
Dies wird durch die Expression eines weiteren Markergens, dem Paar-Regel-Gen
even-skipped, unterstützt (Abb. 13, E – G). Für die Bildung von Segmenten aus der
Wachstumszone ist in Tribolium ein regulatorisches System aus primären und se-
kundären Paar-Regel-Genen notwendig, das schließlich zu segmentaler Expression
von Segmentpolaritätsgenen führt (Choe et al., 2006; Choe und Brown, 2007; 2009).
Die primären Paar-Regel-Gene eve, runt und odd-skipped regulieren durch Interakti-
onen untereinander ihre Expressionsdomänen und führen zur Expression der sekun-
dären Paar-Regel-Gene paired und sloppy-paired (Choe et al., 2006). Vor allem prd,
slp und eve regulieren dann die Segmentpolaritäts-Gene wingless und engrailed,
wodurch die Parasegmentgrenzen festgelegt werden (Choe und Brown, 2007; 2009).
eve wurde hier als Marker für diese Prozesse genutzt. Zunächst entstehen innerhalb
der Wachstumszone breite eve-Domänen mit doppelsegmentaler Periodizität (primä-
re eve-Streifen), die sich später zu segmentalen Domänen auftrennen (sekundäre
eve-Streifen) (Abb. 13, E; Patel et al., 1994; Brown et al., 1997). Diese sind aller-
dings transient und gehen im Laufe der weiteren Segmentdifferenzierung zurück.
Nach nanos/pumilio-RNAi ist auch das even-skipped-Muster deutlich gestört. Zu-

I. 2. Ergebnisse
nächst ist zu beobachten, dass die Bildung der sekundären eve-Streifen innerhalb
der anterioren abdominalen Segmente verändert ist (Abb. 13, F). Die eve-
Expressionsdomänen werden zwar noch in segmentale Streifen getrennt, diese
haben aber weniger Abstand zueinander, scheinen schmaler, zeigen ein niedrigeres
Expressionsniveau und verlaufen unregelmäßig über die Breite des Embryos (Abb.
13, F). In späteren Stadien kommt die Bildung der eve-Streifen offenbar vollständig
zum Erliegen (Abb. 13, E). Nur eine Restexpression im anterioren Bereich der
Wachstumszone ist feststellbar. Vermutlich zeigt das veränderte eve-Muster Störun-
gen des Paar-Regel-Gen-Regulationskreises an, die dann zu atypischer wg-
Expression und schließlich zu fehlerhafter Segmentierung führen. Die irregulären
Muster innerhalb der anterioren abdominalen Segmentanlagen (Abb. 13, B, F) könn-
ten in der Folge zu erkennbaren, wenn auch ebenfalls missgebildeten Segmenten
führen, wie sie Larven nach nos/pum-RNAi zeigen (Abb. 9). Auch der von beiden
Markergenen gezeigte Segmentierungsabbruch nach der Bildung von etwa sechs
Segmentanlagen, stimmt mit den Befunden der Analyse larvaler Kutikulas überein
(Abb. 13, B, G; Abb. 9).
nanos/pumilio-RNAi scheint also mit der Segmentbildung aus der Wachstumszo-
ne zu interferieren. Die Expression der Markergene eve und wg zeigt, dass nos/pum-
RNAi zu Störungen der Paar-Regel-Gen-abhängigen Segmentbildung und zu einem,
vermutlich daraus resultierenden, Abbruch der Segmentierung und einem Aubleiben
der Keimstreifstreckung führt
59

I. 2. Ergebnisse
Abb. 13: nos/pum-RNAi führt zu einem Zusammenbruch der Segmentbildung aus der
Wachstumszone
A - D Hellfeldaufnahmen vom Dotter befreiter, flachpräparierter, voll elongierter Keimstreifembryonen
in ventraler Ansicht, in-situ-Hybridisierung (ISH) gegen wingless.
A Wildtyp Embryo mit segmentalem wg-Muster. Die Mittellinie ist frei von Expression, wodurch
pro Segment zwei Domänen entstehen. Zehn abdominale Doppel-Domänen zeigen
die vollständige Segmentierung an, in den Resten der Wachstumszone verbleibt eine hufeisenförmige
Domäne. Im Thorax verlängern sich die wg-Domänen in die Ventralseite der
Beinknospen, ähnlich wie in der labialen und maxillären Segmentanlage. Der präorale Kopf
zeigt Expressionsdomänen in den antennalen und labralen Anlagen, zwei Domänen des
zukünftigen Augenfelds und eine zentrale Domäne im zukünftigen Stomodeum.
B nos/pum-RNAi-Embryo zeigt das Fehlen der antennalen und die deutliche Störung der
mandibulären Anlagen. Die abdominalen Domänen zeigen schon ab der ersten Segmentanlage
massive Unregelmäßigkeiten und einen vorzeitigen Abbruch der Segmentierung. Die
antennalen Knospen fehlen, die mandibulären Domänen sind reduziert und scheinen in die
maxilläre Segmentanlage verschoben (Pfeilspitze).
C nos-RNAi-Embryo. Die wg-Expression ist ab der zweiten Segmentanlage irregulär, ca. 6
Segmentanlagen sind gebildet. Die Antennenknospen (Pfeilspitze) und eine mandibuläre
Knospe (leere Pfeilspitze) sind deutlich reduziert.
D pum-RNAi-Embryo, etwas älter als A - C. Die abdominale wg-Expression und Segmentmorphologie
ist gestört, es werden ca. 7 Segmentanlagen gebildet. Die mandibuläre Anlage
ist deutlich reduziert (Pfeilspitze).
E – G DIC-Aufnahmen (Differenzieller Intereferenz-Kontrast) vom Dotter befreiter, flachpräparierter
Keimstreifembryonen in ventraler Ansicht, in-situ-Hybridisierung gegen evenskipped.
E Wildtyp-Embryo. Im Bereich der Wachstumszone zeigt sich eine in der Aufspaltung begriffene
eve-Domäne, die in der Folge zu zwei segmentalen Streifen führen wird, wie sie im
weiter anterior liegenden Gewebe in vier Segmentanlagen zu sehen sind.
F Etwas jüngerer nos/pum-RNAi-Embryo mit fehlerhaft gebildeten, segmentalen Domänen
(s. Text). Die thorakalen Segmente sind nicht eindeutig bestimmbar, da von anterioren
Segmentdeletionen ausgegangen werden muss.
G Wiederum etwas älterer nos/pum-RNAi-Embryo. Es sind keine segmentalen Domänen
feststellbar, nur im Bereich der Wachstumszone verbleibt eine eve-Domäne (Pfeil). Der
Segmentbildungsprozess ist zum Erliegen gekommen. Anterior ist eine partielle Deletion der
mandibulären Segmentanlage feststellbar (Pfeilspitze).
Anterior ist in allen Abbildungen links. Der Größenstandard zeigt 100 !m.
T1: erstes thorakales Segment, A“X“: x-tes abdominales Segment, Lr: Labrum/labrale Segmentanlage,
Ant: Antenne/antennale Anlage, Oc: Okulare Segmentanlage, Md: Mandibel/mandibuläre Segmentanlage,
Mx: Maxille/maxilläre Segmentanlage, Lb: Labium/labiale Segmentanlage
60

I. 2. Ergebnisse
61

I. 2. Ergebnisse
2.4.2. nanos/pumilio-RNAi induziert Defekte in frühen embryonalen
62
Stadien
Da ich zeigen konnte, dass nanos/pumilio-RNAi zu Defekten in elongierenden
Keimstreifen führt, ergibt sich nun die Frage, ob auch in früheren Entwicklungssta-
dien Veränderungen beobachtbar sind, die damit in Zusammenhang stehen könnten.
In Drosophila sind die wichtigsten Faktoren für die Regionalisierung des Blastoderms
die Transkriptionsfaktoren der Gruppe der Gap-Gene (Rivera-Pomar und Jäckle,
1996). Obwohl diese in Tribolium durchaus andere Funktionen aufweisen als in der
Fliege, so werden sie doch schon in frühen Stadien in distinkten Domänen expri-
miert, und ihre Funktionsreduktionsphänotypen weisen Segmentierungsdefekte auf
(Wolff et al., 1995; Bucher und Klingler, 2004; Cerny et al., 2005; Savard et al.,
2006a; Cerny et al., 2008; Marques-Souza et al., 2008). Zur weiteren Analyse der
nanos/pumilio Funktion wurde also die Expression von verschiedenen Gap-Genen
untersucht.
Die mRNA-Expression der Transkriptionsfaktoren giant und knirps zeigt in der
Tat Veränderungen in nos/pum-RNAi-Embryonen (Abb. 14, A-D; Abb. 15, E-H). In
Wildtyp Embryonen ist maternale gt-mRNA zunächst gleichmäßig verteilt (Bucher
und Klingler, 2004). Sie zieht sich dann, vermutlich nach der Aktivierung des zygoti-
schen Genoms, vom anterioren und posterioren Pol zurück, um eine zentrale blasto-
dermale Domäne mit einem Streifen stärkerer Expression im Bereich der maxillären
Anlage zu bilden. Im differenzierten Blastoderm entsteht in der Folge eine Domäne
im Bereich der posterioren Invagination, die während der Bildung des Keimrudiments
an dessen posterioren Ende erhalten bleibt (Abb. 14, A; Abb. 15, E) und sich nach
Beginn der Keimstreifstreckung in zwei segmentale Domänen im dritten thorakalen
und im zweiten abdominalen Segment aufspaltet. Diese verschwinden im Laufe der
weiteren Entwicklung, ebenso wie die maxilläre Expression, während sich mehrere,
vermutliche neurale, Expressionsdomänen in der Kopfanlage entwickeln (Bucher und
Klingler, 2004).
knirps-mRNA wird im Gegensatz zu giant erst im Blastoderm exprimiert (Cerny et
al., 2008). Eine große Domäne, die zunächst das Blastoderm beinahe vollständig
überspannt, zieht sich im weiteren Verlauf wiederum auf eine zentrale Domäne
zurück, die sich zu einem Streifen innerhalb der mandibulären Segmentanlage
differenziert. Im Bereich der posterioren Invagination entsteht dann eine weitere

I. 2. Ergebnisse
Domäne. Diese bleibt im sich entwickelnden Keimrudiment posterior (Abb. 14, C;
Abb. 15, G), bildet einen stärkeren segmentalen Streifen aus und verschwindet im
Lauf der Keimstreifstreckung, ebenso wie die mandibuläre Expression (Cerny et al.,
2008). Beide Gene entwickeln somit im sich differenzierten Blastoderm eine anteriore
(gnathale) und eine am posterioren Pol liegende Domäne, die auch im Keimrudiment
aktiv bleibt (Abb. 14, A, C; Abb. 15, E, G).
nanos/pumilio-RNAi führt zu deutlichen Veränderungen dieser Expressionsmus-
ter. Die posterioren Expressionsdomänen beider Gene fehlen in nos/pum-RNAi-
Embryonen bzw. sind deutlich reduziert (Abb. 14, Pfeile in B und D; Abb. 15, Pfeile in
F, H). Normalerweise sind giant und knirps am posterioren Ende des Keimrudiments
exprimiert. Dieses liegt in diesem Entwicklungsstadium tief im Dotter des Eis. Dort ist
in nos/pum-RNAi keinerlei Expression nachzuweisen (Abb. 14, B, D). Die gnathalen
Domänen sind vorhanden, allerdings leicht verändert, worauf ich später noch zu
sprechen kommen werde (s. 2.5). Die Expression anderer Gap-Gene in diesen
Stadien (Krüppel, hunchback und mille-pattes (Wolff et al., 1995; Cerny et al., 2005;
Savard et al., 2006a) sind in nos/pum-RNAi-Embryonen nicht nachweisbar verändert
(nicht gezeigt).
Zusätzlich zur Veränderung der giant- und knirps-Expression führt nanos/pumilio-
RNAi zu Defekten der morphogenetischen Bewegungen in Zusammenhang mit der
posterioren Invagination (Abb. 14, A-D). Bei der Bildung des Keimrudiments entsteht
zunächst am posterioren Pol des differenzierten Blastoderms eine Grube, deren
Zentrum im Verlauf der Entwicklung tief in den Dotter einsinkt. Der dorsale Rand der
initialen Grube bewegt sich hierbei als posteriore Amnionfalte nach anterior, wobei
das Gewebe des zukünftigen Amnions stetig über diese Falte, dem Embryo folgend,
ins Innere des Eis in posterior-dorsaler Richtung invaginiert (Handel et al., 2000).
Das Ergebnis dieser Bewegungen ist ein Keimrudiment, dessen anteriorer Teil noch
an der ventralen Oberfläche des Eis liegt, während der posteriore Teil tief in den
Dotter reicht (Abb. 14, A). Diese Bewegungen sind nach nos/pum-RNAi massiv
gestört. Die Invagination findet in deutlich reduziertem Umfang statt, so dass das
posteriore Ende schließlich weniger tief im Dotter zu liegen kommt (Abb. 14, Pfeile in
B und D) und das Keimrudiment kleiner zu sein scheint als im Wildtyp.
nanos und pumilio erfüllen also schon in Keimrudiment-Stadien eine Funktion für
posteriore Bereiche des Embryos. Sie werden sowohl für die Expression der posteri-
oren gt- und kni-Domänen als auch für die korrekte Ausbildung der posterioren
63

I. 2. Ergebnisse
Invagination benötigt. Dieser Befund erinnert an die Phänotypen, die durch Ausfall
des terminalen Systems hervorgerufen werden, wenn auch in abgeschwächter Form.
In Embryonen aus RNAi-Experimenten gegen Komponenten des torso-Signalwegs
findet die posteriore Invagination und die Bildung der Wachstumszone nicht statt. Die
anteriore Segmentierung hingegen ist nicht gestört. So entwickeln sich verkürzte
Larven, die posterior des zweiten oder dritten Abdominalsegmens keine Segmente
mehr ausprägen (Schoppmeier und Schröder, 2005).
Abb. 14: Die Expression von Markergenen zeigt Veränderungen posteriorer Blasto-
dermbereiche
A – D DIC Aufnahmen von im Dotter liegenden, jungen Keimrudimenten im medianen
optischen Schnitt aus lateraler Sicht. Das embryonale und präsumptive amniotische Gewebe
wurde bei der Bildbearbeitung rosa hervorgerufen (Handel et al., 2000). E – H laterale
Ansicht von Blastoderm Embryonen kurz vor der Differenzierung. In-situ-Hybridisierungen
gegen giant (A, B), knirps (D, E), tailless und otd-1 (E – J).
A Wildtyp-Embryo mit einer anterioren und einer posterioren gt-Expressionsdomäne
(schwarzer Pfeil). Die anteriore Domäne zeigt eine verstärkte Expression im Bereich der
maxillären Anlage. Der Grüne Pfeil zeigt die Bewegungsrichtung des Gewebes bei der
Invagination an.
B nos/pum-RNAi-Embryo, der eine deutlich verminderte posteriore Invagination sowie das
Fehlen der posterioren gt-Domäne (Pfeil) zeigt.
C Wildtyp-Embryo mit einer anterioren kni-Domäne im anterioren Teil des Kopfes, und einer
posteriore Domäne am Ende der Invagination (Pfeil).
D nos/pum-RNAi-Embryo der ebenfalls eine verminderte posteriore Invagination und das
Fehlen der posterioren kni-Domäne zeigt.
E Wildtyp-Embryo zeigt otd-1-Expression als Kontrollfärbung in der anterioren Hälfte (Pfeile
weisen die posteriore Grenze aus) und tll-Expression in Form einer posteriore Kappe, diese
zeigt I in einer posterioren Aufsicht.
F nos/pum-RNAi-Embryo zeigt otd-1-Expression vergleichbarer Stärke in der anterioren
Hälfte (Pfeile weisen die posteriore Grenze aus), während die tll-Expression am posterioren
Pol kaum feststellbar ist (*). J zeigt eine posteriore Aufsicht.
G, H Hoechst-33342 Kernfärbung der Embryonen in E und F zeigen ein vergleichbares
Entwicklungsstadium.
Anterior ist in allen Abbildungen links, außer in I und J.
64

I. 2. Ergebnisse
65

I. 2. Ergebnisse
2.4.3. nanos und pumilio sind nötig für die Expression eines termina-
66
len Zielgens
Im vorangegangenen Kapitel habe ich gezeigt, dass nanos und pumilio Einfluss
auf posteriore gap-Domänen und die posteriore Invagination des Keimrudiments
haben, und auf eine Ähnlichkeit zu Effekten nach RNAi gegen Komponenten des
torso-Signalwegs hingewiesen (Schoppmeier und Schröder, 2005). Ein Zusammen-
hang zwischen diesen Systemen und nanos/pumilio ist also denkbar. Um dies zu
überprüfen habe ich die Auswirkungen von nos/pum-RNAi auf die Expression eines
Zielgens des terminalen Systems, nämlich tailless, untersucht. In Drosophila wird die
Expression von tailless am posterioren Pol des Embryos durch die Aktivierung des
torso-Rezeptors ermöglicht (Furriols und Casanova, 2003). Auch im Tribolium-
Blastoderm wird tll am posterioren Pol exprimiert (Schröder et al., 2000). Kurz bevor
die Differenzierung des Blastoderms in Serosa- und Embryonalanlage anhand der
Kernmorphologie sichtbar wird, ist tll in einer Kappe am posterioren Ende des Emb-
ryos exprimiert. Eine anteriore Expressionsdomäne entsteht erst in der Kopfanlage
des differenzierten Blastoderms. Zu diesem Zeitpunkt existieren beide Domänen für
eine sehr kurze Zeit gleichzeitig, bis die bereits deutlich reduzierte posteriore Domä-
ne vollständig verschwindet. Die posteriore tll-Domäne ist also nur innerhalb eines
kurzen Zeitfensters vorhanden (Schröder et al., 2000). Während diese transiente
Expression sowohl in lateraler Ansicht, als auch in posteriorer Aufsicht eines Wildtyp
Embryos (Abb. 14, E, I) deutlich zu erkennen ist, fehlt sie nach nos/pum-RNAi nahe-
zu vollständig (Abb. 14, F, J). Die Verteilung der Zellkerne in Hoechst-Färbungen
(Abb. 14, G, H) zeigt, dass hier nur sich entsprechende Entwicklungsstadien mitein-
ander verglichen wurden. In beiden hier gezeigten Embryonen ist noch keine
Ungleichverteilung der Zellkerne zu erkennen, wobei beide die gleiche Zellkerndichte
aufweisen. Als Kontrolle wurde in diesem Experiment zusätzlich die Expression von
otd-1 nachgewiesen. otd-1 ist zu diesem Entwicklungsstadium in einer großen,
anterioren Domäne exprimiert, die nicht mit der posterioren tll-Expression überlappt
(Abb. 14, E, F). Das Vorhandensein der otd-1-Domäne schließt ein Fehlen der tll-
Expression aufgrund von RNA-Degradation wegen mangelnder Fixierung oder
anderer Probleme der Nachweismethode aus und dient als zusätzlicher Hinweis auf
das vergleichbare Entwicklungsalter der Embryonen.
nanos und pumilio sind also nötig für die Expression des terminalen Zielgens tll.
Somit eröffnet sich die Möglichkeit, dass nanos und pumilio über die Regulation

I. 2. Ergebnisse
terminaler Zielgene Einfluss auf die Etablierung der Wachstumszone im posterioren
Blastoderm nehmen. Dieser Zusammenhang könnte die Entstehung der posterioren
Segmentierungsphänotypen nach nos/pum-RNAi erklären (s. 3.1). In der Tat können
nach torso-RNAi auch schwache Phänotypen auftreten, die dem abdominalen Phä-
notyp nach nanos/pumilio-RNAi sehr ähneln (Schoppmeier und Schröder, 2005).
2.5. Durch nanos/pumilio-RNAi verursacht Defekte in anterioren
Segmentanlagen
Wie schon im Kapitel 2.3 beschrieben, führt nanos/pumilio-RNAi nicht aus-
schließlich zu abdominalen Defekten, sondern auch zu Veränderungen von Kopf-
segmenten (Abb. 10). In Anbetracht ihrer Rolle als Gene der posterioren Gruppe in
Drosophila überrascht dieser Befund durchaus (St Johnston und Nüsslein-Volhard,
1992).
2.5.1. Markergen-Expression zeigt Kopfdefekte in embryonalen Stadien
Auch die Ursachen der in Larven beobachteten anterioren Defekte sind schon in
frühen embryonalen Prozessen zu suchen und keine Folge von sekundären Degene-
rationsprozessen. In nos/pum-RNAi-Embryonen gibt bereits das wg-
Expressionsmuster eindeutige Hinweise auf die später deutlich werdenden morpho-
logischen Defekte der larvalen Kutikula. In Wildtyp-Embryonen (Abb. 13, A) ist wg in
mehreren Expressionsdomänen innerhalb der Kopfanlage exprimiert. Es lässt sich
Expression in den labralen Anlagen, den Augenanlagen, den entstehenden Anten-
nen und in den gnathalen Segmenten nachweisen. Dieses komplexe Muster ist nach
nanos/pumilio-RNAi deutlich gestört und es zeigen sich auch bereits morphologische
Defekte (Abb. 13, B). Die wg-Expression innerhalb der labralen Anlagen ist reduziert.
Die Expression innerhalb der Anlagen für Antennen und Mandibeln ist kaum fest-
stellbar und die dazugehörigen Extremitätenanlagen scheinen zu fehlen. Auswirkun-
gen auf die wg-Expression in antennalen und mandibulären Segmenten sind auch in
nanos- bzw. pumilo-Einzel-RNAi-Experimenten feststellbar (Abb. 13, C, D). Die
Veränderungen des wg-Musters lassen vermuten, dass auch die Ursache der anteri-
oren Defekte in noch früheren Entwicklungsprozessen zu suchen ist.
In der Tat zeigen auch Nachweise der even-skipped-Expression in blastoderma-
len Stadien von nos/pum-RNAi-Embryonen Veränderungen, die die beobachteten
67

I. 2. Ergebnisse
Segmentdeletionen anzeigen (Abb. 15, A-D). In der Wildtypsituation wird eve erst-
mals im frühen Blastoderm exprimiert und überspannt zunächst die posteriore Hälfte
(Patel et al., 1994; Brown et al., 1997). Innerhalb dieser Domäne geht die Expression
in einem dorso-ventralen Streifen zurück, so dass ein anteriorer Streifen von der
größeren Domäne abgegrenzt wird (Brown et al., 1997). Durch dasselbe Prinzip wird
im weiteren Verlauf auch die verbleibende posteriore Expression in zwei Domänen
unterteilt, so dass im differenzierten Blastoderm drei eve-Streifen angelegt werden
(Patel et al., 1994; Brown et al., 1997; Cerny, 2007). Der anteriorste Streifen spaltet
sich dabei schon kurz nach dem Beginn der posterioren Invagination in zwei seg-
mentale Streifen auf, während der zweite Streifen bis zur Bildung des Keimrudiments
als doppelsegmental erhalten bleibt. Nach nos/pum-RNAi kommt es in frühen diffe-
renzierten Blastodermen zu Deletionen der anterioren doppelsegmentalen eve-
Domäne (eve 1, Abb. 15, A-D), die auch im weiteren Verlauf der Entwicklung nicht
mehr ausgeglichen werden. In schwächer ausgeprägten Fällen kann es auch nur zur
Deletion des ersten segmentalen Streifens kommen (nicht gezeigt). Diese Beobach-
tung illustriert, dass das Fehlen anteriorer Segmente bereits in einem fehlerhaften
Anlagenplan des Blastoderms begründet liegt.
68
Die Effekte auf die Bildung anteriorer Segmente beinhalten, wie erwähnt, nicht
ausschließlich die Deletion von Segmenten, sondern auch deren Transformation. Die
Ursache solcher Identitätsänderungen sind in der Regel Veränderungen der Expres-
sion von homeotischen Genen (Lawrence und Morata, 1994; Hughes und Kaufman,
2002). In der Tat konnte ich für das Hox-Gen Antennapedia eine veränderte Expres-
sion nachweisen (Abb. 15, I, J). Antennapedia wird nomalerweise vor allem in thora-
kalen Segmenten und mit geringerer Stärke in abdominalen Segmenten elongieren-
der Keimstreifen exprimiert (Berghammer, 2003; Bäumer, 2006). Die anteriore Gren-
ze der Expressionsdomäne liegt zwar im posterioren Bereich des labialen Segments,
die labialen Extremitätenknospen sind aber frei von Expression. Dies ändert sich
nach nanos-RNAi. Nun zeigen die Anlagen der labialen und sogar teilweise die der
maxillären Extremitäten ektopische Antp-Expression. Es ist anzunehmen, dass diese
ektopische Antp-Expression zu einer Transformation des Labiums hin zu thorakalem
Schicksal führen kann. Beispielsweise geht in gt-RNAi Embryonen eine ektopische
Expression von Antp in maxillären und labialen Segmentanlagen mit einer Transfor-
mation dieser Segmente zu thorakaler Identität einher (Bucher und Klingler, 2004;
Cerny et al., 2005).

I. 2. Ergebnisse
Tatsächlich fehlen zumindest die posterioren Domänen der Gap-Gene giant und
knirps in nanos/pumilio-RNAi-Embryonen (Abb. 14, Abb. 15). Bei näherer Betrach-
tung weisen aber auch deren anteriore, also gnathale Expressionsdomänen Verän-
derungen auf (Abb. 15). Beide Gene werden in klar begrenzten, segmentalen Domä-
nen innerhalb der Kopfanlage des Keimrudiments exprimiert (Bucher und Klingler,
2004; Cerny et al., 2008). Diese klare Abgrenzung ist in nos/pum-RNAi-Embryonen
deutlich gestört. Während die posteriore Grenze der gt-Expression noch klar gebildet
wird, ist das für die anteriore Grenze nicht der Fall. Im Wildtyp wird die maxilläre gt-
Domäne durch einen schmalen Streifen ohne Expression von einer deutlich schwä-
cheren Expression im gesamten anterioren Kopf abgetrennt (Abb. 15, E). Dies unter-
bleibt in nos/pum-RNAi und führt zu einer verbreiterten Domäne starker Expression,
die der maxillären Domäne im Wildtyp zu entsprechen scheint (Abb. 15, F). Zusätz-
lich ist der Abstand der gt-Domäne zur anterioren Grenze der Kopflappen verkleinert,
möglicherweise ein Hinweis auf eine Reduktion der anterioren Kopfanlage. Der
Einfluß auf kni scheint noch deutlicher zu sein. Hier kommt es in den stärksten Fällen
zu einer ektopischen Expression von kni in der gesamten anterioren Kopfanlage
(Abb. 15, H). Auch hier scheint die posteriore Grenze der Expressionsdomäne auf-
rechterhalten zu werden.
Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass nanos/pumilio-RNAi zu un-
erwarteten, anterioren embryonalen Defekten führt. Diese zeigen sich sowohl in der
veränderten Expression von Markergenen im Blastoderm als auch in späteren Sta-
dien, und sind nicht durch eine mit Drosophila vergleichbare Funktion von nanos und
pumilio in Drosophila erklärbar (s. 3.2).
69

I. 2. Ergebnisse
70

I. 2. Ergebnisse
Abb. 15: nos/pum-RNAi führt zu Veränderungen anteriorer Gewebe in embryonalen
Stadien
A – D laterale Ansicht differenzierter Blastoderm-Embryonen, E – H ventrale Ansicht von
Keimrudimenten, I und J ventrale Ansicht voll elongierter Keimstreifen. E – J wurden vom
Dotter freipräpariert. In-situ-Hybridisierungen gegen: even-skipped (A, B), knirps (E, F), giant
(G, H), antennapedia (braun) und wingless (blau; I, J)
A In frühen Blastodermstadien sind normalerweise drei eve-Domänen feststellbar.
B In vergleichbaren Stadien nach nos/pum-RNAi sind diese anterior reduziert, hier fehlt die
anteriore eve-Domäne vollständig.
C, D Hoechst-33342 Kernfärbung der Embryonen in A und B. Serosa- und Embryonalanlage
sind klar zu erkennen (Pfeilköpfe).
E Wildtyp-Keimrudiment mit gt-Expression im anterioren Kopf, einem maxillären Streifen und
einer posterioren Domäne. Der Bereich direkt vor der maxillären Domäne bleibt frei von
Expression.
F nos/pum-RNAi-Keimrudiment mit aufgelöster anteriorer Expressionsgrenze der maxillären
Domäne. Die posteriore Grenze bleibt erhalten, scheint aber relativ zum anterioren Ende des
Embryos nach anterior verschoben, und somit der anteriore Kopf verkleinert. Die posteriore
Domäne fehlt (Pfeil)
G In Wildtyp-Keimrudimenten ist knirps in einer schmalen anterioren, in der mandibulären
Segmentanlage liegenden und einer posterioren Domäne exprimiert.
H In nos/pum-RNAi-Embryonen vergleichbarer Stadien wird die anteriore Grenze der kni-
Expression nicht mehr (dieser Embryo) oder nur unzureichend ausgebildet (nicht gezeigt),
was zu ektopischer Expression führt. Die posteriore Grenze der anterioren Domäne wird
etabliert, über deren exakte Position lässt sich allerdings keine Aussage treffen. Die posteriore
Domäne ist stark reduziert (Pfeil)
I Wildtyp Embryo mit der vollen Zahl an segmentalen wg-Streifen. Antp ist vor allem in
thorakalen und schwach in abdominalen Segmentanlagen exprimiert. Die anteriore Grenze
liegt posterior im labialen Segment, vermutlich zusammenfallend mit der dortigen Parasegmentgrenze
(Pfeilspitze).
J nos-RNAi-Embryo in vergleichbarem Entwicklungsalter mit ektopischer Antp-Expression in
der labialen und, in schwächerem Ausmaß, der maxillären Segmentanlage und somit einer
Verschiebung der anterioren Expressionsgrenze (Pfeilspitze). Die wg-Expression zeigt
massive Unregelmäßigkeiten innerhalb der abdominalen Segmentanlagen und die vollständige
Reduktion einer Antennenknospe.
Anterior ist in allen Abbildungen links.
T1: erstes thorakales Segment, A“X“: x-tes abdominales Segment, S: Serosaanlage, E: Embryonalanlage
71

I. 2. Ergebnisse
2.6. Ein Effekt von nanos und pumilio auf die Ausbildung von
72
Proteingradienten im Blastoderm ist nicht nachweisbar
Wie ich bisher zeigen konnte, spielen nanos und pumilio eine Rolle in der frühen
Embryonalentwicklung und beeinflussen auch die Musterbildung im Blastoderm. Eine
solche Funktion beider Gene wurde schon seit mehreren Jahren postuliert (Wolff et
al., 1995; Schröder, 2003). Die Idee, nanos und pumilio könnten auch in Tribolium
für die posteriore Repression der HUNCHBACK-Expression zuständig sein, ist in
Analogie der Interaktion bei Drosophila natürlich nahe liegend. Gestützt wird diese
Idee durch das Vorhandensein eines NREs im 3’UTR der hunchback-mRNA (Wolff et
al., 1995). Auch im 3’ UTR der otd-1-mRNA wurde ein putatives Nanos Response
Element beschrieben, und eine Regulation durch nanos und pumilio postuliert
(Schröder, 2003). Es entstand also die These, dass nanos und pumilio durch die
Regulation maternal ubiquitär verteilter mRNAs die Ausbildung frühblastodermaler
Proteingradienten vermitteln und somit eine zentrale Rolle für die initiale Regionali-
sierung des Embryos einnehmen. Schon die verhältnismäßig milden, aus nos/pum-
RNAi resultierenden Phänotypen machen eine solch grundlegende Funktion eher
unwahrscheinlich. Die Verfügbarkeit eines für OTD-1 spezifischen polyklonalen
Antiserums machte es jedoch möglich diese postulierte Interaktion direkt zu untersu-
chen. Allerdings erbrachte die durchgeführte Analyse der OTD-1-Proteinexpression
in nos/pum-RNAi-Embryonen keine Ergebnisse, die diese These stützen könnten.
Maternale otd-1-RNA ist zunächst gleichmäßig im unbefruchteten Ei verteilt
(Schröder, 2003). Etwa um den Zeitpunkt der Aktivierung des zygotischen Genoms
ziehen sich Protein und RNA vom posterioren Pol zurück und es entsteht eine Ex-
pressionsdomäne, die die anteriore Hälfte des frühen Blastoderms überspannt. Es
wurde vermutet, dass dieses Zurückziehen vom posterioren Pol durch translationelle
Repression vermittelt wird, und dass NANOS und PUMILIO dafür verantwortlich sein
könnten (Schröder, 2003). Im weiteren Verlauf zieht sich die otd-1-Expression auch
vom anterioren Pol zurück und es entstehen zwei keilförmige Domänen im anterioren
Kopf (Li et al., 1996; Schröder, 2003; Schinko et al., 2008). Nach nos/pum-RNAi
lassen sich keine Veränderungen dieses frühen Expressionsverlaufs feststellen.
Insbesondere ist keine posteriore Derepression zu beobachten, wie sie der Hypothe-
se folgend zu erwarten wäre, wenn nanos und pumilio tatsächlich posteriore OTD-
Repressoren wären (Abb. 16, A, B). Ebenso wie im Wildtyp zieht sich die OTD-1-

I. 2. Ergebnisse
Expression auf die anteriore Hälfte des Embryos zurück. Es ist natürlich möglich, und
vor allem im Hinblick auf die verhältnismäßig schwachen anterioren nos/pum-
Phänotypen interessant, dass eine subtile Veränderung des lokal begrenzten OTD-1-
Proteingradienten in der Mitte des Blastoderms oder temporale Abweichungen der
OTD-1-Regulation zum Phänotyp nach nos/pum-RNAi beitragen. Solche schwachen
Veränderungen der OTD-1-Expression konnten wegen der dynamischen Entwicklung
der Expression durch die hier verwendetetn Methoden wahrscheinlich nicht detektiert
werden.
Allerdings sind in deutlich späteren Stadien Veränderungen des OTD-1-Musters
zu beobachten. Im wachsenden Keimstreif wird OTD-1 in einer schmalen Reihe von
Mittellinienzellen exprimiert (Abb. 16, C). Im Wildtyp überschreitet die Breite dieses
antero-posterioren Streifens nie drei nebeneinander liegende Zellen (Abb. 16, C).
Nach pumilio- oder nos/pum-RNAi allerdings, umfasst der Streifen etwa doppelt so
viele Zellen (Abb. 16 D, E). Es kommt also zu einer Missexpression von OTD-1.
Obwohl vollkommen unklar ist, ob diese Regulation direkt von NOS/PUM abhängt,
bietet dieser Befund zumindest eine mögliche Erklärung für das Vorhandensein des
NREs im 3’ UTR der otd-1-mRNA. Die Verbreiterung der Mittelliniendomäne ist nach
pumilio- und nos/pum-RNAi, nicht aber nach nanos-RNAi beobachtbar (Abb. 16, D,
E, bzw. nicht gezeigt). Entweder ist dies also eine nanos-unabhängige Funktion des
PUMILIO-Proteins, oder dieser Prozess zeigt sich als nicht ausreichend sensibel für
die Transkriptreduktion durch nanos-RNAi und verhindert somit die Ausprägung des
Phänotyps.
Eine vergleichbare Analyse der HUNCHBACK-Protein-Expression konnte leider
nicht durchgeführt werden, da der von Wolff et al. (1995) verwendete Antikörper
gegen das HB-Protein nicht mehr verfügbar ist. Wolff et al. konnten zeigen, dass die
HB-Expression am posterioren Pol des frühen Blastoderms offenbar translationell
reprimiert wird, während die maternale hb-mRNA noch ubiquitär vorhanden ist (Wolff
et al., 1995). Auch in diesem Fall wurden NANOS und PUMILIO als mögliche Re-
pressoren vorgeschlagen. Meine Analyse der mRNA-Expression zeigte keine
feststellbaren Veränderungen in nos/pum-RRNAi-Embryonen, die möglicherweise
einen Hinweis auf Veränderungen der Proteinexpression hätte liefern können (nicht
gezeigt).
73

I. 2. Ergebnisse
74
Es bleibt also unklar, ob nanos und pumilio für die posteriore HB-Repression ver-
antwortlich sind. Ein Effekt auf die blastodermale OTD-1-Regulation war nicht festzu-
stellen, womit der posteriore Repressor der OTD-1-Expression ebenfalls unbekannt
bleibt (s. 3.5).
Abb. 16: OTD-1-Expression nach nanos/pumilio-RNAi
Hellfeldaufnahmen von Embryonen, gefärbt mit einem polyklonalen Serum gegen das
Tribolium ORTHODENTICLE-1-Protein.
A Wildtypisches frühes Blastodermstadium. Die OTD-1-Expression wurde auf die anteriore
Hälfte des Embryos beschränkt.
B nos/pum-RNAi-Embryo eines vergleichbaren Stadiums. Es sind keine Veränderungen der
Expression feststellbar.
C Ventrale Ansicht eines jungen Wildtyp-Keimstreifembryos. OTD-1 wird stark in den Kopflappen
und in einem ca. zwei bis drei Zellen breiten Streifen entlang der Mittellinie exprimiert.
D Nach nos/pum-RNAi zeigt ein unwesentlich jüngerer Embryo diesen Streifen auf ca. fünf
bis sechs Zellen Ausdehnung verbreitert.
E Ein pumilio-RNAi-Embryo gleichen Alters zeigt den OTD-1-positiven Streifen auf 4 bis 7
Zellen verbreitert.
Anterior ist in allen Abbildungen links.

I. 2. Ergebnisse
2.7. Die Beteiligung von brain-tumor am nanos/pumilio-
Repressionskomplex ist fraglich
Bei der Ausbildung des Repressionskomplexes zur Regulation der HB-
Expression in Drosophila ist außer nanos und pumilio noch ein weiteres Protein
beteiligt: BRAIN-TUMOR. BRAIN-TUMOR ist eines von drei Drosophila Vertretern
der NHL-Domain Familie von Proteinen (Arama et al., 2000; Sonoda und Wharton,
2001). Diese werden durch die, nach den drei erstbeschriebenen Proteinen benann-
te, NHL-Domäne charakterisiert, die meist in Verbindung mit B-box, RING-Finger-
und coiled-coil-Domänen auftritt (Slack und Ruvkun, 1998). Dem Drosophila-BRAIN-
TUMOR-Protein fehlt die RING-Finger-Domäne, zwei B-Box-Domänen sind aller-
dings vorhanden. Diese sind an sich in der Lage, sowohl Protein-Protein- als auch
Protein-RNA-Wechselwirkungen einzugehen. Die bisher als funktionell wichtig be-
schriebene Domäne von BRAT ist allerdings die NHL-Domäne, die die Wirkung von
brat in unterschiedlichen biologischen Zusammenhängen vermittelt (Arama et al.,
2000; Sonoda und Wharton, 2001). Das Drosophila brain-tumor-Gen wurde als
Lokus schon sehr früh in Screens für lethale Mutationen eines bestimmten Chromo-
somenabschnitts gefunden (Wright et al., 1976) und in den folgenden Jahren dann
vor allem als Tumor-Supressor-Gen eingehend untersucht (Hankins, 1991; Kurzik-
Dumke et al., 1992; Woodhouse et al., 1998; Arama et al., 2000). In brat-mutanten
Larven kommt es zu Neuroblastomen der optischen Zentren des Gehirns, die auf
fehlende Differenzierung der Ganglion-Mutter-Zellen zurückzuführen sind
(Betschinger et al., 2006; Lee et al., 2006). Später konnte gezeigt werden, dass brat
auch mit dem NANOS/PUMILIO-Komplex interagiert und für die Regulation von hb
notwendig ist (Sonoda und Wharton, 2001). BRAIN-TUMOR geht hierbei wahr-
scheinlich sowohl mit NANOS als auch PUMILIO Interaktionen ein, allerdings nur
wenn beide im ternären Komplex an die hb-mRNA gebunden sind. brat ist hierbei
kein obligater Partner von NANOS und PUMILIO. So ist es zwar an der Regulation
von hb und auch an der des paralytic Gens in Motoneuronen beteiligt (Muraro et al.,
2008), nicht aber an der nos/pum-abhängigen Repression von cyclinB in den Polzel-
len (Asaoka-Taguchi et al., 1999; Sonoda und Wharton, 2001). Die Zusammenset-
zung des nanos/pumilio-Repressionskomplexes kann sich also in unterschiedlichen
biologischen Zusammenhängen unterscheiden.
75

I. 2. Ergebnisse
Abb. 17: Sequenzvergleich von BRAT-Proteinen
Alignments der (putativen) BRAT-Proteine von Tribolium castaneum (Tc-BRAT, TC008260),
Drosophila melanogaster (Dm-BRAT, NP_476945), Nasonia vitripennis (Nv-BRAT,
XP_001606935) und Acyrtosiphon pisum (Ap-BRAT, XP_001946837). Die RING-Finger-
Domäne (1) der Proteine von Tribolium und der Blattlaus Acyrtosyphon, wie sie von der
NCBI Conserved Domain Suche (www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi) annotiert
wird, ist in orange markiert. Die putativen Zink-bindenden Aminosäuren sind durch Sterne (*)
markiert. Alle Proteine besitzen zwei B-Box-Domänen (2, 3 in grün), eine Coiled-Coil-
Domäne (4, in violett) und eine NHL-Domäne (5, in schwarz) (nach (Arama et al., 2000).
76

2.7.1. Tribolium brain-tumor
I. 2. Ergebnisse
In Tribolium ist ein eindeutiges brain-tumor-Ortholog (TC008260) identifizierbar.
Es liegt auf Komplementationsgruppe 2 und wird von HGSC und NCBI identisch
annotiert (GLEAN_08260 bzw. XM_965281). Die kodierende Sequenz liegt auf
einem einzigen Exon, was der Situation bei Drosophila entspricht (Arama et al.,
2000). 2448 bp kodieren für ein putatives 90,11 kDa Protein. Dieses enthält eindeutig
erkennbar beide B-box-Domänen (AS 124 bis 157 und 194 -227) und eine coiled-
coil-Domäne (AS 233 bis 372) in unterschiedlich hoher Konservierung, sowie die
sehr hoch konservierte NHL-Domäne am C-Terminus des Proteins (AS 541 bis 815,
Abb. 17). Innerhalb der NHL-Domäne beträgt die Zahl identischer Aminosäuren zu
Drosophila- bzw. Nasonia-BRAT 95 bzw 98 % (vgl. Abb. 17). Außerdem scheint das
Tribolium-Protein, wie auch das putative BRAT von Acyrtosiphon, im Aminoterminus
eine RING-Finger-Domäne (AS 61 bis 95) zu besitzen, wie sie in vielen anderen
NHL-Proteinen auftritt (Slack und Ruvkun, 1998), in den brat-Orthologen von Dro-
sophila und Nasonia im Lauf der Evolution aber offenbar verloren ging.
2.7.2. Expression von brat
In Drosophila ist keinerlei brain-tumor Expression vor Stadium 12 beschrieben
(Arama et al., 2000), obgleich zumindest BRAT-Protein natürlich schon in frühen
embryonalen Stadien vorhanden sein muss, um seine Funktion für die hb-Regulation
zu erfüllen. Ab dem späten Stadium 12 wird Drosophila brat in Zellen des sich entwi-
ckelnden ZNS und PNS exprimiert, was auch für das Tribolium-Ortholog zutrifft (Abb.
18, G,H). Tribolium-brat-mRNA findet sich allerdings bereits als maternale Kompo-
nente in der Oozyte und zeigt im weiteren Verlauf der frühen Embryogenese ein
dynamisches Muster. Zunächst wird die Expression an beiden Polen des Embryos
reduziert, so dass eine große zentrale Domäne entsteht (Abb. 18, B). Mit der
Differenzierung des Blastoderm beginnen allerdings die posterior liegenden Zellen
wieder brat-mRNA zu synthetisieren, während Zellen der Serosaanlage frei von
Expression bleiben (Abb. 18, C). brat-mRNA ist dann also in der gesamten Embryo-
nalanlage nachweisbar, zeigt allerdings im Bereich des anterioren Kopfes ein
erhöhtes Expressionsniveau (Abb. 18, C). Während der Bildung des Keimrudiments
wird die Expression nochmals in einem weiter posterior gelegenen, wahrscheinlich
segmentalen Streifen im Bereich der entstehenden thorakalen Segmente verstärkt
(nicht gezeigt). In späteren Stadien wird brat dann in Zellen des sich entwickelnden
77

I. 2. Ergebnisse
In späteren Stadien wird brat dann in Zellen des sich entwickelnden Nervensystems
exprimiert (Abb. 18, G, H).
Abb. 18: Expression des Tribolium brain-tumor-Gens
A – C, G, H Hellfeldaufnahmen von Wildtyp Embryonen, in-situ-Hybridisierung gegen braintumor.
A –C laterale Ansicht früher Stadien, G und H ventrale Ansicht nahezu vollständig
gestreckter Keimstreifen.
A zeigt die gleichmäßig im Ei verteilte maternale brat RNA, die um den Zellkern des frisch
abgelegten Eis (Pfeil in D) angereichert ist.
B Im undifferenzierten Blastoderm sind die Pole des Embryos frei von Expression, vermutlich
in der Folge zygotischer Regulation.
C Das frühe differenzierte Blastoderm zeigt die Serosaanlage ohne, die gesamte Embryonalanlage
mit brat Expression, noch bevor die Differenzierung der Anlagen morphologisch
sichtbar wird (F). Im Bereich des anterioren Kopfes ist das Expressionsniveau erhöht (hervorgehoben).
D - F Hoechst-33342 Kernfärbung der Embryonen in A – C.
G, H brat ist in Neuroblasten des sich entwickelnden Zentral- und peripheren Nervensystems
exprimiert. G ist eine Vergrößerung des Kopfes des Embryos in H.
Anterior ist in allen Abbildungen links, außer in G, dort ist anterior oben.
T1: erstes thorakales Segment, A“X“: x-tes abdominales Segment, Md: Mandibel/mandibuläre Segmentanlage,
Mx: Maxille/maxilläre Segmentanlage, Lb: Labium/labiale Segmentanlage, S: Serosaanlage,
E: Embryonalanlage
78

I. 2. Ergebnisse
2.7.3. brat-RNAi führt zu ähnlichen, aber von nos/pum RNAi abgrenz-
baren Phänotypen
RNAi-Experimente gegen brat wurden mit dsRNA eines 713 bp Fragment der
NHL-Domäne durchgeführt.
In der Folge von brat-RNAi treten kombinierte morphologische Veränderungen
der larvalen Kutikula auf (Abb. 19, A, B). Kopfdefekte gehen einher mit Verkürzungen
des Abdomens. Die Penetranz der RNA-Interferenz dieser Experimente ist hoch, d.h.
es treten keine Wildtyp-Larven auf. Meist bleiben 4 bis 7 abdominale Segmente
zurück, terminale Strukturen können fehlen (Abb. 19, A). Auch im Kopf zeigen sich
Defekte. Die Antennen scheinen häufig verkürzt und die Morphologie der Mandibeln
leicht gestört zu sein, wobei der Incisivi-Teil der Mandibeln reduziert ist (Abb. 19, B).
Außerdem ist das labiale Segment in der Regel ganz oder teilweise deletiert (Abb.
19, Pfeil in B). Hinzu kommen vereinzelte Veränderungen (vor allem Deletionen) der
anderen Mundwerkzeuge (nicht gezeigt). Zusätzlich zu diesen anterioren und poste-
rioren Defekten kommt es auch zu Deformationen in thorakalen Segmenten. Dort
treten Deletionen einzelner Beine, Deformationen des Prätarsus und Missbildungen
kompletter Beine auf (Abb. 19, bzw. nicht gezeigt).
Diese in Kutikulapräparationen auftretenden brat-RNAi-Phänotypen können zum
größten Teil auf frühe embryonale Prozesse zurückgeführt werden. So sind die
Deletion des labialen Segments und die Defekte thorakaler Segmente schon im
Expressionsmuster des Segmentpolaritätsgens wg ablesbar (Abb. 19, C, D). Aller-
dings besteht zwischen der Stärke der in larvalen Stadien beobachtbaren abdomina-
len Phänotypen und den Defekten der posterioren Segmentierung in Keimstreifsta-
dien eine Diskrepanz. Während Larven mit nur 3 oder 4 abdominalen Segmenten
auftreten, finden sich in Keimstreifen stets mindestens 7 abdominale Segmentanla-
gen. Es ist also möglich, dass hier Defekte zum Teil erst während der Differenzierung
der Segmente auftreten, also sekundär eine Reduktion der Segmente nach sich
ziehen. Der Blick auf frühere Entwicklungsstadien macht allerdings deutlich, dass die
hier beschriebenen Embryonen den RNAi-Effekt höchstwahrscheinlich nur in schwa-
cher Ausprägung zeigen, da sie auf deutliich stärkere Defekte hinweisen.
So verdeutlicht der Nachweis des Paar-Regel Gens eve starke Defekte in blas-
todermalen Stadien (Abb. 19, E-H). Die embryonale Anlage ist deutlich verkleinert,
der der Anlage der Serosa im Wildtyp entsprechende Bereich, ist in der Folge flä-
79

I. 2. Ergebnisse
chenmäßig vergößert, und das Gewebe scheinbar massiv verändert, wobei vor allem
die regelmäßige Anordnung der Zellkerne (Abb. 19, G’) gestört ist. Sie bilden teilwei-
se Gruppen von zwei bis drei Kernen, was auf Störungen der Zellmorphologie hin-
weist. Zudem deuten möglich, dass durch Hoechst intensiver gefärbte Bereiche in
den Zellkernen auf apoptotische Prozesse hin. Innerhalb der Embryonalanlage ist
eve-Expression zwar nachweisbar, einzelne eve-Domänen sind allerdings nur
schwer zu erkennen. Die individuellen Streifen sind kaum voneinander abgegrenzt,
nahezu ohne räumlichen Abstand zueinander und in ihrer Form deutlich gestört. Das
Muster könnte dabei möglicherweise die Reste von zwei segmentalen Streifen,
gefolgt von einer posterioren Domäne zeigen (Abb. 19, F). Somit scheint die dritte
blastodermale eve-Domäne (Abb. 19, E „3“) zu fehlen. Angesichts eines solch dra-
matischen Phänotyps ist es denkbar, dass Embryonen mit dem vollständigen Funkti-
onsverlust schon vor Erreichen des Keimstreifs- oder Larvenstadiums sterben und
somit die stärksten Defekte zu diesen Zeitpunkten schon nicht mehr beobachtet
werden können. Die Anzahl an Embryonen ohne Kutikula war allerdings nicht deut-
lich erhöht, wahrscheinlich ist der Anteil dieser starken Phänotypen zu gering. Mög-
licherweis ließe sich die Effizienz der RNAi, und damit die Frequenz der starken
Defekte, durch eine Erhöhung der dsRNA Konzentration noch steigern.
80
Die hier gezeigten Ergebnisse machen unterschiedliche Effekte von brat-RNAi
deutlich und zeigen Diskrepanzen der phänotypischen Ausprägung zu unterschiedli-
chen Zeitpunkten der Embryogenese auf. Die Analyse der blastodermalen Stadien
erlaubte offenbar die Detektion der am stärksten ausgeprägen Defekte, die vermut-
lich zu früher embryonaler Letalität führen und somit zu späteren Zeitpunkten nicht
mehr feststellbar sind. Die untersuchten Keimstreifembryonen zeigen nur schwache
Defekte. Dies legt nahe, dass es sich hierbei um Embryonen handelt, die überlebten
weil der RNAi-Effekt schwächer ausgeprägt war. Auch die in den larvalen Kutikulas
auftretenden abdominalen Defekte sind in dieser Form nicht in den Keimstreifen
feststellbar. Es ist nun denkbar, dass brat in Tribolium sowohl eine frühe Funktion
hat, deren Ausfall in den stärksten Fällen zu frühembryonaler Letalität führt, als auch
eine davon unabhängige spätere Wirkung auf einen Teil der abdominalen Segmente
entfaltet, die nach RNAi in einem sekundären Prozess, der die initiale Segmentbil-
dung kaum betrifft, zum Verlust dieser Segmente führt. Es ist allerdings nicht auszu-
schließen, dass alle beobachteten Effekte nur unterschiedlich starke Ausprägungen
des RNAi-Effekts einer Funktion darstellen. In diesem Fall würden die larvalen Kuti-

I. 2. Ergebnisse
kulas somit intermediäre Phänotypen zeigen, bei denen die brat-
Funktionsreduzierung nicht ausreichte um zu früher Letalität zu führen, wobei die
Analyse des wg-Expressionsmusters nur an noch schwächer betroffenen Phänoty-
pen durchgeführt worden wäre.
Zum jetzigen Zeitpunkt ist es nicht möglich, aufgrund der verfügbaren Daten eine
Interaktion von brat und nos/pum in Tribolium zu postulieren. In brat-RNAi treten,
ebenso wie nach nos/pum-RNAi, abdominale Defekte auf, ihre Entstehung könnte
allerdings unterschiedliche Ursachen haben. brat-RNAi führt zu thorakalen Defekten
und zu Deletionen des Labiums, wie sie nach nos/pum RNAi nicht auftreten. brat-
RNAi ruft außerdem deutlich stärkere Effekte in differenzierten Blastodermstadien
hervor, die starke Veränderungen der Blastodermregionalisierung vermuten lassen.
Es besteht allerdings durchaus eine prinzipielle Ähnlichkeit der Defekte der larvalen
Kutikulas, weshalb eine Interaktion zu diesem Zeitpunkt nicht ausgeschlossen wer-
den kann. Zur Klärung dieser Frage bedarf es weiterer, sorgfältiger Analysen der
brat-RNAi-Effekte sowie doppel- und tripel-RNAi Experimente. Außerdem müssen
Bindungsstudien der beteiligten Proteine Klarheit über deren Interaktionen geben.
Dies war leider im Rahmen dieser Arbeit nicht möglich, womit eine Beteiligung brain-
tumors im nanos/pumilio-Komplex nicht abschließend geklärt werden kann.
81

I. 2. Ergebnisse
82

Abb. 19: brain-tumor-RNAi führt zu embryonalen Defekten
I. 2. Ergebnisse
A, B Epifluoresenzaufnahmen der Kutikula schlupfreifer brat-RNAi-Larven. A zeigt eine
„whole-mount“ Aufnahme in leicht ventro-lateraler Sicht. Die Zahl der Abdominalsegmente ist
auf fünf reduziert, wobei dies nicht den stärksten beobachtbaren Phänotyp darstellt. Die
verbliebenen abdominalen Segmente erscheinen normal. Der Kopf ist nicht normal ausgebildet,
es tritt eine Ausstülpung des Stomodeums, eine Verkleinerung der Antennen und die
Deletion eines Labialpalpus auf. A’ zeigt einen vergrößerten Ausschnitt eines Beins mit
deformiertem Prätarsus. B zeigt die ventrale Ansicht des Kopfes einer anderen Larve. Es ist
eine Deletion des labialen Segments (Pfeil), eine Verkürzung der Antennen und eine leichte
Deformation der distalen Teile der Mandibel zu erkennen. (vergleiche Abb. 10 A)
C, D DIC-Aufnahmen vom Dotter befreiter, flachpräparierter, voll elongierter Keimstreifembryonen
in ventraler Ansicht, in-situ-Hybridisierung gegen wingless.
C zeigt den Wildtyp, D einen brat-RNAi-Embryo. Die Segmentierung brach offensichtlich
nach Bildung des neunten abdominalen wg-Streifens ab, die abdominalen Domänen sind
normal ausgeprägt. Die thorakalen Segmente zeigen unregelmäßige Domänen sowie verkleinerte,
deformierte Extremitätenknospen. Das labiale Segment ist deletiert (Pfeilspitze),
Die labralen Knospen sind reduziert.
E, F Hellfeldaufnahmen differenzierter Blastoderm-Embryonen in lateraler Ansicht, in-situ-
Hybridisierung gegen even-skipped.
E zeigt den Wildtyp, der erste doppelsegmentale eve-Streifen hat sich bereits in segmentale
Streifen aufgespalten (1a und b), Streifen zwei und drei sind deutlich erkennbar. F zeigt
einen brat-RNAi-Embryo. Es scheinen zwei segmentale eve-Streifen (Pfeilköpfe) und eine
größere (doppelsegmentale?) Domäne (weißer Pfeilkopf) angelegt zu sein, allerdings ist
deren Abstand zueinander deutlich verkleinert und ihre Form gestört. Somit scheint eine der
blastodermalen Domänen zu fehlen.
G, H Hoechst-33342 Kernfärbung der Embryonen in E, G. Serosa- und Embryonalanlage
sind klar zu erkennen (Pfeilköpfe). In H erschwert ein schlechtes Signal-zu-Hintergrund
Verhältnis die Auswertung. Die Zellkerne der Serosa liegen unregelmäßig verteilt. Die
Embryonalanlage ist deutlich verkleinert. G’ und H’ zeigen vergrößerte Ausschnitte eines
vergleichbaren lateralen Bereichs der Serosa aus G und H im gleichen Maßstab. Die Fehlverteilung
der Zellkerne nach brat-RNAi wird deutlich.
Anterior ist in allen Abbildungen links, außer in B, dort ist anterior oben. Der Größenstandard
weist 100 !m aus.
T1: erstes thorakales Segment, A“X“: x-tes abdominales Segment, Lr: Labrum/labrale Segmentanlage,
Ant: Antenne/antennale Anlage, Oc: Okulare Segmentanlage, Md: Mandibel/mandibuläre Segmentanlage,
Mx: Maxille/maxilläre Segmentanlage, Lb: Labium/labiale Segmentanlage, S: Serosaanlage,
E: Embryonalanlage
83

I. 2. Ergebnisse
2.8. pumilio-RNAi führt zu weiteren Phänotypen
84
In der Folge der schon beschriebenen RNAi-Experimente traten auch Effekte auf,
die nur durch pumilio-RNAi, nicht aber durch nanos-RNAi hervorgerufen wurden.
Diese wurden im Rahmen dieser Arbeit zwar nicht näher untersucht, ich möchte sie
und ihre möglichen Ursachen dennoch im Folgenden daher nur kurz beschreiben.
2.8.1. pum-RNAi führt zum Verlust der primordialen Keimzellen
In Tribolium findet man keine deutlich erkennbaren Polzellen, also früh separierte
embryonale Vorläuferzellen der Keimbahn, wie sie z.B. in vielen anderen Insekten-
embryonen vorkommen (Zissler, 1992). Trotzdem können solche primordialen Keim-
zellen (PGCs) schon in relativ frühen Stadien der Embryogenese durch in situ Nach-
weis der vasa Expression sichtbar gemacht werden (Schröder, 2006); Abb. 20). In
Drosophila spielen nanos und pumilio eine wesentliche Rolle für den Erhalt der
primordialen Keimzellen bei der Migration in die Gonadenanlage (Kobayashi et al.,
1996; Forbes und Lehmann, 1998; Hayashi et al., 2004; Sato et al., 2007). Auch in
Tribolium scheint pumilio wichtig für die PGCs zu sein. Diese liegen in der Wildtyp-
Situation als Gruppe von Zellen dem wachsenden Keimstreif bzw. dem präsumptiven
Mesoderm auf (Abb. 20, A, B; (Schröder, 2006; Nunes da Fonseca et al., 2008), sind
somit also von Dotter umgeben, der in den gezeigten Abbildungen entfernt wurde.
Nach nos/pum- oder pum-RNAi kommt es zu einem vollständigen Verlust der vasa-
positiven primordialen Keimzellen (Abb. 20, C-F). Dieser Effekt konnte nach nanos-
RNAi nicht nachgewiesen werden (nicht gezeigt). Die Frequenz von starken Phäno-
typen, also dem vollständigen Verlust der PGCs, schien aber in den Doppel-RNAi-
Embryonen erhöht zu sein (nicht gezeigt), was ein Hinweis auf eine Beteiligung von
nos sein könnte.
Die Notwendigkeit von pumilio-Aktivität innerhalb der Keimbahn könnte auf eine
konservierte Funktion hinweisen. So spielt pum nicht nur eine Rolle für die primordia-
len Keimzellen in Drosophila (Asaoka-Taguchi et al., 1999; Parisi und Lin, 1999;
Gilboa und Lehmann, 2004; Kadyrova et al., 2007), sondern ist gemeinsam mit
nanos auch an der Regulation der Keimbahnstammzellen beteiligt (Lin und Sprad-
ling, 1997; Forbes und Lehmann, 1998; Wang und Lin, 2004; Kim et al.). Auch in C.
elegans, oder selbst in Vertebraten wurden pumilio-Orthologe mit Funktionen in der

I. 2. Ergebnisse
Keimbahn in Verbindung gebracht (Crittenden et al., 2002; Xu et al., 2007; Lee et al.,
2008; Kuo et al., 2009).
Abb. 20: vasa-Expression verdeutlicht das Fehlen der PGCs nach nos/pum-RNAi
A, C, E laterale Ansicht von Keimstreifembryonen, in-situ-Hybridisierung gegen vasa, vom
Dotter freipräpariert
B, D, F Hoechst-33342 Kernfärbung der Embryonen in A, C, E
A vasa wird in den putativen primordialen Keimzellen (Pfeil), die dem Bereich der Wachstumszone
aufliegen, exprimiert.
C, E nach nos/pum- oder pum-RNAi fehlt die vasa-Expression ebenso wie die Zellen an der
Position der PGCs (Pfeile)
Anterior ist in allen Abbildungen links.
2.8.2. Parentale RNAi gegen pumilio führt zu einer Eiablegehemmung
nanos und pumilio sind in Drosophila auch für den Erhalt der Keimbahnstamm-
zellen wichtig (Bhat, 1999; Wang und Lin, 2004). In adulten Tribolium-Weibchen gibt
es keine Keimbahnstammzellen mehr, da deren Aktivität wahrscheinlich auf frühe
pupale Stadien beschränkt ist. Somit wird diese Aktivität von pupaler RNA-Injektion
nicht mehr beeinträchtigt, da in der Regel ältere Puppenstadien injiziert wurden.
Trotzdem legen pum-RNAi-Tiere signifikant weniger Eier als Wildtyp-Weibchen (Tab.
85

I. 2. Ergebnisse
2). Dies ist allerdings nicht auf Defekte während der Oogenese, sondern vielmehr auf
eine Störung der Eiablage zurückzuführen (Abb. 21), wie sie in ähnlicher Weise auch
in Drosophila-pum-Mutanten auftreten (Parisi und Lin, 1999). Die Ursachen dieser
Störung bleiben unklar und können vielfältig sein. Der Effekt tritt nicht in der Folge
von nanos-RNAi auf, ist also wahrscheinlich ausschließlich auf pumilio zurückzufüh-
ren.
Abb. 21: pumilio-RNAi führt zu einer Eiablagehemmung
A Vollständiges Ovar eines Wildtyp Weibchens. Jedes Halbovar besteht aus sechs Ovariolen
und dem lateralen Ovidukt. Das laterale Ovidukt eines Halbovars enthält eine reife
Oozyte (*).
B Vollständiges Ovar eines Weibchens nach pum-RNAi. Reife Oozyten werden nicht oder
nur selten abgelegt. Das laterale Ovidukt des linken Halbovars enthält sechs bis sieben reife
Oozyten (fünf davon sichtbar, *), das andere ist während der Präparation verletzt worden
(Pfeilspitze), die enthaltenen Oozyten wurden dabei verloren.
Gezeigt sind Fluoreszenzaufnahmen von Hoechst33342 gefärbten Präparaten.
Tab. 2: Legeleistung nach pumilio-RNAi
86
pumilio-pRNAi Wildtyp
durchschnitlliche Lege-
4,4 13,8
leistung pro Tag
Gezählt wurden gelegte Eier von 11 (pum-RNAi) bzw. 12
(Wildtyp) Weibchen über einen Zeitraum von 12 (pum-RNAi)
bzw. 8 (Wildtyp) Tagen.
Maxima: 14 (pum) 22 (WT) Minima: 0 (pum) 7,5 (WT)

I. 2. Ergebnisse
2.8.3. pumilio spielt eine Rolle für die Entwicklung larvaler Extremitä-
ten
Wie bereits erwähnt (2.3.2) führt pumilio-RNAi zu Defekten sämtlicher Extremitä-
ten. Dabei werden keine Segmente oder Glieder deletiert, sie erscheinen aber ver-
kürzt und deformiert (Abb. 22, Abb. 10). Dies führt zu in der proximo-distalen Achse
verkürzten Extremitäten irregulärer Morphologie (Abb. 22, C, D). Die Beteiligung
pumilios an der Extremitätenentwicklung wird auch durch seine räumliche Expression
gestützt. Es wird distal in den Extremitätenanlagen stärker exprimiert als im restli-
chen Gewebe des Embryos (Abb. 22, A,B). Die pum-mRNA ist in einem Kern-freien
Bereich basal der ektodermalen Zellkerne nachweisbar (Abb. 22, Pfeile in A, B), wo
sich vermutlich der Großteil des Zytoplasmas der Ektodermzellen befindet.
pum spielt also eine Rolle für die korrekte Ausbildung der Extremitätenanlagen
und könnte hierbei mit diversen Prozessen interferieren. Am wahrscheinlichsten ist
wohl eine Funktion für das Auswachsen entlang der proximo-distalen Achse. Hierbei
könnte pum beispielsweise an der Proliferationskontrolle oder der Steuerung mor-
phogenetischer Prozesse während der Beinentwicklung beteiligt sein. Beide Prozes-
se spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der adulten Beine aus den Imagi-
nalscheiben in Drosophila (Taylor und Adler, 2008). Eine Beteiligung pumilios an
diesen Vorgängen in Drosophila ist allerdings bisher nicht bekannt.
87

I. 2. Ergebnisse
Abb. 22: pumilio spielt eine Rolle in der Extremitätenentwicklung
A Die Durchlichtaufnahme einer vom Rest des Embryos entfernten Beinanlage. pum in-situ-
Hybridisierung.
B Epifluoreszenzaufnahme der Hoechst-33342-Kernfärbung des gleiches Objekts. pum RNA
ist in einem Bereich unterhalb der ektodermalen Zellkerne lokalisiert (Pfeil). Vermutlich
befindet sich in diesem Bereich das Cytoplasma der ektodermalen Epithelzellen.
C Epifluoreszenzaufnahme des Beines einer schlupfreifen L1 Larve.
D Epifluoreszenzaufnahme des Beines einer pum-RNAi Larve. Die Podomere sind vorhanden,
sie sind allerdings im Vergleich zum Wildtyp deutlich verkürzt und erscheinen verdickt.
Cx: Coxa, Tr: Trochanter, Fe: Femur. Tt: Tibiotarsus, Pt: Prätarsus
2.8.4. Larvale RNAi gegen pumilio resultiert in einem Entwicklungs-
88
block
Systemische RNAi in Tribolium kann nicht nur dazu verwendet werden, um emb-
ryonale Phänotypen zu generieren und Genfunktionen während der Embryogenese
zu untersuchen, sondern auch um postembryonale Prozesse, v.a. die Metamorphose
und die Bildung von adulten Strukturen zu analysieren (Tomoyasu und Denell, 2004;
Konopova und Jindra, 2007; 2008; Miller et al., 2008).
Nach Injektion von Larven (fünftes oder sechstes Larvenstadium) mit pumilio-
dsRNA kommt es zu einem Entwicklungsblock (Abb. 23). Während der normalen
Entwicklung durchlaufen die Tiere am Ende des siebten Larvenstadiums eine Phase
der Vorbereitung auf die Häutung zur Puppe. Als sogenannte Präpuppe sind die
Tiere bewegungslos und entwickeln die epidermalen pupalen bzw. adulten Anlagen,
die dann in der Puppe morphologisch deutlich zu Tage treten (äußere Metamorpho-
se; (Sokoloff, 1972; Dettner, 2003). Nach larvaler pum-RNAi sind die Tiere nicht in
der Lage, die Häutung zur Puppe korrekt zu durchlaufen und sterben als eine Art

I. 2. Ergebnisse
Präpuppe, deren Morphologie allerdings schon den Beginn der pupalen Ecdysis
anzeigt (Abb. 23).
pum ist in diesem Zusammenhang also nötig, um die Vorbereitungen zur pupalen
Häutung in der Präpuppe korrekt ablaufen zu lassen. Über die zu Grunde liegenden
Prozesse kann ich nur spekulieren. So wäre es etwa möglich, dass pumilio in die
Signalkaskade des Juvenil-Hormons (JH) eingreift, um dort beteiligte Repressoren zu
regulieren (Riddiford et al., 2003). Das JH-Zielgen broad-complex beispielsweise
zeigt einen sehr ähnlichen RNAi-Phänotyp wie pumilio (Konopova und Jindra, 2008).
Auch dieser Effekt ist nicht nach nanos-RNAi zu beobachten.
Abb. 23: Larvale pumilio-RNAi führt zu einem
Entwicklungsblock kurz vor der pupalen Ecdysis
A WT-Präpuppe in lateraler Ansicht.
B Nach larvaler Injektion von pum-dsRNA können die
Tiere die Ecdysis nicht vollständig durchführen und
sterben als Präpuppe mit einigen puppenähnlichen
Merkmalen. So ist das ganze Tier verkürzt und der
Kopf bereits in einer hypognathen Position
C WT-Puppe in ventraler Ansicht.
Die gezeigten Tiere sind vermillion white , zeigen also
unpigmentierte Komplexaugen. Anterior ist in allen
Abbildungen links.
pumilio-RNAi führt also zu einigen weiteren phänotypischen Effekten, die nicht
mit der Segmentierung in Zusammenhang stehen. Eine Rolle innerhalb der Keim-
bahn und der primordialen Keimzellen ist sowohl aus Drosophila, als auch aus ande-
ren Systemen bekannt (Lin und Spradling, 1997; Forbes und Lehmann, 1998; Asao-
ka-Taguchi et al., 1999; Crittenden et al., 2002; Xu et al., 2007; Lee et al., 2008; Kuo
et al., 2009). und stellt wahrscheinlich einen konservierten Funktionskomplex von
PUF-Domänen-Proteinen dar (Wickens et al., 2002). Die Beteiligung an der Entwick-
lung der larvalen Extremitäten oder der Kontrolle der Metamorphose allerdings sind
als bisher unbekannte Funktionen von pumilio zu sehen, die in dieser Form in keiner
anderen Art beschrieben wurden. Nur in C. elegans spielt ein pumilio-Homolog, puf-
9, eine Rolle bei der Regulation des larval-zu-adult Übergangs (Nolde et al., 2007),
ob allerdings Parallelen zwischen diesem Prozess und der Insektenmetamorphose
bestehen ist fraglich.
89

I. 2. Ergebnisse
90
Die beschriebenen Segmentierungs-unabhängigen Effekte treten wie erwähnt
nicht nach nanos-RNAi auf. Dieser Befund steht nicht im Wiederspruch zu einer
gemeinsamen Funktion während der Segmentierung und könnte mehrere Ursachen
haben. Es ist denkbar, dass pumilio auch ohne nanos bzw. mit anderen Kofaktoren
als Repressor wirken kann. Da PUMILIO die spezifische RNA-bindende Komponente
des Komplexes darstellt, scheint dies nicht abwegig (Murata und Wharton, 1995;
Sonoda und Wharton, 1999; Wang et al., 2002). NANOS könnte die Funktion für
diese Prozesse in Tribolium verloren haben, oder pumilio wurde für sie unabhängig
von nanos herangezogen. Eine andere denkbare Erklärung wäre mangelnde Effi-
zienz der nanos-RNAi-Experimente. nanos-RNAi führt weniger penetrant zur Ausbil-
dung von larvalen Phänotypen als pum-RNAi (Abb. 11; 2.3.2, S.53), sie scheint also
nicht in allem Fällen ausreichend zu sein, um Defekte zu induzieren. So wäre es
auch möglich, dass nanos-RNAi das mRNA-Niveau nicht ausreichend erniedrigt, um
Defekte der Beinentwicklung, der primordialen Keimzellen oder der Metamorphose
hervorzurufen. Möglicherweise genügen sehr geringe nanos-mRNA-Konzentrationen
für die Produktion der nötigen Menge an NANOS-Protein, oder die mRNA-
Degradation ist bei nanos weniger effizient.

3. Diskussion
I. 3. Diskussion
3.1. Das Zusammenspiel von nanos und pumilio und dem termi-
nalen System ist wesentlich für die posteriore Segmentie-
rung in Tribolium
Im vorangegangen Text habe ich dargelegt, dass nanos und pumilio in Tribolium,
ähnlich wie in Drosophila, eine wichtige Rolle für die Ausbildung posteriorer Segmen-
te spielen (s. 2.3, 2.4; Nüsslein-Volhard et al., 1987). Nach nos/pum-RNAi kommt es
in Tribolium-Embryonen zum vorzeitigen Stop der Segmentbildung aus der posterio-
ren Wachstumszone. Dabei werden zunächst noch abdominale Segmente gebildet,
deren Determination aber bereits gestört ist, wie die veränderte Paar-Regel- und
Segmentpolaritäts-Gen-Expression (Abb. 13) sowie die Morphologie der larvalen
Kutikula (Abb. 9) zeigen. Schließlich kommt es zu einem Segmentierungsabbruch, es
werden keine wg- oder eve-Streifen mehr gebildet und es entwickelt sich in der Folge
eine verkürzte Larve (Abb. 9, Abb. 13). Der Paar-Regel-Gen-Regelkreis innerhalb
der Wachstumszone (Choe et al., 2006) kommt also wohl zum Erliegen, wodurch
keine Segmentpolaritäts-Gen-Domänen mehr aktiviert werden, also keine Segment-
grenzen mehr entstehen und die Segmentbildung ausbleibt. Vermutlich stehen
posteriore Defekte in früheren Stadien mit diesen späteren Auswirkungen in Zusam-
menhang. So ist bereits die posteriore Invagination zu Beginn der Gastrulation
(Handel et al., 2000) gestört, und die Domänen der Gap-Gene giant und knirps im
posterioren Keimrudiment (Bucher und Klingler, 2004; Cerny et al., 2008) fehlen
(Abb. 14). In noch früheren Blastodermstadien ist zudem die Expression von tailless,
einem Zielgen des torso-Signalwegs (Schröder et al., 2000; Furriols und Casanova,
2003), am posterioren Pol des Blastoderms deutlich reduziert (Abb. 14). Es treten
also Effekte auf, die posteriore Bereiche des Blastoderms bzw. des Keimrudiments
sowie die Segmentbildung aus der Wachstumszone betreffen.
Die beobachteten Defekte ähneln im Ergebnis den embryonalen Phänotypen von
nanos- oder pumilio-Mutanten in Drosophila (Lehmann und Nüsslein-Volhard, 1987;
Nüsslein-Volhard et al., 1987; Irish et al., 1989a). Diese zeigen einen vollständigen
Verlust der abdominalen Segmente, verursacht durch die Derepression der materna-
len hb-RNA. Bleibt die vom posterioren Pol ausgehende, NANOS/PUMILIO-
vermittelte Repression aus, so kommt es zu einer nahezu ubiquitären HB-Expression
91

I. 3. Diskussion
(Hülskamp et al., 1989; Irish et al., 1989a; Struhl, 1989), die in der Folge zum Verlust
der posterioren Domänen von gt und kni (Nauber et al., 1988; Eldon und Pirrotta,
1991; Kraut und Levine, 1991a; b) sowie einer verschobenen Kr-Expression führt
(Gaul et al., 1987; Hülskamp et al., 1990). Hierdurch bleibt die streifenspezifische
Aktivierung der Paar-Regel-Gene, sprich die Segmentierung, in einem breiten Be-
reich aus (Frasch und Levine, 1987; Struhl, 1989; Klingler und Gergen, 1993; Klingler
et al., 1996; Fujioka et al., 1999). Sowohl in Tribolium als auch in Drosophila kommt
es nach dem Ausfall von nanos und pumilio also zu einem Verlust von abdominalen
Segmenten und der posterioren Domänen von giant und knirps. Allerdings unter-
scheidet sich die Bildung dieser abdominalen Segmente in beiden Arten fundamen-
tal: im Rahmen der syncytialen, blastodermalen Segmentierung des Langkeim-
Insekts Drosophila werden einzelne Paar-Regel-Streifen durch unterschiedliche
Kombinationen von gap-Faktoren spezifisch reguliert, während die Segmentierung in
Tribolium-Kurzkeim-Embryonen innerhalb der zellulären Wachstumszone von einem
Paar-Regel-Gen-Regelkreis abhängt (Klingler und Tautz, 1999; Choe et al., 2006;
Schröder et al., 2008). Diese prinzipiellen Unterschiede erschweren es, von der
Drosophila-Situation direkt auf die Prozesse im Tribolium-Embryo zu schließen.
Die Ursache der beschriebenen abdominalen Phänotypen in Tribolium hängt of-
fenbar mit Musterbildungsstörungen in der posterioren Wachstumszone zusammen.
Hierbei scheinen zwei unterschiedliche Szenarien möglich: 1. nanos und pumilio
wirken direkt auf die Musterbildung in der Wachstumszone während der
Keimstreifstreckung. Oder 2. beide Gene wirken auf die Anlage der Wachstumszone
und nehmen über die Regulation weiterer Faktoren indirekt Einfluss auf die
Musterbildung in der Wachstumszone und. Oder 3. sie spielen eine Rolle bei der
Etablierung der Wachstumszone.
Wirken NANOS und PUMILIO direkt auf den Segmentierungsprozess in der Wachs-
tumszone?
Über die Funktionsweise und die zellbiologischen Mechanismen der posterioren
Wachstumszone in Tribolium ist nur wenig bekannt. Möglicherweise ließen sich aber
Befunde bestimmter segmentierungsunabhängiger Funktionen von nanos und pumi-
lio in Drosophila auf die Situation in der Wachstumszone vo Tribolium übertragen. In
Fliegenembryonen sind nanos und pumilio nötig, um die primordialen Keimzellen
während ihrer Wanderung in die Gonadenanlage in einem undifferenzierten,
transkriptionell inaktiven Zustand zu halten (Asaoka et al., 1998; Forbes und Leh-
92

I. 3. Diskussion
mann, 1998; Asaoka-Taguchi et al., 1999; Deshpande et al., 1999; Deshpande et al.,
2005; Kadyrova et al., 2007). Dabei verhindern sie die Expression von somatischen
Genen, wie z.B. den Paar-Regel-Genen eve oder fushi-tarazu (Asaoka-Taguchi et
al., 1999; Deshpande et al., 1999; Deshpande et al., 2005; Kadyrova et al., 2007),
wahrscheinlich indem sie den Phosphorylierungszustand und somit die Aktivität der
C-terminalen Domäne der großen Untereinheit der RNA-Polymerase II regulieren.
Auch in der Wachstumszone von Tribolium müssen höchstwahrscheinlich Zellen in
einem undifferenzierten Zustand gehalten werden, um die aufeinander folgende
Bildung der Segmente zu gewährleisten (McGregor et al., 2009). Analog zu ihrer
Funktion für die Keimbahnvorläuferzellen in Drosophila könnten nanos und pumilio
hierbei eine direkte Rolle innerhalb der Wachstumszone spielen, indem sie die
Expression von Differenzierungsgenen unterdrücken. Diese dem ersten Szenario
folgende These würde eine Funktion von nos/pum während der Keimstreifstreckung
bedeuten, während der Einfluss auf die Expression von tll, gt und kni (s. 2.4) auf eine
frühere Funktion hinweist. Somit erscheint es mir wahrscheinlicher, dass nanos und
pumilio indirekt auf den Segmentierungsprozess in der Wachstumszone wirken.
Der Effekt auf die Wachstumszone könnte durch GIANT vermittelt werden
Der Verlust der posterioren Domänen von gt und kni ist eine Parallele zwischen
Drosophila und Tribolium, die möglicherweise eine Erklärung der Phänotypen bietet.
Wie erwähnt, führt das Fehlen jener posterioren Domänen in Drosophila nanos-
Mutanten zu einem Verlust der eve-Streifen innerhalb der normalerweise kni und gt
exprimierenden Bereiche (Frasch und Levine, 1987; Struhl, 1989). Ein ebenso direk-
ter Zusammenhang zwischen gap- und Paar-Regel-Gen-Expression konnte zwar
bisher in Tribolium nicht festgestellt werden (Bucher und Klingler, 2004; Cerny et al.,
2005; Cerny et al., 2008; Marques-Souza et al., 2008), dennoch führt beispielsweise
gt-RNAi zu Unregelmäßigkeiten der posterioren blastodermalen Paar-Regel-Gen-
Streifen (Cerny, 2007). Außerdem kommt es nach gt-RNAi zu einem Abbruch der
Segmentierung und somit zu verkürzten Larven. Die posteriore gt-Domäne könnte
also für die Etablierung oder auch die Aufrechterhaltung des „pair-rule circuit“ (Choe
et al., 2006) und somit für die Funktion der posterioren Wachstumszone nötig sein.
Es wurde vermutet, dass diese Funktion auf einem „Induktions-Ketten“ Mechanismus
der posterioren Gap-Gen-Domänen basieren könnte (Bucher und Klingler, 2004).
Dabei wäre die Anwesenheit zumindest jeweils eines abdominalen Gap-Gens nötig,
um die Aktivität des „pair-rule-circuit“ aufrecht zu erhalten. Das Fehlen der posterio-
93

I. 3. Diskussion
ren gt-Domäne nach nos-pum-RNAi bietet demnach eine Erklärung für das Auftreten
der posterioren Phänotypen, wobei nanos und pumilio durch die Regulation von gt
Einfluss auf die Funktion der Wachstumszone nähmen. Der Ausfall der posterioren
Domäne von kni ist hierbei wohl nebensächlich, da nach kni-RNAi nur sehr schwa-
che abdominale Musterbildungsdefekte auftreten (Cerny et al., 2008).
94
Ebenso wie in Drosophila wirken nanos und pumilio in Tribolium aber wohl nicht
direkt auf die Expression von gt und kni. Innerhalb der 3’-UTR-Bereiche beider Gene
finden sich keine kanonischen „Nanos Response Elemente“ und die bisher beschrie-
bene Funktion von nanos und pumilio als translationeller Repressor-Komplex sollte
nach RNAi nicht zum Verlust sondern zur Verstärkung oder Expansion von Zielge-
nexpression führen. Somit stellt sich die Frage, wie der Effekt von nanos und pumilio
auf die Expression von kni und gt in Tribolium vermittelt werden könnte.
In Drosophila führt die Derepression von hunchback als Repressor von gt und kni
zum Verlust der posterioren Domänen (Hülskamp et al., 1989; Irish et al., 1989a;
Struhl, 1989; Kraut und Levine, 1991a). In Analogie hierzu wurde vermutet, dass
nanos und pumilio auch in Tribolium für eine Repression der Translation von der
maternalen hb-mRNA am posterioren Pol und außerdem für eine ähnliche Regulati-
on der maternalen otd-1-mRNA verantwortlich seien (Schröder, 2003). Könnten
diese postulierten Interaktionen für das Fehlen der posterioren Domänen von gt und
kni nach nos-pum-RNAi verantwortlich sein?
Maternale otd-1-mRNA findet sich zunächst ubiquitär in frühen Embryonen. Die
Expression wird dann auf die anteriore Hälfte des Embryos begrenzt, um später eine
Domäne innerhalb der Anlage des anterioren Kopfes zu bilden (Li et al., 1996;
Schröder, 2003). Schröder vermutete, dass die initiale Repression innerhalb der
posterioren Hälfte des Embryos auf translationelle Regulation zurückzuführen sei. Ich
konnte jedoch zeigen, dass nanos-pumilio-RNAi nicht zu einer detektierbaren poste-
rioren Derepression führt (Abb. 16), und OTD-1 somit zum dem Zeitpunkt, zu dem
normalerweise die posterioren Domänen von gt und kni aktiviert würden, auch in
nos/pum-RNAi-Embryonen nur innerhalb des anterioren Kopfes exprimiert wird. Eine
Beteiligung von OTD-1 kann hier also mit hoher Sicherheit ausgeschlossen werden.
Maternale hb-mRNA und HB-Protein sind ebenfalls zunächst ubiquitär im Embryo
nachweisbar, die Proteinexpression wird aber in frühen Blastodermstadien am poste-
rioren Pol reprimiert (Wolff et al., 1995). Eine Beteiligung von NANOS und PUMILIO
an dieser posterioren Repression der HB-Expression im frühen Blastoderm konnte

I. 3. Diskussion
leider nicht geprüft und kann somit nicht ausgeschlossen werden. Falls eine HB-
Derepression am posterioren Pol von frühen nos/pum-RNAi-Embryonen stattfindet,
so wirkt sich diese offenbar nicht auf die späteren hb-Expressionsdomänen aus, da
diese nach nos/pum-RNAi nicht feststellbar verändert sind. Ein Zusammenhang mit
dem Fehlen der posterioren Expressionsdomänen von giant und knirps wäre aller-
dings denkbar. In Drosophila wirkt HB als Repressor der posterioren Domänen von
gt und kni, wodurch die HB-Derepression zum Verlust dieser Domänen führt (Kraut
und Levine, 1991b). Tribolium-HB wirkt zwar formal als Aktivator der posterioren gt-
Domäne (Cerny, 2007; Marques-Souza et al., 2008), diese Aktivierung wird aber
zumindest teilweise indirekt durch die Aktivierung von Krüppel vermittelt (Cerny et al.,
2005; Cerny, 2007; Marques-Souza et al., 2008). hb-RNAi führt also zu einem Feh-
len von Kr und dadurch zum Verlust der posterioren gt-Domäne. Ein direkter repri-
mierender Einfluss von HB auf gt, wie er nötig wäre um das Fehlen der posterioren
gt-Domäne nach nos/pum-RNAi zu erklären, könnte daher in den bisherigen hb-
RNAi-Studien „verdeckt“ worden sein. Wegen der fehlenden Aktivierung von gt durch
KRÜPPEL könnte sich eine eventuelle Expansion der gt-Domäne, hervorgerufen
durch den Verlust des reprimierenden Einflusses von HB, nicht manifestieren. Glei-
ches gilt in ähnlicher Weise für die posteriore kni-Domäne (Cerny, 2007; Cerny et al.,
2008). Es ist also prinzipiell möglich, dass die HB-Repression am posterioren Pol
nötig ist, um dort gt- und kni-Expression zu erlauben. Eine solche Regulation in
Analogie zu Drosophila ist zum jetzigen Zeitpunkt aber nicht nachweisbar und bleibt
Spekulation. Im Übrigen ist die hier erwähnte Expression von Kr nach nos/pum-RNAi
nicht feststellbar verändert (nicht gezeigt), kann also ihrerseits nicht mit dem Fehlen
der posterioren gt und kni-Domänen in Zusammenhang stehen.
NANOS und PUMILIO interagieren mit dem terminalen System
Einen Hinweis auf eine weitere mögliche Erklärung für die Ursache der abdomi-
nalen Defekte nach nanos/pumilio-RNAi bietet der Einfluss auf die Expression des
terminalen Zielgens tailless (Abb. 14). tailless wird im Wildtyp transient am posterio-
ren Pol des Blastoderms exprimiert (Abb. 14, F, J; Schröder et al., 2000), nach
nanos/pumilio-RNAi ist diese Expression allerdings massiv reduziert (Abb. 14, F, J).
Während die Bedeutung des torso-Signalwegs, also des terminalen Systems, für
die Segmentierung in Drosophila relativ begrenzt ist (nur das Akron, das achte Ab-
dominalsegment und das Telson sind in terminalen Mutanten betroffen (Nüsslein-
Volhard et al., 1987; Klingler et al., 1988), spielt er in Tribolium eine wichtige Rolle für
95

I. 3. Diskussion
die Ausbildung aller von der posterioren Wachstumszone gebildeten Segmente
(Schoppmeier und Schröder, 2005). So fehlen Larven nach torso- oder torso-like-
RNAi alle abdominalen Segmente und der Metathorax, wobei schwache torso-RNAi-
Phänotypen deutliche Ähnlichkeit zu den Defekten nach nanos/pumilio-RNAi aufwei-
sen (Schoppmeier und Schröder, 2005). RNAi gegen tll führt erwartungsgemäß
ebenso zu verkürzten Larven (G. Bucher, persönliche Mitteilung), allerdings scheinen
die tll-Defekte schwächer ausgeprägt zu sein, als nach torso- oder tsl-RNAi, was auf
die Beteiligung weiterer Zielgene hinweist. Nichtsdestotrotz dürfte tll also auch mit
den abdominalen Defekten nach nos/pum-RNAi in Zusammenhang stehen. Als eine
weitere Parallele bleibt zu bemerken, dass die posteriore Invagination, die in
nos/pum-RNAi-Embryonen gestört ist (Abb. 14), in tsl-RNAi-Embryonen vollständig
ausbleibt (Schoppmeier und Schröder, 2005).
96
In Drosophila wurde eine Interaktion des terminalen und des posterioren Systems
bereits beschrieben. In Drosophila nanos-Mutanten kommt es zu einer leichten
Derepression des Repressors CAPICUA nahe dem posterioren Pol (Cinnamon et al.,
2004). CAPICUA verhindert normalerweise (zusammen mit dem allgemeinen Ko-
repressor GROUCHO) im Zentrum von Drosophila-Embryonen die Expression termi-
naler Zielgene und wird an den Polen durch den torso-Signalweg reprimiert (Paroush
et al., 1997; Jimenez et al., 2000). Es wurde spekuliert, NANOS könnte auf eine
MAP-Kinase vermittelte, also TORSO-abhängige, Inaktivierung von CAPICUA oder
möglicherweise auch auf die capicua-mRNA direkt einwirken. Diese Derepression
CAPICUAS in nanos-Mutanten ist allerdings verhältnismäßig gering. Das Tribolium
capicua-Ortholog wurde bereits untersucht und seine Funktion für die Expression
terminaler Zielgene scheint tatsächlich konserviert zu sein (Koniszewski, 2007), so
dass auch in Tribolium ein Zusammenhang zwischen nanos, pumilio und dem termi-
nalen System über CAPICUA vermittelt werden könnte.
Da der Effekt von nos/pum-RNAi auf die abdominale Segmentierung schwächer
ist als der von torso oder torso-like (Schoppmeier und Schröder, 2005), kann man
annehmen, dass NOS/PUM nur unterstützend auf den torso-Signalweg wirken. Somit
könnten unterschiedliche terminale Zielgene in Abhängigkeit ihrer Dosissensitivität
unterschiedlich stark betroffen sein. Tatsächlich fehlt beispielsweise die posteriore
wg-Domäne innerhalb der Wachstumszone von tor- nicht aber von nos/pum-RNAi-
Embryonen (Abb. 13; Schoppmeier und Schröder, 2005).

I. 3. Diskussion
Möglicherweise vermittelt die Reduktion der tll-Expression auch den Einfluss auf
die posterioren Domänen von gt und kni. So fehlt beispielsweise auch nach tsl-RNAi
die posteriore gt-Domäne (Koniszewski, 2007). Somit könnte der Einfluss von
nos/pum-RNAi auf die Wachstumszone durch eine primär vom terminalen System
abhängige giant-Aktivierung vermittelt werden. Diese Zusammenhänge erlauben nun
also eine schlüssige Erklärung des posterioren Phänotyps nach nanos/pumilio-RNAi:
Der Wegfall NOS/PUM-vermittelter Repression von capicua führt zur (partiellen)
Repression von tll und möglicherweise weiterer terminaler Zielgene, was auch die
Reduktion der posterioren Domänen von gt und kni zur Folge hat. Das Fehlen der
posterioren Domäne von giant schließlich könnte dann durch die ausbleibende
Aufrechterhaltung des Paar-Regel-Gen-Regulationskreises zu den abdominalen
Segmentierungsdefekten führen.
Es ist außerdem denkbar, dass noch weitere direkte oder indirekte terminale
Zielgene an der Entstehung des Phänotyps beteiligt sind und gt nicht der einzige
oder dabei wesentliche Effektor ist. So fehlt beispielsweise die posteriore Expression
von Genen wie WntD/8 und caudal nach torso-RNAi (Schoppmeier und Schröder,
2005; Bolognesi et al., 2008a), die beide wesentlich für die Bildung Wachstumszo-
nen-abhängiger Segmente sind (Copf et al., 2004; Bolognesi et al., 2008a). Mögli-
cherweise führt die Reduktion der tll-Expression und eventuell weiterer terminaler
Zielgene auch nach nos/pum-RNAi zu einer schwächeren Expression von Wnt8/D
oder caudal in der Wachstumszone und daraufhin zu verkürzten Keimstreifen. Aller-
dings bleibt wie erwähnt die posteriore Domäne der wg-Expression nach nos/pum-
RNAi erhalten, die zu Wnt-D/8 redundant zu sein scheint (Bolognesi et al., 2008b).
NANOS und PUMILIO sind also am posterioren Pol des Tribolium Embryos not-
wendig für die korrekte Expression von tll, den posterioren Domänen der Gap-Gene
knirps und giant sowie möglicherweise anderer terminaler Zielgene. Sie wirken
wahrscheinlich über diese, möglicherweise vor allem über gt, auf die Funktion oder
die Anlage der posterioren Wachstumszone.
97

I. 3. Diskussion
3.2. Das Auftreten anteriorer Phänotypen illustriert die Beteili-
gung von NANOS und PUMILIO an den regulatorischen Inter-
aktionen im Tribolium-Blastoderm
nanos- und pumilio-RNAi führen nicht nur zu abdominalen, sondern auch zu
deutlichen anterioren Defekten (Abb. 10). Da ihre wichtigen embryonalen Funktionen
in Drosophila - die Regulation der maternalen hunchback-mRNA und die Beteiligung
an der Bildung der primordialen Keimzellen - mit ihrer posterioren Aktivität assoziert
sind (Hülskamp et al., 1989; Irish et al., 1989a; Kobayashi et al., 1996), und die
posteriore nanos-Expression auch in einigen anderen Arten auf eine konservierte
Funktion hinweist (Curtis et al., 1995; Lall et al., 2003; Chang et al., 2006; Dearden,
2006; Olesnicky und Desplan, 2007), ist dies ein unerwarteter Befund. Allerdings gab
es bereits Hinweise auf eine Beteiligung an anterioren Prozessen. So zeigen Dro-
sophila pumilio Mutanten subtile Kopfdefekte (Gamberi et al., 2002), und in den
Mücken Anopheles gambiae und Culex quinquefasciatus wird nanos-mRNA transient
am anterioren Pol lokalisiert (Goltsev et al., 2004; Juhn et al., 2008).
In Tribolium traten nach nos/pum-RNAi Transformationen und Deletionen von
Mundwerkzeugen bzw. gnathalen Segmenten auf, die im stärksten Fall zum Verlust
des antennalen und mandibulären Segments führten (Abb. 10, Abb. 12, Abb. 15).
Diese Defekte haben ihre Ursache in fehlerhaften Prozessen während früher Stadien
der Embryogenese. So kann beisielsweise die in den schwächeren nanos-RNAi
Larven auftretende Transformation des labialen Segments zu thorakaler Identität
höchstwahrscheinlich auf die ektopische Expression von Antp zurückgeführt werden
(Abb. 15). Diese wiederum könnte dabei z.B. von einer NANOS-Funktion als Antp-
Repressor innerhalb der labialen Segmentanlage abhängen. In Drosophila wurde
zwar eine möglicherweise direkte Regulation von Antp durch nanos beschrieben
(Riley et al., 1991), in Tribolium allerdings konnte ich in den 3’ Bereichen des Antp
Gens kein kanonisches NRE feststellen. Somit hängt diese Hox-Gen-Missregulation
wahrscheinlich nicht direkt von NANOS und PUMILIO ab, weist aber bereits darauf
hin, dass in früheren Stadien die Expression von Gap-Genen gestört sein könnte, da
diese sowohl in Drosophila als auch in Tribolium einen wichtigen Einfluss auf die
Etablierung der Hox-Gen-Domänen haben (Ingham und Martinez-Arias, 1986; White
und Lehmann, 1986; Riley et al., 1987; Harding und Levine, 1988; Irish et al., 1989b;
Casares und Sanchez-Herrero, 1995; Bucher und Klingler, 2004; Cerny et al., 2005;
98

I. 3. Diskussion
Marques-Souza et al., 2008). So kommt es beispielsweise auch nach gt-RNAi zu
ektopischer Antp-Expression (Cerny et al., 2005), wobei aber unklar bleibt, wie diese
vermittelt wird, da gt normalerweise innerhalb der maxillären Segmentanlage expri-
miert wird, ektopische Antp-Expression aber innerhalb der maxillären und der labia-
len Segmentanlage nachweisbar ist.
nanos/pumilio-RNAi führt zu Defekten anteriorer Kopfanlagen
Nach nos/pum-RNAi konnten in der Tat Veränderungen der anterioren Expressi-
onsdomänen von giant und knirps festgestellt werden (Abb. 15). In Wildtyp-
Keimrudimentstadien werden beide Gene in distinkten Streifen exprimiert, die aus
großflächigen Expressionsdomänen in früheren Stadien hervorgehen
(Bucher und Klingler, 2004; Cerny et al., 2008). Die knirps-Domäne liegt inner-
halb der zukünftigen mandibulären Segmentanlage und grenzt dabei anterior, die
giant-Domäne posterior an den ersten segmentalen eve-Streifen. Der zweite seg-
mentale eve-Streifen überlappt dann mit dem posterioren Bereich der anterioren gt-
Domäne, diese überspannt demnach die zukünftige maxilläre Segmentanlage
(Bucher und Klingler, 2004; Cerny et al., 2008). Nach nos/pum-RNAi ist im Wesentli-
chen ein Fehlen der anterioren Begrenzung der Expressionsdomänen von giant und
knirps in Keimrudimentstadien feststellbar, wodurch es zu ektopischer Expression
innerhalb des anterioren Kopfes kommt (Abb. 15). Die gt-Domäne ist dabei in anteri-
orer Richtung vergrößert, und dort ektopisch exprimiert wo in der Wildtyp-Situation
der erste segmentale eve-Streifen gebildet würde, während sich die kni-Expression
im Extremfall im gesamten anterioren Kopf findet. Außerdem fehlt nach nos/pum-
RNAi bereits in deutlich früheren Stadien der anteriore doppelsegmentale eve-
Streifen (Abb. 15). Das bedeutet es kommt bereits hier zu Störungen der Segmentie-
rung, die schließlich auch zu phänotypischen Defekten führen. Hierbei erhält offenbar
das erste definierte Parasegment maxilläre Identität, da die Maxille in nos/pum-RNAi
ausgebildet wird, wobei das antennale und das mandibuläre Segment fehlen. na-
nos/pumilio-RNAi induziert also Effekte in frühen embryonalen Stadien, die einerseits
zum frühen Verlust von eve-Streifen innerhalb der Kopfanlage und andererseits zu
veränderter Gap-Gen-Expression, ebenfalls innerhalb anteriorer Bereiche der Kopf-
anlage, führen. Wie kann also der Verlust von nanos und pumilio zu diesen Defekten
führen?
In diesem Fall eröffnet der Blick auf Drosophila keine offensichtlichen Erklä-
rungsmöglichkeiten. Hier führt der Verlust von pumilio-Aktivität, abgesehen von den
99

I. 3. Diskussion
abdominalen Defekten, zwar zu Fehlern bei der Involution des Kopfes und zu miss-
gebildeten Mundhaken (Gamberi et al., 2002), diese kutikulären Strukturen leiten
sich aber vom maxillären Segment ab. Kopfstrukturen, die von weiter anterior liegen-
den Segmenten gebildet werden, bleiben unbeeinträchtigt (Jürgens et al., 1986;
Gamberi et al., 2002). Der Grund dieser anterioren Phänotypen in Drosophila ist ein
verzögerter Abbau von bicoid-mRNA (Gamberi et al., 2002), also die Regulation
eines Dipteren-spezifischen Faktors. Somit scheint es keine offensichtliche Ähnlich-
keit der nos/pum-abhängigen anterioren Phänotypen in beiden Spezies zu geben.
100
Die veränderte Expression von kni und gt legt eine Beteiligung an der Entstehung
der Defekte nahe. Tatsächlich spielt kni in Tribolium, anders als in Drosophila, wo die
anteriore Domäne keine Segmentierungsfunktion mehr hat, eine wichtige Rolle für
die Anlage des mandibulären und des antennalen Segments (Gonzalez-Gaitan et
al., 1994; Cerny et al., 2008). kni-RNAi führt zu einer Deletion von Antenne und
Mandibel, wobei aber die anterioren, segmentalen eve-Streifen und sogar der man-
dibuläre engrailed-Streifen zunächst gebildet werden, letzerer aber schnell ver-
schwindet. Der Bereich der anterioren Segmentanlagen ist insgesamt im Vergleich
zum restlichen Embryo verkleinert (Cerny et al., 2008). giant ist in Drosophila we-
sentlich für die Bildung des labialen Segments, führt in Tribolium aber nur, abgese-
hen von der posterioren Funktion in beiden Arten, zu Defekten des ersten thorakalen
Segments und zu einer homeotischen Transformation von Maxille und Labium zu
thorakaler Identität. Die gnathalen Segmentanlagen werden aber gebildet. Der Funk-
tionsverlust von gt führt also zu einem ähnlichen Effekt, wie er auch in der schwa-
chen nos-RNAi auftritt (die Transformation des labialen Segments zu thorakalem
Schicksal). kni-RNAi führt sogar zum gleichen gnathalen Larven-Phänotyp wie der
Verlust von nanos und pumilio, wo aber statt einer reduzierten eine vergrößerte kni-
Expression feststellbar ist. Ein weiterer Unterschied ist, dass sich der Defekt nach
nos/pum-RNAi in Form des fehlenden anterioren eve-Streifens früher manifestiert. Es
scheinen hier also zwei deutlich unterschiedliche Situationen zu einem ähnlichen
Ergebnis zu führen. So stellt sich die Frage, ob die ektopische Expression von kni
und gt in nos/pum-RNAi-Keimrudimenten nun die Ursache der Deletionen oder nur
eine Folge von Fehlern in übergeordneten Systemen oder zu früheren Zeitpunkten
sind, die ihrerseits zum Verlust der Segmentanlagen führen. Die RNAi Experimente
gegen kni legen eher eine Funktion als Differenzierungsfaktor nahe (Cerny et al.,
2008). So ist es prinzipiell denkbar, dass durch die ektopische Expression von kni in

I. 3. Diskussion
der antennalen Segmentanlage des Keimrudiments die Zellen innerhalb dieses
Bereichs widersprüchlichen Differenzierungssignalen ausgesetzt sind und sich das
Gewebe somit nicht zu einem antennalen Segment entwickeln kann. Dies könnte in
ähnlicherweise auf die ektopische Expression von gt innerhalb der mandibulären
Segmentanlage zutreffen, und würde bedeuten, dass die Defekte erst während der
Differenzierung der Segmentanlage aufträten. Gegen eine solche Erklärung spricht
aber, dass der Verlust des anterioren eve-Streifens auf frühe Defekte der Segmentie-
rung hinweist. Dieser fehlt nämlich bereits in blastodermalen Stadien, womit sich der
Verlust der Segmentanlagen und höchstwahrscheinlich auch der Grund der gt- und
kni-Missexpression, schon vor dem Keimrudimentstadium manifestiert. Wenn also
die Befunde eher für einen Einfluss auf frühere, übergeordnete Prozesse sprechen,
welche Prozesse könnten das sein?
Wie führt der Verlust von nanos und pumilio zu frühen Defekten?
Anders als in Drosophila, wo die Expression der Gap-Gene zygotisch in relativ
klar definierten Domänen initiiert wird (Gaul et al., 1987; Oro et al., 1988; Kraut und
Levine, 1991b), sind die klar umgrenzten Domänen von kni und gt in Tribolium-
Keimrudimenten das Ergebnis eines schnell ablaufenden, dynamischen Prozesses,
bei dem die zunächst sehr großflächigen und im Falle von giant sogar maternal,
ubquitären Expressionsdomänen während der Blastodermentwicklung auf klar defi-
nierte Domänen begrenzt werden (Bucher und Klingler, 2004; Cerny et al., 2008).
Hierbei erlischt die Expression beider Gene zunächst an den Polen des Embryos,
zieht sich dann aus den posterioren Bereichen der Embryonalanlage und der Anlage
der Serosa zurück und wird schließlich innerhalb des anterioren Kopfes reduziert.
Die klar begrenzten Domänen innerhalb des Keimrudiments erlauben die Analyse
der Expressionsdomänen als Ergebnis dieses dynamischen Prozesses, Veränderun-
gen der Expression in blastodermalen Stadien sind allerdings wegen der schnellen
Entwicklung nur schwer nachzuweisen. Im Falle von nos/pum-RNAi konnten in
diesen früheren Stadien keine deutlichen, charakteristischen Veränderungen festge-
stellt werden, dennoch ist es möglich, dass sich der Ursprung der vergrößerten
Expressionsdomänen im Keimrudiment schon in früheren, möglicherweise nicht sehr
prägnanten Abweichungen abzeichnet. Nach nos/pum-RNAi spiegeln die Expressi-
onsmuster im Keimrudiment sozusagen die Expressionsverhältnisse früherer Stadien
wieder, d.h. die Begrenzung auf die segmentalen Domänen schlug im Ergebnis fehl,
und ist möglicherweise auf Verschiebungen übergeordneter Faktoren zurückzufüh-
101

I. 3. Diskussion
ren. Diese angenommenen frühen Verschiebungen könnten dann auch die Etablie-
rung des anterioren eve-Streifens verhindern. Dieser wird wahrscheinlich in einer Art
streifenspezifischer Regulation festgelegt. Das heißt, der erste eve-Streifen benötigt
wahrscheinlich eine bestimmte Kombination von Regulatoren, um korrekt gebildet zu
werden, wobei z.B. CAUDAL eine Rolle spielt (Schoppmeier et al., 2009) und durch-
aus auch kni und gt beteiligt sein könnten.
102
Die Prozesse und die beteiligten Faktoren der frühen gt und kni Regulation sind
noch weitgehend unverstanden, was die Interpretation der hier beschriebenen Phä-
notypen erschwert. Um die exakt umgrenzte Expression in späten Blastoderm- und
Keimrudimentstadien zu erreichen ist eine Vielzahl von regulatorischen Interaktionen
nötig. Maternale ebenso wie zygotische, reprimierende ebenso wie aktivierende (s.
3.5). Nichtsdestotrotz ist die Missregulation dieser beiden Gene ein deutlicher Effekt
von nanos/pumilio-RNAi und steht höchstwahrscheinlich - ursächlich oder als Ne-
benprodukt - mit der Deletion anteriorer Segmente in Zusammenhang. Zur Erklärung
dieses Zusammenhanges möchte ich im Folgenden mögliche, zwangsläufig spekula-
tive Szenarien darstellen.
Zunächst wäre es denkbar, dass NANOS und PUMILIO direkt die Expression von
gt und kni reprimieren. Eine Reduktion der nos/pum-Aktivität könnte dann zu einer
Derepression und der Verschiebung von Expressionsdomänen innerhalb des Blasto-
derms führen, die schließlich den Verlust der der anterioren eve-Domäne nach sich
zieht. Dieses Modell impliziert NOS/PUM-Aktivität innerhalb der zukünftigen Anlage
des anterioren Kopfes. Eine direkte Regulation von Dm-gt und Dm-kni ist allerdings
bisher nicht beschrieben worden und es ist unklar, ob NRE-ähnliche Sequenzen in
den (putativen) 3’-UTR-Bereichen der Tribolium-gt- und kni-mRNAs funktionell sein
könnten (s. Anhang).
Innerhalb der Anlage des Gnathums ist hb, das in Drosophila aktivierend auf die
anteriore kni-Domäne wirkt (Hülskamp et al., 1990), zumindest zeitweilig mit knirps
und giant koexprimiert (vgl. (Wolff et al., 1995; Bucher und Klingler, 2004; Cerny et
al., 2008) und könnte somit aktivierenden Einfluss haben. Die Wirkung von NOS und
PUM auf gt und kni könnte demnach unter Berücksichtigung der aus Drosophila
bekannten Interaktion (Hülskamp et al., 1989; Irish et al., 1989a; Struhl, 1989 1664)
durch anteriore Repression der gnathalen hunchback-Domäne vermittelt werden. In
der nos/pum-RNAi Situation käme es dann zu einer HB-Derepression nach anterior
und damit einer ektopischen Aktivierung von kni und gt. Dies wäre allerdings ein

I. 3. Diskussion
Effekt, der erst im differenzierten Blastoderm zum Tragen käme, da hb vorher ubiqui-
tär exprimiert ist (Wolff et al., 1995). Ein solcher aktivierender Effekt von HB auf die
anteriore gt-Domäne konnte aber nicht nachgewiesen werden (Marques-Souza et al.,
2008) und wurde für die anteriore kni-Domäne zumindest nicht beschrieben. Außer-
dem konnte ich keine Derepression der hb-Domäne in nos/pum-RNAi-Embryonen
nachweisen, weshalb diese Erklärung wohl verworfen werden kann.
otd-1 spielt eine Rolle für anteriore Bereiche des Embryos (Schröder, 2003;
Schinko et al., 2008; Kotkamp et al., 2010) und wurde bereits als Ziel von NANOS-
abhängiger Repression postuliert (Schröder, 2003). Es könnte somit an der Entste-
hung des anterioren nos/pum-RNAi-Phänotyps beteiligt sein. Allerdings erfüllt OTD-1
vielfältige Rollen innerhalb der frühen Embryogenese, was die Interpretation er-
schwert. Seine frühe ubiquitäre Expression fungiert als eine Art allgemeiner antia-
poptotischer Faktor und ist für die Ausbildung dorso-ventraler Polarität in sehr frühen
Stadien wichtig, was wiederum wesentlich für die Bildung der Anlage des anterioren
Kopfes ist (Kotkamp et al., 2010). Außerdem hängt der größte Teil der Serosa von
OTD-1-Aktivität ab (Schröder, 2003). So sind die Blastodermdomänen von giant und
kni nach otd-1-RNAi im Zuge einer koordinierten „fate-map“ Verschiebung nach
anterior verlagert und wegen des fehlenden anterioren Kopfes verkleinert (Kotkamp
et al., 2010). Später ist otd-1 als Kopf-Gap-Gen nötig für die Ausbildung des Labrums
und der Antennen (Schinko et al., 2008). Die Funktion innerhalb des dorso-ventralen
Systems, die den Verlust des anterioren Kopfes zur Folge hat, könnte in RNAi-
Experimenten einen direkten Einfluss auf gt und kni innerhalb eben dieser Region
verdecken, der sich dann nach nos/pum-RNAi auswirken könnte. Die Expression von
OTD-1 ist allerdings nach nos/pum-RNAi nicht offensichtlich verändert. Sollte den-
noch eine Interaktion bestehen, so müsste diese sehr subtil sein, etwa eine leichte
Veränderung des Expressionsniveaus oder der zeitlichen Dynamik der OTD-1-
Expression. So könnte möglicherweise ein durch die Derepression erhöhtes, oder
länger persistierendes hohes OTD-1-Niveau innerhalb des Bereiches des zukünfti-
gen anterioren Kopfes zu einer verstärkten Aktivierung von gt und kni führen. In
Drosophila-pumilio-Mutanten werden anteriore Defekte tatsächlich durch eine ver-
längerte Stabilität der bcd-mRNAs und damit einem längeren Vorhandensein des
BCD-Proteins hervorgerufen (Gamberi et al., 2002).
Kein weiteres der bisher in Tribolium untersuchten Gene eignet sich als Kandidat
für einen anterioren Faktor dessen Derepression durch NANOS und PUMILIO zu den
103

I. 3. Diskussion
beobachteten Auswirkungen auf eve, gt und kni führen könnte. Es besteht allerdings
natürlich die Möglichkeit, dass der verantwortliche Faktor durch den bisher vor allem
verfolgten Kandidatengenansatz mit Drosophila-Orthologen nicht entdeckt wurde. In
der Tat bestehen noch diverse Lücken innerhalb des blastodermalen Musterbil-
dungssystems (s. 3.5). So ist beispielsweise unklar wie die Expression des für einen
Teil der CAUDAL-Regulation verantwortlichen Faktors mex-3 innerhalb des anterio-
ren Kopfes initiiert wird (Schoppmeier et al., 2009), wofür also auch ein Faktor inner-
halb anteriorer Bereiche des Embryos benötigt würde. Ein solcher Faktor X könnte
ähnlich wie bcd in Drosophila (Frigerio et al., 1986; Berleth et al., 1988) als maternale
mRNA am anterioren Pol lokalisiert werden und einen Proteingradienten bilden. Die
anteriore Lokalisierung der maternale RNAs der Gene eagle und pangolin zeigt, dass
die dafür notwendige Maschinerie in Tribolium vorhanden ist (Bucher et al., 2005).
Das Ausbreiten des Faktor X-Gradienten nach posterior könnte dann durch die
Funktion von NANOS und PUMILIO begrenzt werden. So wären NOS und PUM zwar
an der Feinregulation des Gradienten beteiligt, ihr Fehlen würde den Gradienten aber
nicht vollständig aufheben, was eine mögliche Erklärung für die lokale Begrenzung
der anterioren Defekte böte. Die Derepression des Faktors X könnte dann direkt oder
indirekt einen aktivierenden Effekt auf die Expression von gt und kni innerhalb des
Bereichs der zukünftigen Anlagen des anterioren Kopfes vermitteln.
104
Mittlere oder niedrige Konzentrationen des Faktors X innerhalb anteriorer Anla-
gen könnten außerdem eine Rolle für die bisher ungeklärte Aktivierung von mex3 im
anterioren Kopf und für die Bildung des ersten eve-Streifens spielen, dessen Regula-
tion selbst in Drosophila noch weitgehend unverstanden ist (Fujioka et al., 1999).
Eine Überaktivierung von mex-3 durch den dereprimierten Faktor X könnte zu einer
verstärkten oder beschleunigten CAD-Repression führen und somit die Bildung des
ersten eve-Streifens, der sehr sensitiv auf die Reduktion der CAD-Aktivität reagiert
(Schoppmeier et al., 2009), verhindern.
Es wird also deutlich, dass gerade die regulativen Interaktionen innerhalb des
Tribolium Blastoderms, die zu den ersten Regionalisierungen und zur anterioren
Segmentierung des Tribolium-Embryos führen, noch weitgehend unverstanden und
nicht alle beteiligten Faktoren bekannt sind. Genauere Analysen der Expressions-
muster von gap- und Kopfgenen und deren Interaktionen sowie die Suche nach
neuen, wichtigen anterioren Faktoren der Tribolium Embryogenese werden helfen
die Kopfdefekte nach nos/pum-RNAi besser zu verstehen, und das genetische

I. 3. Diskussion
Netzwerk, das zur Regionalisierung des Tribolium-Blastoderms führt zu entschlüs-
seln.
3.3. Wo wirken nanos und pumilio?
Die beschriebenen, distinkten RNAi-Phänotypen legen nahe, dass nanos und
pumilio im Tribolium-Embryo spezifische Aufgaben für die Musterbildung erfüllen,
und eher keine allgemeinen Funktionen, beispielsweise beim Abbau von mRNAs
oder der Zellzykluskontrolle wahrnehmen. So stellt sich die Frage, wie die Funktion
von nanos und pumilio auf bestimmte Bereiche des Embryos beschränkt wird. In
Drosophila wird die Funktion des nanos/pumilio-Komplexes über die Lokalisierung
der nos-mRNA am posterioren Pol des Embryos räumlich begrenzt (Wang und
Lehmann, 1991). In Tribolium, wie in Drosophila, ist die maternale pumilio-mRNA
ubiquitär verteilt, so dass auch hier nanos die räumliche Spezifität vermitteln sollte.
Wie in 2.2.2 beschrieben war es allerdings nicht möglich, nanos-mRNA- oder Prote-
inexpression in situ zu detektieren, obwohl die mRNA durch RT-PCR über alle Ent-
wicklungsstadien nachweisbar war, und die RNAi-Phänotypen deutlich die Aktivität
des Tribolium-nanos-Gens belegen.
Die whole-mount in-situ-Hybridisierung an Tribolium-Embryonen ist eine gut etab-
lierte Methode (z.B. Sommer und Tautz, 1993; Brown et al., 1994a) und wird auch in
Erlangen seit Jahren erfolgreich angewandt. Somit ist es unwahrscheinlich, dass rein
technische Schwierigkeiten den Grund für das Fehlen des Nachweises in situ dar-
stellen. Trotzdem wurde versucht durch unterschiedliche Färbemethoden die Sensiti-
vität zu erhöhen sowie die Permeabilität der Gewebe und die Länge und Sequenz
der Sonden zu variieren (s. 4.2.1). Der Vergleich mit durchgeführten Positivkontrollen
und die Erfahrung mit in-situ-Hybridisierungen anderer Tribolium-Gene, wie sie
mehrfach auch in dieser Arbeit gezeigt werden, macht deutlich, dass Sonden, Emb-
ryonen und Fehler in der Methode als Grund für den fehlenden Nachweis ausge-
schlossen werden können. Der erfolglose Einsatz von polyklonalen Antiseren gegen
zwei synthetisch hergestellte Peptide des NANOS-Proteins (Eurogentech, Köln,
Deutschland/Seraing, Belgien; s. 4.2.2) könnte dagegen auf rein technische Schwie-
rigkeiten zurückzuführen sein. Obwohl die Auswahl der Peptide von Fachleuten der
Firma Eurogentec getroffen wurde, ist es durchaus möglich, dass diese Epitope im
nativen bzw. fixierten Protein nicht ausreichend zugänglich waren und somit der
105

I. 3. Diskussion
Nachweis eines möglicherweise in geringen Konzentrationen vorliegenden Proteins
verhindert wurde.
106
Tribolium-nanos ist anhand seiner charakteristischen Zink-Finger-Domäne (Curtis
et al., 1997) zweifelsfrei als nanos-Ortholog zu identifizieren. Diese Domäne ist durch
die invarianten, ungewöhnlichen Abstände der funktionellen Aminosäuren unver-
wechselbar (Curtis et al., 1997). Dies zeigt zwar, dass es sich bei dem hier unter-
suchten Gen um ein nanos-Ortholog handelt, nicht aber, dass es das einzige im
Tribolium Genom ist. Das Vorhandensein eines weiteren nanos-Homologs würde die
Möglichkeit eröffnen, dass es sich bei dem hier beschriebenen nanos-Gen um ein
inaktiviertes, Pseudogen-ähnliches Paralog handelt (D'Errico et al., 2004). Dessen
mRNA würde dann zwar noch produziert werden, was den Nachweis durch RT-PCR
ermöglichen würde, müsste dann aber schnell degradieren, so dass der in situ
Nachweis verhindert würde. Diese Erklärung ist möglich, scheint aber unwahrschein-
lich. Naszierende RNAs können auch mit Standard-Methoden im Kern nachgewiesen
werden (z.B. knirps, nicht gezeigt), so dass also die Degradierung der reifen mRNA
alleine den mangelnden in situ Nachweis nicht erklären kann. Außerdem konnten im
Tribolium Genom keine weiteren Sequenzen identifiziert werden, deren putative
Proteinsequenzen zumindest Ähnlichkeiten zu Teilen der bekannten NANOS-
Proteine aufweisen. Innerhalb des sequenzierten Genoms gibt es also kein weiteres
nanos-Homolog. Die Möglichkeit, dass ein solches in den unsequenzierten Berei-
chen des Tribolium Genoms liegt, ist nicht auszuschließen aber gering, da diese
Bereiche zum größten Teil aus repetitiven Sequenzen bestehen (Tribolium Genome
Sequencing Consortium, 2008). Die durch nanos-RNAi hervorgerufenen Phänotypen
und deren Ähnlichkeit zu den pum-RNAi-Effekten schließlich, zeigen deutlich, dass
das hier untersuchte nanos in Tribolium ein aktives, funktionelles Gen darstellt.
Möglicherweise ist die vorhandene nanos-mRNA in situ nicht für eine Hybridisie-
rung zugänglich. In Drosophila wird nanos-mRNA lokalisiert und streng translationell
reguliert, woran mehrere RNA-bindende Proteine beteiligt sind (Wharton und Struhl,
1989; Bergsten und Gavis, 1999; Bergsten et al., 2001; Zaessinger et al., 2006; Jain
und Gavis, 2008). Die bisher bekannte Tribolium-nanos-RNA ist deutlich kürzer als
die Drosphila-mRNA (1081 vs. 2347 Nukleotide), so dass vorhandene Proteine die
Hybridisierung stärker beeinflussen könnten. Allerdings sollten Dauer und Tempera-
tur der Hybridisierung in der Regel ausreichen, um eine durch Formaldehyd hervor-

I. 3. Diskussion
gerufene Vernetzung der Proteine und RNA wieder zu lösen. Eine übermäßige
Vernetzung könnte aber irreversibel sein (Masuda et al., 1999; Orlando, 2000).
Wie schon in 2.2.2 erwähnt, ist es die wahrscheinlichste Erklärung, dass die na-
nos Expressionstärke die Sensitivität der in-situ-Hybridisierung unterschreitet und so
der Nachweis verhindert wird. Die RT-PCR Experimente zeigen, dass das nanos-
Gen exprimiert und gespleißt wird (s. 2.2.2), lassen aber keine definitive Aussage
über die Expressionsstärke zu. Tribolium-nanos-Expression konnte auch durch Real-
time-PCR-Experimente nachgewiesen werden, wobei ein vergleichsweise niedriges
Expressionslevel festgestellt wurde (Dr. Joel Savard, persönliche Mitteilung). Diese
PCR-Methoden gelten, zumindest in anderen Systemen (Biedermann et al., 2004),
als sensitiver im Vergleich zu colorimetrischer ISH. Eine Erklärung für ein niedriges
nanos Expressionsniveau könnte das Fehlen von Polzellen und eines ausgeprägten
Polplasmas in Tribolium bieten (Grünfelder, 1998). In Drosophila ist die nanos-mRNA
zunächst auf das Polplasma und dann auf die Polzellen begrenzt (Wang und Leh-
mann, 1991; Gavis und Lehmann, 1992). Ohne die Bildung eines Polplasmas unter-
bleibt möglicherweise eine ausgeprägte Konzentrierung der für die primordialen
Keimzellen nötigen Faktoren, was zu einer breiteren Verteilung der RNAs und niedri-
gerer lokaler Konzentration führen könnte. Wenn man also von einer zu Drosophila
konservierten posterioren Lokalisierung von nanos ausgeht, würde in einer Spezies
ohne Polzellen auch eine weniger ausgeprägte Lokalisierung ausreichen, was die
Detektion erschweren könnte. Die Ausbildung eines Gradienten ist natürlich auch
von einer mRNA die sich innerhalb eines etwas größeren Bereichs des posterioren
Embryos befindet möglich, ähnlich wie bei bcd am anterioren Pol von Drosophila-
Embryonen (Berleth et al., 1988; St Johnston et al., 1989).
In Zukunft können möglicherweise sensitivere Detektionsmethoden wie z.B. in-
situ-RT-PCR (Abdel-Latief, 2007; Abdel-Latief et al., 2008), Reportergenkonstrukte
oder Antikörper gegen das vollständige NANOS-Protein helfen, diese Lücke zu
schließen.
nanos-mRNA könnte lokalisiert sein
Im Folgenden möchte ich die Möglichkeiten einer lokalisierten nanos-Aktivität be-
sprechen, die es erlauben würden dem nanos/pumilio-Komplex räumliche Spezifität
zu vermitteln.
Die beschriebenen anterioren und posterioren Defekte erfordern nanos Aktivität
an unterschiedlichen Orten des Tribolium-Embryos. Das Auftreten der posterioren
107

I. 3. Diskussion
Effekte, also Defekte im posterioren Blastoderm und Keimrudiment, sowie die Re-
duktion abdominaler Segmente (s. 2.4) ließe sich auf eine am posterioren Pol lokali-
sierte NANOS-Expression zurückführen, die nur dort ihre Wirkung entfalten müsste.
Mit einer solchen auf den posterioren Pol beschränkten Aktivität ließen sich aber die
anterioren Phänotypen, die sich innerhalb der Kopfanlage beobachten lassen (s.
2.5), nicht erklären. Diese erfordern eine zusätzliche nanos Aktivität in anterioren
Bereichen. Eine Möglichkeit hierfür wäre beispielsweise die zusätzliche anteriore
Lokalisierung maternaler nanos-mRNA. Die Lokalisierung der maternalen RNAs der
Gene eagle und pangolin am anterioren Pol zeigt, dass die zelluläre Maschinerie für
diesen Prozess prinzipiell in Tribolium existiert (Bucher et al., 2005). Von dieser
anterioren nanos-mRNA ausgehend ließen sich dann die anterioren Phänotypen
erklären (s. 3.2), wenngleich sich die in schwächeren nanos-RNAi auftretenden
Transformationen des labialen Segments zu thorakalem Schicksal in diesem Fall
kaum noch im direkten Einflussbereich einer solchen Domäne befinden dürften.
Außerdem müsste man sich die Frage stellen, warum die Wirkung einer anterior
lokalisierten RNA erst in zentralen Bereichen des Embryos zu Defekten führt und
nicht schon in weiter anterior liegenden Bereichen. Eine einfachere, und im Hinblick
auf Drosophila konservativere, Erklärung aller Phänotypen böte ein von einer poste-
rior lokalisierten nanos-mRNA ausgehender NANOS Gradient. Dieser könnte bis in
die zentralen Bereiche des Blastoderms wirken, und am posterioren Pol mit höchster
Konzentration seine Rolle für die Anlage bzw. Funktion der Wachstumszone erfüllen.
Niedrige Konzentrationen innerhalb der anterioren Bereiche der zukünftigen Embry-
onalanlage könnten ausreichen, um die dort nötigen subtilen Effekte zu erzielen, die
für die Ausprägung des anterioren Kopfes nötig sind. Vorstellbar ist auch, dass ein
solcher Gradient nur bei einer bestimmten, relativ geringen Niveauabsenkung zu
Phänotypen innerhalb des labialen Segments führen könnte.
108
Des weiteren wäre es möglich, dass nanos-mRNA zusätzlich zu einer posterioren
Lokalisation auf niedrigem Niveau im gesamten Embryo exprimiert wird. Dies ent-
spräche der frühen nanos-Expression in Drosophila-Embryonen, wo allerdings von
nicht lokalisierter mRNA kein Protein synthetisiert wird (Bergsten und Gavis, 1999).
Eine solche ubiquitäre Expression könnte an der Entstehung des anterioren Phäno-
typs beteiligt sein und beispielsweise eine Rolle für die Feinregulation der Gap-Gen-
Domänen spielen.

I. 3. Diskussion
Natürlich gibt es auch die Möglichkeit, dass ein weiterer, zusätzlicher Faktor, der
gemeinsam mit NOS und PUM die Ziel-mRNAs bindet für die räumliche Spezifität
des NOS/PUM-Komplexes verantwortlich ist. Ein solcher Faktor ist momentan aller-
dings rein spekulativ, könnte aber auf ähnliche Art und Weise wie oben für nanos
besprochen die Ortsspezifität des Komplexes vermitteln.
Auch der Blick auf die Situation in anderen Insektenarten macht keines dieser
Modelle deutlich wahrscheinlicher, da sich eine große Varianz zeigt. Die veröffent-
lichten Daten sprechen allerdings auch nicht gegen eine konservierte posteriore
Lokalisierung der nanos-mRNA in Tribolium. In etlichen Arten wird nanos mit einem
posterioren Fokus exprimiert, dieser stellt jedoch nicht immer die einzige Expressi-
onsdomäne dar. Innerhalb der Langkeim Insekten scheint eine Lokalisierung der
maternalen nanos RNA am posterioren Pol konserviert zu sein, so zu finden in
Drosophila, Apis oder Nasonia (Wang und Lehmann, 1991; Dearden, 2006; Olesni-
cky und Desplan, 2007), allerdings findet sich sogar innerhalb der Dipteren Expressi-
on in anderen Bereichen. So ist in den Moskitos Anopheles gambiae und Culex
quinquefasciatus transiente anteriore Lokalisierung von nanos-mRNA, und in der
Winterschwebfliege Episyrphus balteatus sogar eine zusätzliche ubiquitäre Kompo-
nente nachweisbar (Goltsev et al., 2004; Juhn et al., 2008; Lemke und Schmidt-Ott,
2009). Auch in Kurzkeimern finden sich unterschiedliche Expressionsmuster. So wird
in der Heuschrecke Schistocerca americana zwar maternale RNA im posterioren
Bereich der Oozyte deponiert, jedoch davon kein Protein synthetisiert. Erst in späte-
ren Keimrudimentstadien wird NANOS dann zygotisch an posteriorer Position expri-
miert (Lall et al., 2003). Der Seidenspinner Bombyx besitzt gar vier nanos-Orthologe,
die ubiquitäre maternale Expression, Expression in den primordialen Keimzellen,
zygotische posteriore Expression und diverse Expressionsmuster in weiteren Gewe-
ben zeigen (Nakao et al., 2008). Wie groß neben dieser Varianz der Expressions-
muster die Konservierung der nanos/pumilio Funktion ist, bleibt aus Mangel an
funktionellen Studien ebenso offen.
Ein vom posterioren Pol ausgehender nanos-Gradient, der bis in anteriore Bereiche
des Embryos wirkt, bietet also bei diesem Stand der Analyse die einfachste und
durchaus nicht unwahrscheinliche Erklärung für die räumlich spezifische Funktion
des nos/pum-Komplexes.
109

I. 3. Diskussion
Abb. 24: Schema der Funktion von nanos und pumilio in frühen Tribolium-Embryonen
Schematische Darstellung der Regionalisierung des Tribolium Blastoderms. NANOS und
PUMILIO wirken innerhalb der posterioren Hälfte, möglicherweise durch einen, bisher nicht
nachweisbaren, posterior nach anterior verlaufenden nanos-Gradienten. Höchste Konzentrationen
am posterioren Pol sind, gemeinsam mit der Aktivität des torso-Signalwegs (TOR*),
wichtig für die Ausbildung oder die Funktion der Wachstumszone (WZ). Außerdem ist es
möglich, dass sie dort HB regulieren. Niedrigere Konzentrationen in zentralen Bereichen
könnten einen unbekannten anterioren Faktor X regulieren oder in subtilem Maße auf OTD-
1-Expression einwirken.
110

I. 3. Diskussion
3.4. Das Zusammenspiel von terminalen und posterioren Signa-
len stellt möglicherweise einen konservierten Mechanismus
dar
In Drosophila besteht die Musterbildungsfunktion von nanos und pumilio in der
Regulation der maternalen hb-mRNA und der Begrenzung der HB-Expression auf die
anteriore Hälfte des Embryos (Hülskamp et al., 1989; Irish et al., 1989a). Diese
Regulation ist notwendig, um im posterioren Bereich des Embryos die Bildung des
Abdomens zu ermöglichen (St Johnston und Nüsslein-Volhard, 1992). In Abwesen-
heit der ubiquitären maternalen hb-mRNA ist allerdings auch die Aktivität des
nos/pum Komplexes verzichtbar für die Segmentierung, er erfüllt also keine weiteren
Funktionen für die Morphogenese (Hülskamp et al., 1989; Irish et al., 1989a; Struhl,
1989).
Ob nanos und pumilio, in Analogie zu Drosophila, auch in Tribolium einen Ein-
fluss auf die maternale hb-mRNA haben, ist unklar. Es ist außerdem fraglich, ob eine
solche eine ähnlich zentrale Rolle spielen könnte. In Tribolium als Kurzkeiminsekt
findet die Bildung abdominaler Segmente im Vergleich zu Drosophila erst deutlich
später unter zygotischer Kontrolle statt (Schröder et al., 2008), wobei also die mater-
nale hunchback-Komponente nicht mehr zum Tragen kommen kann. Ein Effekt auf
die Anlage der Wachstumszone, z.B. durch eine Regulation der posterioren gt-
Domäne, könnte allerdings vorhanden sein (s. 3.1).
Die Notwendigkeit maternale hb-mRNA im posterioren Bereich des Blastoderms
zu reprimieren um die Bildung abdominaler Segmente zu erlauben, könnte eine
prinzipiell wichtige Rolle für die Langkeimentwicklung spielen. Allerdings scheint dies
in unterschiedlichen Langkeiminsekten variabel. Beweise für eine wichtige Rolle
existieren nur in Drosophila. Das Vorhandensein einer translationellen Regulation
maternaler hb RNA wurde zwar auch in Nasonia gezeigt (Pultz et al., 2005), ob diese
aber eine wichtige Funkton hat und von nanos und pumilio abhängt ist unbekannt.
Nasonia-nanos-RNAi-Phänotypen ähneln allerdings den nanos-Drosophila-Mutanten
(J. Lynch, persönliche Mitteilung). Selbst innerhalb der Dipteren scheint das System
nicht konserviert zu sein. So gibt es beispielsweise in dem Moskito Anopheles gam-
biae und der Schwebfliege Episyrphus balteatus keine maternale hb-Expression
(Goltsev et al., 2004; Lemke und Schmidt-Ott, 2009). Die in Episyrphus durchgeführ-
ten funktionellen Studien zu nanos/pumilio zeigen dann auch tatsächlich, dass die
111

I. 3. Diskussion
nanos Funktion in dieser Situation entbehrlich zu sein scheint (Lemke und Schmidt-
Ott, 2009).
112
In Kurzkeimembryonen sind die vorhandenen Daten ebenfalls nicht einheitlich
und sehr variabel. Während in Tribolium eine translationelle Regulation postuliert
wurde (Wolff et al., 1995), ist in der Wanze Oncopeltus fasciatus unklar, ob die
Entwicklung der frühen hb-Expression unter Beteiligung von translationeller Kontrolle
stattfindet (Liu und Kaufman, 2004). Im Seidenspinner Bombyx mori und der Heu-
schrecke Schistocerca americana fehlt wiederum maternale hb-RNA, wobei in bei-
den Arten die Expressionsmuster eine zygotische Regulation von hb durch nanos
zumindest für begrenzte Zeit vermuten lassen (Bombyx, nanosP) bzw. stark nahe
legen (Schistocerca) (Lall et al., 2003; Nakao et al., 2008).
Die vorhandenen Daten weisen also darauf hin, dass die Regulation von mater-
naler hb-mRNA durch nanos/pumilio kein hoch konservierter Zusammenhang ist und
deren Bedeutung in Drosophila eine Ausnahme darstellen könnte.
In Drosophila wurde eine weitere Funktion von nanos beschrieben, die mögli-
cherweise eine anzestrale Musterbildungsfunktion darstellen könnte. Dort interagiert
nanos mit dem terminalen System und trägt einen Teil zur Aktivierung terminaler
Zielgene bei, indem es Einfluss auf die Expression des Repressors CAPICUA nimmt
(Cinnamon et al., 2004). Dieser Effekt bleibt allerdings von untergeordneter Bedeu-
tung. Die in dieser Arbeit gezeigten Ergebnisse lassen vermuten, dass eine solche
Interaktion von nanos und pumilio mit dem terminalen System auch in Tribolium
besteht (s. 3.1). Beide Gene scheinen hier auf die Expression terminaler Zielgene
einzuwirken und damit Einfluss auf die Funktion der posterioren Wachstumszone zu
nehmen. Das terminale System ist in Tribolium nötig für die Bildung aller abdomina-
len und des dritten thorakalen Segments (Schoppmeier und Schröder, 2005) und
spielt somit eine wichtigere Rolle als in Drosophila, wo sich der Einfluss auf das
posteriore Abdomen der Larve beschränkt (Furriols und Casanova, 2003). Die Aktivi-
tät am posterioren Pol früher Tribolium-Embryonen ist offensichtlich nötig für die
Anlage der Wachstumszone. Um diesen wichtigen Prozess sicher zu stellen, könnte
sich in Tribolium auch der Einfluß von nanos und pumilo auf die Expression termina-
ler Zielgene verstärkt haben, der ja in Drosophila keine wichtige Rolle spielt
(Cinnamon et al., 2004). Kürzlich wurde eine Verbindung zwischen der Rolle von
NOS für die Expression terminaler Zielgene und der Regulation von HB in Drosophila
aufgezeigt (Kim et al., 2010c). Dort scheint HB im Falle einer posterioren Derepres-

I. 3. Diskussion
sion als Substrat der von TORSO aktivierten MAP-Kinase zu fungieren und als
solches mit dem Repressor CAPICUA zu kompetitieren, wodurch dieser terminal
nicht vollständig inaktiviert wird, so dass wiederum die Expression terminaler Zielge-
ne stäker reprimiert wird. Ein ähnlicher Zusammenhang könnte auch in Tribolium
bestehen, wenn man davon ausgeht, dass HB von NOS/PUM am posterioren Pol
reprimiert wird.
Die Bedeutung des torso-Signalwegs für die Tribolium Wachstumszone eröffnet
die Möglichkeit, dass Faktoren des terminalen Systems eine ursprünglich wesentli-
che Rolle für die Bildung abdominaler Segmente einnehmen. So ist tll beispielsweise
in der Hymenoptere Nasonia tatsächlich notwendig für die Bildung der fünf posterio-
ren abdominalen Segmente (Lynch et al., 2006), wobei allerdings die Aktivierung der
tll-Expression nicht vom torso-Signalweg abhängt, dessen Komponenten zumindest
teilweise in Hymenopteren fehlen (Dearden et al., 2006; Honeybee Genome Se-
quencing Consortium, 2006). In Anbetracht der großen Varianz im Auftreten mater-
naler hb-mRNA könnte die in Drosophila wahrscheinliche und in Tribolium mögliche
Interaktion von nanos und dem terminalen System tatsächlich eine evolutionär alte
Verbindung sein, die innerhalb der als anzestral angesehenen Kurzkeimentwicklung
(Davis und Patel, 2002) die Segmentbildung aus der posterioren Wachstumszone
sicherstellt und damit eine wichtige Musterbildungsfunktion erfüllt. Für die Überprü-
fung dieser These werden zusätzliche Erkenntnisse aus Kurzkeiminsekten weiterer
Phyla wie Oncopeltus oder Gryllus wertvolle Beiträge leisten.
113

I. 3. Diskussion
3.5. Die antero-posteriore Achse im Tribolium-Blastoderm
114
Am Beginn dieser Arbeit stand die These im Raum, dass otd-1 und hb in Triboli-
um ähnliche Aufgaben übernehmen wie bicoid in Drosophila und instruktive Funktion
für die Bildung der blastodermalen Segmentanlagen haben (Schröder, 2003). nanos
und pumilio sollten ihre Expression von posterior reprimieren und somit den initial
ubiquitären Faktoren räumliche Asymmetrie geben (Wolff et al., 1995; Schröder,
2003). Dieses Modell konnte durch die vorliegende und andere Arbeiten der letzten
Jahre nicht bestätigt werden. So zeigte sich, dass hb nicht wie angenommen für die
Ausbildung von Segmentanlagen des zukünftigen Gnathums nötig ist, sondern
vielmehr durch die Regulation von Hox-Genen deren Identität vermittelt und stattdes-
sen an der Bildung abdominaler Segm ente beteiligt ist (Cerny, 2007; Marques-
Souza et al., 2008). otd-1 erfüllt zwar diverse Funktionen innerhalb des frühen Tribo-
lium-Embryos, der transiente Gradient scheint aber ebenfalls keine instruktive Funk-
tion für die Bildung anteriorer Segmentanlagen zu haben. So kommt es nach otd-1-
RNAi zwar zu „fate-map“-Verschiebungen, die gnathalen Segmente werden aber
angelegt (Kotkamp et al., 2010). Schließlich wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass
nanos und pumilio nicht für die OTD-1-Repression in der posterioren Hälfte des
Embryos verantwortlich sind, und sie somit nicht im vermuteten Sinne den posterio-
ren Gegenspieler darstellen, welcher folglich unbekannt bleibt. Die Beteiligung an der
posterioren Repression von HUNCHBACK konnte allerdings nicht ausgeschlossen
werden.
In der vorliegenden Arbeit konnte ich zeigen, dass nanos und pumilio aber
durchaus Funktionen für die Tribolium Embryogenese erfüllen. Sie wirken dabei auf
zwei räumlich getrennte Bereiche. Einerseits auf die Bildung abdominaler Segmente,
andererseits auf die Entwicklung des antennalen und mandibulären Segments und
des anterioren Kopfes. Beide Funktionen stehen wahrscheinlich mit einer Beteiligung
an der Musterbildung in blastodermalen Stadien in Zusammenhang. Vermutlich
vermittelt nanos, ebenso wie in Drosophila (Wang und Lehmann, 1991), die räumli-
che Spezifität des Komplexes über einen posterior-anterioren Gradienten. Dabei
wirken nanos und pumilio innerhalb des Bereichs der postulierten höchsten Konzent-
ration auf die korrekte Etablierung der Wachstumszone, indem sie parallel zum torso-
Signalweg offenbar auf die Expression terminaler Zielgene, zumindest aber auf die
Aktivierung von tll, gt und kni einwirken. In der Folge könnte der Verlust der posterio-

I. 3. Diskussion
ren gt-Domäne über eine fehlende Aktivierung des Paar-Regel-Gen-Regelkreises in
der Wachstumszone die Wirkung auf die abdominale Segmentierung vermitteln.
Diese Wirkung könnte auf einem bereits postulierten „Induktions-Ketten“ Mechanis-
mus der posterioren Gap-Gen-Domänen während der Achsenelongation basieren
oder auch auf eine Rolle für den Beginn des „pair-rule circuits“ zurückzuführen sein
(Bucher und Klingler, 2004). Bei der Etablierung der Wachstumszone und mögli-
cherweise auch bei der Aktivierung der posterioren gt- und kni-Domänen könnte
auch die postulierte (aber nicht überprüfbare) posteriore Repression von HB eine
Rolle spielen.
Die Anahme eines nanos-Gradienten ist die einfachste Erklärung für die posterio-
ren und die anterioren Effekte nach nanos/pumilio-RNAi. Durch einen bis in die
zentralen Bereiche des Embryos reichenden Gradienten könnten nanos und pumilio
auch dort ihre Funktion entfalten. Offenbar sind sie hier an der Regulation der anteri-
oren Domänen von gt und kni und der Etablierung des ersten eve-Streifens beteiligt.
Möglicherweise haben NOS/PUM einen subtilen Einfluss auf die Regulation von
OTD-1, oder sie reprimieren die Translation eines bisher unbekannten, anterioren
Faktors X, dessen mRNA, ähnlich wie bcd in Drosophila (Driever und Nüsslein-
Volhard, 1988a) oder eagle und pangolin in Tribolium (Bucher et al., 2005), anterior
lokalisiert sein könnte. Dieser wiederum könnte an der Positionierung eines gt/kni-
Repressors beteiligt sein, der früh innerhalb der Bereiche der späteren anterioren
Kopfanlage aktiv ist. nanos und pumilio sind also wahrscheinlich indirekt an der
Positionierung der Gap-Gen-Domänen innerhalb des Blastoderms beteiligt.
Die Untersuchung der nanos/pumilio-Funktion hat in Bezug auf die Prozesse im
Tribolium Blastoderm Lücken aufgezeigt. So bleibt beispielsweise ungeklärt, welcher
Faktor für die posteriore Repression von otd-1 verantwortlich ist. Die anterioren
Effekte nach nos/pum legen die Existenz von zwei noch unbekannten Faktoren nahe
und es wird klar, dass die frühe Regulation der blastodermalen Domänen von Genen
wie gt oder kni noch kaum verstanden ist. Dennoch erlauben es die heute bekannten
Daten, ein Bild der blastodermalen Musterbildung in Tribolium zu zeichnen, dessen
Lücken, offene Fragen und Spekulationen im Laufe der kommenden Jahre zu schlie-
ßen und aufzuklären sind.
Im Prinzip lässt sich die frühe Entwicklung von Tribolium bis zum differenzierten
Blastoderm in drei Phasen bzw. Prozesse einteilen. Zu Beginn erfolgen die frühen
Kernteilungszyklen und die Bildung des Blastoderms. Diese Phase ist geprägt von
115

I. 3. Diskussion
zunächst relativ statischen Proteinverteilungen ausgehend von maternalen mRNAs,
deren Expressionsdomänen dann aber zunehmend reguliert werden. Um den Zeit-
punkt der Aktivierung des zygotischen Genoms im noch undifferenzierten Blastoderm
finden dann in einem sehr schnell ablaufenden Prozess regulative Interaktionen ab,
die sowohl die maternalen Faktoren als auch die aufkommenden frühen zygotischen
Gene auf immer genauer definierte Expressionsdomänen eingrenzen, also eine
Phase der Regionalisierung. Diese geht fließend in ein Stadium über, in dem nun,
teilweise schon morphologisch sichtbar, Schicksale determiniert werden: Serosa-
und Embryonalanlage sind anhand der Zellmorphologie unterscheidbar, die posterio-
re Invagination beginnt, erste Segmentanlagen werden spezifiziert. Die Beschreibung
dieser „Phasen“ stützt sich sowohl auf Expressionsdaten als auch auf morphologi-
sche Beschreibungen, folgt aber keinen exakten Kriterien, sondern gruppiert die
Prozesse in frühen Tribolium-Embryo eher in thematische Kategorien (Brown et al.,
1994c; Nagy und Carroll, 1994; Sommer und Tautz, 1994; Wolff et al., 1995; Li et al.,
1996; Brown et al., 1997; Grünfelder, 1998; Schulz et al., 1998; Chen et al., 2000;
Handel et al., 2000; Schröder et al., 2000; Schröder, 2003; Bucher und Klingler,
2004; Bucher et al., 2005; Cerny et al., 2005; Schoppmeier und Schröder, 2005; van
der Zee et al., 2005; Choe et al., 2006; Savard et al., 2006a; Cerny et al., 2008;
Marques-Souza et al., 2008; Schinko et al., 2008; Schoppmeier et al., 2009; Kot-
kamp et al., 2010).
Maternale Phase:
Die Asymmetrien, die der Tribolium-Oozyte während der Oogenese vermittelt
werden, müssen in der Embryonalentwicklung bei der Etablierung der anteroposteri-
oren Achse umgesetzt werden. An dieser Umsetzung sind diverse bereits aus Dro-
sophila bekannte Faktoren beteiligt, einige Komponenten sind aber nach wie vor
unbekannt. Ähnlich wie in Drosophila lassen sich anteriore, posteriore und terminale
Systeme unterscheiden, die eng miteinander vernetzt sind. Das terminale System ist
dabei sowohl für die Anlage der Serosa als auch für die Etablierung der posterioren
Wachstumszone nötig, und erfüllt damit eine wichtigere Rolle als beispielsweise in
Drosophila (Schröder et al., 2000; Furriols und Casanova, 2003; Schoppmeier und
Schröder, 2005). Auch die frühe otd-1-Expression ist wichtig für die Etablierung der
Serosaanlage (Kotkamp et al., 2010), möglicherweise wirken OTD-1 und TORSO
dort synergistisch auf die Expression von zen-1 und -2 ein (vgl. (Finkelstein und
Perrimon, 1990; van der Zee et al., 2005; Koniszewski, 2007; Kotkamp et al., 2010).
116

I. 3. Diskussion
Außerdem hat otd-1 Einfluss auf die Bildung der dorso-ventralen Achse und ermög-
licht so die Ausbildung des anterioren Kopfes als ventraler Anlage. Die zunächst
maternal ubiquitäre otd-1-Expression wird wahrscheinlich durch einen bisher unbe-
kannten Faktor innerhalb der posterioren Hälfte des Embryos reprimiert, der dabei
entstehende transiente Protein-Gradient scheint aber keine Musterbildungsfunktion
inne zu haben (Kotkamp et al., 2010). Eine etwas spätere anteriore Repression
könnte in einer Art negativer Rückkopplung durch ZEN-1 vermittelt werden, oder
möglicherweise ähnlich wie in Drosophila durch das terminale System. Ebenfalls auf
die Bildung des anterioren Kopfes könnte der in dieser Arbeit postulierte anteriore
Faktor X einwirken. Er würde von NANOS/PUMILIO als posteriorem Repressor
reguliert und wäre an der Positionierung der anterioren Grenzen der kni- und gt-
Expressionsdomänen und an der Bildung des ersten eve-Streifens beteiligt. Außer-
dem könnte dieser Faktor X auch auf die Expression des zygotischen Faktors mex-3
innerhalb der Kopfanlage einwirken, der neben zen-2 in der Serosaanlage, die ma-
ternal ubiquitäre CAUDAL-Expression auf den posterioren Bereich des Embryos
begrenzt (Schoppmeier et al., 2009). CAD ist für die Ausbildung aller embryonalen
Segmente posterior des anterioren Kopfes wichtig und beeinflusst somit sowohl die
Bildung blastodermaler Segmentanlagen als auch die Funktion der Wachstumszone
(Copf et al., 2004). CAD ist dabei wichtig für die blastodermale eve-Expression und
könnte noch weiter reichenden aktivierenden Einfluss auf die zygotische Expression
von beispielsweise gt, kni und hb innerhalb der posterioren Hälfte des Blastoderms
haben, ähnlich wie CAD die Expression der posterioren Domänen von gt und kni in
Drosophila aktiviert (Rivera-Pomar et al., 1995; Schulz und Tautz, 1995). Die Ausbil-
dung der Anlage der posterioren Wachstumszone schließlich, findet offenbar in den
posteriorsten Bereichen des Embryos statt und erfordert sowohl die Aktivität von
torso, nanos und pumilio als auch von caudal und zygotischen Wnt-Genen (diese
Arbeit, (Copf et al., 2004; Schoppmeier und Schröder, 2005; Bolognesi et al., 2008b).
Außer diesen Faktoren, deren maternale Funktionen innerhalb des Blastoderms eine
Rolle spielen, haben auch die Gap-Gene giant und hunchback eine maternal ubiqui-
täre Expressionskomponente (Wolff et al., 1995; Bucher und Klingler, 2004). Die
Regulation dieser Expression auf die relativ klar abgegrenzten zygotischen Domänen
ist größtenteils noch nicht verstanden. Die anteriore Repression von gt könnte im
Bereich der Serosaanlage beispielsweise durch ZEN-1, und innerhalb der zukünfti-
gen Anlage des anterioren Kopfes durch einen von Faktor X positionierten Repressor
117

I. 3. Diskussion
vermittelt werden. hb hingegen bleibt in der Serosaanlage exprimiert und wird im
anterioren Kopf wahrscheinlich von einem anderen Faktor reprimiert. Die initiale
posteriore Repression von HB könnte durch nanos und pumilio vermittelt werden,
später wird die gnathale Expressionsdomäne von posterior durch Krüppel begrenzt
(Marques-Souza et al., 2008). Die posteriore Regulation der anterioren gt-Domäne
hingegen ist unbekannt und erfordert in frühen Stadien wohl wiederum die Aktivität
eines bisher nicht beschriebenen Faktors, könnte in späteren Stadien aber durch
Paar-Regel-Gene vermittelt werden.
Nach diesem Szenario würden also das terminale System, das anteriore System
aus Otd-1 und möglicherweise einem Faktor X, sowie das posteriore System mit
caudal, nanos, pumilio und einem unbekannten OTD-1-Repressor initiale räumliche
Information innerhalb des Tribolium-Blastoderms vermitteln.
Zygotische Regionalisierung:
Eine Reihe von Faktoren werden im weiteren Verlauf der Entwicklung in räumlich
und zeitlich dynamischen Expressionsdomänen exprimiert und verfeinern schließlich
die Regionalisierung des Embryos.
Obwohl für zen-1 maternale Expression beschrieben wurde (van der Zee et al.,
2005), ist über deren räumliche Ausdehnung nichts bekannt, weswegen ich beide
zen-Gene hier nochmals als anteriorste zygotische Faktoren erwähne. Ihre Expressi-
on hängt wahrscheinlich von otd-1 und dem terminalen System ab. ZEN-1 ist wichtig
für die Ausprägung der Serosaanlage (Li et al., 1996; van der Zee et al., 2005) und
könnte dort Gene wie gt, kni oder otd-1 reprimieren. ZEN-2 hingegen reprimiert
ebenfalls dort die Expression von CAD (Schoppmeier et al., 2009). Innerhalb der
Anlage des anterioren Kopfes werden zeitweilig hb, gt und kni exprimiert, und es
entstehen Expressionsdomänen der Gene mex-3 und mille-pattes. MEX-3 ist inner-
halb des anpterioren Kopfes nötig für die Repression von CAD und wirkt sich auch
auf alle gnathalen Segmente aus (Schoppmeier et al., 2009). Die Regulation der
mex-3-Expression ist noch unbekannt, denkbar wäre aber eine Beteiligung des
anterioren Faktor X, der möglicherweise in mittlerer oder niedriger Konzentration
aktivierend auf die anteriore mex-3-Domäne wirken könnte. Die anteriore Domäne
von mlpt wird von OTD-1 aktiviert, sie scheint allerdings nicht wesentlich zu sein
(Savard et al., 2006a; Kotkamp et al., 2010). hb, gt und kni werden innerhalb der
anterioren Kopfanlage später nicht mehr oder schwächer exprimiert, was auf einen
dortigen reprimierenden Einfluss hinweist, der im Falle von kni und gt auf die Funkti-
118

I. 3. Diskussion
on eines von Faktor X abhängigen Repressors zurückzuführen sein könnte. kni wird
vorher in einer breiten Domäne aktiviert und in der Folge ähnlich wie gt auf eine
relativ klare Domäne begrenzt. Auch hier ist, wie im Fall von gt, die Etablierung der
posterioren Grenze unklar. Ein aktivierender Einfluss von CAD auf die zygotischen,
anterioren Domänen von kni, gt und hb ist wie erwähnt denkbar. kni ist schließlich für
die Ausbildung des antennalen und mandibulären Segments wichtig, während gt und
hb vor allem für die Positionierung von Hox-Genen verantwortlich sind (Bucher und
Klingler, 2004; Cerny et al., 2008; Marques-Souza et al., 2008). Bisher wurden keine
Interaktionen der anterioren Domänen von hb, gt, kni und mlpt untereinander be-
schrieben, wobei fraglich bleibt, ob subtilere Effekte in blastodermalen Stadien auf-
grund der dynamischen Entwicklung möglicherweise nicht detektiert werden konnten.
Dies steht im Gegensatz zu den Interaktionen der posterioren Domänen, auf deren
Regulation während der Keimstreifstreckung ich hier nicht im Detail eingehen möchte
(Bucher und Klingler, 2004; Cerny et al., 2005; Savard et al., 2006a; Cerny, 2007;
Cerny et al., 2008; Marques-Souza et al., 2008). Initiiert wird deren Expression
allerdings, abgesehen von hb, am posterioren Pol des Blastoderms, unter Einfluss
des terminalen Systems (Schoppmeier und Schröder, 2005; Koniszewski, 2007). Im
posterioren Bereich des Blastoderms wird schließlich das Gap-Gen Krüppel aktiviert
(Cerny et al., 2005). Diese Aktivierung ist abhängig von hb (Marques-Souza et al.,
2008), während die Positionierung der anterioren Grenze z.T. durch gt-abhängige
Repression vermittelt wird (Cerny et al., 2005; Cerny, 2007). Kr wird damit vor allem
von anderen Gap-Genen reguliert. Die Expression dieser beschriebenen zygotischen
Expressionsdomänen hängt also von einem schnell ablaufenden Regulationssystem
aus bekannten und unbekannten, maternalen und zygotischen Faktoren ab, deren
Interaktionen wahrscheinlich vor allem reprimierenden Charakter haben. Durch
dieses System entstehen ähnlich wie im Drosophila Blastoderm räumlich begrenze
Expressionsdomänen, die die molekulare Grundlage für die Ausbildung unterschied-
licher Gewebe und Segmentanlagen darstellen.
Determinierung von Gewebeschicksalen:
Die Regionalisierung des Blastoderms in Bereiche differentieller Genexpression
führt nun zu Differenzierungsprozessen, die teilweise schon früh morphologisch
sichtbar werden, wie die veränderte Zellmorphologie der Serosa und die beginnende
posteriore Invagination, oder aber zunächst nur auf molekularer Ebene Auswirkun-
gen haben, wie die Bildung der Segmentanlagen. Während über die morphogeneti-
119

I. 3. Diskussion
schen Prozesse der extraembryonalen Membranen und der posterioren Invagination
im Prinzip nichts bekannt ist, hat man über den Verlauf der Segmentierung durchaus
Anhaltspunkte. Die posteriore Segmentierung in der Wachstumszone hängt in Tribo-
lium vermutlich von einem Paar-Regel-Gen-Regelkreis ab, der durch Interaktionen
der primären Paar-Regel-Gene even-skipped, odd-skipped und runt vermittelt wird
(Choe et al., 2006). Die Expression der ersten Streifen innerhalb des Blastoderms
hängt aber sicherlich auch von der Aktivität anderer Faktoren, wie den Gap-Genen
oder auch den maternalen Komponenten ab. Diese Regulation ist allerdings noch
wenig beschrieben. eve wird initial innerhalb der posterioren Hälfte des Blastoderms
aktiviert (Brown et al., 1997), als potentieller Aktivator kommt dabei CAD in Frage.
Die Positionierung der anterioren Grenze hängt zumindest unter anderem von der
Aktivität von OTD-1 ab (Kotkamp et al., 2010). An der Aktivierung des ersten eve-
Streifens sind CAD (Schoppmeier et al., 2009) und wahrscheinlich das System aus
anteriorem Faktor X und nanos/pumilio beteiligt. Offenbar ist hierbei eine bestimmte
Kombination aus Regulatoren notwendig, um die Ausbildung des ersten doppel-
segmentalen Streifens zu ermöglichen. So scheint also zumindest der erste eve-
Streifen einer streifenspezifischen Regulation zu unterliegen. Es wurde vermutet,
dass die Unterteilung der initialen eve-Domäne in die Streifen 1, 2 und 3 auf Repres-
sionsvorgänge zurückzuführen ist (Brown et al., 1997), und der „pair-rule circuit“
auch im Blastoderm wirkt (Choe et al., 2006). Wahrscheinlicher scheint aber, dass
eine streifenspezifische Regulation der blastodermalen Paar-Regel-Gen-Domänen
gemeinsam mit den Interaktionen zwischen eve, odd und runt wie sie im Modell des
Paar-Regel-Gen-Regelkreises bestehen, zur Festlegung der Segmentanlagen im
Blastoderm beitragen. So führt beispielsweise gt-RNAi zum weitgehenden Verlust
des zweiten runt-Streifens und zu einer Fusion der eve-Streifen 2 und 3. Diese
Defekte werden im weiteren Verlauf der Segmentierung teilweise wieder ausgegli-
chen, was eine ausgeprägte Plastizität des Systems deutlich macht (Cerny, 2007).
Nichtsdestotrotz hat gt offenbar einen direkten Einfluss auf die Paar-Regel-
Gendomänen, nämlich auf den zweiten runt-Streifen, was zum Verlust des zweiten
odd-Streifens und damit zur fehlenden Separierung der eve-Streifen 2 und 3 führen
könnte. Nach hb-RNAi werden innerhalb des Blastoderms zunächst nur zwei eve-
Domänen gebildet, ein Effekt, der ebenfalls im weiteren Verlauf der Entwicklung
korrigiert wird (Cerny, 2007). Die initiale blastodermale Expression von runt und odd
ist nicht veröffentlicht, möglicherweise könnte hb aber an der Positionierung der
120

I. 3. Diskussion
jeweiligen ersten Streifen von odd oder runt beteiligt sein. Das Fehlen einer dieser
Domänen könnte dann durch die Paar-Regel-Gen-Interaktionen dazu führen, dass
nur eine der normalerweise zwei Trennungen der initialen eve-Domäne innerhalb des
Blastoderms möglich ist. Untersuchungen der Enhancer-Elemente des in Paar-
Regel-Streifen exprimierten Gens hairy legen außerdem das Vorhandensein von
streifenspezifischen Elementen für einige der hairy-Streifen nahe (Eckert et al.,
2004). Es ist also wahrscheinlich, dass die blastodermalen Paar-Regel-Genmuster
durch initiale Aktivierung, vermittelt von den lokal begrenzten zygotischen und ma-
ternalen Komponenten, gefolgt von Paar-Regel-Gen-Interaktionen ähnlich denen des
Paar-Regel-Gen-Regulationskreises der Wachstumszonen etabliert werden. Bei
letzterem könnte vor allem die Repression angrenzender Domänen (eve und odd,
(Choe et al., 2006) die wesentliche Rolle spielen. Somit würden die blastodermalen
Paar-Regel-Gen-Domänen durch eine Kombination aus Streifenspezifischer Aktivie-
rung und „pair-rule circuit“-Regulation entstehen.
Die Musterbildung im Tribolium-Blastoderm läuft also im Wesentlichen ähnlich
wie in Drosophila über mehrere Stufen ab. Jedoch sind die Expressionsdomänen im
Tribolium Blastoderm über den gesamten Verlauf der Entwicklung dynamischer. Die
lokale Begrenzung von Expressions-Domänen maternaler Faktoren wie otd-1, gt
oder cad, und zygotischer Faktoren wie kni oder den Paar-Regel-Genen entwickelt
sich innerhalb eines komplexen regulatorischen Zusammenspiels. So kommt dem
Rückwirken zygotischer Aktivität auf maternale Faktoren eine größere Bedeutung zu.
Innerhalb dieser Systeme scheinen vor allem reprimierende Interaktionen eine wich-
tige Rolle zu spielen.
Obwohl viele der aus Drosophila bekannten Gene auch in Tribolium eine wichtige
Rolle für die Ausprägung der Achsen spielen, sind die Lücken in unserem Verständ-
nis so groß, dass die Möglichkeiten der Kandidaten-Gen Analyse offenbar nicht
ausreichen, um Entwicklungsprozesse in einer phylogenetisch so entfernten Art, in
diesem Fall in Tribolium, vollständig aufzuklären. Dieser Mangel macht neue Ansätze
nötig, welche die Identifizierung wesentlicher Faktoren, die nicht aus Drosophila
bekannt sind, möglich machen. Dieses Ziel verfolgt der im zweiten Kapitel dieser
Arbeit vorgestellte genomweite RNAi-Screen „iBeetle“ auf breiter Basis.
Die hier durchgeführte funktionelle Analyse von nanos und pumilio außerhalb der
Dipteren zeigt erneut die enorme Plastizität früher Musterbildungsprozesse (Tautz
und Schmid, 1998; Peel et al., 2005). Die initiale Einordnung beider Gene in das
121

I. 3. Diskussion
regulative System der frühen Tribolium Embryogenese konnte erfolgen, wirft aber
noch viele Fragen über die exakten Interaktionen der Regionalisierungsprozesse
innerhalb des Blastoderms auf. Vor allem die Identifizierung und Analyse neuer,
bisher unbekannter Faktoren wird hierbei den Schlüssel zur Aufklärung dieser Mus-
terbildungsvorgänge darstellen.
122

4. Material und Methoden
I. 4. Material und Methoden
Die angewendeten molekularbiologischen Methoden, Lösungen und sonstige La-
borbedarfsmittel richteten sich nach den Herstellerangaben der Produkte, bzw. nach
Sambrook et. al. (Sambrook und Russell, 2001).
Die Experimente wurden mit Tieren des San Bernadino Stammes durchgeführt
(M. Klingler, persönliche Mitteilung).
4.1. Klonierung
Die Tribolium-Orthologe zu nanos, pumilio und brain-tumor wurden über BLAST-
Homologiesuchen (http://beetlebase.org/blast/blast.html, http://www.hgsc.bcm.tmc.
edu/blast.hgsc oder http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) mit den Drosophila Prote-
insequenzen identifiziert. Fragmente der Gene wurden mit Hilfe genspezifischer
Primer aus cDNA amplifiziert und kloniert.
RNA aus unterschiedlichen embryonalen Stadien wurde mit Hilfe von TRIzol Re-
agenz (Invitrogen) nach Herstellerangaben isoliert, die Isolate wurden vereinigt und
davon mit der Superscript II Reversen Transkriptase (Invitrogen) ebenfalls nach
Herstellerangabe cDNA hergestellt. Ein !l der cDNA wurde für PCR eingesetzt.
Tab. 3: Primer und PCR-Bedingungen
Gen/Primer
nanos
Annealingtemperatur
fw 5’-CCCCAAAATGTTACGACT-3’
bw 5’-CATGTTATATACAATGTAATTTGG-3’ 50 °C 810 bp
pumilio (kloniert während der Diplomarbeit)
fw 5’-CAATCACATCGTGGAG-3’
bw 5’-CTCAACGAGTTAAGATGAG-3’ 50 °C 887 bp
brain-tumor
fw 5’-GCAAGTTCGGCGAGTTTGG-3’
bw 5’-GAAACATTGGGCGTGCTTC-3’ 52 °C 713 bp
Fragmentlänge
PCR-Produkte wurden mit einer T4-DNA-Polymerase (New England Biolabs)
vervollständigt, mit Polynukleotidkinase (New England Biolabs) phosphoryliert,
mittels präparativer Agarosegelektrophorese (MinElute Gelextraction Kit, Quiagen)
123

I. 4. Material und Methoden
aufgereinigt und in mit CIP (Invitrogen) dephosphorylierten, mit EcoRV (New England
Biolabs) geöffneten Bluescript II KS Vektor ligiert (T4 DNA-Ligase, New England
Biolabs). Erhaltene Klone wurden durch Kolonie-PCR, unter Verwendung einer
Probe der Kolonie als DNA-Matrizen Quelle, mit vektorspezifischen Primern (5´-
CTATGACCATGATTACGCCAAG-3´, 5´-TAACGCCAGGGTTTTCCCAGT-3´, 58 °C
Annealingtemperatur) verifiziert und schließlich bei der Firma Seqlab (Göttingen)
sequenziert. Primer wurden von Metabion (München) synthetisiert.
124
Ein weiteres nanos Fragment, inklusive aus RACE bekannter 5’ UTR Sequenz
wurde in meiner Diplomarbeit kloniert (Länge: 631 bp), ein dritter Klon, ausschließlich
kodierende Sequenz enthaltend wurde von Dr. Michael Schoppmeier zur Verfügung
gestellt (Länge: 331 bp).
DNA und Protein Sequenzanalysen, sowie Primerdesign wurden unter Zuhilfe-
nahme von online-Datenbanken (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) und der folgen-
den Programme durchgeführt: CLC Sequence Viewer, Oligo 4.05, ClustalX, DNASIS
2.0.
4.2. Expressionsanalysen
Tribolium-Embryonen für Expressionsananalysen wurden, wenn nicht anders be-
schrieben, in 50 % Klorix für 2 mal 3 Minuten dechorionisiert, gespült, in einem
Heptanbad aus dem Netzchen (180 !m) gesaugt und für 35 Minuten in 2 ml PEMS-
Puffer, 6 ml Heptan und 350 !l 37% Formaldehydlösung fixiert. Nach der Fixierung
wird die wässrige Phase entfernt und die Embryonen durch Zugabe von 8 ml Metha-
nol und ca. 15 s starkes Schütteln devitellinisiert. Dadurch nicht devitellinisierte
Embryonen können mehrmals durch eine 18g Kanüle gepresst werden um die noch
verbliebene Vitellinhülle mechanisch zu entfernen. Vor allem Keimstreifstadien
lassen sich schlecht devitellinisieren und werden durch diese Prozedur leicht zer-
stört. Somit wurden Keimstreifembryonen, wenn nötig, nach der Fixierung von Hand
aus der Eihülle präpariert. Hierzu werden die Embryonen einzeln aus der Heptan-
phase auf doppelseitiges Klebeband (Tesa Photo Tape) gebracht, nach Verdunsten
des Heptans mit DEPC-behandeltem PBS überschichtet und mit Hilfe von Minutien-
nadeln aus der Eihülle präpariert. Danach werden die Embryonen so schnell wie
möglich in Methanol überführt.

4.2.1. in situ Hybridisierung
I. 4. Material und Methoden
Die Synthese einzelsträngiger, Dig- bzw. Flu-markierter RNA-Sonden erfolgte
durch T3 oder T7 Polymerase (Roche) im wesentlichen nach Standardprotokollen
(Klingler und Gergen, 1993) mit aufgereinigten PCR-Produkten als Matrize (T3 bzw.
T7 Primer, nach Stratagene; Quiagen MinElute PCR-Purification). Die Sonden wer-
den nach der Präzipitation durch Ethanol und Ammoniumacetat, in 80 !l RNAse-
freiem Wasser gelöst. In-situ-Hybridisierungen unter Verwendung dieser Sonden
wurden ebenfalls nach Standardprotokollen durchgeführt (Tautz und Pfeifle, 1989;
Prpic et al., 2001) und durch Alkalische Phophatase und !-Galactosidase Färbungen
detektiert.
Für in-situ-Hybridisierungen an Ovaren wurden adulte Weibchen in DEPC-
behandeltem PBS präpariert und die Ovare in frischer, 4%iger Formaldehydlösung
für 30 min bei 0°C fixiert. Die in-situ-Hybridisierung erfolgte im Wesentlichen wie für
Embryonen beschrieben (Tautz und Pfeifle, 1989), allerdings wurde im Hybridisie-
rungspuffer 2% Blocking Reagenz (Roche) und nach der Hybridisierung ein MABT
Puffer (100 mM Maleinsäure, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20, pH 7.5) verwendet.
Um RNA-Expression für nanos nachzuweisen, wurden einige Veränderungen
und Varianten des Standardprotokolls getestet. So wurden Sonden von allen verfüg-
baren Fragmenten in unterschiedlichen Verdünnungen getestet (zwischen 0,01 !l
und 5 !l Sonde pro 30 !l Hybridisierungspuffer). Sonden des 810 bp und des 631 bp
Fragments wurden hydrolytisch verdaut und dann eingesetzt. Hierzu wurde präzipi-
tierte Sonde in 25 !l 80 mM NaHCO3, 120 mM Na2CO3, pH 10,2 für 10 min bei 37°C
hydrolysiert, die Reaktion mit 50 !l 200 mM C2H3NaO2, pH 6 beendet und die RNA
durch Fällen von der Salzlösung gereinigt. Auf diese Art fragmentierte Sonden kön-
nen die Signalstärke verbessern, da sie das Gewebe besser durchdringen
(Wilkinson, 1998). Der Nachweis der 810 bp Sonde wurde auch unter Zuhilfenahme
des Vectastain ABC Kits und des ABC-AP von Vector Labs, getestet. Ferner wurde
die Verwendung einer Detergenzlösung (1% SDS, 0,5 % Tween, 1 mM EDTA, 50
mM TrisHCl pH 7,5, 150 mM NaCl) und alternativer Hybridisierungslösungen getes-
tet. Außerdem wurden unterschiedlich stark fixierte (zwischen 30 min bei 4°C und
mehreren Stunden bei Raumtemperatur) Embryonen mit dem Standardprotokoll
getestet, die Sonden vor der Hybridisierung auf 95 °C erhitzt, um Sekundärstrukturen
aufzulösen, und die Entwicklung der Färbung auch unter Verwendung von 5 %
125

I. 4. Material und Methoden
Polyvinylalkohol durchgeführt. Keine dieser Variationen führten zu einem spezifi-
schen Nachweis der nanos-Expression.
4.2.2. Antikörperproduktion und Immunohistochemische Färbungen
126
Zum Nachweis der nanos-Expression in situ wurden von der Firma Eurogentec
Polyklonale Seren gegen in vitro synthetisierte NANOS Peptide hergestellt. Eurogen-
tec hat dabei zwei kurze Peptide der NANOS-Proteinsequenz synthetisiert (H2N-
QNQQFSQDVENYQRPC-CONH2 und H2N-RNQQFSNVLRSIENVQC-CONH2) die
von Fachleuten dort ausgewählt wurden, und eine möglichst hohe Wahrscheinlichkeit
für die Erkennung der Epitope des nativen Proteins durch das polyklonale Serum
gewährleisten sollen. Mit einer Mischung beider Peptide wurden zwei Kaninchen
immunisiert, die anhand des Verhaltens ihrer Präimmunseren in Testfärbungen von
mir aus fünf Tieren ausgewählt wurden. Unter Berücksichtigung der Ergebnisse
weiterer von mir durchgeführter Testfärbungen während des Immunisierungspro-
gramms, wurden insgesamt sechs Injektionen durchgeführt. Die zweite zwei Wochen
nach der ersten Injektion, jede weitere im Abstand eines Monats. 20 ml der Immun-
seren der finalen Blutungen beider Kaninchen wurden vereinigt, und mittels Affini-
tätschromatographie getrennt gegen beide Peptide von Eurogentec aufgereinigt und
mir zur Verfügung gestellt. Die polyklonalen Immunseren wurden in whole-mount
Immunhistochemischen Färbungen an Tribolium und Drosophila Embryonen unter-
schiedlichen Alters auf ihre Reaktivität getestet. Es war leider nicht möglich durch
diese Experimente NANOS-Protein nachzuweisen. Die Polyklonalen Immunseren
konnten zwar verwendet werden um die an Carrier-Protein gebundenen Peptide zu
detektieren, es konnte aber auch durch Western-Blot verschiedener Tribolium-
Proteinextrakte kein NANOS-Protein nachgewiesen werden. Vorhandene Polyklona-
le Seren gegen OTD-1 oder CAD hingegen (Schulz et al., 1998; Schröder, 2003),
konnten in Western-Blots erfolgreich zum Nachweis ihrer Zielproteine eingesetzt
werden.
Zum Nachweis des NANOS-Proteins in whole mount Färbungen mit Tribolium
Embryonen wurden diverse Variationen des Standardprotokolls für Immunhistoche-
mische Färbungen getestet (Roth et al., 1989). Zunächst wurden Verdünnungen der
Seren zwischen 1:10 und 1:200 getestet. Die Seren wurden mit Tribolium Embryo-
nen präabsorbiert. Die Stärke der Blocking-Schritte wurde zwischen 20 min bis 2 h
mit 3% BSA, 1h mit 8% BSA, 30 min mit 0,5 % Böhringer Blocking Reagenz und

I. 4. Material und Methoden
ohne Blocking Schritt variiert. Abweichend von der Standard Fixierung wurden kürze-
re und längere Fixationszeiten (15 min, 90 min), Devitellinisierung mit Ethanol statt
Methanol, Devitellinisierung von Hand unter Vermeidung von Alkoholen und Hitzefi-
xierung (Sullivan et al., 2000) angewandt. Zur Detektion wurde Alkalische Phospha-
tase, Peroxidase unter Verwendung eines Amplifikationsschritts durch das Vec-
tastain ABC System (Vectorlabs) und Immunfluoreszenz (Anti-Rabbit-Cy3) verwen-
det. Außerdem wurde durch Behandlung mit Isopropanol, oder Xylol und Aceton vor
Zugabe des Erstantikörpers versucht das Ergebnis zu verbessern. Schließlich wur-
den die Seren auch auf ihre Reaktivität in Tribolium Ovaren und Drosophila Embryo-
nen getestet.
Alle diese Experimente führten zur gleichen, unregelmäßigen Hintergrundfär-
bung. Marginale Unterschiede waren in einzelnen Ansätzen zu beobachten, in kei-
nem wurde ein qualitativ unterschiedliches Ergebnis erreicht.
Tab. 4: Verwendete Erst- und Zweitantikörper
Antikörper Hersteller/Referenz Verdünnung
Rabbit-Anti-Tc-OTD (Schröder, 2003) 1:100
Rabbit-Anti-Tc-CAD (Schulz et al., 1998) 1:50
Mouse-Anti-!-TUBULIN Sigma 1:500
Anti-DIG-AP (Fab) Roche 1:2000
Anti-DIG-Pod (Fab) Roche 1:2000
Anti-Flu-AP (Fab) Roche 1:2000
Goat-Anti-Rabbit-Bio Vector Laboratories 1:200
Goat-Anti-Rabbit-Cy3 Jackson Immuno Research 1:100
Rabbit-Anti-Mouse-Cy2 Rockland 1:50
4.2.3. Qualitative RT-PCR
Zum Nachweis der nanos-Expression in vitro wurde RT-PCR mit unterschiedli-
chen cDNAs als Matrize durchgeführt. RNAs wurden aus 3 Tieren bzw. ca. 50 !l
Embryonen unter Verwendug von TRIzol (Invitrogen) extrahiert, mit DNAse inkubiert
und nochmals durch TRIzol gereinigt. RNAs wurden Spektralphotometrisch vermes-
sen und 1,5 !g jeder Extraktion für die cDNA Synthese eingesetzt (Transcriptor High
Fidelity cDNA Synthsis Kit, Roche). 0,5 !l cDNA wurde für PCR-Reaktionen verwen-
det. Der Nachweis von nanos und der mRNA des ribosomalen Proteins rp49 erfolgte
durch Verwendung von Primerpaaren, deren „forward“-Primer auf einer Exon-Grenze
liegen und somit die Amplifikation von genomischer DNA vermeiden. Das kleine
Intron des nanos Gens (49 bp) könnte eine Unterscheidung genomischer und
127

I. 4. Material und Methoden
gespleißter Fragmente durch Agarose-Geleelektrophorese erschweren, weshalb
diese Stragtegie gewählt wurde. Die Amplifikation genomischer Fragmente aufgrund
von verunreinigten Reagenzien wurde außerdem durch Kontrollreaktionen ausge-
schlossen (Reaktionsansätze ohne Reverse Transkriptase, bzw. ohne RNA Matrit-
ze).
Tab. 5: Primer und Bedingungen der RT-PCR
Primer Annealing- Zyklen Fragment-
nanos
temperaturlänge fw 5’-ACGTGCTCAAATGTCTTTC-3’
bw 5’-GTGGTTGATAAATTTGGTCG-3’ 50 °C 34 450 bp
rp49 Verändert nach (Konopova und Jindra,
2007)
fw 5’-ATGGCAAACTCAAACGCAAC-3’
bw 5’-TAGCATGTGCTTCGTTTTGG-3’ 50 °C 24 132 bp
4.3. RNAi-Experimente
128
RNAi Injektionen von Tribolium Puppen, ebenso wie embryonale, larvale und a-
dulte RNAi-Experimente wurden im Wesentlichen wie beschrieben durchgeführt
(Bucher et al., 2002; Brown et al., 1999b; Tomoyasu und Denell, 2004; van der Zee
et al., 2006). Die hier gezeigten Ergebnisse stammen, falls nicht anders ausgewie-
sen, aus pupalen RNAi-Experimenten.
Für die Synthese der Kontroll-RNA gegen DS-Red wurde eine DNA-Matrize
durch PCR hergestellt. Hierzu wurden genspezifische Primer mit zusätzlichen T7-
RNA-Polymerase Promoter-Sequenzen verwendet. Das DS-Red Fragment wurde
von pSLfa[Tc’hsp5’-dsRedEx-3’UTR] (Johannes Schinko, Göttingen) amplifiziert.
Auch von nanos und pumilio wurden DNA-Matrizen durch PCR, unter Verwendung
des T7-Primers und eines T3-Primers ebenfalls mit zusätzlicher T7-
Promotorsequenz, hergestellt. Aufgereinigte PCR Produkte (MinElute PCR Purificati-
on, Quiagen) wurden zu RNA-Synthese mit MEGAscript T7 Kits (Ambion) verwendet.
dsRNAs wurden in Injektionspuffer (1,4 mM NaCl, 0,07 mM Na2HPO4, 0,03 mM
KH2PO4, 4 mM KCL) gelöst.

Tab. 6: Primer für dsRNA Matrize
I. 4. Material und Methoden
Primer
DSred
Annealing-temperatur
fw 5’-TAATACGACTCACTATAGG
AGTTCATGCGCTTCAAGGTG-3’
bw 5’-TAATACGACTCACTATAGG
TGGTGTAGTCCTCGTTGTGG-3’
5 Zyklen 40 °C, 30 Zyklen 58 °C
T7 5’-TAATACGACTCACTATAGG-3’
T3-T7 5’-TAATACGACTCACTATAGG
AATTAACCCTCACTAAAGGG-3’
Tab. 7: Verwendete dsRNA
58 °C
Gen Verwendete Konzentration Fragmentlänge
DSred 8 !g/!l 600 bp
nanos 4 !g/!l 810 bp
pumilio 4 !g/!l 887 bp
brain-tumor 1 !g/!l 713 bp
Für nanos/pumilio Doppel-RNAi wurden ebenfalls 4 !g/!l jeder RNA eingesetzt. Die beobachteten
Phänotypen traten auch nach Injektion niedriger Konzentrationen auf (1 – 3 !g/l)
der höchstmögliche Anteil starker Phänotypen wurde allerdings durch die angegebenen
Konzentrationen erreicht.
129

II. Kapitel:
II. 1. Einleitung
Entwicklung und Machbarkeitsstudie eines genomwei-
ten RNAi-Screen-Projekts in Tribolium
1. Einleitung
1.1. Tribolium als eigenständiges Modellsystem
Der rote Reismehlkäfer Tribolium castaneum entwickelte sich in den letzten Jah-
ren zu einem wichtigen Modellsystem der Insektenbiologie und beginnt sich zuneh-
mend aus dem Schatten des bestuntersuchten Insekts, Drosophila melanogaster, zu
lösen. Nachdem Tribolium in der ersten Hälfte des letzten Jahrhunderts vor allem
Forschungsobjekt von Populationsgenetikern und Ökologen war (Sokoloff, 1972)
entdeckten in den nachfolgenden Jahrzehnten zunehmend Entwicklungsbiologen
(Beeman, 1987; Brown et al., 1994b; Schröder et al., 2008) und Entomolgen die sich
mit Schädlingsbekämpfung beschäftigten (Andreev et al., 1999; Handler und Bee-
man, 2003) Tribolium als Forschungsobjekt für sich. Heute ist die „Tribolium-
Community“ mit einem großen Anteil deutscher Forscher, vor allem an entwicklungs-
biologischen Fragestellungen interessiert, die durch die Verfügbarkeit etlicher wichti-
ger Methoden effektiv bearbeitet werden können.
Wie bereits in der allgemeinen Einleitung (S. 11) zusammengefasst, ist dieses
große Methodenspektrum ein Grund für die Entwicklung Triboliums zu einem konkur-
renzfähigen Modellorganismus. Neben grundlegenden Techniken zur Analyse von
Entwicklungsprozessen wie in-situ-Hybridisierung und Immunhistochemie (Sommer
und Tautz, 1993; Patel et al., 1994) spielen genetische und molekularbiologische
Anwendungen eine große Rolle. Vor allem die Verfügbarkeit der Genom-Sequenz
hat viele Ansätze vereinfacht und eine große Zahl neuer Möglichkeiten eröffnet
(Tribolium Genome Sequencing Consortium, 2008).
Die Etablierung mehrerer Transformationssysteme (Lorenzen et al., 2003; Pavlo-
poulos et al., 2004) erlaubt heute den Einsatz transgener Techniken, und ermöglicht
die Verwendung von „Enhancer-trap“-Konstrukten und transgenen Missexpressions-
systemen wie z.B. dem UAS-Gal-4-System oder Hitze-Schock induzierbaren Kon-
strukten (G. Bucher, persönl. Mitteilung).
131

II. 1. Einleitung
132
In Anlehnung an die Arbeiten in Drosophila wurden auch in Tribolium Mutagene-
se-Screens in kleinerem Maßstab durchgeführt (Sulston und Anderson, 1996; Ma-
derspacher et al., 1998). Der Nutzen dieser genetischen Mutanten blieb in der bishe-
rigen Forschung aber begrenzt, da die Generierung und schließlich auch die Arbeit
mit ihnen durch das Vorhandensein von zehn Chromosomen und der Verfügbarkeit
nur weniger Balancer-Chromosomen erschwert wird (Berghammer et al., 1999a). Die
Haltung von mutanten Linien in Tribolium ist damit deutlich aufwändiger als bei
Drosophila und saturierende Screens in dieser Situation kaum möglich (Trauner et
al., 2009).
Auch aus diesen Gründen erwies sich in den letzten Jahren die RNA-Interferenz
als effektivere Methode zur Durchführung funktioneller Studien in Tribolium (Roth
und Hartenstein, 2008). RNAi wurde in den 90er Jahren des letzten Jahrhunderts in
C. elegans entdeckt (Fire et al., 1998) und bezeichnet den Abbau oder die translatio-
nelle Reprimierung von einzelsträngigen Ziel-RNAs (z.B. mRNAs), hervorgerufen
durch komplementäre doppelsträngige RNA (Meister und Tuschl, 2004). Dieser
Mechanismus kann sowohl durch exogene dsRNAs (z.B. von Viren; (Waterhouse et
al., 2001) als auch durch endogene Moleküle wie z.B. micro-RNAs hervorgerufen
werden (Rana, 2007) und wurde mittlerweile in einer Vielzahl von Spezies nachge-
wiesen (Meister und Tuschl, 2004). Dabei werden doppelsträngige Vorläufermoleküle
von einem Proteinkomplex gebunden und durch die DICER-RNase in kleine siRNAs
(„small interfering RNAs“) von 21 bis 23 Nukleotiden Länge prozessiert, die dann
durch einen weiteren Proteinkomplex (RISC) zur Erkennung und zum Abbau bzw.
der Repression der Ziel-RNA benutzt werden (Meister und Tuschl, 2004). Dieser
Effekt wurde bereits vielfach verwendet, um durch von außen eingebrachte dsRNAs
experimentell die Expression bestimmter Gene von Interesse zu reduzieren und
damit den Effekt des Verlusts der Genfunktion zu studieren. In einigen Arten, so z.B.
in C. elegans oder auch in Tribolium (Fire et al., 1998; Bucher et al., 2002), aber
nicht in Drosophila (Miller et al., 2008), funktioniert dies systemisch, was bedeutet,
dass sich der Effekt innerhalb des Organismus ausbreitet und somit unterschiedliche
Gewebe erreicht. Dadurch konnten speziell in Tribolium Methoden entwickelt wer-
den, die die Untersuchung von Genfunktionen durch die Injektion von dsRNA in
praktisch allen Entwicklungsstadien und allen bisher untersuchten Geweben erlau-
ben.

II. 1. Einleitung
Durch Injektion von dsRNA in Embryonen können Funktionen während der Emb-
ryonalentwicklung untersucht werden, und durch unterschiedliche Injektionszeitpunk-
te sogar zeitlich unterschiedliche Funktionen, wie z.B. die maternale und zygotische
Komponente eines Faktors, aufgelöst werden (Brown et al., 1999b; Schinko et al.,
2008). Die parentale RNAi ermöglicht es, embryonale Genfunktionen sogar noch
effizienter und zeitsparender zu untersuchen (Bucher et al., 2002). Dabei wird
dsRNA in weibliche Puppen oder adulte Käfer (van der Zee et al., 2006) injiziert und
so auch in den Nachkommen der injizierten Tiere RNAi hervorgerufen. In einigen
Fällen wurde gezeigt, dass der so induzierte embryonale Phänotyp dem einer gene-
tischen Null-Mutation entspricht (Brown et al., 1999b; Bucher et al., 2002; Cerny et
al., 2005).
Wird dsRNA in larvalen Stadien injiziert (Tomoyasu und Denell, 2004), kann da-
durch eine Vielzahl von Prozessen, die mit der Metamorphose in Zusammenhang
stehen, untersucht werden. Dabei lässt sich sowohl die hormonelle Kontrolle der
Metamorphose selbst (Konopova und Jindra, 2007), als auch die Entwicklung adulter
Strukturen beeinflussen (Tomoyasu und Denell, 2004). So können durch RNAi
beispielsweise Defekte in der Entwicklung der adulten Flügel (Tomoyasu et al.,
2005), Beine und Kopfanhänge (Shippy et al., 2009), Augen (Yang et al., 2009) und
auch der Gonaden induziert werden (Trauner und Büning, 2007). Durch Exon-
spezifische larvale RNAi gegen CHS-1 konnte außerdem gezeigt werden, dass sogar
RNAi gegen einzelne Spleißvarianten eines Gens möglich ist (Arakane et al., 2005).
Diese Verfügbarkeit wesentlicher Methoden, die Möglichkeit schneller, einfacher
funktioneller Analysen und die Sequenzierung des Genoms haben dazu beigetragen,
das Spektrum der in Tribolium bearbeiteten Fragestellungen in den letzten Jahren
deutlich zu erweitern. Zu Beginn der molekularen Arbeiten in Tribolium stand
die Analyse von embryonalen Prozessen im Vergleich mit Drosophila im Vorder-
grund, wie z.B. bei der Analyse von Segmentierungs-Genen (Tautz und Sommer,
1995; Brown und Denell, 1996). Neuerdings rückt Tribolium aber immer mehr als
selbstständiges Forschungsobjekt und Modellsystem der Entwicklungsbiologie und
anderer Forschungsbereiche in den Blickpunkt. Interessante Aspekte der Biologie
von Tribolium, wie das Vorhandensein einer sehr großen Zahl von Geruchsrezepto-
ren (Engsontia et al., 2008), die Differenzierung seiner Kutikula (Arakane et al., 2005)
und die Kontrolle seiner ökonomischen Bedeutung als Getreideschädling (Handler
und Beeman, 2003) werden ebenso erforscht, wie insektentypische Aspekte der
133

II. 1. Einleitung
Entwicklung. Dabei sind ganz besonders Prozesse interessant, die in Drosophila
nicht oder nur unzureichend untersucht werden können. So sind z.B. die Mechanis-
men der Segmentierung in Tribolium aufschlussreich, da sich dieser im Vergleich zur
Langkeimentwicklung Drosophilas nach dem als anzestral angesehenen Kurzkeim-
modus entwickelt (Krause, 1939; Sander, 1976; Davis und Patel, 2002). Andere
Aspekte der Tpaufliegenentwicklung, wie die Kopfentwicklung (Jürgens et al., 1986)
oder die Verpuppung, zeigen sehr abgeleitete Merkmale und werden deshalb mitt-
lerweile ebenfalls in Tribolium untersucht (Bate und Martinez Arias, 1993; Konopova
und Jindra, 2007; 2008; Parthasarathy et al., 2008a; Parthasarathy et al., 2008b;
Posnien et al., 2009; Posnien und Bucher, 2009). Noch deutlicher wird die Notwen-
digkeit eines konkurrenzfähigen Insektenmodells beispielsweise im Fall der embryo-
nalen Beinentwicklung: Drosophila-Larven sind apod, d.h. sie bilden keine Beine aus,
deren Entwicklung untersucht werden könnte (Bate und Martinez Arias, 1993). Die
Larven von Tribolium allerdings haben Beine und eignen sich somit auch hier als
alternatives Forschungsobjekt (Prpic et al., 2001; Beermann et al., 2001).
1.2. Die Limitierungen des “candidate gene approach”
134
Die Analyse der Segmentierung und der Embryonalentwicklung von Tribolium,
und anderer Forschungsbereiche, wie z.B. der Oogenese, basierten bisher in der
Regel auf einem Kandidaten-Gen-basierten Ansatz. Dabei wurden und werden
Tribolium-Orthologe zu Genen, die meist aus Drosophila bekannt sind, auf ihre
konservierte oder divergierte Funktion hin untersucht. Dieser Ansatz war vor allem
für die Untersuchung der Tribolium-Segmentierung sehr erfolgreich (Brown und
Denell, 1996; Schröder et al., 2008). Auch die Ausweitung dieser Herangehensweise
auf andere Insektenarten, wie Nasonia vitripennis, Gryllus bimaculatus oder Onco-
peltus fasciatus (Denell und Shippy, 2001; Beukeboom und Desplan, 2003; Mito und
Noji, 2006; Peel, 2008; Rosenberg et al., 2009), führte und führt immer noch zu
weiteren Einblicken dieser Richtung der EvoDevo-Forschung. So erfolgreich dieser
Weg auch ist, und gerade für vergleichende Studien zur Evolution einzelner Gen-
funktionen auch bleiben wird, ihm sind in einigen Bereichen Grenzen gesetzt.
Vor allem für die im vorangegangenen erwähnten aktuellen Forschungsrichtun-
gen, deren Ziele in Drosophila nicht oder nur unzureichend erreicht werden können,
ist der Kandidaten-Gen-Ansatz der letzten Jahre nicht geeignet. Die Untersuchung
solcher Prozesse kann eben nicht auf eine Vielzahl bekannter Drosophila-Gene

II. 1. Einleitung
zurückgreifen. Bereits erwähnt wurden die Kopfentwicklung und die Entwicklung der
larvalen Beine, es lassen sich aber weitere Beispiele finden. So z.B. die Entwicklung
adulter Muskulatur, über die in Drosophila nur wenig bekannt ist (Roy und VijayRag-
havan, 1999). Um solche Prozesse in Tribolium zu untersuchen, benötigt man neue
funktionelle Ansätze, um einen Zugang zu den molekulargenetischen Grundlagen zu
bekommen.
Aber nicht nur bei diesen neuen Forschungsrichtungen kommt der Kandidaten-
genansatz an Grenzen. Auch sehr gut bekannte Prozesse, wie die frühe Embryonal-
entwicklung, sind nicht abschließend durch diese Herangehensweise aufzuklären. Im
ersten Kapitel dieser Arbeit wurde unter anderem deutlich, dass in Tribolium Fakto-
ren an der Etablierung der frühen antero-posterioren Achse beteiligt sein müssen, die
in Drosophila keine Rolle spielen, oder zumindest nicht in diesem Zusammenhang
bekannt sind. So ist beispielsweise noch unklar, wie der Symmetriebruch vermittelt
wird, der zur Ausbildung der embryonalen AP-Achse führt, oder - ein speziellerer Fall
- welche Faktoren die frühe Expression des anterioren Faktors ORTHODENTICLE-1
regulieren. Auch in Zusammenhang mit der Ausbildung der dorso-ventralen Achse
sind einige frühe Mechanismen noch unbekannt. Dabei ist beispielsweise nicht klar,
wie genau in Tribolium die ursprüngliche dorso-ventrale Asymmetrie unter Beteili-
gung des EGF-Signalwegs initiiert, oder wie der an diesem Prozess beteiligte TOLL-
Rezeptor in der weiteren Folge aktiviert wird (Moussian und Roth, 2005; Nunes da
Fonseca et al., 2008; Fonseca et al., 2009).
Auch um diese und ähnliche Fragen zu klären, ist also die unvoreingenommene
Suche nach relevanten Faktoren in Tribolium nötig. Dass es prinzipiell möglich ist,
solche Faktoren zu finden, zeigen Beispiele aus der Vergangenheit, wo durch alter-
native Ansätze Gene identifiziert wurden, die an der Tribolium-Embryonalentwicklung
beteiligt sind, in Drosophila aber keine feststellbare Rolle erfüllen. Dies gilt beispiels-
weise für den CAUDAL-Repressor mex-3 oder das ungewöhnliche Gap-Gen mille-
pattes (Savard et al., 2006a; Schoppmeier et al., 2009).
Eine letzte Schwäche des Kandidatengenansatzes ist seine Beschränkung auf
bereits bekannte Prozesse. Da dabei Faktoren untersucht werden, die bereits aus
Drosophila (oder auch einer anderen Art) mit einer spezifischen Rolle bekannt sind,
ist es unwahrscheinlich, vollkommen neue und unerwartete Genfunktionen oder
Funktionszusammenhänge zu entdecken. Dies ist nur durch das systematische,
unvoreingenommene Herangehen mittels “forward genetics“ möglich.
135

II. 1. Einleitung
1.3. RNAi-Screens als Alternative zu klassischen genetischen
136
Ansätzen
Seit den genetischen Drosophila-Screens nach embryonal-letalen Phänotypen
der 80er Jahre (zusammengefasst in (Nüsslein-Volhard, 1994) sind solche geneti-
schen Screens in großem Maßstab aus der Entwicklungsbiologie nicht wegzudenken
(Patton und Zon, 2001; Jorgensen und Mango, 2002; St Johnston, 2002; Kile und
Hilton, 2005). Seit einigen Jahren besteht durch RNAi eine Alternative zu diesem
Ansatz, die ebenfalls in genomweitem Maßstab ihre Anwendung findet. In vivo RNAi-
Screens zur Analyse von Genfunktionen wurden vor allem in C. elegans durchge-
führt. Dort wurden Phänotypen der Embryonalentwicklung ebenso wie spätere Pro-
zesse untersucht (Fraser et al., 2000; Gönczy et al., 2000; Sönnichsen et al., 2005).
In Drosophila wurden wegen der fehlenden systemischen RNAi zunächst nur RNAi-
Screens in Zellkultur durchgeführt, um beispielsweise bestimmte Signalwege zu
analysieren, oder neue Genfunktionen für die Zellvitalität oder -morphologie zu
entdecken (Kiger et al., 2003; Boutros et al., 2004; Baeg et al., 2005; DasGupta et
al., 2005). Durch embryonale Injektion von dsRNAs wurde dann ein sehr arbeitsauf-
wändiger Weg beschritten um embryonale RNAi-Phänotypen zu erzeugen (Koizumi
et al., 2007), bis durch die Verfügbarkeit von genomweiten Kollektionen transgener
RNAi-Konstrukte (Dietzl et al., 2007) auch in Drosophila die Möglichkeit entstand in
vivo RNAi-Screens durchzuführen (Neely et al., 2010; Schnorrer et al., 2010). Diese
Kollektion repräsentiert allerdings nur 88 % der Drosophila-Gene und die meisten
produzierten Phänotypen scheinen nur hypomorphen Charakter zu haben (Dietzl et
al., 2007).
Durch die Verfügbarkeit des Tribolium-Genoms (Tribolium Genome Sequencing
Consortium, 2008) ist es nun auch in Tribolium möglich, ein groß angelegtes Scree-
ning-Projekt zu verwirklichen und damit die effektive RNAi-Maschinerie dieser Käfer-
art auszunutzen (Bucher et al., 2002; Tomoyasu et al., 2008).
Gerade in Tribolium kommen dabei einige Vorteile von RNAi-Screens im Ver-
gleich zu genetischen Screens zum Tragen. Zunächst ist ein RNAi-Screen im Hin-
blick auf Stammhaltung weniger aufwändig als genetische Screens. Es müssen
keine mutanten Linien auf Dauer gehalten werden, was in Tribolium wegen des
Mangels an Balancer-Chromosomen ein kompliziertes Unterfangen darstellt. Die
Ergebnisse können in einer Datenbank dauerhaft aufbewahrt und der Öffentlichkeit
zur Verfügung gestellt werden

II. 1. Einleitung
Im Vergleich zur Verwendung der transgenen RNAi-Konstrukte in Drosophila
(Dietzl et al., 2007) sind in Tribolium nicht einmal Kreuzungen im Vorfeld nötig, was
die Durchführung zusätzlich vereinfacht.
Nachdem optimierte dsRNAs für jedes annotierte Gen etabliert worden sind,
können auf dieser Grundlage durchgeführte Screens oder Teile davon jederzeit
wiederholt werden. Außerdem können weitere Screens mit anderen Fragestellungen
ebenfalls unter Verwendung dieser dsRNA-Kollektion durchgeführt werden.
Durch die hohe Penetranz der Tribolium-RNAi (Bucher et al., 2002) ist ein RNAi-
Screen auch bei der Auswertung der Phänotypen effizienter. Während aufgrund der
Kreuzungsschemata bei einem klassischen genetischen Screen für embryonale,
zygotische Genfunktionen beispielsweise nur 1/4 der vorhandenen Larven homozy-
got für die Mutation sind (St Johnston, 2002), können in iBeetle im Bestfall nahezu
100 % der Tiere einen Phänotyp zeigen.
Außerdem ermöglicht RNAi die Analyse von Genfunktionen in verschiedenen
Stadien, was wiederum die Effizienz erhöht. Ein gemeinsames Problem aller
Screenansätze ist nämlich, dass bei Pleiotropie, die häufig bei Entwicklungsgenen
auftritt (Miklos und Rubin, 1996), nur der früheste Phänotyp detektiert werden kann
(St Johnston, 2002). Während man versucht diese Schwierigkeit in genetischen
Screens durch die Verwendung klonaler Methoden zu lösen, kann systemische RNAi
einfach in späteren Stadien eingesetzt werden, um somit beispielsweise auch die
Analyse der Prozesse während der Metamorphose systemisch im gesamten Orga-
nismus durchzuführen.
Der systemische Effekt der RNAi erlaubt zudem bei der Untersuchung embryona-
ler Prozesse sowohl die maternalen als auch die zygotischen Anteile einer Genfunk-
tion auszuschalten und so einen vollständigen Funktionsverlust zu erreichen. In
klassischen Drosophila-Screens, die entweder die zygotische oder über klonale
Methoden die maternale Genfunktion untersuchen (Nüsslein-Volhard und Wie-
schaus, 1980; Schüpbach und Wieschaus, 1986), kann es vorkommen, dass der
zygotische Verlust einer Genaktivität durch das Vorhandensein des maternalen
Proteins ganz oder teilweise ausgeglichen wird, wie zum Beispiel im Fall des posteri-
oren CAUDAL-Gradienten (Macdonald und Struhl, 1986).
RNAi führt in der Regel nicht zu gleich starken Defekten in allen untersuchten
Tieren, d.h. als Ergebnis eines Experiments ist in der Regel eine phänotypische
137

II. 1. Einleitung
Serie zu beobachten. Dieses parallele Auftreten von starken und schwächeren
Defekten kann die Detektion von zusätzlichen funktionellen Aspekten ermöglichen.
138
Ein großer Vorteil von RNAi-Screens ist schließlich der Aspekt der reversen Ge-
netik. Das Gen, das einen interessanten Phänotyp verursacht, muss nicht aufwändig
identifiziert, keine Mutation lokalisiert werden. Die Identität der injizierten bzw. ver-
wendeten dsRNAs ist von vornherein bekannt, so dass das betroffene Gen unmittel-
bar weiter untersucht werden kann. Durch die Synthese der benutzten dsRNAs auf
Basis von Expressions- und genomischen Daten verliert auch die Unsicherheit über
die Saturierung des Screens an Bedeutung. Während bei genetischen Screens
wegen der Ungleichverteilung der induzierten Mutationen nur schwer eine definitive
Aussage über die Saturierung gemacht werden kann (Pollock und Larkin, 2004), ist
der begrenzende Faktor von RNAi-Screens vor allem die Qualität der Genomannota-
tion.
Ein RNAi-Screen in Tribolium bietet also beste Vorraussetzungen, um die Ein-
schränkungen des Kandidaten-Gen-Ansatzes zu überwinden und Tribolium als
Modellsystem voranzubringen.

1.4. iBeetle – ein genomweiter RNAi-Screen
II. 1. Einleitung
Wie im vorangegangenen Text bereits erläutert, steht die Forschung in Tribolium
an einem Punkt, an dem die funktionelle Datenbasis aus Drosophila nicht mehr
ausreicht, um Prozesse abschließend aufzuklären und neuen Fragestellungen
nachzugehen. Um diese Einschränkung zu überwinden haben sich mehrere
deutsche Tribolium-Labore unter der Leitung der Sprecher Gregor Bucher
(Göttingen) und Martin Klingler (Erlangen) zusammengeschlossen, um einen
genomweiten RNAi-Screen für entwicklungsrelevante Gene zu verwirklichen – den
iBeetle-Screen. Das Konzept und die Ziele dieses Großprojekts, möchte ich im
Folgenden kurz vorstellen.
1.4.1. Das iBeetle Konzept
Im Rahmen des iBeetle-Screens sollen alle Tribolium-Gene durch RNAi auf ihre
Funktion in unterschiedlichen Entwicklungsprozessen untersucht werden. Dabei
verfolgt iBeetle drei übergeordnete Ziele:
1. Es soll eine Basis für funktionelle Studien in neuen Forschungsbereichen ge-
schaffen werden. Für die Analyse von Prozessen, die in Drosophila nicht oder
nur unzureichend bearbeitet wurden, sollen Kandidatengene gefunden wer-
den. Dies trifft für Prozesse zu, die beispielsweise in Drosophila nicht unter-
sucht werden können (z.B. die Entwicklung larvaler Beine, die Entwicklung
von Stinkdrüsen) oder aufgrund technischer Schwierigkeiten nicht effektiv un-
tersucht werden können (Metamorphose, Kopfentwicklung, die somatische
Stammzellnische im Ovar).
2. Es sollen neue wichtige Entwicklungsgene gefunden werden, die entweder
spezifisch für die Käferentwicklung sind, oder die in Drosophila ihre Funktion
verloren haben, aus technischen Gründen bisher nicht untersucht werden
konnten, oder eventuell sogar nicht mehr vorhanden sind. Solche Kandidaten-
gene werden helfen, Fragen zu beantworten, die trotz intensiver Bearbeitung
in Tribolium und Drosophila noch ungeklärt sind. Beispiele hierfür sind etwa
fehlende Faktoren der antero-posterioren Achsendetermination oder die Seg-
mentierungsmechanismen der posterioren Wachstumszone.
3. Tribolium soll als zweites Modellsystem für genomweite Studien der Insekten-
biologie etabliert werden. Wenn iBeetle durchgeführt worden ist, können die
dabei etablierten Prinzipien für andere Screens mit unterschiedlichen spezifi-
139

II. 1. Einleitung
140
schen Fragestellungen eingesetzt werden. Die Ergebnisse von iBeetle können
auch benutzt werden um bestimmte Klassen von Genen einem solch spezifi-
schen Screen zu unterziehen. Mit iBeetle soll daher auch gezeigt werden,
dass RNAi-Screens in Tribolium für unterschiedliche Prozesse gut durchführ-
bar sind, was Wissenschaftler später auch für Fragestellungen in anderen Ar-
ten nutzen können, in denen diese Themen nicht genomweit oder nur tech-
nisch aufwändig durchzuführen sind.
Um diese Ziele möglichst schnell und effektiv zu erreichen, bietet sich in Triboli-
um die Anwendung der effizienten RNA-Interferenz-Methoden an. iBeetle soll dabei
auf möglichst breiter Ebene von dauerhaftem Nutzen sein und mehrere unterschied-
liche Entwicklungsprozesse umfassen (s. 1.4.3). Dabei wird man sich auf zwei we-
sentliche Entwicklungsstadien - Embryogenese und Metamorphose – konzentrieren,
um alle Tribolium-Gene sowohl auf ihre Funktion in embryonalen Entwicklungspro-
zessen, als auch in postembryonalen Vorgängen während der Metamorphose zu
untersuchen.
Um dieses aufwändige Projekt zu realisieren, haben sich nahezu alle deutschen
Tribolium-Arbeitsgruppen zu einer von der DFG geförderten Forschergruppe zu-
sammengeschlossen. In zwei dreijährigen Förderperioden sollen insgesamt 14
Doktoranden, ein Postdoktorand und zwei technische Angestellte an iBeetle mitarbei-
ten, wobei die erste Phase mit 6 Doktoranden bereits während der Niederschrift
dieser Arbeit genehmigt wurde.
Die Arbeitsgruppenleiter des iBeetle-Konsortiums sind mit jeweils einem eigenen
Projekt an iBeetle beteiligt (1.4.3) und werden anhand der Screenergebnisse einen
bestimmten Entwicklungsprozess untersuchen. Hierbei bedient sich iBeetle eines
neuartigen Konzepts, das sowohl für alle beteiligten Wissenschaftler als auch für das
Gesamtprojekt den schnellstmöglichen Erfolg sichern soll. In der Anfangszeit der
Förderperiode führen zunächst alle beteiligten Doktoranden und der Postdoktorand
gemeinsam die Screen-Arbeit an den beiden Screening-Centern Göttingen und
Erlangen durch. Nach Analyse aller zu untersuchenden Gene (in der ersten Förder-
periode ca. 6000) werden die Doktoranden sowie der Postdoktorand in den Arbeits-
gruppen der beteiligten Wissenschaftler aus dem Screen erhaltene Kandidatengene
für den jeweiligen im Forschungsinteresse der Gruppe liegenden Aspekt auswählen
und diese weiter analysieren. So kann der Erfolg des iBeetle-Screens bereits am

II. 1. Einleitung
Ende der ersten Förderperiode durch seinen Einfluss auf die aktuelle Forschung der
beteiligten Arbeitsgruppen gezeigt werden.
Die dafür benötigten doppelsträngigen RNAs werden auf der Basis verbesserter
Genmodelle durch eine PCR-basierte Strategie von der Arbeitsgruppe um Frank
Buchholz am MPI in Dresden hergestellt. Die Methodik, die dort für siRNAs zum
Einsatz in Säugerzellkultur entwickelt wurde, wurde für diese Zwecke angepasst
(Kittler et al., 2005; Kittler et al., 2007). Die Genmodelle für die RNA-Synthesen
werden durch Kombination bereits vorhandener und neu zu erstellender cDNA-
Sequenzen sowie der vorhandenen Genmodelle der Genomannotation
(http://beetlebase.org/) in Zusammenarbeit mit Mario Stanke und Burkhard Morgens-
tern (Abt. f. Bioinformatik, Göttingen) generiert. Diese Kollektion von dsRNAs (iBeet-
le-Library) wird kommerziell zu erwerben sein und wird so die schnelle Durchführung
weiterer Screenprojekte mit spezifischen Fragestellungen ermöglichen.
Ebenfalls in Zusammenarbeit mit der Abteilung für Bioinformatik in Göttingen wird
eine Online-Datenbank für iBeetle entwickelt (iBeetle-Base). Sie soll den Screenern
während der Screening-Phase die direkte Eingabe der Beobachtungen erlauben und
diese durch Vorgabe von Textbausteinen standardisieren. Nach Abschluss des
Screens soll iBeetle-Base öffentlichen Zugriff auf die Ergebnisse ermöglichen und
langfristig eine Genfunktions-zentrierte Datenbank und wichtige Tribolium-Ressource
werden.
1.4.2. „Enhancer trap“-Stämme erlauben die Detektion zusätzlicher
Phänotypen
Um im Verlauf des iBeetle-Screens embryonale und postembryonale Prozesse
zu untersuchen, sollem zwei unterschiedliche RNAi-Methoden zur Anwendung
kommen: Injektionen in weibliche Puppen (parentale RNAi) zur Analyse embryonaler
Defekte in den Nachkommen der injizierten Tiere und Injektionen in weibliche Larven
(larvale RNAi) zur Auswertung von Metamorphose- und Oogenese-Defekten in den
injizierten Tieren selbst.
Für beide Injektionen wird man sich die zusätzliche Information gewebespezifi-
scher GFP-Expression (eines grün-fluoreszierendes Proteins) in „Enhancer-trap“-
Stämmen zu Nutze machen (Abb. 25). Beide verwendeten Stämme tragen als Trans-
formationsmarker ein eGFP-Gen unter der Kontrolle eines 3xP3 Promotors (Horn
und Wimmer, 2000; Lorenzen et al., 2003), der zur Expression des Markers in den
141

II. 1. Einleitung
Augen und im zentralen Nervensystem führt. Die Detektion der Expression wird
durch die Verwendung eines genetischen Hintergrundes mit einer Mutation des
vermillion-Gens vereinfacht, die zu einem Verlust der Augenpigmentierung führt
(Lorenzen et al., 2002). Diese Marker-Expression erlaubt die einfache Feststellung
von Defekten der Augenentwicklung in embryonalen und vor allem in pupalen Sta-
dien. Je nach Integrationsort kann dieses Konstrukt außerdem von benachbarten
endogenen Enhancern aktiviert werden und zu gewebespezifischer Expression
führen.
142
Die pupalen Injektionen werden mit dem Stamm pig19 durchgeführt. Dieser trägt
eine Insertion des Enhancer-Trap-Konstrukts in einem aktin-Gen, was zu eGFP-
Expression im Großteil der Körpermuskulatur der schlupfreifen Larve führt (Lorenzen
et al., 2003; Lorenzen et al., 2007). Ventrale, laterale und dorsale Muskulatur in
Thorax und Abdomen sind ebenso wie die Muskulatur des Kopfes deutlich zu erken-
nen (Abb. 25), und erlauben die Detektion von globalen Defekten dieser Muskel-
gruppen. Auch die Muskulatur der larvalen Beine ist deutlich erkennbar und wird ein
Schwerpunkt der Auswertung sein (Abb. 25, 1.4.3).
Diesem genetischen Hintergrund soll für die Durchführung von iBeetle noch ein
rot-fluoreszierender Marker im gesamten zentralen Nervensystem hinzugefügt wer-
den, der die Detektion von neuralen Defekten erlauben soll.
Für die larvalen Injektionen wird ein Stamm verwendet, der eine nicht lokalisierte
Insertion eines minos-3xP3-eGFP Konstrukts trägt (Pavlopoulos et al., 2004), die zur
GFP-Expression in Teilen der sich entwickelnden Muskulatur des dritten Thorakal-
segments pupaler Stadien führt (mD17, Abb. 25). Dieses metathorakale Muster
entwickelt sich in der Präpuppe und Puppe und bleibt auch in jungen adulten Käfern
noch sichtbar bevor es dann zurückgeht. Die Enhancer-trap-Expression erlaubt somit
die Analyse von Defekten während der Entwicklung der thorakalen adulten Muskula-
tur. Für den iBeetle-Screen soll diesem Stamm noch ein Konstrukt hinzugefügt
werden, das eine Y-chromosomale Insertion eines dominanten Augenpigmentmar-
kers trägt (Lorenzen, nicht veröffentlicht) und so durch die vorhandene Augenfärbung
eine einfache Unterscheidung von männlichen und weiblichen Larven zulässt.

Abb. 25: Für iBeetle verwendete Käferstämme
II. 1. Einleitung
Gezeigt sind Fluoreszenzaufnahmen der eGFP-Expression in dem für die pupalen Injektionen
verwendeten pig19-Stamm (A - E) und dem md17-Stamm, der für larvale Injektionen
verwendet wird (F, G).
Die somatische Muskulatur in Kopf, Thorax und Abdomen einer frisch geschlüpften pig19-
Larve ist in lateraler (A), dorsaler (D) und ventraler Ansicht (E) gut zu erkennen.
Kurz vor dem Schlupf sind vor allem Details der Beinmuskulatur einer noch in der Eihülle
befindlichen Larve in lateraler Ansicht nur schwer zu erkennen (B). Wird die Eihülle durch
mechanische Belastung zum Platzen gebracht, können auch die coxale Muskulatur (cm), die
femorale (fm) und die tibio-tarsale Muskulatur gut ausgewertet werden (C).
In dorsaler Ansicht ist die eGFP-exprimierende metathorakale Muskulatur einer mD17-Puppe
deutlich erkennbar (Pfeilspitze in G), während in ventraler Ansicht vor allem die als Transformationsmarker
dienende Augenexpression sichtbar ist (Pfeilspitze in F).
Anterior ist in allen Abbildungen links.
143

II. 1. Einleitung
1.4.3. Die iBeetle-Einzelprojekte und ihre Themen
144
Alle beteiligten Wissenschaftler haben ein eigenes, aus einer wissenschaftlichen
Fragestellung resultierendes Interesse an der Durchführung des iBeetle-Screens.
Diese einzelnen Projekte definieren einerseits die Detailanalysen von neuen Kandi-
datengenen nach Abschluss der Screeningphase und bestimmen andererseits vor
allem die im Rahmen von iBeetle zu screenenden Prozesse und Merkmale. Nicht alle
Einzelprojekte werden bereits in der ersten Förderungsphase von iBeetle im Detail
bearbeitet. Trotzdem werden natürlich in der Screeningphase der ersten Periode
auch die für diese Projekte wichtigen Merkmale analysiert. Die Themen der Einzel-
projekte lassen sich grob in embryonale und postembryonale Prozesse einordnen.
Embryonalentwicklung:
Zwei Arbeitsgruppen interessieren sich für Prozesse der embryonalen
Kopfentwicklung, die wegen der abgeleiteten Morphologie des internalisierten Kopfes
(Jürgens et al., 1986) in Drosophila nur schwer zu analysieren ist. Gregor Buchers
(Göttingen) Projekt fokussiert sich dabei auf die Entwicklung eines neu postulierten
Kompartiments am anterioren Ende des sich entwickelnden Embryos, des „Anterior
Medium Tissue“ (Bucher, nicht veröffentlicht). Ernst Wimmer (Göttingen) konzentriert
sich in iBeetle auf das genetische Netzwerk, das die Entwicklung des Interkalaren
Segments steuert, und dessen evolutionäre Anpassungen innerhalb der Arthropoden
(Damen et al., 1998; Abzhanov und Kaufman, 1999). Beide Projekte sind vor allem
an Veränderungen des larvalen Kopfborstenmusters interessiert, die Rückschlüsse
auf Veränderungen der Kopfsegmente zulassen. Auch andere morphologische
Veränderungen des larvalen Kopfes könnten von Interesse sein und werden deshalb
ebenfalls dokumentiert.
Siegfried Roth (Köln) und Martin Klingler (Erlangen) interessieren sich vor allem
für die Ausbildung der embryonalen Achsen. Siegfried Roth legt dabei seinen
Schwerpunkt auf frühe Prozesse der dorso-ventralen Achsendetermination und die
Aufrechterhaltung dieser Polarität in der posterioren Wachstumszone (Handel et al.,
2005; Nunes da Fonseca et al., 2008), während Martin Klinglers Fokus auf der
Ausbildung der antero-posterioren Achse liegt (Rosenberg et al., 2009). Die Detekti-
on von früh embryonal-letalen Defekten und von charakteristischen Kutikula-
Phänotypen weisen in beiden Fällen auf potentielle Kandidatengene hin. Während

II. 1. Einleitung
von der Morphologie der Kutikula auf einen wahrscheinlichen antero-posterioren oder
dorso-ventralen Phänotyp geschlossen werden kann, müssen früh-embryonale
Defekte (in deren Folge keine Kutikula mehr gebildet wird) zunächst genauer analy-
siert werden um diese Entscheidung treffen zu können. Ein weiteres Projekt Siegfried
Roths beschäftigt sich mit der Entwicklung der extraembryonalen Membranen, deren
Defekte beispielsweise zu invertierten larvalen Kutikulas führen können (van der Zee
et al., 2005; Panfilio, 2008).
Martin Klingler interessiert sich außerdem für die Segmentierung und die Muster-
bildung während der Keimstreifstreckung (Brown und Denell, 1996), wobei Phänoty-
pen mit Deletionen und Transformationen von Segmenten ähnlich denen der Triboli-
um-Gap-Gene im Fokus stehen (z.B. Bucher und Klingler, 2004; Cerny et al., 2005).
Die Entwicklung der larvalen Beinmuskulatur soll im Rahmen des Projekts von
Manfred Frasch (Erlangen) untersucht werden, der einerseits diesen Prozess in
Tribolium entschlüsseln möchte, und andererseits hofft, neue interessante Kandida-
tengene der Muskelentwicklung für die Analyse in Drosophila zu finden (Frasch und
Nguyen, 1999; Ciglar und Furlong, 2009). Somit sind nicht nur Veränderungen der
GFP-markierten Beinmuskulatur, sondern auch globale Defekte der übrigen Musku-
latur von Interesse.
Entwicklung adulter Strukturen
Gregor Bucher interessiert sich außer für die embryonale Entwicklung anteriorer
Kopfstrukturen, auch für ihre Umgestaltung während der Metamorphose. Hierbei sind
potentielle Kandidatengene von besonderem Interesse für die Evolution phänotypi-
scher Divergenz innerhalb der Insekten (Moczek, 2007). Die Grundlage der morpho-
logischen Vielfalt und der Anpassungen von Kopfstrukturen unterschiedlicher Taxa
kann so untersucht werden.
Michael Schoppmeier (Erlangen) untersucht die Entwicklung und Funktion des
telotroph-meroistischen Tribolium-Ovars (Trauner und Büning, 2007). dsRNAs die zu
reduzierter Eiproduktion führen, sind für dieses Projekt potentiell interessant. Tritt der
Effekt nach larvaler Injektion auf, könnte auch die Entwicklung des Ovars betroffen
sein, pupale Injektionen sollten dagegen zu Defekten der Oogenese führen (Trauner
und Büning, 2007). Dabei ist besonders die Untersuchung somatischer Stammzellen
der Follikelzellpopulation und die Differenzierung der Follikelzellen von Interesse
(Horne-Badovinac und Bilder, 2005; Kirilly und Xie, 2007). Erstere, da sie in Dro-
145

II. 1. Einleitung
sophila wegen technischer Schwierigkeiten nicht gut zugänglich sind. Deutliche
Veränderungen der Ovar-Morphologie (in der Regel eine Verkleinerung aufgrund des
Verlusts einzelner oder mehrerer Zellpopulationen) werden im Screen erkannt wer-
den, ihre exakte Einordnung muss in einer nachträglichen Analyse erfolgen.
Projekte der zweiten Phase
146
In der zweiten Phase werden weitere Projekte hinzukommen, die sich mit der
Entwicklung adulter Strukturen beschäftigen. So wird Hanh Thi Nguyen (Erlangen)
die Entwicklung adulter Muskulatur untersuchen. Wegen der synzytialen Natur der
Muskelzellen ist dies ein Prozess, der in Drosophila nur schwer durch klonale Analy-
sen zu verwirklichen ist. Dies ist jedoch für viele Faktoren notwendig, da viele Ent-
wicklungs-Mutanten wegen Funktionen während der Embryogenese schon früh zu
Letalität führen. Durch RNAi sollten die Mechanismen in Tribolium aber gut zu unter-
suchen sein. Defekte der Muskulatur werden durch die Markergenexpression in der
metathorakalen Muskulatur pupaler Stadien des md17-Stammes detektiert (Abb. 25).
Ernst Wimmer (Göttingen) wird sich in der zweiten Phase von iBeetle mit der
Entwicklung und Funktion der Stinkdrüsen beschäftigen. Drüsen zur Produktion von
Sekreten zur Feindabwehr oder der Kontrolle von Bakterien oder Pilzen finden sich
häufig in Käferarten, aber selten in Dipteren und nicht in Drosophila (Francke und
Dettner, 2005). Die abdominalen Stinkdrüsen sind in den adulten Tieren sichtbar.
Wenn sie aufgrund von Fehlfunktion melanisieren, sind auch die thorakalen Drüsen
leicht zu erkennen (Beeman et al., 1996).
Ein weiterer embryonaler Prozess soll in der zweiten Phase von iBeetle im Rah-
men eines Projekts von Reinhard Schröder (Rostock) untersucht werden. Dabei
stehen die Mechanismen der embryonalen Achsenelongation und die Funktionswei-
se der posterioren Wachstumszone im Fokus. Hier werden vor allem Kutikulaphäno-
typen mit posterioren Verkürzungen ein Hinweis auf potentielle Kandidatengene sein,
die im Hinblick auf die Entstehung und Verwirklichung der unterschiedlichen Emb-
ryogenesetypen (Lang- und Kurzkeim) der Insekten von besonderem Interesse sind.
Weitere interessante Prozesse
Einige wichtige Entwicklungsprozesse werden innerhalb des iBeetle-Konsortium
von keiner spezifischen Arbeitsgruppe untersucht, werden aber wegen ihrer Bedeu-
tung für die Tribolium-Entwicklung im Rahmen des Screens trotzdem analysiert.
Diese zusätzlichen Themenschwerpunkte erfordern dabei keine weiteren Auswer-

II. 1. Einleitung
tungen sondern werden im Rahmen der anderen Untersuchungen mit gescreent. Zu
nennen sind hier die Steuerung der Metamorphose, die Entwicklung der adulten
Beine und anderer Extremitäten (v.a. der Flügel) und die Entwicklung der larvalen
Beine.
Somit ergeben sich insgesamt 18 unterschiedliche Prozesse, die im Rahmen von
iBeetle untersucht werden: Etablierung der antero-posterioren und dorso-ventralen
Achse, Entwicklung extraembryonaler Membranen, Segmentierung, Achsen Elonga-
tion und Wachstumszonenfunktion, embryonale Beinentwicklung, embryonale Kopf-
entwicklung, Entwicklung der larvalen Beinmuskulatur, Muskelentwicklung, Spezifi-
zierung des Interkalaren Segments, Oogenese, Ovariogenese, Metamorphose-
Kontrolle, Entwicklung des adulten Kopfs, der adulten Beine und anderer adulter
Extremitäten, Stink-Drüsen Biologie, Entwicklung der adulten Thoraxmuskulatur.
147

II. 1. Einleitung
1.5. Ziele des zweiten Kapitels dieser Arbeit
148
Im Rahmen der Weiterentwicklung von Tribolium als Modellsystem der Insekten-
biologie stoßen die beteiligten Wissenschaftler immer häufiger auf Fragen, die durch
die Untersuchung von Orthologen zu Drosophila Genen nicht mehr zu beantworten
sind. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben deutsche Tribolium-
Wissenschaftler die Idee eines genomweiten RNAi-Screens entwickelt, der auf
möglichst breiter Ebene die Funktion aller Tribolium-Gene für unterschiedliche Ent-
wicklungsprozesse untersuchen soll.
Ziel dieser Arbeit war, die Durchführbarkeit eines solchen RNAi-Screens zu prü-
fen, ein mögliches Prozedere zu entwickeln und dieses im Rahmen eines Pilot-
Screens zu testen. Dabei sollte geklärt werden, ob das Vorhaben mit der angestreb-
ten thematischen Breite innerhalb der personellen und zeitlichen Rahmenbedingun-
gen durchführbar ist.
Zu diesem Zweck mussten die einzelnen Arbeitsschritte und Auswertungsmetho-
den entwickelt bzw. angepasst werden. Hierbei sollte untersucht werden, ob die
Verwendung der ausgewählten Marker-Expressions-Stämme („Enhancer-traps“)
möglich und sinnvoll ist, und ob für alle zu untersuchenden Prozesse geeignete
Analysemethoden gefunden werden können. Eine wichtige Frage war dabei, ob
diese Methoden und die Durchführung zweier unabhängiger Injektionen im Groß-
Maßstab realisierbar sind, um somit die Analyse embryonaler und postembryonaler
Prozesse zu erlauben.
Auf Basis dieser Vorarbeiten sollte ein Protokoll für die Durchführung des iBeetle-
Screens entworfen werden, das die Durchführung mit mehreren Personen gleichzei-
tig erlaubt. Dabei war es wichtig zu klären, ob die Untersuchung aller Tribolium-Gene
mit dem angestrebten Personalaufwand in der vorgebenen Zeitspanne erreichbar ist.
Schließlich sollte durch die Überprüfung dieses Protokolls im Rahmen eines Pi-
lotscreens gezeigt werden, dass alle Analysemethoden geeignet sind, die zu unter-
suchenden Defekte verlässlich zu detektieren. Mögliche Schwierigkeiten und Prob-
leme könnten so im Vorfeld des Hauptscreens erkannt und gelöst werden. Die De-
tektion neuer, bisher unbekannter Genfunktionen unterstreicht dabei die Effektivität
der erarbeiteten Methodik.

2. Ergebnisse
II. 2. Ergebnisse
2.1. Wie kann ein genomweiter RNAi-Screen verwirklicht werden?
Die Durchführung eines genomweiten Projekts mit den Dimensionen des iBeetle-
Screens erfordert eine sehr ausführliche und sorgfältige Planung, die sicherstellt,
dass alle gesetzten Ziele auch in der angestrebten Zeitspanne erreichbar sind. Das
iBeetle-Konzept sieht vor, dass während des Screens 18 unterschiedliche Ent-
wicklungs-Prozesse untersucht werden sollen (s. 1.4.3).
Für die Planung der praktischen Durchführung im Rahmen der hier vorliegenden
Arbeit ergaben sich daraus drei grundsätzliche Fragestellungen:
1. Ist die Analyse der zu untersuchenden Prozesse im Rahmen eines RNAi-
Screens möglich?
2. Wie können die dafür nötigen Untersuchungen durchgeführt und miteinander
verknüpft werden?
3. Ist die Durchführung in einem sinnvollen zeitlichen, personellen und finanziel-
len Rahmen realisierbar?
Zur Beantwortung dieser Fragen musste also zunächst eine Methodik entwickelt
werden, die die Analyse der 18 Prozesse auf effiziente Art und Weise erlaubt, um
diese dann im Praxistest auf den Prüfstand zu stellen. Dabei sollen zwar möglichst
alle Prozesse untersucht werden, es stellt sich jedoch immer die Frage der Wirt-
schaftlichkeit. Einzelne Untersuchungen sollen einfach und schnell durchführbar sein
und idealerweise in einem Schritt mehrere Aspekte untersuchen. Einzelne Prozesse
können nur untersucht werden, wenn ihre Analyse nicht zu aufwändig ist und so die
Durchführung des Screens erschwert.
2.1.1. Die Analyse vieler unterschiedlicher Prozesse erfordert zwei
parallele Screen-Ansätze und exakt definierte Zeitintervalle
Bereits während der Entwicklungsphase wurde klar, dass zur Durchführung von
iBeetle zumindest zwei voneinander unabhängige dsRNA-Injektionen nötig würden:
die Injektion von dsRNA in weibliche Puppen, zur Analyse embryonaler Effekte in
den Nachkommen der injizierten Tiere (Bucher et al., 2002) und larvale Injektionen
zur Untersuchung von postembryonalen Prozessen in den injizierten Tiere selbst
(Tomoyasu und Denell, 2004). Durch die pupalen Injektionen sollen diverse embryo-
149

II. 2. Ergebnisse
nale Musterbildungsprozesse (Achsenbildung, Segmentierung, Kopf- und Beinent-
wicklung usw.) anhand von Kutikulapräparationen, die Entwicklung der Muskulatur in
lebenden Embryonen sowie die Eiproduktion und eventuelle Oogenese-Defekte
untersucht werden. Nach den larvalen Injektionen hingegen liegt das Augenmerk auf
der Untersuchung von unterschiedlichen Prozessen während der Metamorphose, der
Entwicklung des Ovars sowie der Stinkdrüsen.
150
Es ist nicht möglich diese beiden Komplexe zur Vereinfachung des Screens
durch einen einzigen Ansatz abzudecken. Pupale Injektion eignet sich zwar sehr gut
zur Analyse der Embryonalentwicklung in den Nachkommen der injizierten Tiere, die
Dauer des RNAi-Effekts (Bucher et al., 2002) reicht aber sicher nicht aus, um auch
einen Effekt auf die Metamorphose der Nachkommen zu entfalten. Außerdem ver-
hindern Defekte während der Embryogenese die Auswertung möglicher Effekte auf
spätere Prozesse. Um Vorgänge während der Metamorphose zu untersuchen muss
also larval injiziert werden. Diese Injektionen eignen sich wiederum nicht für die
zusätzliche Analyse der Embryonalentwicklung. Der zeitliche Abstand zwischen
Injektion und der Geschlechtsreife der injizierten Tiere ist hier zu groß um noch RNA-
Interferenz optimaler Effizienz zu induzieren.
Um eine ökonomische Durchführung des Screens zu gewährleisten, muss die
Anzahl der Injektionen pro Gen auf diese beiden beschränkt werden, wobei aber
dennoch alle relevanten Prozesse untersucht werden sollen. Somit ist es nötig aus
einer Injektion möglichst viel Information zu erhalten, also mehrere Analysen mit den
gleichen Tieren durchzuführen. Ebenso muss vorsichtig abgewogen werden, ob der
praktische Aufwand der Analyse eines Prozesses vertretbar ist und in sinnvollem
Verhältnis zum Nutzen, also dem erwarteten Kenntnisgewinn steht.
Auf dieser Grundlage habe ich zunächst ein Konzept für die Durchführung des
Screens erstellt (Abb. 26). Hierfür wurden beide Injektionen mit den darauf folgenden
Auswertungen als voneinander unabhängige Experimente betrachtet. Um die Analy-
se aller zu untersuchenden Prozesse zu erlauben, müssen während des pupalen
Screen-Teils zumindest vier, und in der Folge der larvalen Injektionen fünf Auswer-
tungsschritte erfolgen (eine genauere Beschreibung dieser Schritte folgt). Diese
umfassen im pupalen Screenteil die Begutachtung der injizierten Tiere (Kontrolle des
Injektionserfolgs und potentielle Metamorphosedefekte), die Anfertigung von Kutiku-
lapräparaten und Präparaten der larvalen Muskulatur (embryonale Defekte) und die
Auswertung der Legeleistung (Defekte der Oogenese). Nach den larvalen Injektionen

II. 2. Ergebnisse
werden Defekte die während der Metamorphose auftreten in pupalen und adulten
Stadien kontrolliert und der korrekte Ablauf der Metamorphose (Kontrolle der Imagi-
nalhäutung) untersucht. Zudem werden die Legeleistung (Defekte der Ovarent-
wicklung) und schließlich die thorakalen und abdominalen Stinkdrüsen überprüft.
Abb. 26: Überblick über den iBeetle-Screening Ablauf
Gezeigt ist der schematische Ablauf der pupalen (oben) und der larvalen Injektionen im
Rahmen von iBeetle (rote Kästen) und die zu den einzelnen Zeitpunkten (- dX -) detektierbaren
Phänotypen (grüne Kästen). Potentielle Metamorphose-Phänotypen beziehen sich im
pupalen Screen-Teil auf Defekte der Metamorphosekontrolle. Im larvalen Screen-Teil hingegen
bedeuten Metamorphose-Phänotypen I Defekte der Morpho- und Organogenese sowie
Defekte der Metamorphose-Kontrolle, Metamorphosephänotypen II wiederum nur Defekte
der Metamorphosekontrolle. Auch die morphologischen Phänotypen im larvalen Screen-Teil
beziehen sich auf Defekte der Prozesse die während der Metamorphose ablaufen. Embryonale
Phänotypen werden anhand von Kutikulapräparaten analysiert und umfassen Defekte
der Achsendetermination, der Segmentierung, der Kopf- und der Beinentwicklung. Embryonale
Muskelphänotypen werden mit Hilfe des Muskel-Enhancer-Traps untersucht. Oogenese-
und Ovariogenese werden anhand der Ovarmorphologie von Tieren mit schlechter
Legeleistung klassifiziert. Die Defekte der Stinkdrüsen sind schließlich durch eine einfache
äußere Inspektion der Tiere erkennbar.
!!: Weibchen, "": Männchen, d: Tag, pig19: Stamm mit Enhancertrap der larvalen Muskulatur, SB:
San Bernardino-Stamm, mD17: Stamm mit Enhancertrap der pupalen und jung-adulten thorakalen
Muskulatur
151

II. 2. Ergebnisse
152
Im nächsten Schritt wurden die für die Injektionen und Analysen notwendigen
Methoden für die Durchführung im Großmaßstab getestet und angepasst. Dabei
wurde beispielsweise der Ablauf der Injektionen etabliert und verschiedene Präpara-
tionsmethoden für Kutikula- und Muskelpräparate zur Analyse der Embryonalent-
wicklung miteinander verglichen. Die Auswertung der adulten und pupalen Morpho-
logie wurden auf ihre Durchführbarkeit getestet. Hierbei mussten auch die zur Ver-
wendung kommenden Käferstämme auf ihre Eignung hin geprüft und die Auswer-
tungsschritte auf die Analyse der jeweiligen „Enhancer trap“-Expression ausgerichtet
werden. Von besonderer Wichtigkeit war außerdem die Bestimmung eines sinnvollen
zeitlichen Ablaufs und der nötigen und optimalen Inkubationszeiten.
Durch diese Tests und Vorversuche konnte ich ein detailliertes Protokoll zur
Durchführung der Injektionen und der nachfolgenden Auswertungsschritte erstellen
(siehe folgenden Text und 4.2). Es ermöglicht die Analyse aller zu untersuchenden
Prozesse mit zwei Injektionen pro Gen innerhalb weniger Wochen. Bei der Durchfüh-
rung des Pilot-Screens (2.2, 2.3) wurde dieses Protokoll getestet und erwies sich als
praktikabel und effizient.
Im Folgenden werden die einzelnen Arbeitsschritte des Screenablaufs vorge-
stellt, erläutert und auf wichtige Prinzipien des Screening-Ablaufs hingewiesen. Im
Anschluss daran werde ich die praktische Umsetzung dieses Protokolls im tatsächli-
chen Screening-Betrieb darlegen (2.1.2). Schließlich werden die Ergebnisse der
Durchführung des Pilotscreens, also dem Praxistest der Methodik, präsentiert (2.2
und 2.3).
Die vorgestellten Arbeitsschritte gelten für die Durchführung des Pilot- und des
Hauptscreens (sofern nicht anders angegeben) und sollen einen Überblick über den
Ablauf und die nötigen Arbeiten vermitteln. Eine Beschreibung der genauen methodi-
schen Durchführung findet sich im Abschnitt „Material und Methoden“ (4.2). Bei
jedem Arbeitsschritt werden Beobachtungen, Befunde und Ergebnisse protokolliert
und gegebenenfalls dokumentiert. Für die Auswertungen werden vor allem ein Prä-
parationsbinokular (für einige Arbeitsschritte mit Fluoreszenzlampe) und ein Fluores-
zenzmikroskop benötigt. Tiere die einen interessanten Phänotyp zeigen, werden
zumindest teilweise fixiert und archiviert. Im Rahmen des iBeetle-Screens wird die
Dokumentation direkt in eine Online-Datenbank (iBeetle-Base) eingetragen, die

II. 2. Ergebnisse
durch vorgefertigte Textbausteine bzw. Auswahlmenüs die Vergleichbarkeit der
Ergebnisse der unterschiedlichen am Screen beteiligten Personen gewährleistet.
Pupale Injektionen:
Injektion, Tag 0:
Pro dsRNA werden acht weibliche Puppen des pig19-Stamms (s. 1.3; Lorenzen
et al., 2003) injiziert, und diese dann mit vier adulten Männchen verpaart. Die Zugabe
adulter Männchen stellt kein Problem in Hinsicht auf Kannibalismus dar (nicht ge-
zeigt; (Sokoloff, 1972). Die Tiere werden in einem Multiwellsystem gehalten, das für
die Haltung von Tribolium-Mutanten entwickelt wurde (Berghammer et al., 1999a).
Die Injektion von acht Puppen ist wegen der sehr guten Überlebensquoten der
pupalen RNAi ausreichend um später genügend Embryonen zur Auswertung zu
erhalten.
Pupale Analyse, Tag 3:
Der Erfolg der Injektionen wird kontrolliert. Nachdem zum Zeitpunkt der Injektion
schon der Großteil des ca. 5,5 Tage dauernden Puppenstadiums vorüber ist (bei
30°C; (Sokoloff, 1972), sind nun die überlebenden Tiere bereits geschlüpft. Es be-
steht die Möglichkeit, dass manche Injektionen bereits während des Puppenstadiums
zum Tod der injizierten Tiere führen, wobei die Ursache eine essentielle, allgemeine
Genfunktion oder eine Rolle für die Metamorphose sein könnte. Diese Unterschei-
dung ist in aller Regel nicht anhand der Morphologie zu treffen, weswegen diese
Effekte nur als potentieller Defekt der Metamorphose festgehalten werden können.
Erste Ablage, Tag 9:
Der Beginn der Eiablage unterliegt individueller Variabilität, erfolgt bei 30 °C aber
in der Regel vier Tage nach Schlupf (Sokoloff, 1972). Die Tiere hatten also ausrei-
chend Zeit die Imaginalhäutung zu durchlaufen und geschlechtsreif zu werden,
keines der bereits abgelegten Eier wird aber die Embryonalentwicklung vollständig
durchlaufen haben. So werden keine bereits geschlüpften Larven beim Absieben
verloren. Alle innerhalb der ersten Lebenstage abgelegten Eier werden in der ersten
Ablage aufgefangen und durch Kutikulapräparate ausgewertet (Tag 13). Die Eier
werden in geeigneten Sieben (s. 4.2.2; Berghammer et al., 1999a) noch vier Tage
153

II. 2. Ergebnisse
bei 30°C inkubiert, um sicherzustellen, dass allen Embryonen genug Zeit gegeben
wird, sich bis zur Schlupfreife zu entwickeln und eine Kutikula auszubilden.
Zweite Ablage, Tag 11:
154
Nach zwei Tagen ist die Eimenge ausreichend um die Auswertung der Muskula-
tur zu erlauben und der Entwicklungsabstand der Embryonen innerhalb der Ablage
dennoch nicht zu groß. Diese Eier werden wiederum bei 30°C inkubiert, und nach
drei Tagen anhand der Enhancer-trap-Expression auf Defekte der Muskulatur unter-
sucht (Tag 14).
Die Eimenge der Gelege wird im Vergleich zu Gelegen uninjizierter Tiere bzw.
der Gelege untereinander abgeschätzt und festgehalten. Dabei muss die Zahl der
lebenden Tiere pro Well mit beachtet werden. Im Fall reduzierter Eizahl werden die
Ovare von vier der injizierten Tiere präpariert und das Ergebnis dokumentiert. Wäh-
rend des Pilot-Screens wurden die Ovare für eine spätere Dokumentation am Fluo-
reszenzmikroskop fixiert und gefärbt.
Kutikulapräparate, Tag 13:
Die Embryonalentwicklung der ersten Ablage (ca. 3,5 Tage; Sokoloff, 1972), soll-
te abgeschlossen sein. Die an Tag 9 verwendeten Siebe erlauben geschlüpften
Larven durch das Sieb zu kriechen, wo sie aufgefangen werden. Die relative Menge
der geschlüpften Larven wird festgehalten, die zurückbleibenden Eier mit nicht-
geschlüpften Embryonen als Kutikulapräparate eingebettet und über Nacht inkubiert
(Bucher et al., 2002). Es verbleiben nur embryonal letale Phänotypen im Präparat,
wodurch die Auswertung vereinfacht wird. Die Präparation erlaubt die genaue Analy-
se kutikulärer Strukturen durch Fluoreszenz- oder Dunkelfeldmikroskopie und die
Lagerung der Präparate bis zur Auswertung oder der Reanalyse einzelner Aspekte.
Die Auswertung der Präparate richtet ihr Augenmerk auf diverse embryonale Pro-
zesse. Eine hohe Zahl an Eiern ohne Kutikula zeigt Effekte auf die Befruchtung oder
früh-embryonale Letalität an, die in Zusammenhang mit der frühen Achsenbildung
stehen könnte. Die Morphologie der Kutikula gibt unter anderem Hinweise auf Defek-
te während der Achsenbildung, der Entwicklung der extraembryonalen Membranen,
der Segmentierung, der Kopfentwicklung und der Beinentwicklung (s. 1.3).

Muskelpräparate, Tag 14:
II. 2. Ergebnisse
Nach drei Tagen bei 30 °C ist der Großteil der Larven der zweitägigen zweiten
Ablage frisch geschlüpft oder kurz vor dem Schlupf. In diesem Fall werden ge-
schlüpfte und nicht geschlüpfte Larven eingebettet und das Muster der pig19-
Enhancer-Trap-Expression in der Muskulatur der Larven analysiert. Subtilere Mus-
keldefekte, z.B. der Beinmuskulatur sind möglicherweise nicht letal, weswegen alle
Tiere untersucht werden. Hierbei ist wichtig, nicht zu viel von der 72-stündigen Inku-
bation abzuweichen, da sich die Expression des Muskel-Enhancer-Traps der pig19-
Linie erst spät in der Embryonalentwicklung ausbildet, sich dieses Muster aber in
toten Embryonen schnell auflöst. Eine zu frühe oder zu späte Präparation erlaubt
also keine sinnvolle Auswertung mehr. Eine Abweichung von 12 Stunden erwies sich
hierbei bereits als zu groß.
Die Analyse der Enhancer-Trap-markierten Muskulatur erlaubt die Erfassung von
Defekten der Körper- oder der Beinmuskulatur, die protokolliert und dokumentiert
werden. Außerdem ist bei diesen Präparaten, im Gegensatz zur Kutikulapräparation,
bei der alle nicht-kutikulären Gewebe aufgelöst werden, die Unterscheidung zwi-
schen unbefruchteten bzw. unentwickelten Embryonen und embryonaler Letalität in
Keimstreifstadien möglich. Durch Fluoreszenz- oder Nomarski-Mikroskopie frischer
Präparate kann embryonales Gewebe noch vor der Sezernierung von Kutikula er-
kannt, und somit starke Defekte der Achsenbildung oder der Segmentierung detek-
tiert werden.
Während des iBeetle-Screens soll ein zusätzlicher Fluoreszenzmarker des Ner-
vensystems die Detektion neuronaler Phänotypen erlauben.
Larvale Injektionen:
Injektion, Tag 0:
Während des Pilot-Screens wurden 16 bzw. 20 Larven im sechsten (vorletzten)
Larvenstadium des mD17-Stammes (Sokoloff, 1972; Pavlopoulos et al., 2004) inji-
ziert. Im iBeetle-Screen wird ein zusätzlicher Y-Chromosom-gekoppelter Augenmar-
ker die Geschlechtertrennung der Larven erlauben, weswegen dann die Injektion von
8 - 10 weiblichen Larven ausreichend sein wird.
155

II. 2. Ergebnisse
1999a)
156
Auch die Larven werden in ein Multiwellsystem transferiert (Berghammer et al.,
Analyse der pupalen Morphologie und Verpaarung, Tag 11:
Die injizierten Tiere befinden sich jetzt im pupalen Stadium. Die Zahl der überle-
benden und toten Tiere wird dokumentiert. Eine hohe Zahl toter Larven weist entwe-
der auf eine allgemein wichtige Genfunktion oder möglicherweise auf einen Defekt
der Larvalhäutung hin, was aber nicht eindeutig unterscheidbar ist. Das Auftreten von
lebenden L7-Larven, größeren Larvenstadien oder kleineren Puppenstadien weist
auf eine Funktion in der Metamorphosekontrolle hin, ebenso wie das Vorhandensein
toter Präpuppen oder unvollständig verpuppter Tiere.
Die Morphologie der Puppen und das Enhancer-Trap-Muster im dritten Thorakal-
segment wird auf Defekte untersucht um Phänotypen der Kopfentwicklung, der
Extremitätenentwicklung, der Entwicklung der thorakalen Muskulatur und der sonsti-
gen Puppenmorphologie zu detektieren. Für die sinnvolle Auswertung des Muskel-
musters ist der richtige Zeitpunkt wichtig, da das Muster sich erst im Laufe des
Puppenstadiums entwickelt. In frisch geschlüpften Imagines ist das Muster durch die
vorerst noch helle Kutikula zwar gut sichtbar, die Motilität der Käfer und das enge
Zeitfenster bis zur vollständigen Färbung der Kutikula machen aber die Analyse der
Puppenstadien einfacher und deutlich schneller.
Die Tiere werden wiederum mit Männchen des SB- bzw. des black-Stamms ver-
paart, diesmal aber als Einzelverpaarungen mit jeweils zwei Männchen. Dies erleich-
tert später die zeitsparende Identifizierung einzelner Weibchen mit verminderter
Legeleistung, was bei der pupalen Injektion wegen der Notwendigkeit möglichst
großer Gelege mehrerer Weibchen nicht möglich ist.
Kontrolle der pupal-adult-Häutung, Start der Eiablage (Tag 20 - 23)
Falls eine hohe Zahl an injizierten Tieren während der Imaginalhäutung stirbt,
was auf Fehler der Metamorphose-Kontrolle hinweist, werden diese analysiert und
dokumentiert. Außerdem wird eine Eiablage der nun geschlechtsreifen Tiere für die
spätere Auswertung begonnen. Diese Synchronisierung der Ablagen ist nötig, um
den späteren quantitativen Vergleich zu erlauben.
Dieser Arbeitsschritt kann nach ca. 20 bis 23 Tagen stattfinden, da hier kein ex-
akter Zeitabstand zum vorherigen Arbeitsschritt nötig ist.

II. 2. Ergebnisse
Analyse der Adultmorphologie und eventueller Ovariogenesedefekte (Tag 23 – 26)
Die Morphologie der adulten Tiere wird untersucht und somit Defekte der Kopf,
Extremitäten- und Kutikulaentwicklung detektiert. Diese traten entweder spät wäh-
rend der Metamorphose auf und/oder waren zu subtil um bei der Analyse der Pup-
penmorphologie erkannt zu werden. Zusätzlich können eventuell auftretende Verhal-
tensauffälligkeiten z.B. der Fortbewegung zu diesem Zeitpunkt festgestellt werden.
Wiederum wird die Eimenge im Vergleich zu Gelegen uninjizierter Tiere abge-
schätzt. Die Eiablage soll in diesem Fall drei Tage andauern, um eine ausreichende
Eimenge der Einzelverpaarungen sicherzustellen und eventuelle Schwankungen zu
Beginn der Ablage zu nivellieren. Im Fall reduzierter Legeleistung bei mehreren
Gelegen einer Injektion werden die betroffenen Tiere auf ihren Ovarphänotyp hin
untersucht. Potentielle Phänotypen werden dokumentiert, wobei diese nun auf De-
fekte der Entwicklung des Ovars selbst hinweisen können. Wieder wurden die Ovare
während des Pilot-Screens für eine spätere Dokumentation am Fluoreszenzmikro-
skop fixiert und gefärbt.
Analyse der Stinkdrüsen (6 – 8 Wochen nach Injektion)
Die adulten Tiere werden auf das Vorhandensein melanotischer bzw. das Fehlen
von Stinkdrüsen hin untersucht. Gefundene Phänotypen werden dokumentiert. Hier
muss der Zeitabstand ausreichend lange gewählt werden, damit sich Defekte der
Stinkdrüsen gut erkennbar manifestieren können.
Der hier dargestellte Ablauf ermöglicht die Untersuchung embryonaler und post-
embryonaler Prozesse mit nur zwei Injektionen pro dsRNA innerhalb weniger Wo-
chen und berücksichtigt die für die jeweiligen Analysen notwendigen Zeitabstände.
Die Durchführung aller Arbeitsschritte die jeweils im Rahmen des Screeningteils mit
larvaler bzw. mit pupaler Injektionen nötig sind, nenne ich im folgenden Text einen
Durchgang des larvalen bzw. des pupalen Screens.
2.1.2. Arbeitsteilung und unterschiedliche Arbeitspläne erlauben opti-
male Ressourcennutzung und hohen Durchsatz
Die im vorigen Abschnitt vorgestellten Arbeitsschritte der larvalen und pupalen In-
jektionen des iBeetle-Screens müssen im tatsächlichen Screening-Betrieb insgesamt
tausende Male ablaufen. Um dies zu ermöglichen ist es nötig diese Abläufe mög-
157

II. 2. Ergebnisse
lichst effektiv zu gestalten und sinnvolle Arbeitsteilung zu realisieren. Die Injektionen
und die darauf folgenden Auswertungen sollen in jeder der beiden Phasen des
iBeetle-Screens von je vier Doktoranden bzw. Postdocs an den Screening-Centern
Göttingen und Erlangen durchgeführt werden. Außerdem werden die Screener von je
einer/einem technischen Assistenten und studentischen Hilfskräften unterstützt. Die
Arbeitsschritte dieser vier Screener müssen an den Screening-Centern so koordiniert
werden, dass: 1. während der Arbeit die höchstmöglichen Qualitätsstandards erreicht
werden. 2. möglichst viele Gene gescreent werden können, und 3. die Infrastruktur
der Screening-Center möglichst gut genutzt wird.
158
Die Grundlagen für das Erreichen dieser Ziele stellen die im vorherigen Abschnitt
beschriebenen Arbeitsabläufe dar. Wie diese in die Praxis umgesetzt werden kön-
nen, wurde durch Vorexperimente getestet und während der Durchführung des Pilot-
Screens verfeinert.
Um den Screenern eine möglichst hohe Routine für die Durchführung der Injekti-
onen und vor allem der Auswertungen und damit für das Erkennen und die Interpre-
tation interessanter Phänotypen zu ermöglichen, ist es sinnvoll, dass jeder Screener
nur pupale oder larvale Injektionen mit den nachfolgenden Auswertungen durchführt.
Die Zahl der in einem Durchgang injizierbaren dsRNAs wird dabei sowohl durch den
Zeitaufwand der Injektion selbst, als auch durch die nötige Zeit nachfolgender Ar-
beitsschritte begrenzt, da einige Auswertungen nicht auf mehrere Tage aufgeteilt
werden können. Die begrenzenden Schritte des pupalen Screens sind die Injektion
und die Auswertung der Lebendpräparate auf Muskeldefekte, die des larvalen
Screens vor allem die Injektion und die Begutachtung der pupalen Morphologie.
Anhand des in Vorexperimenten und dem Pilotscreen ermittelten Zeitaufwands der
einzelnen Arbeitsschritte (s. Anhang) konnten Zeitpläne für die Durchführung des
iBeetle-Screens erstellt werden (Abb. 27, Abb. 28, Abb. 29). Hierbei muss zunächst
beachtet werden, dass sich die einzelnen Arbeitsschritte aufeinanderfolgender
Durchgänge eines Screeners nicht überschneiden und trotzdem einen kontinuierli-
chen Arbeitsablauf erlauben. Außerdem muss vermieden werden dass sich die
Auswertungsphasen der beiden Screener die jeweils am pupalen oder larvalen
Screen arbeiten überlappen. Die Auswertungen im Rahmen des pupalen Screens
finden vor allem am Fluoreszenzmikroskop, die des larvalen Screens am hochver-
größernden Fluoreszenz-Stereomikroskop statt. Beides sind Geräte, die an den

II. 2. Ergebnisse
Screening-Centern nicht für jeden Screener exklusiv zur Verfügung gestellt werden
können und deren Nutzung deshalb gut koordiniert sein muss.
Im Rahmen des pupalen Screens soll ein Screener 30 dsRNAs innerhalb eines
Durchgangs analysieren. Dies wird möglich, indem vorbereitende Arbeiten für die
Injektion, sowie die Anfertigung eines Teils der Kutikula- und Muskelpräparate durch
die/den technischen Assistenten am jeweiligen Screening-Center übernommen
werden. Innerhalb eines fünfwöchigen Blocks können so fünf Durchgänge durchge-
führt werden (Abb. 27). Ein Screener kann also durchschnittlich 30 Genfunktionen
pro Woche analysieren. Der absolute Zeitaufwand eines Durchgangs und damit auch
die durchschnittliche wöchentliche Arbeitsbelastung des Screeners beträgt dabei
27,25 h. Da bei allen Arbeitschritten bis auf die Auswertung der Kutikulapräparate
bestimmte Zeitintervalle eingehalten werden müssen, erstreckt sich die geplante
Arbeitszeit auch auf Wochenenden, wobei aber pro Woche dennoch durchschnittlich
2,2 Tage ohne geplante Screening-Zeit bleiben.
Um vor allem die Nutzung des Fluoreszenzmikroskops zu koordinieren, arbeiten
die beiden Screener des pupalen Screen-Teils eines Screening-Center zwar nach
dem gleichen Arbeitsplan, allerdings zeitlich um zwei Wochen zueinander versetzt.
Dadurch benötigt beispielsweise Screener 1 das Fluoreszenzmikroskop für die
Auswertung der Muskelpräparate an den Tagen, die für die Injektionen von Screener
2 vorgesehen sind.
Abb. 27: Arbeitsplan für pupale Injektionen und darauf folgende Auswertungen
Die Arbeitsschritte des pupalen Screen-Teils sind in einem Wochenplan dargestellt. Arbeitsschritte,
die zu einem Durchgang des Screening-Ablaufs gehören sind in der gleichen Farbe
hervorgehoben. Die erwartete Bearbeitungszeit ist in Klammern angegeben, der erste
Durchgang (braun) weist zudem die Screen-Tage nach 2.1.1 aus. Innerhalb eines fünfwöchigen
Blocks können fünf Durchgänge ausgeführt werden. Arbeitschritte vorheriger oder
nachfolgender Blöcke sind in grau ergänzt. Die Auswertung der Kutikulapräparate (hellblau)
ist nicht an einen bestimmten Zeitpunkt innerhalb eines Durchgangs gebunden, weshalb
diese Arbeitschritte keinem einzelnen Durchgang zugeordnet sind. Die letzte Kutikula-
Analyse ist aus Gründen der überlappenden Gerätenutzung zweier Screener zeitlich in den
nachfolgenden Block verschoben.
d: Tag, h: Stunden.
159

II. 2. Ergebnisse
160

II. 2. Ergebnisse
Die Planung des larvalen Screening-Teils erlaubt während eines Durchgangs die
Analyse von 23 dsRNAs. In einem sechswöchigen Block können acht Durchgänge
realisiert werden, wobei der kontinuierliche Arbeitsablauf es nötig macht, dass einige
letzte Analysen eines Blocks noch während der Arbeiten am darauf folgenden
sechswöchigen Block durchgeführt werden. Somit kann ein Screener im larvalen
Screen-Teil ebenfalls ca. 30 Gene pro Woche analysieren. Der Arbeitsaufwand eines
Durchgangs beträgt 21,5 h, womit sich die durchschnittliche Screeningzeit auf 28,6 h
pro Woche summiert.
Um die Nutzung des hochvergrößernden Fluoreszenz-Stereomikroskops zu ko-
ordinieren müssen hier für die beiden Screener des larvalen Teils an einem Scree-
ning-Center unterschiedliche Arbeitspläne aufgestellt werden (Abb. 28, Abb. 29).
Screener 1 beginnt dabei seine sechswöchigen Blöcke jeweils erst in der dritten
Screening-Woche des zweiten Screeners. In beiden Fällen ist wiederum Wochen-
endarbeit nötig, wobei diese während des zweiten Arbeitsplans nicht vollständig
durch freie Tage unter der Woche ausgeglichen werden kann. Allerdings gibt es hier
mehr kurze Arbeitstage und der larvale Screen-Teil bietet aufgrund einiger flexibler
Zeitintervalle, die Möglichkeit persönliche Anpassungen vorzunehmen. Nichtsdesto-
trotz sollten die Screener des larvalen Teils in einem sinnvollen Intervall (z.B. 12
Wochen) die Arbeitspläne untereinander wechseln.
Abb. 28: Arbeitsplan 1 für larvale Injektionen und darauffolgende Auswertungen
Die Arbeitsschritte des ersten Screeners des larvalen Screen-Teils sind in einem Wochenplan
dargestellt. Arbeitsschritte, die zu einem Durchgang des Screening-Ablaufs gehören
sind in der gleichen Farbe hervorgehoben. Die erwartete Bearbeitungszeit ist in Klammern
angegeben, der erste Durchgang (braun) weist zudem die Screen-Tage nach 2.1.1 aus.
Innerhalb eines sechswöchigen Blocks können acht Durchgänge ausgeführt werden. Arbeitschritte
vorheriger oder nachfolgender Blöcke sind in grau ergänzt. Um einen kontinuierlichen
Ablauf zu gewährleisten werden einige Arbeitsschritte des ersten Blocks noch nach
Beginn des darauf folgenden durchgeführt. Die Analyse der Stinkdrüsen (hellblau) aus
mehreren Durchgängen findet gesammelt statt.
d: Tag, h: Stunden.
161

II. 2. Ergebnisse
162

II. 2. Ergebnisse
163

II. 2. Ergebnisse
Abb. 29: Arbeitsplan 2 für larvale Injektionen und darauf folgende Auswertungen
Die Arbeitsschritte des zweiten Screeners des larvalen Screen-Teils sind in einem Wochenplan
dargestellt. Arbeitsschritte, die zu einem Durchgang des Screening-Ablaufs gehören
sind in der gleichen Farbe hervorgehoben. Die erwartete Bearbeitungszeit ist in Klammern
angegeben, der erste Durchgang (braun) weist zudem die Screen-Tage nach 2.1.1 aus.
Innerhalb eines sechswöchigen Blocks können acht Durchgänge ausgeführt werden. Arbeitschritte
vorheriger oder nachfolgender Blöcke sind in grau ergänzt. Um einen kontinuierlichen
Ablauf zu gewährleisten werden einige Arbeitsschritte des ersten Blocks noch nach
Beginn des darauf folgenden durchgeführt. Die Analyse der Stinkdrüsen (hellblau) aus
mehreren Durchgängen findet gesammelt statt. Die Schlupfkontrollen in den Woche 5, 6 und
7 könnten je nach persönlicher Preferenz an jeweils einem Tag durchgeführt werden, was
aber einen sehr langen Arbeitstag mit den jeweiligen folgenden Eizahl-Adult-Kontrollen nach
sich zöge.
d: Tag, h: Stunden.
2.2. Das Screening-Schema ermöglicht die Identifizierung
164
interessanter Phänotypen mit hoher Sensitivität
Für den Test des Screening-Ablaufs und den Nachweis über den Erfolg der Me-
thode wurden im Rahmen eines Pilotscreens insgesamt 112 dsRNAs injiziert. Die
Durchführung des Großteils der pupalen Injektionen und der darauf folgenden Aus-
wertungen hat Nikolaus Koniszewski (Universität Göttingen) unter meiner Anleitung
übernommen, die larvalen Injektionen und deren Auswertung hab ich selbst durchge-
führt. 82 der 112 dsRNAs wurden auf Grundlage von Fragmenten aus einer embryo-
nalen cDNA-Bank (zur Verfügung gestellt von R. Schröder; Wolff et al., 1995) herge-
stellt (s. 4.1). Die restlichen 30 dsRNAs waren gegen eine Auswahl Gene gerichtet,
deren Ausfallphänotyp bereits bekannt war (Tab. 8). Diese wurden als Positiv-
Kontrollen zufällig und für die Screener nicht erkennbar den Fragmenten unbekann-
ter Funktion hinzugefügt. Im Folgenden möchte ich die Ergebnisse dieses Pilot-
Screens darstellen.

Tab. 8: Verwendete Positivkontrollen
II. 2. Ergebnisse
Gen Quelle RNA # Erwarteter Phänotyp
methoprenetolerant
(Konopova und Jindra, 2007) 12 L Metamorphose-Block II
broad-complex (Konopova und Jindra, 2008) 37 L Metamorphose-Block II
chitinase-5 (Zhu et al., 2008) 111 L Metamorphose-Block III
chitinase-7 (Zhu et al., 2008) 97 L Adulte Extremitäten (Flügel), Kutikula
hedgehog pers. Mitteil., G. Bucher 23 L Pupale Extremitäten
(Farzana und Brown, 2008) P starker Musterbildungsdefekt
sex-combs-reduced (Tomoyasu et al., 2005) 13 L Pupale Extremitäten
(Curtis et al., 2001) P Segmentierung
(Suzuki et al., 2009) 42 L Pupale Extremitäten/Metamorphosedistal-less
Block I
(Beermann et al., 2001) P Beindefekt
ultra-bithorax (Tomoyasu et al., 2005) 66 L Pupale Extremitäten
(Lewis et al., 2000) P Segmentierung
spineless (Shippy et al., 2009) 86 L Pupaler/Adulter Kopfdefekt
(Toegel et al., 2009) P Kopfdefekt
female-sterile1/Yb pers. Mitteil., R. Rübsam 24 L Oogenese
pers. Mitteil., R. Rübsam P Oogenese, frühembryonal letal
piwi pers. Mitteil., J. Trauner 98 L Oogenese
pers. Mitteil., J. Trauner P Oogenese
wnt-less (Bolognesi et al., 2008b) 28 P starker Musterbildungsdefekt
short-gastrulation (van der Zee et al., 2006) 68 P starker Musterbildungsdefekt
(Nunes da Fonseca et al., P
toll
2008) 92 starker Musterbildungsdefekt
even-skipped (Choe et al., 2006) 74 P starker Musterbildungsdefekt
orthodenticle (Kotkamp et al., 2010) 50 P früh-embryonal letal
caudal (Copf et al., 2004) 84 P Meso-embryonal letal
pumilio diese Arbeit, Kap. 1 77 P Segmentierung, Bein-/Kopfdefekt
(Schoppmeier und Schröder, 103 P
torso-like
2005)
Segmentierung
brain-tumor diese Arbeit, Kap. 1 17 P Segmentierung
six3 (Posnien et al., 2009) 83 P Kopfdefekt
knirps (Cerny et al., 2008) 115 P Kopfdefekt
labial (Posnien und Bucher, 2009) 105 P Kopfdefekt
empty-spiracles (Schinko et al., 2008) 34 P Kopfdefekt
twist pers. Mitteil., S. Roth 46 P genereller Muskeldefekt
mirror pers. Mitteil., M. Schoppmeier 60 P Oogenese
cactus pers. Mitteil., S. Roth 62 P Adult letal
mef-2 pers. Mitteil., C. Schaub 75 P Adult letal
par-1 pers. Mitteil., M. Schoppmeier 91 P Adult letal
org-1 pers. Mitteil., C. Schaub 113 P Adult letal
Aufstellung der für den Pilot-Screen verwendeten Positivkontrollen und ihrer erwarteten Phänotypen
im Rahmen der larvalen (L) oder pupalen (Injektionen). Nur bei zwei dieser Injektionen wurde kein
Phänotyp festgestellt (rot markiert), in einem Fall trat ein deutlich stärkerer Phänotyp auf (emptyspiracles,
grau), in zwei Fällen waren die Phänotypen oder Teile davon nur mit niedriger Penetranz
feststellbar (distal-less, labial, dunkelgrün). Siehe Text für weitere Informationen.
165

II. 2. Ergebnisse
Ergebnisse der Positiv-Kontroll-Injektionen
166
Für einen Teil der 30 als Positiv-Kontrollen verwendeten Gene war bereits be-
kannt, dass sowohl larvale als auch pupale RNAi zu einem detektierbaren Defekt
führt. So sollten durch die Positiv-Kontroll-dsRNAs 37 überprüfbare Phänotypen
produziert werden. Diese erwarteten Phänotypen umfassen Defekte in diversen
embryonalen und postembryonalen Prozessen. So erfüllen einige der Gene Aufga-
ben für die Segmentierung, die frühe Embryonalentwicklung, die Kopfentwicklung,
die Entwicklung der Extremitäten, für das Mesoderm, die Metamorphosekontrolle, die
Oogenese und auch allgemeine, essentielle Aufgaben für das Überleben der injizier-
ten Tiere (Tab. 8).
Die Auswertung der im Rahmen des Screening gemachten Beobachtungen er-
gab, dass nach nahezu jeder dieser 37 Injektionen mit erwarteten Phänotypen (pupal
und/oder larval) Defekte detektiert wurden. Allein in zwei Fällen, der pupalen Injekti-
on von spineless und piwi, konnte kein Effekt festgestellt werden.
Im Falle von spineless (Shippy et al., 2009; Toegel et al., 2009), wurde die Trans-
formation der larvalen Antennen zu Bein-ähnlichen Strukturen übersehen, obwohl sie
in den Präparaten vorhanden war. Die gleiche Transformation in Puppen bzw. adul-
ten Tieren nach larvaler RNAi wurde hingegen festgehalten. Dies ist also schlicht als
Fehler zu werten, wie sie bei einem solchen Prozedere zwangsläufig auftreten.
piwi-RNAi führte zwar nach larvaler, nicht aber nach pupaler RNA-Injektion zu
Sterilität und deutlichen Defekten des Ovars. Wahrscheinlich ist dies auf den Zeit-
punkt der Injektion zurückzuführen. piwi-dsRNA-Injektion in junge Puppen stört zwar
die Oogenese, für die Injektionen des Pilot-Screens wurden aber Tiere im letzen
Drittel der Puppenentwicklung (Schachtner, unveröffentlicht) verwendet, wo piwi-
RNAi möglicherweise keinen Effekt mehr hat (Trauner, 2009) und persönl. Mitteil.).
In den meisten Fällen war die Penetranz der Phänotypen mit über 80 % relativ
hoch (nicht gezeigt), und somit der Effekt leicht und zweifelsfrei detektierbar. Die
pupale Injektion von labial-dsRNA allerdings führte nur in ca. 30 % der präparierten
Kutikulae zu den erwarteten Veränderungen des Musters der Kopfborsten (Posnien
und Bucher, 2009). Dieser Phänotyp ist sehr subtil, weswegen die schwachen Defek-
te einer phänotypischen Serie im Rahmen des Screenings übersehen worden sein
könnten und somit die schwächere Penetranz erklären.
Nach larvaler Injektion von distalless-dsRNA wurden die typischen Veränderun-
gen der Extremitäten (Suzuki et al., 2009) in allen untersuchten Puppen festgestellt,

II. 2. Ergebnisse
eine verlängerte Larvalphase, wie sie ebenfalls nach larvaler RNAi beschrieben
wurde (Suzuki et al., 2009), konnte aber nur bei 4 von 9 Tieren beobachtet werden.
Diese Beispiele machen deutlich, dass die Sensitivität des iBeetle-Screens massiv
von den definierten Schwellenwerten für die Mindest-Frequenz eines auftretenden
Phänotyps abhängen wird.
Vier der Positiv-Kontroll-Injektionen führten zu stärkeren Defekten als den bisher
beschriebenen. Nach pupaler empty-spiracles(ems)-RNAi fanden sich in den Präpa-
raten statt Larven mit subtilen Defekten der Antennen (Schinko et al., 2008), nur
unbefruchtete oder wenig entwickelte Eier. In Anbetracht der normalerweise schwa-
chen Defekte nach pupaler ems-RNAi (Schinko et al., 2008), muss davon ausgegan-
gen werden, dass es sich in diesem Fall um ein Artefakt handelt. Möglicherweise war
hier eine Kontamination der Positiv-Kontroll-RNA vorhanden, oder suboptimale
Bedingungen innerhalb des betroffenen Wells (Verschmutzung etc.) störten die
Verpaarung der Tiere.
distal-less und sex-combs-reduced-pRNAi führte neben den veröffentlichten
Phänotypen (Curtis et al., 2001; Suzuki et al., 2009) auch zu schwer zu interpretier-
baren Kutikularesten. Diese zusätzlichen Phänotypen könnten natürlicherweise
sporadisch auftretenden Abberationen darstellen. Solche Defekte finden sich zu
einem gewissen Anteil in jeder Präparation. Angesichts weiterer, durch die RNAi
hervorgerufener Defekte, könnten diese möglicherweise ebenfalls als spezifische
Effekte gewertet werden.
Im letzten Fall, pupaler RNAi gegen orthodenticle, führte die Injektion zu einer
höheren Penetranz des stärksten Phänotyps als bisher beschrieben. Kotkamp zeigt,
dass nach otd-RNAi 70 % der Embryonen keine Kutikula mehr sezernieren können
(Kotkamp et al., 2010). Hier war dies sogar bei 100 % der Fall, wobei in vielen emb-
ryonales Gewebe nachweisbar war. Scheinbar handelte es sich hierbei also um eine
äußerst effiziente Injektion.
Interessanterweise führten sechs der Positiv-Kontroll-Gene im Rahmen des
postembryonalen Screen-Teils zu bisher unbekannten Phänotypen (Abb. 38). Dies
illustriert, dass wahrscheinlich viele der in der Embryonalentwicklung untersuchten
Gene weitere Funktionen während der Metamorphose wahrnehmen.
Die eingesetzten Positiv-Kontrollen konnten also nahezu vollständig erkannt wer-
den und zeigen somit, dass durch das iBeetle-Prozedere das effektive Hervorrufen
167

II. 2. Ergebnisse
von RNAi-Effekten in unterschiedlichen Enwicklungsstadien und die Detektion inte-
ressanter Phänotypen mit hoher Sensitivität möglich sein wird.
Ergebnisse der dsRNAs unbekannter Funktion
168
Außer den 30 dsRNAs der Positiv-Kontroll-Gene wurden im Rahmen des iBeetle-
Pilot-Screens 82 dsRNAs von zufällig aus einer embryonalen cDNA-Bank (Wolff et
al., 1995) amplifizierten Fragmenten synthetisiert und injiziert (s. 4.1). Es wurden
Fragmente mit einer Größe von ca. 450 bis 2000 bp verwendet und zunächst se-
quenziert. Doppelt vorhandene Fragmente, Fragmente ohne eindeutige Überein-
stimmung zu Sequenzen des Tribolium-Genoms und ribosomale (bis auf zwei) oder
mitochondriale Klone wurden verworfen. Die meisten der verwendeten cDNAs ließen
sich durch BLAST-Suchen automatisch annotierten, konservierten Tribolium-Genen
zuordnen, aber auch noch nicht annotierte Sequenzen (RNAs # 9, 57) und solche
ohne klare Homologien (RNAs # 14, 15, 27, 30, 63, 71, 85) waren darunter. Eine
vollständige Liste der injizierten Fragmente findet sich im Anhang.
Der Großteil der Injektionen dieser zufällig gewählten dsRNAs führte zu detek-
tierbaren Veränderungen im Rahmen des Pilot-Screens (Abb. 30). Nur 39 % der
injizierten dsRNAs hatten weder nach pupaler noch nach larvaler Injektion einen
feststellbaren Effekt, die korrespondierenden Gene spielen also scheinbar keine
wesentliche, entwicklungsrelevante Rolle. 33 % führten aber zu Störungen der unter-
suchten embryonalen oder postembryonalen Entwicklungsprozesse (Abb. 30). Hier-
bei hatten ungefähr ein Drittel dieser Fragmente sowohl Einfluss auf embryonale als
auch postembryonale Prozesse, was wiederum illustriert, dass viele Entwicklungsge-
ne mehrere Aufgaben erfüllen (Miklos und Rubin, 1996).
Fast ein Drittel aller Fragmente führte außerdem zu aus iBeetle-Sicht unspezifi-
scher Letalität der injizierten Tiere (Abb. 30). Als solche unspezifische Letalität be-
zeichne ich hier den Tod der injizierten Tiere während später larvaler Stadien nach
larvaler Injektion oder als junge adulte Tiere nach pupaler Injektion ohne erkennba-
ren, interessanten Phänotyp. Fragmente die diesen Effekt hervorrufen, repräsentie-
ren vermutlich „house keeping“-Gene oder Gene die für Prozesse wichtig sind, die
nicht im Fokus von iBeetle stehen. Der größte Teil dieser Gene (68 %) führt erwar-
tungsgemäß sowohl nach larvaler als auch nach pupaler Injektion zum Tod. In diese
Gruppe fallen beispielsweise auch die beiden injizierten Fragmente ribosomaler
Gene, was bestätigt, dass hier von allgemein essentiellen Genfunktionen ausgegan-

II. 2. Ergebnisse
gen werden kann. Eventuelle zusätzliche Funktionen für Musterbildungsprozesse
während der Entwicklung sind in diesen Fällen nicht detektierbar.
Zusätzlich zu dieser unspezifischen Letalität tritt auch bei dem größten Teil der
Injektionen mit spezifischen Phänotypen embryonale oder spätere Letalität auf, so
dass insgesamt 55 % der Injektionen zu Letalität führten. Dies scheint im Vergleich
zu anderen Studien ein recht hoher Wert für eine zufällige Auswahl an Genen zu
sein. Bei Drosophila geht man beispielsweise davon aus, dass ungefähr ein Drittel
aller Gene zur Letalität mutieren können (Miklos und Rubin, 1996). Eine mögliche
Erklärung dafür könnte beispielsweise die Verwendung einer embryonalen cDNA-
Bank sein, in der wahrscheinlich entwicklungsrelevante Gene überrepräsentiert sind
(weitere mögliche Erklärungen s. 3.2.3).
Abb. 30: Zusammenfassung der Ergebnisse des iBeetle Vorscreens
Darstellung der Verteilung festgestellter Effekte nach larvaler und pupaler Injektion von zu 82
zufällig ausgewählten Genfragmenten korrespondierenden dsRNAs. Ein großer Teil der
Injektionen führte zu keinen detektierbaren Defekten (grau). Der Funktionsverlust von jeweils
ungefähr einem Drittel der Gene führte zum Tod der injizierten Tiere bald nach der Injektion
ohne interessanten Phänotyp (rot) oder zu distinkten Defekten in den untersuchten Entwicklungsprozessen
(grün). Letztere stellen also interessante Befunde im Sinne der Zielsetzung
des iBeetle-Screens dar. Ein großer Teil der dsRNAs führte sowohl nach larvaler als auch
nach pupaler Injektion zu spezifischen Phänotypen (dunkelgrün) oder unspezifischer Letalität
(dunkelrot). Sieben Injektionen führten in einem Screen-Teil zu unspezifischer Letalität und
im anderen Teil zu spezifischen Phänotypen und wurden deshalb doppelt gezählt.
169

II. 2. Ergebnisse
2.3. Es konnten für nahezu alle Prozesse neue Kandidatengene
170
identifiziert werden
Insgesamt wurden durch RNAi gegen ungefähr ein Drittel der zufällig ausgewähl-
ten Gene spezifische Ausfall-Phänotypen hervorgerufen. Für die meisten der in
iBeetle untersuchten Prozesse konnten so bereits im Rahmen des Pilot-Screens
neue Kandidatengene gefunden werden (Abb. 31 - Abb. 37).
Betrachtet man pupale und larvale Injektionen getrennt, führte jeweils die Hälfte
der 82 dsRNAs nicht zu beobachtbaren Veränderungen, ein Viertel führte bald nach
der Injektion zum Tod der injizierten Tiere (Abb. 31, Abb. 32). 16 % der pupalen
Injektionen und 18 % der larvalen Injektionen induzierten Defekte morphologischer
Strukturen oder der Entwicklung selbst, die auf eine Rolle der korrespondierenden
Gene in Musterbildungsprozessen hinweist. Diese Phänotypen sind von besonderem
Interesse für iBeetle und werden im Folgenden präsentiert.

Abb. 31: Zusammenfassung der Ergebnisse durch pupale Injektionen
II. 2. Ergebnisse
Darstellung der Verteilung der nach pupaler RNAi festgestellten Phänotypen. Die Hälfte der
Injektionen (51 %, grau) führte nicht zu detektierbaren Effekten, ein Viertel (26 %, rot) führte
zum Tod oder zu schwerer Unterernährung der Tiere innerhalb der ersten 10 Tage nach der
Imaginalhäutung. 7 % führten zu früher embryonaler Letalität oder Nicht-Befruchtung, ein
innerhalb des Screens nicht unterscheidbarer Effekt. In dieser Gruppe können sich also
Faktoren befinden die für die frühe Embryogenese, oder den komplexen Ablauf der Paarung,
Befruchtung und Eiaktivierung wichtig sind. Klare Enwicklungsgene finden sich aber in den
restlichen Kategorien (grüner Kasten, 16 % insgesamt). Meso-embryonal letal bedeutet den
Tod der Embryonen nach der Kompaktion von embryonalem Gewebe zur Embryonalanlage
bzw. dem Keimrudiment, gemischt embryonal bedeutet eine Mischung aus früh-embryonaler
Letalität und späteren Defekten. Bilden die Embryonen Kutikula aus, lassen aber keine
deutliche Segmentierung erkennen, werden sie als starker Musterbildungsdefekt kategorisiert.
Ist die Larve segmentiert, die Segmentierung aber gestört, liegt ein Segmentierungsphänotyp
vor, gleiches gilt für Borstenmuster-, Kopf- oder Beinphänotypen. Ein Oogenesedefekt
liegt vor, wenn trotz reduzierter Legeleistung keine deutlichen Veränderungen am Ovar
erkennbar sind, also ein subtiler Phänotyp vermutet wird. Ovaratrophie allerdings bedeutet
massive Störungen des Ovars, die zu einer Verkleinerung führen. Zwei der Injektionen
führten zu mehreren Defekten, wodurch hier nach 40 Injektionen 42 Phänotypen detektiert
wurden.
Eine Auflistung der Phänotyp-Kategorien findet sich auch im Anhang.
171

II. 2. Ergebnisse
Abb. 32: Zusammenfassung der Ergebnisse durch larvale Injektionen
Darstellung der Verteilung der nach larvaler RNAi festgestellten Phänotypen. Die Hälfte der
Injektionen (48 %, grau) führte nicht zu detektierbaren Effekten, ein Viertel (25 %, rot) führte
zum Tod der Tiere während larvaler Stadien. 7 % führten zum Tod der Tiere in adulten
Stadien, möglicherweise in der Folge subtiler Defekte während der Metamorphose, die nicht
bestimmt werden können. Defekte der Metamorphosekontrolle sind in drei Kategorien
unterteilt: I) verlängerte Larven-Phase II) fehlerhafte Verpuppung III) fehlerhafte Imaginalhäutung.
Defekte der thorakalen Muskulatur werden durch Analyse der metathorakalen GFP-
Expression des md17-Stammes detektiert. Störungen bei der Bildung der Extremitäten oder
des Kopfes werden entweder bereits in pupalen Stadien, oder später bei den adulten Tieren
festgestellt. Defekte der Stinkdrüsen bedeuten ihre Melanisierung oder ihr Fehlen. Ein
Oogenesedefekt liegt vor, wenn trotz reduzierter Legeleistung keine deutlichen Veränderungen
am Ovar erkennbar sind, also ein subtiler Phänotyp vermutet wird. Ovaratrophie allerdings
bedeutet massive Störungen des Ovars, die zu einer Verkleinerung führen. Das
Vorhandensein dunkel gefärbter Gewebe in Puppenstadien wird als möglicherweise nekrotisches
Gewebe festgehalten und alle Defekte die nicht in die vorgegeben Kategorien eingeordnet
werden können, werden unter „Andere“ gesammelt. Somit wurden in 18 % aller
Injektionen für iBeetle interessante Phänotypen detektiert (grüner Kasten). Hier wurden in
drei Fällen mehrere Phänotypen detektiert, so dass nach 42 Injektionen 46 Phänotypen
detektiert wurden.
Eine Auflistung der Phänotyp-Kategorien findet sich auch im Anhang.
172

2.3.1. Defekte der Ovario- oder Oogenese
II. 2. Ergebnisse
Prozesse der frühen Embryonalentwicklung sind bei Insekten, wie bei vielen an-
deren Tiergruppen abhängig von Faktoren, die während der Oogenese im Ei depo-
niert werden (Heming, 2003). Die Oogenese und das Ovar sind also nicht nur im
Sinne der Fortpflanzung wesentlich für die Entwicklung, es werden auch die geneti-
schen Vorraussetzungen der Embryogenese geschaffen. Das Ovar von Tribolium
gehört dem telotroph-meroistischem Typus an, wo im Gegensatz zu polytroph-
meroistischen Ovaren wie bei Drosophila, Nährzellen zur Versorgung des Embryos
in einem Tropharium verbleiben und nicht mit der wachsenden Oozyte in einem
Follikel gruppiert sind (Büning, 1994; Trauner und Büning, 2007). Im Gegensatz zur
Situation bei Drosophila ist über die Oogenese und die Entwicklung des Ovars bei
Tribolium noch wenig bekannt, iBeetle wird hier also helfen einen noch wenig er-
forschten Prozess zu verstehen.
Sechs pupale und vier larvale Injektionen des Pilot-Screens führten zu Defekten
der Oogenese oder der Ovarentwicklung selbst (Abb. 33, Abb. 34). Zeigten die
injizierten Tiere eine reduzierte Eiproduktion wurden die Ovare präpariert, fixiert und
am Fluoreszenzmikroskop analysiert.
Während des iBeetle-Screens werden die Ovare nur bei niedriger Vergrößerung
auf ihre Morphologie hin untersucht. Dies ist ausreichend um eine Einordnung in eine
von drei Kategorien zu erlauben. Zeigen die Ovare einen sogenannten „held egg“-
Phänotyp (Abb. 33, B) wird dies nicht als spezifischer Effekt dokumentiert. In einem
solchen Fall ist die vermeintlich verminderte Eiproduktion offenbar auf Störungen der
Eiablage zurückzuführen, einem komplexen Prozess, in dem sich Veränderungen auf
vielen Ebenen auswirken können (Sisodia und Singh, 2005) und der nicht im Fokus
von iBeetle steht. Ein solcher Phänotyp trat nach sieben der larvalen und sechs der
pupalen Injektionen auf, wobei nur eine dsRNA (# 82) den Effekt in beiden Injektio-
nen zeigte. Schon die Häufigkeit weist darauf hin, dass diese gestörte Oviposition
vielfältige Ursachen haben kann. Außerdem zeigt sie die Bedeutung der morphologi-
schen Analyse der Ovare für die Sensitivität der Detektion potentieller Oogenese-
oder Ovariogenese-Kandidatengene. Mehr als die Hälfte der Injektionen, die zu
verminderter Legeleistung führten, konnten so als unspezifisch bzw. uninteressant
erkannt werden.
173

II. 2. Ergebnisse
Abb. 33: Defekte der Oogenese nach pupaler Injektion
Kernfärbungen der Ovare von pupal injizierten Tieren (B - G) im Vergleich mit einem Wildtyp-
Ovar (A). Gezeigt sind ganze (A - D, G) oder halbe Ovare (E, F).
A Zwei Halbovare aus je sechs Ovariolen bilden das Tribolium Ovar. Eine Ovariole besteht
aus dem die Nährzellen enthaltenden Tropharium (T) und dem Vitellarium (V) mit wachsenden
Oozyten unterschiedlicher Entwicklungsstadien.
B Beispiel eines „held egg“-Phänotyps (pumilio-RNAi). Im lateralen Ovidukt eines Halbovars
befinden sich mindestens fünf reife Oozyten (*), der zweite laterale Ovidukt ist aufgerissen
und die Oozyten gingen verloren.
C Phänotyp nach Injektion der dsRNA eines automatisch vorhergesagten Gens. Die Oozyten
akkumulieren innerhalb der Ovariolen (Pfeilspitze).
D Phänotyp nach Injektion der dsRNA zu similar to X-box binding protein 1 (ein Transkriptionsfaktor).
Es sind keine reifenden Oozyten sichtbar (Pfeilspitze).
E Phänotyp nach Injektion der dsRNA zu similar to ubiquitin conjugating enzyme E2I. Die
Zahl der Follikelzellen eines Follikels ist reduziert und ihre Kerne scheinen vergrößert (E’’) im
Vergleich zum Wildtyp (E’, gleicher Masstab wie E’’). Es sind wenige späte Oozytenstadien
zu sehen. Dieser Phänotyp wurde als Oogenesedefekt kategorisiert, die morphologischen
Veränderungen aber erst am Mikroskop erkannt.
F Phänotyp nach Injektion der dsRNA zu similar to Dynein light chain 90F. Es sind keine
reifenden Oozyten sichtbar (Pfeilspitze) und die Tropharien scheinen kleiner. Diese RNA
führte auch im larvalen Screen zu Ovar- und weiteren Phänotypen (Abb. 34 B, Abb. 36 D)
G Phänotyp nach Injektion der dsRNA zu similar to SET (ein Cyclin-bindendes Protein). Es
sind keine reifenden Oozyten sichtbar (Pfeilspitze).
Der Größenstandard weißt 100 !m aus.
174

II. 2. Ergebnisse
Liegt kein „held egg“-Phänotyp vor, weist das Ovar aber erkennbare morphologi-
sche Defekte auf, die zu einer Verkleinerung führen, wird der Effekt als Ovaratrophie
bezeichnet (z.B. Abb. 33 D o. Abb. 34). Dies wird für die Mehrzahl der beobachtba-
ren Ovar-Phänotypen der Fall sein. Sowohl das Fehlen von reifenden Oozyten nach
pupaler Injektion (Abb. 33 D, F, G) als auch starke Defekte in der Folge gestörter
Prozesse bei der Ovarentwicklung nach larvaler Injektion (Abb. 34) führen zu einer
erkennbaren Verkleinerung des Ovars. Für unerfahrene Screener sind die einzelnen
Aspekte der Ovarmorphologie bei geringer Vergrößerung nur schwer zu erkennen,
weshalb diese Kategorie der Ovaratrophie relativ breit aufgefasst werden muss.
Nahezu alle interessanten Phänotypen werden also dort eingeordnet werden. Für die
Auswahl besonders interessanter Kandidatengene ist die nachträgliche Analyse und
der Vergleich der Phänotypen dieser Kategorie nötig. Hohe Priorität erhalten dabei
beispielsweise dsRNAs die sowohl nach larvaler als auch nach pupaler Injektion zu
vergleichbaren Effekten führen. Die Wiederholung vielversprechender Injektionen
wird dann helfen die Zahl der im Verlauf des Projekts detailliert zu bearbeitenden
Gene weiter einzugrenzen.
Ist weder ein morphologischer Defekt noch ein „held egg“-Phänotyp zu beobach-
ten, obwohl eine reduzierte Eiproduktion vorliegt, wird ein Oogenese-Defekt fest-
gehalten (z.B. ähnliche Effekte wie in Abb. 33 E). Diese Effekte sollen nicht als
Wildtyp kategorisiert werden, da die Auswertung bei niedriger Vergrößerung dies
nicht zweifelsfrei zulässt. Auch diese Ovare ohne erkennbare morphologische Defek-
te werden dokumentiert, um eine nachträgliche Beurteilung zu ermöglichen. Die hier
zu vermutenden subtilen Störungen der Eiproduktion sind möglicherweise bei einer
Evaluation durch einen Experten charakterisierbar. Auch morphologische Verände-
rungen, die nicht zu einer Verkleinerung des Ovars führen, wurden im Rahmen des
Pilot-Screens dieser Kategorie hinzugefügt (z.B. Abb. 33 C).
Erwartungsgemäß führten die larvalen Injektionen im Wesentlichen zu morpholo-
gisch stärker gestörten Phänotypen (vgl. Abb. 33 C - G mit Abb. 34 B - D), was die
mögliche Beteiligung dieser Kandidaten des larvalen Screens an der Entwicklung
des Ovars selbst illustriert. Diese wurden im Pilotscreen gemeinsam mit schwäche-
ren Phänotypen des pupalen Screen-Teils in die Kategorie „Ovaratrophie“ eingeord-
net. Im Rahmen des Hauptscreens empfiehlt es sich möglicherweise diese Kategori-
sierung zur Erhöhung der Auflösung noch auszuweiten, indem die „Ovaratrophie“-
Kategorie geteilt wird. Dies würde erlauben stärkere von schwächeren Phänotypen
175

II. 2. Ergebnisse
zu trennen. So könnten beispielsweise nur noch starke Defekte, die vermutlich in
Zusammenhang mit der Ovarentwicklung stehen, als „Ovaratrophie“ („small ovary“)
bezeichnet werden. Alle übrigen Fälle morphologischer Veränderungen (z.B. das
Fehlen reifer Follikel) würden dann als Oogenese-Defekte kategorisiert. Fälle ohne
morphologische Veränderungen könnten „potentielle Oogenese-Defekte“ genannt
werden. Die Abwesenheit von erkennbaren morphologischen Defekten sollte nach
wie vor nicht zu einer Kategorisierung als Wildtyp führen, und für die Auswertung
durch Fachleute dokumentiert werden.
176
In einigen Fällen ist bei der Präparation der Ovare feststellbar, dass die betroffe-
nen Tiere keinerlei Fettkörper enthalten und das Abdomen wie ausgetrocknet wirkt.
Diese Tiere sind offensichtlich nicht oder mangelernährt (kachektisch) und sterben
meist im weiteren Verlauf. Die Ovare solcher Käfer zeigen ebenfalls keine entwi-
ckelnden Oozyten, was höchstwahrscheinlich eine Folge der Mangelernährung ist. In
Drosophila wurde gezeigt, dass Mangelernährung sogar zu Apoptose in der Keim-
bahn führt (Mazzalupo und Cooley, 2006). Die Injektionen, die zu diesen Effekten
führen werden deshalb als „letal/kachektisch“ und nicht als Oogenese-Phänotyp
gewertet.
Nur eines der hier als Oogenese-relevant gefundenen Gene ist in Flybase
(http://flybase.org/) bereits mit einem Effekt auf die Fertilität von Drosophila Weib-
chen annotiert (lethal (3) 87Df, RNA-# 20, Abb. 34 B), für ein weiteres wurde eine
Expression in bestimmten dorsalen Follikelzellen beschrieben (X-box binding protein
1, RNA-# 41, Abb. 33 D; (Souid et al., 2007). Außerdem wurden mit dem Gen zur
RNA mit der Nummer 3 einem in den automatischen Annotationen der Genom-
Projekte von Tribolium und Drosophila (Adams et al., 2000; Tribolium Genome
Sequencing Consortium, 2008) vorhergesagten Gen unbekannter Funktion und
Homologie, und dem Gen zu Nummer 85, für das kein Drosophila-Homolog identifi-
ziert werden konnte, bisher unbekannte Faktoren mit einer Funktion verknüpft. Hier
zeigt sich also bereits die Fähigkeit iBeetles zur Identifikation neuer wichtiger Fakto-
ren.
Interessanterweise führten vier der sechs dsRNAs, die nach pupaler Injektion De-
fekte der Oogenese hervorriefen (RNA-Nummern 41, 55, 90, 117) nach larvaler
Injektion zu larvaler Letalität. So könnten die beobachteten Ovar-Phänotypen auch
eine sekundäre Folge von allgemein reduzierter Fitness darstellen, die nach pupaler
Injektion weniger stark zu Tage tritt. Die Berücksichtigung der Ergebnisse beider

II. 2. Ergebnisse
Screen-Teile ist hier also bei der Auswahl interessanter Kandidatengene von großer
Bedeutung. So sollten im Falle der Oogenese nur Gene mit höchster Priorität weiter
untersucht werden, die in keinem der beiden Screenteile mit Letalität assoziiert sind.
Im Umkehrschluss ist das Auftreten von Letalität im jeweils anderen Screen-Teil bei
allen Phänotypen ein Hinweis auf einen möglicherweise sekundären Effekt und somit
ein Argument gegen eine detaillierte Analyse.
Abb. 34: Defekte der Ovariogenese bzw. der Oogenese nach larvaler Injektion
Kernfärbungen der Ovare von larval injizierten Tieren (B - D) im Vergleich mit einem Wildtyp-
Ovar (A bzw. E). Gezeigt sind halbe Ovare.
A Ein Halbovar eines Wildtyp-Weibchens, der laterale Ovidukt ist teilweise abgeschnitten.
B Phänotyp nach Injektion der dsRNA zu similar to lethal (3) 87Df (unbekannte Funktion).
Die Tropharien sind sehr klein, es sind keine wachsenden Oozyten erkennbar.
C Phänotyp nach Injektion der dsRNA zu similar dynein light chain 90F. Die Struktur des
Ovars ist vollkommen verändert, es sind keine Ovariolen zu erkennen. Diese RNA führte
auch im pupalen Screen zu Oogenesedefekten und nach larvaler RNAi zu weiteren Phänotypen
(Abb. 33 F, Abb. 36 D)
D Phänotyp nach Injektion der dsRNA zu einem unbekannten Gen ohne deutliches Drosophila-Homolog.
Die Tropharien sind sehr klein, es sind keine wachsenden Oozyten erkennbar.
Bei der automatischen Annotation des Tribolium-Genoms wurde ein großes Intron
als intergenisch missinterpretiert und das Gen in zwei Genmodelle getrennt.
E Größenvergleich der RNAi-Halbovare mit dem Wildtyp im gleichen Maßstab.
Der Größenstandard in A - D weist 100 !m aus.
177

II. 2. Ergebnisse
2.3.2. Defekte während der Embryonalentwicklung
178
Ein Hauptfokus des iBeetle-Screens liegt auf der Analyse der embryonalen Mus-
terbildung, wobei mehrere Prozesse untersucht werden sollen. Einerseits will man für
Zusammenhänge, die bereits seit längerem bearbeitet werden, offene Fragen klären
und Lücken schließen, andererseits soll ein funktioneller Zugang zu noch neuen
Forschungsgebieten ermöglicht werden. So sind beispielsweise trotz einiger Fort-
schritte vor allem die frühen Ereignisse der Achsendeterminierung noch weitgehend
unbekannt (diese Arbeit, Fonseca et al., 2009; Rosenberg et al., 2009), und auch zur
Funktionsweise der posterioren Wachstumszone, also der abdominalen Segmentie-
rung, der Entwicklung des Kopfes und der Beinentwicklung bleiben viele Fragen
bisher unbeantwortet (Schröder et al., 2008). Noch vollkommen unbearbeitet ist die
Entwicklung der larvalen Beinmuskulatur.
Im Rahmen des Pilot-Screens konnten bereits einige neue Kandidatengene im
Zusammenhang mit der Embryonalentwicklung gefunden werden. Allein sechs
Injektionen führten zu früher embryonaler Letalität, oder Fehlern bei der Befruchtung
(dsRNAs mit den Nummern 8, 39, 78, 82, 89, 118). Diese Effekte, also der Tod des
Embryos vor der Keimrudimentbildung und das vollständige Ausbleiben von Embry-
onalentwicklung sind im Rahmen des Screens bisher nicht unterscheidbar. Mögli-
cherweise lässt sich durch einige zusätzliche Vorversuche und eine genauere Analy-
se des Dotters im Falle solcher Phänotypen die Unterscheidung im Rahmen des
Hauptscreens noch verbessern, um dann auch schwere Defekte in sehr frühen
Stadien der Embryogenese zu detektieren. Diese könnten allerdings auch durch
allgemeine Funktionen für die Embryogenese hervorgerufen werden, weswegen
diese Gruppe von Phänotypen wahrscheinlich keine Priorität bei weiteren Auswer-
tungen erfahren wird. Leichter zu identifizieren, und möglicherweise ein deutlicherer
Hinweis auf eine wichtige Funktion sind Defekte, die erst nach der Keimrudimentbil-
dung zum Tod führen. Eines der injizierten dsRNA-Fragmente führte zu solcher
Letalität in etwas späteren Stadien (meso-embryonal letal, RNA-# 101, similar to HIF
Prolyl Hydroxylase), so dass embryonales Gewebe, aber keine Kutikula ausgebildet
wurde. Zu ähnlichen Ergebnisse führten die Injektionen zu similar to Osiris 19 und
similar to ras (RNA-# 47 und 49). In diesen beiden Fällen fanden sich leere Eier und
unterschiedlich stark betroffene Reste embryonalen Gewebes nur zu jeweils weniger
als 50 %. Diese unterschiedlichen Kategorien embryonaler Letalität zusammenge-
nommen führten diese Injektionen aber jeweils bei ca. 2/3 der Nachkommen zu

II. 2. Ergebnisse
embryonaler Letalität. Hier muss also während des Screens darauf geachtet werden,
dass Letalität zu unterschiedlichen Stadien zusammengenommen eine durchaus zu
beachtende Penetranz ergeben kann, und deshalb als Phänotyp festgehalten wer-
den muss.
Diese früh gestörten Phänotypen weisen wahrscheinlich auf eine Beteiligung der
Gene an der Achsenbildung oder an frühen Prozessen der Segmentierung hin. Alle
bisher beschriebenen embryonal letalen Phänotypen wurden nicht durch Aufnahmen
dokumentiert, und finden sich deshalb nicht in Abb. 35.
Dort sind weitere embryonale Phänotypen dargestellt, deren Defekte allerdings
nicht so stark waren, dass sie die Bildung von Kutikula verhinderten. Unterschiedli-
che Prozesse sind hierbei betroffen. Es finden sich Defekte der Kopfentwicklung
(Abb. 35 B, C) der Beinentwicklung (D) und des Borstenmusters (H) auf. Solche
Veränderungen des Borstenmusters können in Drosophila und mit Sicherheit auch in
Tribolium als Indikator für Störungen innerhalb des Ektoderms, z.B. der planaren
Zellpolarität interpretiert werden (Lawrence et al., 2004; Payre, 2004). Außerdem
traten noch ein starker Musterbildungsdefekt, bei dem nur Kutikulareste zurückblie-
ben (Abb. 35 F), und ein Defekt der anterioren Segmentierung auf, der allerdings nur
in ca. 30 % der Larven beobachtet wurde.
Besonders interessant innerhalb dieser embryonalen Phänotypen sind die Er-
gebnisse der Injektion der RNA-# 9. Diese RNA entspricht einem Gen, das erstens
keine Homologien zu bekannten Genen aufweist und zweitens nicht in der automati-
schen Annotation des Tribolium-Genoms entdeckt wurde. Dieses Gen zeigt sich
zudem pleitrop, da es einen Defekt innerhalb des Kopfes (Abb. 35 C), der Beine
(Abb. 35 D) und in den Stinkdrüsen der adulten Käfer zeigt (Abb. 37 B). Hier wird
also demonstriert, dass das Vorgehen im iBeetle-Screen die Detektion interessanter
Gene erlaubt, die trotz des sequenzierten Genoms bisher nicht entdeckt wurden.
Außerdem konnten hier bereits Phänotypen diverser Prozesse detektiert werden,
was wiederum die Effektivität des Screens zeigt. Es wurden allerdings keine spezifi-
schen Defekte der Muskelentwicklung detektiert. Einerseits könnte dies auf die noch
neue Methodik und damit in Zusammenhang stehende Schwierigkeiten zu Beginn
des Pilot-Screens zurückzuführen sein, andererseits aber auch schlicht durch die
niedrige Zahl an gescreenten Genen bedingt sein. Die Detektion der Positiv-Kontrolle
twist zeigte aber, dass Effekte auf die Muskelentwicklung prinzipiell erkannt werden
können.
179

II. 2. Ergebnisse
Abb. 35: Morphologisch feststellbare Defekte der Embryonalentwicklung nach pupaler
Injektion
Gezeigt sind Aufnahmen der Kutikula-Autofluoreszenz von Larven nach parentaler RNAi (B -
F, H) im Vergleich zum wildtypischen Phänotyp (A, G).
A laterale Ansicht des Kopfes einer Wildtyp-L1-Larve.
B Phänotyp nach Injektion der dsRNA zu similar to nuclear fallout (Mikrotubuli-bindendes
Protein, wichtig unter anderem für adulte sensorische Vorläuferzellen in Drosopila (Abdelilah-
Seyfried et al., 2000). Laterale Ansicht des Kopfes. Die distale Borste der Antenne fehlt
(Pfeilspitze).
C Phänotyp nach Injektion der dsRNA zu einem nicht annotierten Gen ohne bekannte
Homologe. Laterale Ansicht des Kopfes. Das Borstenmuster des Kopfes ist gestört (Pfeilspitze).
D Phänotyp nach Injektion der dsRNA zu einem nicht annotierten Gen ohne bekannte
Homologe. Optischer Schnitt durch Kopf und Thorax. Die Kutikula der Antennen und zweier
Beine ist nach innen eingestülpt.
E Phänotyp nach Injektion der dsRNA zu similar to translin (DNA-bindendes Protein). Ventrale
Ansicht. Anteriore Segmente fehlen, nur ein thorakales Segment (die Pfeilspitze zeigt auf
ein Bein) und das Abdomen sind erkennbar.
F Phänotyp nach Injektion der dsRNA zu einer vorhergesagten mRNA (Ähnlichkeit zu Protein-Tyrosin-Phosphatasen).
Nur noch ein undefinierbarer Rest Kutikula und ein Stück Darm
sind erkennbar.
G Dorsale Ansciht einer Wildtyp-L1-Larve.
E Phänotyp nach Injektion der dsRNA zu similar to glucorunyltransferase-I (wichtig für
Proteoglykan-Biosynthese). Dorsale Ansicht. Das Borsten-Muster der abdominalen Segmente
ist gestört (Pfeilspitze).
Anterior ist in allen Abbildungen links.
T1: erstes thorakales Segment, A1: erstes abdominales Segment, A8: achtes abdominales Segment
180

2.3.3. Defekte postembryonaler Prozesse
II. 2. Ergebnisse
Der zweite Haupt-Fokus des iBeetle-Screens liegt auf Musterbildungsprozessen
während der Metamorphose, die durch larvale RNA-Injektionen untersucht werden
sollen. Dieser Themenkomplex, bei dem vor allem die Entwicklung des Kopfes, der
Extremitäten und der thorakalen Muskulatur von Interesse ist, ist noch weitgehend
unbearbeitet. Hier werden also in besonderem Maße neue Forschungsrichtungen
unterstützt.
Auch die larvalen Injektionen führten zu einigen unterschiedlichen Phänotypen.
Zunächst trat beispielsweise nach sechs Injektionen der Tod der injizierten Tiere in
adulten Stadien auf (RNA-# 10, 20, 25, 55, 82, 89). Da diese Letalität erst deutlich
nach der Injektion auftritt, ist dies wohl nicht auf essentielle Funktionen der Gene
zurückzuführen, sondern auf eine spezifische Beteiligung an physiologischen Vor-
gängen der adulten Tiere, die beispielsweise mit der Nahrungsaufnahme, dem
adulten Stoffwechsel oder neurologischen Prozessen zusammenhängen könnten.
Eine der RNAs dieser Gruppe könnte ein Beispiel sein, das die Schwächen eines
großangelegten Screenings verdeutlicht. Die Injektion der dsRNA zu similar to calci-
neurin-B (RNA-# 10) führte im Rahmen des Pilot-Screens zu erwähnter adulter
Letalität. Der Tod von drei von sieben Puppen, und die verspätete Verpuppung von
vier von 16 Larven flossen dabei wegen der geringen Penetranz nicht in die Katego-
risierung des Phänotyps ein. In Drosophila zeigen Mutanten des calcineurin-B-Gens
Störungen der Metamorphose, die zum Tod in larvalen oder pupalen Stadien führen
(Sullivan und Rubin, 2002), also den wenig penetranten Phänotypen im Screen
entsprechen. Außerdem entwickeln „Escaper“ der Drosophila-Mutanten Defekte der
indirekten Flugmuskulatur (Gajewski et al., 2003). Dieser Phänotyp war in unserem
Screen nicht nachweisbar, möglicherweise weil in diesem Fall die RNA-
Konzentration nicht ausreichend war, um Defekte zu induzieren. Natürlich ist auch
denkbar, dass calcineurin-B keine konservierte Funktion in Tribolium hat, dennoch
verdeutlicht dieser Zusammenhang, dass die Sensitivität eines solchen Screens
zwangsläufig begrenzt ist und nicht alle Faktoren mit interessanten Funktionen
detektiert werden können.
Zum Tod der injizierten Tiere in etwas früheren Stadien führen Faktoren, die mit
der Kontrolle des Ablaufs der Metamorphose interferieren. Die RNA mit der Nummer
51 führte zur Verlängerung der Larven-Phase, die RNAs 36 und 64 verhinderten die
Puppenhäutung (Abb. 36 M) und RNA 88 führte zum Tod der Puppen. Zwischen
181

II. 2. Ergebnisse
diesen Phänotypen könnte möglicherweise ein Zusammenhang bestehen: drei dieser
vier RNAs scheinen zu essentiellen „house-keeping“-Genen zu korrespondieren. Die
Recherche der besten Drosophila-BLAST-Ergebnisse in „Fly base“ ergab einen
Kalium-Kanal (RNA-# 51), ein Protein mit einer Rolle für den Atmungsketten-
Komplex IV (RNA-# 36) und einen Elektronentransporter der oxidativen Phosphory-
lierung (RNA-# 88). Im vierten Fall gab es keine Information in „Fly base“. Außerdem
führten mindestens drei der vier RNAs nach pupaler Injektion zu adulter Letalität oder
Kachexie, im vierten Fall wurde dies fälschlicherweise nicht getestet. Diese Situation
legt nun den Schluss nahe, dass hier möglicherweise dsRNAs Stoffwechsel-
relevanter Gene im Falle einer wenig effizienten larvalen RNA-Interferenz oder durch
teilweise Redundanz erst in späteren Stadien zum Tod der Tiere führen. Möglicher-
weise akkumulieren durch die RNAi hervorgerufene Imbalancen, bis sie schließlich
zum Tod der injizierten Tiere führen und somit den Eindruck eines spezifischen
Defekts der Metamorphose erwecken. Diese Situation kann bei der Suche nach
Kandidaten-Genen für die Metamorphose-Kontrolle durch die Berücksichtigung der
Phänotypen nach pupaler Injektion entschärft werden, indem hierbei Kandidaten
priorisiert werden, die nach pupaler RNAi nicht zu Letalität führen. Die RNAs # 36, 51
und 64 führten nach pupaler Injektion zu adulter Letalität/Kachexie. Es zeigt sich also
der große Wert der beiden unabhängigen Injektionen für die Analyse der Screen-
Ergebnisse.
182
Im Laufe der Metamorphose traten auch Defekte einzelner morphogenetischer
Prozesse auf. So kam es zu einigen Defekten der Flügelentwicklung, der Kopf- und
der Beinentwicklung sowie zu Veränderungen der Stinkdrüsen und der Kutikula (Abb.
36, Abb. 37). Hervorzuheben ist dabei die Pleiotropie von similar to Dynein light
chain 90F (RNA-# 70) dessen larvale Injektion zu Veränderungen der Antennen
(nicht zu erkennen in Abb. 36 D), der pupalen (Abb. 36 D) und der adulten Flügel (n.
gezeigt) führt und das sich zudem sowohl nach larvaler als auch pupaler Injektion auf
die Morphologie des Ovars auswirkt (Abb. 33, Abb. 34). Dieses Gen scheint also in
diversen Prozessen eine wichtige Rolle zu spielen, ohne eine „house keeping“-
Funktion zu erfüllen. Ähnlich scheint die Situation in Drosophila zu sein, wo diese
Dynein-Untereinheit ebenfalls verzichtbar für die grundsätzlichen Funktionen von
Dynein zu sein scheint, aber beispielsweise während der Spermatogenese wichtig ist
(Li et al., 2004; Mische et al., 2008). Es ist also denkbar, dass similar to Dynein light

II. 2. Ergebnisse
chain 90F nur für bestimmte Dynein-Funktionen in unterschiedlichen Entwicklungs-
prozessen benötigt wird.
Eine weitere RNA (# 76) führte außerdem zu Defekten der thorakalen Muskulatur
(Abb. 36 L). Diese wurden problemlos durch die pupale Analyse des Enhancer-Trap-
Musters detektiert, wenngleich bei der weiteren Verfolgung der Tiere auffiel, dass der
Effekt in jungen adulten Stadien noch deutlicher zum Ausdruck kam. Die Auswertung
dieses Stadiums ist aber im Screenablauf nicht praktikabel (schwierigere Zeitplanung
wegen engem Zeitfenster, komplizierte Auswertung wegen Beweglichkeit der Tiere,
deutliche Verschlechterung der Auswertbarkeit pupal-letaler Phänotypen), dennoch
sollten solche Phänotypen, wenn möglich, im Screenablauf ausgesondert und weiter
beobachtet werde. Das korrespondierende Homolog dieses Gens in Drosophila spielt
eine Rolle für hedgehog-Signalling und für die asymmetrische Teilung von Neu-
roblasten (Jia et al., 2009; Sousa-Nunes et al., 2009), ist bisher aber nicht in Zu-
sammenhang mit Muskelentwicklung gebracht worden.
Abschließend sei noch ein interessanter Effekt erwähnt, der vermutlich nicht mit
den Vorgängen während der Metamorphose in Zusammenhang steht: die Injektion
der RNA zu similar to heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U-like 1 (RNA-# 39)
führt zum Verlust der GFP-Expression in den Augen und des Thorax der injizierten
Tiere, während die schwache Expression innerhalb des zentralen Nervensystems
erhalten bleibt (Abb. 36 I, J). Die Tiere haben keine weiteren Auffälligkeiten, ob die
Muskulatur des Thorax vorhanden ist oder fehlt ist unklar. Ihre Nachkommen zeigen
wieder das normale Enhancer-Trap-Muster. similar to heterogeneous nuclear ribo-
nucleoprotein U-like 1 scheint also nötig für die GFP-Expression in den Augen und
dem Thorax zu sein, dabei aber nicht mit anderen Prozessen während der Metamor-
phose zu interferieren. Die pupale Injektion dieser RNA führt allerdings zu früher
embryonaler Letalität oder Fehlern bei der Befruchtung.
183

II. 2. Ergebnisse
184

Abb. 36: Defekte in larvalen oder pupalen Stadien
II. 2. Ergebnisse
Gezeigt sind Aufnahmen unterschiedlicher larvaler RNA-Injektionen (B - E, G, H, J, L, M) im
Vergleich zum Wildtyp-Phänotyp (A, F, I, K). I-M: Fluoreszenzaufnahmen der GFP-
Expression.
A Ventrale Ansicht einer Wildtyp-Puppe.
B Ventrale Ansicht einer Puppe nach larvaler Injektion von similar to rac-RNA (# 8). Die
Flügelspitzen (Pfeil) sind nach außen gewölbt.
C Ventrale Ansicht einer Puppe nach larvaler Injektion von dsRNA zu einem vorhergesagten
Protein (# 3). Die Flügel sind deutlich reduziert (Pfeile), möglicherweise fehlen die Elytren.
Auch die Morphologie der Beine ist gestört.
D Ventrale Ansicht einer Puppe nach larvaler Injektion von similar to dynein light chain 90F-
RNA (# 70). Die Flügel sind verkürzt (Pfeile), die Antennen irregulär (Pfeilspitze).
E Ventrale Ansicht einer Puppe nach larvaler Injektion von similar to glucuronyltransferase I-
RNA (# 40). Die Elytren sind verändert und reduziert (Pfeile).
F Dorsale Ansicht einer Wildtyp-Puppe.
G Ventrale Ansicht einer Puppe nach larvaler Injektion von similar to flavoprotein beta petide-
RNA (# 88). Eine ungewöhnliche Schwarzfärbung ist festzustellen. Die injizierten Tiere
sterben als Puppen
H Dorsale Ansicht einer Puppe nach larvaler Injektion von similar to ras-RNA (# 49). Entlang
der dorsalen Mittellinie sind dunkle, möglicherweise nekrotische Areale zu beobachten
(Pfeil).
I Fluoreszenzaufnahme einer Wildtyp-Puppe in ventraler Ansicht. GFP-Expression in den
Augen und dem Thorax (Pfeile) ist deutlich sichtbar.
J Fluoreszenzaufnahme einer Puppe nach larvaler Injektion von similar to heterogeneous
nuclear ribonucleoprotein U-like 1-RNA (# 39) in ventraler Ansicht. GFP-Expression in den
Augen und dem Thorax ist nicht mehr sichtbar, die noch vorhandene schwache Expression
innerhalb des Zentral-Nerven-Systems (Pfeilspitze) zeigt aber das Vorhandensein des
Enhancer-Konstrukts.
K Fluoreszenzaufnahme einer Wildtyp-Puppe in dorsaler Ansicht. In einem Hemisegment
des dritten Thorakalsegments sind zwei diagonale und drei longitudinale (Pfeile, Vergrößerung
in K’) Muskeln zu erkennen.
L Fluoreszenzaufnahme einer Puppe nach larvaler Injektion von similar to AGAP002501-
RNA (# 76, vermutlich die regulatorische Untereinheit 2 der Proteinphosphatase 4) in dorsaler
Ansicht. Nur zwei der drei longitudinalen Muskeln pro Hemisegment im dritten thorakalen
Segment sind vorhanden (Pfeile, Vergrößerung in L’). In jungen adulten Käfern sind diese
Defekte noch deutlicher (nicht gezeigt).
M Laterale Ansicht eines Tiers nach larvaler Injektion von similar to GA21389-RNA (# 36).
Ein Metamorphose-Block liegt vor, die Tiere versterben im gezeigten präpupalen Stadium.
Unter der larvalen Kutikula sind Merkmale pupaler Stadien, wie die Komplexaugen und die
thorakale Muskulatur anhand der GFP-Expression erkennbar.
Anterior ist in allen Abbildungen links.
185

II. 2. Ergebnisse
Abb. 37: In adulten Tieren auftretende Effekte
A Ventrale Ansicht eines Wildtyp-Käfers. Kopf und die ersten beiden thorakalen Segmente
sind erkennbar.
B Ventrale Ansicht eines Käfers nach larvaler Injektion der dsRNA zu einem bisher unbekannten
Gen ohne deutliche Homologe. Im Thorax erscheinen dunkle Flecken, deren Lage
mit der Lage der prothorakalen Stinkdrüsen (Sokoloff, 1972) korrespondiert. Der Effekt war in
zwei von fünf Tieren zu beobachten, war allerdings in einem der Tiere nur transient.
C Ein Bein des dritten thorakalen Segments eines Wildtyp-Käfers.
D Das Bein eines adulten Käfers nach larvaler Injektion von similar to thioredoxin-like-dsRNA
(# 78). Vor allem Tarsus (schwarze Linie) aber auch Tibia sind verkürzt.
E Der Vergleich eines Wildtyp-Käfers (oben) mit einem Käfer nach larvaler similar to Histone
H3.3B-dsRNA-Injektion (#89, unten). Das RNAi-Tier zeigt eine dunklere Färbung der Kutikula.
Außerdem war diese Injektion mit erhöhter adulter Letalität assoziiert.
186

2.3.4. Bisher unbekannte Phänotypen der Positiv-Kontrollen
II. 2. Ergebnisse
Da in der Vergangenheit der Großteil der entwicklungsbiologisch arbeitenden
Tribolium-Laboren an embryologischen Fragestellungen interessiert waren, haben
die meisten der verwendeten Positiv-Kontrollen bekannte Aufgaben innerhalb der
Embryonalentwicklung (Tab. 8). Für einige dieser Gene konnten im Rahmen der
larvalen Injektionen des Pilot-Screens neue Funktionen für die Adult-Entwicklung
festgestellt werden (Abb. 38). Auch dies zeigt wiederum die Pleiotropie vieler Ent-
wicklungsgene, und die Effektivität mit der solche mehrfachen Funktionen innerhalb
des iBeetle-Screens durch die beiden unabhängigen Injektionen erkannt werden
können.
Besonders interessant ist hierbei der Effekt der ultrabithorax-RNAi. Hier sugge-
riert das Vorhandensein der Metathorax-typischen Muskulatur eine Transformation
des ersten und zweiten abdominalen Segments hin zu einer Identität ähnlich dem
dritten thorakalen Segment (Abb. 38 K). Dies steht im Widerspruch zu bereits veröf-
fentlichten Daten. Tomoyasu zeigte anhand ektopischer Mesonotae und Elytren im
dritten thorakalen und ersten abdominalen Segment eine Transformation hin zu einer
Identität ähnlich des zweiten thorakalen Segments (Tomoyasu et al., 2005), was für
das Vorhandensein von Elytren statt membranöser Flügel im Metathorax auch in
meinen Injektionen bestätigt wurde. Hier scheint sich also der Verlust von
ULTRABITHORAX in unterschiedlicher Weise auf das Ekto- und das Mesoderm
auszuwirken.
187

II. 2. Ergebnisse
Abb. 38: Bisher unbekannte Phänotypen der Positvkontrollen
A Laterale Ansicht einer Wildtyp-Puppe in einer Fluoreszenzaufnahme, das Komplexauge ist
weiß umrandet.
B und C Laterale Ansicht von Puppen nach larvaler Injektion von brain-tumor- (B) oder six-3dsRNA
(C) in Fluoreszenzaufnahmen. Die Zahl der Ommatidien ist reduziert, und ihre
Anordnung gestört.
A - C zeigen Puppen gleichen Entwicklungsalters, ventral ist unten.
D Ventrale Ansicht einer Wildtyp-Puppe. Die Flügelspitzen (Pfeile) liegen nahe beisammen.
E Ventrale Ansicht einer Puppe nach larvaler mirror-RNAi. Die Puppe ist deutlich verbreitert,
so dass die Flügelspitzen nicht mehr benachbart zueinander liegen.
F Ventrale Ansicht einer Puppe nach larvaler wnt-less-RNAi. Die Flügel fehlen (*) und die
Beine sind verändert.
G Laterale Ansicht einer Wildtyp-Präpuppe in einer Fluoreszenaufnahme. Die thorakale
Muskulatur ist anhand der GFP-Expression bereits erkennbar (Pfeilspitze).
H Laterale Ansicht eines Tieres nach larvaler pumilio-RNA-Injektion in einer Fluoreszenaufnahme.
Die Puppenhäutung konnte nicht vollendet werden, das Tier ähnelt einer Präpupe
und zeigt die sich entwickelnde thorakale Muskulatur (Pfeilspitze). Die Entwicklung ist arretiert,
und die Tiere sterben in diesem Zwischenstadium.
I Larvale knirps-RNAi führt zu einem identischen Phänotyp wie in H zu sehen, hier gezeigt in
einer lateralen Auflichtaufnahme.
J Dorsale Fluoreszenzaufnahme einer Wildtyp-Puppe. Die Pfeilspitzen markieren das erste
und zweite abdominale Segment.
K Dorsale Fluoreszenzaufnahme einer Puppe nach larvaler ultra-bithorax-RNAi. Im ersten
und zweiten abdominalen Segment sind ektopische GFP-positive Gewebe erkennbar (Pfeilspitzen),
ähnlich denen im dritten thorakalen Segment.
188

3. Diskussion
II. 3. Diskussion
3.1. Ein genomweiter RNAi-Screen in Tribolium ist technisch
möglich
Im zweiten Kapitel dieser Arbeit habe ich bisher die Planung, Durchführung und
Auswertung eines Pilotscreens für ein genomweites Tribolium-RNAi-Screen Projekt
beschrieben. Diese Arbeiten stellen die Grundlage für die technische Durchführung
dieses Großprojekts und den Beweis seiner Machbarkeit dar. Im Folgenden möchte
ich zusammenfassen, inwieweit damit gezeigt werden konnte, dass sich die Methodik
technisch und bezüglich der zu erwartenden Ergebnisse zur Durchführung eines
genomweiten Projektes eignet, und mögliche kritische Punkte aufzeigen.
3.1.1. Sowohl pupale als auch larvale RNAi sind im Screenmaßstab
durchführbar
Im Rahmen des Pilot-Screens haben, wie auch für den Hauptscreen geplant,
zwei Screener jeweils Larven bzw. Puppen mit dsRNAs injiziert und die darauf fol-
genden Analysen durchgeführt. In beiden Fällen sind je vier Auswertungsschritte
nötig, um alle zu untersuchenden Prozesse abzudecken (Abb. 26). Dabei wird durch
die pupale Injektion auch in den Nachkommen der injizierten Tiere RNA-Interferenz
ausgelöst, was die Analyse der Embryonalentwicklung erlaubt (Bucher et al., 2002).
Durch die larvale Injektion soll der Einfluss der zu screenenden dsRNAs auf die
Metamorphose untersucht werden (Tomoyasu und Denell, 2004; Konopova und
Jindra, 2007). Die personelle Trennung beider Screen-Teile ermöglicht den Scree-
nern eine optimale Einarbeitung und die nötige Routine für die teilweise anspruchs-
vollen Arbeiten und Auswertungen. Die Screener müssen dabei einerseits in der
Lage sein, die Injektionen so effektiv wie möglich durchzuführen, und anderseits die
Morphologie der schlupfreifen Larven bzw. der Puppen und adulten Käfer genau
kennen und interessante Phänotypen sicher von natürlich auftretenden Defekten
unterscheiden können.
Um den iBeetle-Screen genomweit durchzuführen, müssen während der ersten
Phase des Projekts (drei Jahre) 6000 Gene analysiert werden. An jedem der beiden
Screening-Zentren (Göttingen und Erlangen) werden zwei Screener den larvalen und
zwei Screener den pupalen Teil des Screens durchführen. Dabei soll nur während
189

II. 3. Diskussion
des ersten Jahres aktiv gescreent werden, so dass den Doktoranden Gelegenheit
gegeben werden kann, in den folgenden beiden Jahren erste Kandidaten-Gene der
für sie speziell interessanten Prozesse zu analysieren. Somit muss ein Screener
innerhalb eines Jahres 1500 Gene analysieren. Die vorgestellten Arbeitspläne (Abb.
27, Abb. 28, Abb. 29) und die Methodik (2.1.1) erlauben diesen hohen Durchsatz.
190
Der Pilot-Screen machte deutlich, dass sowohl die pupale als auch die larvale
dsRNA-Injektion (Bucher et al., 2002; Tomoyasu und Denell, 2004) geeignet sind,
auch in großem Maßstab durchgeführt zu werden. Die Methoden sind gut routinisier-
bar, schnell zu erlernen und ohne großen apparativen Aufwand anzuwenden. Die
Injektionen mittels einfacher 1D-Mikromanipulatoren und fein ausgezogener Glaska-
pillaren unter Verwendung mehrerer Kapillarhalter zur Vermeidung von Kreuzkonta-
minationen (s. 4.2.2) erwies sich als praktikable Lösung. Die Größenselektion durch
verschiedene Siebgrößen und die Kryoanästhesie der zu injizierenden Tiere erlau-
ben dabei auch die einfache Durchführung larvaler Injektionen (4.2.3).
Es zeigte sich, dass in beiden Fällen wenige injizierte Tiere ausreichen, um die
nötigen Auswertungen durchzuführen. Im Durchschnitt überleben 86 % der Larven
und 78 % der Puppen die Prozedur (nicht gezeigt), sofern kein spezifischer RNAi-
Effekt zum Tod führt. So stehen meist acht von zehn Larven oder sechs von acht
Puppen zur weiteren Analyse zur Verfügung. Da beide Screener im Rahmen des
Pilot-Screens nicht die Gelegenheit hatten, Routine in dem Unfang zu entwickeln,
wie das im Hauptscreen der Fall sein wird, kann davon ausgegangen werden, dass
diese Quoten in iBeetle noch verbessert werden können. Die Zahl der überlebenden
Tiere ist ausreichend, um sowohl während des pupalen Screenteils die nötige Menge
an Nachkommen für die embryonalen Analysen zu erhalten, als auch während des
larvalen Screens morphologische Veränderungen der Tiere festzustellen. Dies wird
durch die meist hohen Penetranzen der Tribolium-RNAi-Phänotypen möglich (z.B.
Bucher et al., 2002; Konopova und Jindra, 2007). Auch innerhalb des Pilotscreens
waren die Effekte der Injektionen meist in 60 bis 100 % der untersuchten Tiere
beobachtbar (Anhang 6 bzw. nicht gezeigt). Dies gilt sowohl für die larvalen als auch
für die pupalen Injektionen und für die zufällig ausgewählten Fragmente unbekannter
Funktion ebenso wie für die Positiv-Kontrollen. Nur einige wenige der neu gefunde-
nen embryonalen Phänotypen (RNAs # 9, 11, 40) zeigten eine geringere Penetranz
(30 - 50 %). Dies ist aber offensichtlich kein prinzipielles Problem bei embryonalen
Phänotypen, da die als Positiv-Kontrollen verwendeten embryonalen Entwicklungs-

II. 3. Diskussion
gene mit hoher Penetranz zu Defekten der Embryonalentwicklung führten (nicht
gezeigt).
Sowohl larvale als auch pupale Injektionen sind für die effektive Realisierung des
RNAi-Screens notwendig, da aus technischen Gründen nicht alle zu untersuchenden
Prozesse durch eine einzige Injektion abgedeckt werden können. Um Defekte der
Entwicklung adulter Strukturen während der Metamorphose auszulösen muss larval
injiziert werden (Tomoyasu und Denell, 2004). Da aber der RNAi-Effekt mit der Zeit
nachlässt (Bucher et al., 2002), können zum Zeitpunkt der Geschlechtsreife der
injizierten Tiere nicht mit bestmöglicher Effizienz embryonale Phänotypen induziert
werden. Somit sind zusätzliche pupale Injektionen nötig. Diese beiden Injektionen
gemeinsam sind jedoch ausreichend, um Phänotypen in allen zu untersuchenden
Prozessen zu detektieren (s. Ergebnisse). Für 16 der insgesamt 18 zu screenenden
Prozesse (s. 1.3) konnte während des Prescreens entweder durch Positiv-Kontrollen
oder unbekannte Fragmente gezeigt werden, dass das Screeningschema die Detek-
tion entsprechender Phänotypen erlaubt.
Während der Planungsphase des Screens wurde der Nutzen der larvalen Injekti-
onen diskutiert. Die Detektion einer Reihe bisher unbekannter Phänotypen während
der Metamorphose, die teilweise sogar durch Injektionen von für embryonale Phäno-
typen beschriebenen Positiv-Kontrollen herrührten, macht nun aber den Wert der
larvalen Injektionen deutlich. Auch das Auftreten von starken Veränderungen der
Ovarmorphologie (Abb. 34), die auf Defekte der Ovariogenese hindeuten und so
nicht durch pupale Injektionen erzeugbar sind, unterstützt dies. Zudem zeigte sich
ein großer Wert der beiden voneinander unabhängigen Injektionen für die Auswahl
von Kandidatengenen zur weiteren, detaillierten Untersuchung (s. 3.2.5). Da der
Hauptfokus der meisten beteiligten Arbeitsgruppen und damit auch des iBeetle-
Screens auf der Untersuchung embryonaler Prozesse liegt, stand der Verzicht auf
die pupalen Injektionen zu keinem Zeitpunkt zur Debatte.
3.1.2. Die Auswertungen erlauben die Analyse der zu untersuchenden
Prozesse mit hoher Sensitivität
Während der Vorbereitung und Durchführung des Pilotscreens wurden auch die
Auswertungsschritte der Injektionen entwickelt, bzw. bestehende Methoden entspre-
chend angepasst. Dabei musste sichergestellt werden, dass das volle Spektrum der
zu untersuchenden Prozesse in möglichst wenigen Arbeitsschritten möglichst effektiv
191

II. 3. Diskussion
analysiert werden kann. Die in 2.1.1 und 4.2 beschriebenen Methoden erwiesen sich
hierbei als hinreichend und notwendig, um dieses Ziel zu erreichen. Dabei sind sie
sensitiv genug, um trotz des hohen Durchsatzes nicht zu viele interessante Phänoty-
pen zu verpassen. Im Rahmen des Pilot-Screens wurde nur eine der 30 Positiv-
Kontrollen übersehen, nämlich die Transformation der Antenne zu beinähnlichen
Strukturen nach spine-less-RNAi (Shippy et al., 2009; Toegel et al., 2009). Einige
andere subtile, teilweise noch subtilere Phänotypen sind aber im Laufe des Screens
erkannt worden, wie z.B. das Fehlen des distalen Teils der Antenne nach RNAi # 43,
Veränderungen des Kopf-Borstenmusters nach labial-RNAi (Posnien und Bucher,
2009) oder auch den adulten Phänotyp der spine-less-Transformation (Shippy et al.,
2009). Wenn man den möglicherweise aufgrund des Injektionszeitpunkts ausgeblie-
benen Ovarphänotyp nach pupaler piwi-Injektion (s. 2.2) mit einbezieht, ergibt sich
eine Falsch-Negativ-Rate von 6,6 %. Mit einem solchen Anteil falsch negativer
Ergebnisse muss gerechnet werden, er liegt in ähnlichen Bereichen oder sogar
besser als bei anderen RNAi-Screens (Fraser et al., 2000; Sönnichsen et al., 2005;
Neely et al., 2010; Schnorrer et al., 2010).
192
Somit kann davon ausgegangen werden, dass die Analysen geeignet sind, um
Phänotypen mit hoher Sensitivität zu erkennen. Um aussagekräftige Daten über die
Sensitivität jedes einzelnen Auswertungsschrittes bezüglich bestimmter Gruppen von
Phänotypen zu erhalten, ist die Zahl der im Pilot-Screen bearbeiteten Injektionen
aber nicht ausreichend. Darüber wird der Hauptscreen Aufschluss geben. Insgesamt
kann festgehalten werden, dass alle Auswertungsschritte bereits während des Pilot-
Screens erfolgreich eingesetzt wurden und somit prinzipiell geeignet sind, um neue
Phänotypen zu detektieren.
So wurden nach pupaler Injektion sowohl in der ersten, als auch in der zweiten
Ablage Effekte der Injektionen festgestellt. Die Kutikula-Präparationen der ersten
Ablage führten zur Detektion der embryonalen Phänotypen in Abb. 35. Die Auswer-
tung der Lebendpräparate der zweiten Ablage ermöglichte die Detektion von drei
dsRNAs, die zum Tod der Embryonen noch vor der Sekretion von Kutikula führten,
und somit in den Kutikula-Präparaten der ersten Ablage nicht von unbefruchteten
Eiern unterschieden werden konnten (Abb. 31). Zudem konnten durch die Analyse
der Eimenge in der zweiten Ablage Defekte der Oogenese festgestellt werden (Abb.
33). Leider konnten in den Lebendpräparaten keine neuen, an der Muskelentwick-
lung beteiligten Gene gefunden werden. Die erfolgreiche Detektion des twist-

II. 3. Diskussion
Ausfallphänotyps (einer Positiv-Kontrolle) zeigt aber, dass dies prinzipiell möglich ist.
Vermutlich war die Anzahl der untersuchten Gene zu gering, um hier ein neues
Kandidaten-Gen zu finden. Auch in einem Drosophila-RNAi-Screen für Muskelphäno-
typen führten beispielsweise nur ca. 1,8 % der Linien zu morphologisch erkennbaren
Muskeldefekten (Schnorrer et al., 2010).
Auch nach larvaler Injektion konnten einige interessante Phänotypen detektiert
werden (Abb. 36, Abb. 37). Diese wurden nicht nur bei der Analyse der pupalen,
sondern auch der adulten Stadien gefunden. Dabei zeigte sich beispielsweise, dass
subtile Defekte, wie die Verkürzung distaler Beinsegmente (Abb. 37), nur bei der
Untersuchung der adulten Morphologie festgestellt werden können. Auch die Aus-
wertung der Legeleistung und der Stink-Drüsen nach larvaler dsRNA-Injektion erwie-
sen sich als erfolgreich und sinnvoll durchführbar (Abb. 34, Abb. 37).
Die Analyse der Legeleistung wurde während des Pilot-Screens in Form von Ein-
zelverpaarungen durchgeführt, um die maximale Sensitivität zu erreichen. Im Rah-
men des Hauptscreens sollten nur Injektionen, die bei mindestens der Hälfte der
injizierten Tiere zu verminderter Legeleistung führen, auf ihren Ovarphänotyp hin
kontrolliert werden. Während des Pilot-Screens wurden allerdings alle Tiere mit
verminderter Legeleistung präpariert. Dabei wurde deutlich, dass durch die Einzel-
verpaarungen vermutlich keine wesentliche Steigerung der Sensitivität erreicht wird.
In elf larvalen Injektionen wurde eine verminderte Legeleistung in mindestens der
Hälfte der Einzelverpaarungen festgestellt (vier möglicherweise „interessante“, fünf
unspezifische „held-egg“-Phänotypen). In zwei Fällen (ein interessanter, ein „held-
egg“-Phänotyp) trat die verminderte Legeleistung bei der Hälfte der überlebenden
Tiere auf, bei den restlichen Injektionen bei allen verbleibenden Tieren. Das heißt,
diese wären höchstwahrscheinlich alle ebenso in einer „Gruppenverpaarung“ erkannt
worden. Bei den restlichen Injektionen traten in 26 Fällen bei maximal einem Drittel
der Einzelverpaarungen verminderte Legeleistung auf. Diese Fälle würden also nicht
auf ihren Ovarphänotyp hin untersucht werden und sie zeigten tatsächlich auch
durchwegs keine interessanten Phänotypen. Möglicherweisen würden im Rahmen
des Hauptscreens etwas mehr dieser unauffälligen Reduktionen auf ihren Ovarphä-
notyp untersucht werden, wenn die Tiere in Gruppenverpaarungen gehalten werden,
dies steht aber sicherlich in keinem Verhältnis zum zusätzlichen Mehraufwand der
Einzelverpaarungen von ca. 2,5 bis 4 h pro Injektionsdurchgang. Somit bin ich der
193

II. 3. Diskussion
Meinung, dass der Einsatz der Einzelverpaarungen im Hauptscreen nicht notwendig
oder sinnvoll ist.
3.1.3. iBeetle ist mit den vorgegebenen zeitlichen Rahmenbedingun-
194
gen realisierbar
Die nötige Gesamtzahl an Injektionen ist durch die vorgestellten Arbeitspläne und
die Verschachtelung der Arbeitsabläufe mit den für iBeetle vorgesehenen personel-
len Mitteln durchführbar. Wie in 2.1.2 beschrieben, können die Screener - mit Unter-
stützung einer/eines technischen Mitarbeiter/in im pupalen Screen-Teil - im Durch-
schnitt 30 Gene pro Woche analysieren. Durch den geplanten Einsatz eines
Postdocs und sieben Doktoranden kann das Screening-Ziel von 6000 Genen in der
ersten Phase in ca. 50 Wochen erreicht werden. Diese Planung verlangt einen
durchschnittlichen wöchentlichen Arbeitsaufwand von ungefähr 28 Stunden, wobei
von den Screenern eine flexible Zeitplanung verlangt werden muss, da die teilweise
unveränderbaren Zeitabstände der Arbeitsschritte auch Arbeit an Wochenenden
erfordern. Dies wird aber zum größten Teil durch freie Tage unter der Woche wieder
ausgeglichen. Durch die Architektur aus im Prinzip abgeschlossenen Blöcken lässt
sich der Screening-Ablauf alle fünf bzw. acht Wochen unterbrechen, um z.B. Ur-
laubsplanungen gerecht zu werden. Die Anwesenheit weiterer Screener, eines
technischen Mitarbeiters und mehrerer PIs an den Screening Centern erlaubt die
Kompensation für Ausfälle wegen Krankheit, und Absprachen zur Übernahme von
einzelnen kurzen Arbeitstagen bzw. -schritten. Auch innerhalb der Arbeitsabläufe
sind einige Arbeitsschritte verschiebbar, so kann beispielsweise die Auswertung der
Kutikulapräparate flexibel gehandhabt werden und der Zeitpunkt einiger Arbeits-
schritte des larvalen Screens innerhalb gewisser Rahmenbedingungen verschoben
werden.
Die hier vorgestellten Techniken, Auswertungen und Arbeitsabläufe sind also ge-
eignet einen genomweiten RNAi-Screen in Tribolium mit einer breiten Zielsetzung, in
ausreichender Sensitivität durchzuführen.

II. 3. Diskussion
3.2. Der Pilotscreen illustriert die Chancen und Risiken des
Hauptscreens
3.2.1. Technische Verbesserungen könnten die Effizienz des Haupt-
screens noch erhöhen
Die Durchführung des Pilotscreens zeigte, dass ein genomweiter RNAi-Screen in
Tribolium realisierbar und vielversprechend ist. Nichtsdestotrotz zeigte er auch einige
Punkte auf, die möglicherweise bis zum Beginn des iBeetle-Screens noch verbessert
werden sollten, bzw. denen erhöhte Beachtung zukommen sollte.
Beispielsweise erwies sich die Detektion von früh-embryonal-letalen Defekten als
noch nicht ausgereift. So war es im Verlauf des Pilotscreens nicht möglich, Embryo-
nen, deren Entwicklung noch vor der Bildung eines Keimrudiments zum Erliegen
kam, von nicht entwickelten oder nicht befruchteten Eiern zu unterscheiden. Mögli-
cherweise könnte diese Diskriminierung durch die Zugabe eines fluoreszenten DNA-
Farbstoffs (z.B. Hoechst 33342) und/oder eines fluoreszenten Phalloidins deutlich
verbessert werden. Da ein Teil der Embryonen in den hier zur Debatte stehenden
Lebend-Präparaten durch mechanischen Druck aus der Eihülle befreit werden,
könnten die verwendeten Farbstoffe das embryonale Gewebe erreichen. Hierbei
muss aber noch getestet werden, ob die Diffusion der Moleküle in dem viskosen
Einbettungsmedium (Voltalef-Öl) ausreichend ist. Alternativ könnten andere viskose
Einbettungsmedien getestet werden, wobei sich eine 50 %ige Glycerolverdünnung
bereits als weniger gut geeignet erwies, da diese häufiger zu Schäden des GFP-
positiven Gewebes führte. Einen weiteren Hinweis auf initiierte Embryonalentwick-
lung könnte der beginnende Abbau des Dotters liefern (Petavy, 1986), inwieweit dies
aber ohne weitergehende Analysen feststellbar ist, bliebe zu testen. Gleiches gilt für
die Analyse des im Hauptscreen zusätzlich zu Verfügung stehenden Fluoreszenz-
markers innerhalb des Zentralnervensystems, der möglicherweise die Detektion
differenzierten Gewebes erlaubt.
Ein weiterer Punkt, der vor Beginn des Hauptscreens möglicherweise noch
verbessert werden sollte, ist die Durchführung der Injektionen. Die fehlende Routine
der Screener des Pilot-Screens, und die noch nicht perfektionierte Technik kommen
in dem Befund zum Ausdruck, dass einige der als Negativ-Kontrollen durchgeführten
Injektionen zur Letalität der injizierten Tiere führten (drei von zwölf im pupalen und
sechs von sechzehn im larvalen Screen-Teil). Diese Kontroll-Injektionen wurden
195

II. 3. Diskussion
jeweils zu Beginn und am Ende eines Injektionstages durchgeführt, und sollten im
Hauptscreen beibehalten werden. Dadurch wird den Screenern eine kurze tägliche
Einarbeitung ermöglicht und der nachlassenden Konzentration am Ende eines Injek-
tionstages Rechnung getragen, ohne die tatsächlichen RNA-Injektionen zu beein-
trächtigen. Möglicherweise sollten zudem für beide Injektionen im Hauptscreen
einige Faktoren standardisiert werden, wie beispielsweise die Menge der injizierten
dsRNA, die maximale Stärke der verwendeten Nadel und die Injektionsstelle. Außer-
dem sollte im Falle des larvalen Screens überprüft werden, ob die Dauer der Kryoa-
nästhesie und die Menge des dabei entstehenden Kondenswassers einen Einfluss
auf die Überlebensrate hat.
196
Vor dem Beginn des Hauptscreens sollte außerdem das Auftreten von Entwick-
lungsdefekten in den verwendeteten Stämmen überprüft werden. Die Stämme, die im
Hauptscreen zur Verwendung kommen, entsprechen genetisch nicht exakt den im
Pilotscreen verwendeteten, da zusätzliche Marker eingekreutzt und männliche Käfer
anderer Stämme zur Verpaarung genutzt werden. Innerhalb der Tribolium-
„Community“ gilt trotz fehlender Studien als anerkannt, dass sich verschiedene
Labor-Stämme in der Art und Häufigkeit der natürlich autretenden Entwicklungsde-
fekte unterscheiden können. Um diesen genetischen Hintergrund der zu verwenden-
den Stämme zu bestimmen und genetische Prävalenzen, also einen für bestimmte
Phänotypen sensitivierten genetischen Hintergrund (St Johnston, 2002), auszu-
schließen, sollten sowohl Test-Kutikulapräparationen von nicht-injizierten, als auch
von mit Kontroll-RNAs injizierten Tieren ausgewertet werden.
3.2.2. Der Pilot-Screen zeigt kritische Aspekte der Screen-
Durchführung auf
Abgesehen von den genannten technischen Aspekten, die einige wenige weitere
Vorarbeiten empfehlen, wurden im Laufe des Pilotscreens einige Punkte deutlich,
deren Beachtung bei der Durchführung des Hauptscreens eine wesentliche Rolle
spielt, und die ich deshalb hier aufgreifen möchte.
Die Grundlage für den Erfolg des iBeetle-Projekts ist die professionelle Herstel-
lung der verwendeten dsRNAs. Dabei muss durch strengste Sorgfalt und effektives
Qualitätsmanagement eine gleich bleibende Qualität und Konzentration der RNAs
gewährleistet und Kreuzkontaminationen unbedingt vermieden werden. Durch die

II. 3. Diskussion
Verwendung der gleichen Promotoren für die RNA-Synthese und die vorherige
Amplifikation der Matrizen erlangt der letzte Punkt besondere Bedeutung.
Eine Beobachtung während der Durchführung des Pilot-Screens verdeutlicht die
Wichtigkeit dieser Qualitätskontrollen. Die dort verwendeten dsRNAs wurden auf
Basis von PCR-Produkten hergestellt, die Amplifikate der Inserts zufällig gewählter
Klone einer embryonalen cDNA-Bank repräsentierten (4.1). Sieben dieser dsRNAs
konnten nicht in die Auswertung einbezogen werden. In diesen Fällen führte eine
Verunreinigung mit einem hunchback-Fragment unbekannter Herkunft zu hunch-
back-spezifischen Phänotypen. Erst bei genauer Analyse der Sequenzierungen der
als Matrizen für die dsRNA-Synthesen dienenden PCR-Produkte konnte die Konta-
minations-Sequenz als zusätzliches Signal knapp über dem Hintergrundrauschen
nachgewiesen werden. Das detektierte Fragment trug einen 120 bp-Abschnitt der
hunchback-kodierenden Sequenz, der keinem der veröffentlichten oder in unserem
Labor bekannten Tribolium-hb-Klone entsprach, und somit keine Kontamination aus
unserem Labor darstellt. Außerdem kann eine Kreuzkontamination mit Fragmenten
innerhalb des Pilotscreens ausgeschlossen werden, da das besagte Fragment nicht
auf dem für die cDNA-Bank verwendeten Vektor basiert und hunchback nicht als
Positiv-Kontrolle verwendet wurde.
Vermutlich ist die Kontamination auf eine Verunreinigung des verwendeten
cDNA-Bank-Phagen-Lysats mit einer sehr geringen Konzentration des unbekannten
hb-Fragments zurückzuführen. Bei der Prozessierung der zufälligen Auswahl der
Phagen-Klone wurde dann wahrscheinlich die in einem kleinen Teil der Proben
enthaltenen DNA-Verunreinigung mitamplifiziert. Für diese Erklärung spricht, dass
die cDNA-Bank Anfang der 90er Jahre im Rahmen von Arbeiten zu Tribolium-
hunchback von Schröder hergestellt wurde (Wolff et al., 1995).
Diese Befunde zeigen, dass durch die Verwendung von Amplifikationsschritten
und wegen der effizienten RNAi-Maschinerie in Tribolium schon kleine Verunreini-
gungen zu unerwünschten Effekten führen können, und somit die Qualitätskontrolle
der dsRNA-herstellung besondere Aufmerksamkeit verdient.
Sind die zu injizierenden ds-RNAs in der notwendigen Qualität vorhanden, sind
auch bei der Durchführung der Screen-Arbeit einige übergeordnete Themen zu
beachten. Zunächst ist es für das Gelingen des Screens und die Validität der erhal-
tenen Ergebnisse sehr wichtig, dass die Ergebnisse der einzelnen Screener absolut
vergleichbar sind. Hierzu muss sicher gestellt sein, dass einerseits alle Screener
197

II. 3. Diskussion
nach den gleichen Methoden und denselben Arbeitsplänen vorgehen, und anderer-
seits die Bedingungen an den beiden Screening-Centern (einschließlich Temperatur
und Luftfeuchtigkeit) möglichst exakt angeglichen werden.
198
Um dies zu gewährleisten, ist die Einarbeitung der Screener von zentraler Be-
deutung. Dabei sind sicherlich die Durchführung der Injektionen und die Auswertung
und Dokumentation der Ergebnisse die wichtigsten Aspekte. Aber auch die Präpara-
tion der Ovare, die Prozessierung der injizierten Tiere und die Vermeidung von
Kreuzkontaminationen muss mit gleich bleibender Sorgfalt erfolgen. Bei der geringen
Zahl an Tieren mit denen in diesem Screen gearbeitet wird, kann der Verlust oder die
Verschleppung weniger Tiere bei Absiebe- oder Transferschritten durchaus Ergeb-
nisse verändern. Als eine Möglichkeit der Qualitätskontrolle der praktischen Durch-
führung sollte neben Puffer-Injektionen am Beginn und am Ende jedes Injektionstags
auch die Verwendung von zufällig eingestreuten Positiv-Kontrollen erwogen werden.
Für die Gewährleistung hoher Qualität der Screeningergebnisse ist außerdem die
regelmäßige Kommunikation der Screener äußerst wichtig. Dies soll über Telefon-
konferenzen und einen iBeetle-Blog realisiert werden. Durch diesen engen Kontakt
kann schnell auf unvorhergesehene Schwierigkeiten reagiert werden und der
Screen-Ablauf im gegenseitigen Austausch in Frage gestellt und optimiert werden.
Wichtige Punkte sind dabei speziell zu Beginn des iBeetle-Screens die Durchführung
und Zahl der Injektionen, der Erfolg der Auswertungen und die sinnvolle Definition
der Phänotyp-Kategorien. Der Grundstein dieser Kommunikation und des techni-
schen Trainings soll zu Beginn des iBeetle-Screens im Rahmen eines ca. einwöchi-
gen Kurses gelegt werden. Dieses „kick-off Meeting“ sollte auch genutzt werden um
die Motivation der Studenten und ihre Verantwortung für das gesamte iBeetle-Projekt
sowie das Gemeinschaftsgefühl des iBeetle-Teams zu stärken (Peterson, 2007). Die
anspruchsvolle Screening-Arbeit erfordert hohen persönlichen Einsatz, der nur durch
positive Identifikation mit dem Gesamt-Projekt und dem beteiligten Team gewährleis-
tet werden kann.
3.2.3. Der Pilot-Screen macht die Effektivität eines RNAi-Screens deut-
lich
Der Pilot-Screen zeigte nicht nur, dass die Methodik durchführbar ist und dabei
geeignet Phänotypen zu detektieren, er macht außerdem die hohe Effektivität eines
RNAi-Screens in Tribolium deutlich. So konnten in wenigstens 17 der larvalen und in

II. 3. Diskussion
12 der pupalen Injektionen interessante neue Phänotypen gefunden werden. Diese
stellen potentielle Kandidatengene für 12 der insgesamt 18 in iBeetle untersuchten
Entwicklungsprozesse dar. Außerdem konnten im Rahmen des larvalen Screen-Teils
sogar für 6 der verwendeten Positiv-Kontrollen bisher nicht beschriebene Effekte
beobachtet werden.
Dabei ist besonders wichtig, dass hier Kandidatengene gefunden werden kön-
nen, deren Beteiligung an bestimmten Prozessen nicht durch den bisher verfolgten,
auf Orthologie und Homologie basierenden Kandidatengenansatz aufgedeckt werden
konnte. So fanden sich nämlich außer Genen, für deren Drosophila-Homologe be-
reits Funktionen beschrieben waren (z.B. Dynein-light chain 90F, RNA# 70, Abb. 33,
Abb. 34, Abb. 36), beispielsweise auch solche, deren Drosophila-Homologen bisher
keine Funktion zugeordnet war (z.B. RNA# 3, ein vorhergesagtes Protein homolog zu
CG12975, Abb. 33, Abb. 36). Solche Gene haben entweder ihre Funktion im Laufe
der Evolution verändert, oder sie wurden in den bisherigen Drosophila-Screens und
Studien nicht detektiert. In jedem Fall können durch solche Befunde also auch Pro-
jekte in anderen Insektenarten, einschließlich Drosophila, unterstützt werden.
Besonders interessant sind außerdem Gene, für die bisher kein Drosophila-
Homolog annotiert wurde. Hinter diesen könnten sich Faktoren verbergen, die mögli-
cherweise spezifische Innovationen innerhalb der Käfer darstellen, oder aber an-
zestrale Insektengene, die während der Drosophila-Evolution verloren gingen. Auch
für dieses Szenario fand sich ein Beispiel (RNA# 85, Abb. 34).
Eine letzte interessante Gruppe sind schließlich Gene, die nicht in den Daten-
banken annotiert sind. Diese wurden möglicherweise aufgrund einer ungewöhnlichen
Struktur oder wegen Lücken in der Genomsequenz, nicht von den automatischen
Genom-Annotations-Projekten in Tribolium und Drosophila erkannt und zusätzlich
nicht von bisherigen funktionellen Studien erfasst. Auch ein Beispiel dieser Gruppe
wurde im Rahmen des Pilot-Screens detektiert (RNA# 9, Abb. 35, Abb. 37) Solche
Gene zeigen deutlich den Nutzen eines cDNA-basierten Ansatzes wie dem hier
verfolgten, der es auch ermöglicht Gene zu detektieren, die „in silico“ nicht gefunden
werden könnten. Ein Beispiel für einen ähnlichen Fall ist das polycistronische mille-
pattes-Gen, das durch einen cDNA-in-situ-Hybridisierungs-Screen entdeckt wurde
und aufgrund seiner ungewöhnlichen Struktur höchstwahrscheinlich nicht von einer
Annotations-Pipeline erkannt worden wäre (Savard et al., 2006a). Zudem ist dies ein
Beispiel für unterschiedliche Gen-Funktionen innerhalb der Insekten, da mille-pattes
199

II. 3. Diskussion
in Tribolium, nicht aber in Drosophila für die Segmentierung benötigt wird (Galindo et
al., 2007).
200
Vor allem die beiden letzten Gen-Gruppen zeigen, dass iBeetle in der Lage sein
wird wichtige Entwicklungsgene zu identifizieren, die nicht bereits in den zahlreichen
Drosophila-Screens entdeckt wurden, und demonstrieren damit den großen Nutzen,
den iBeetle für die Insekten-Entwicklungsbiologie haben wird.
Trotz seiner insgesamt hohen Effizienz gibt es eine Einschränkung, die iBeetle
mit vielen anderen Screens teilt, nämlich das Prinzip der Detektion des frühesten
Phänotyps (St Johnston, 2002). Das bedeutet, dass beispielsweise letale Defekte der
Embryonalentwicklung in genetischen Screens die Beobachtung späterer Phänoty-
pen verhindern. In iBeetle wird dieser Effekt abgeschwächt, indem durch die pupalen
und larvalen Injektionen zwei Screens kombiniert werden. Nichtsdestotrotz können
Fragmente, deren larvale Injektion zu Letalität während der Metamorphose oder
früher führt, nicht mehr auf ihre Rolle für die Funktion der Stinkdrüsen untersucht
werden, was im Sinne der ökonomischen Durchführung des Screens akzeptiert
werden muss. Ein ähnliches Problem tritt auch im pupalen Screenteil auf. Führt die
Injektion zum Tod der injizierten Tiere, ist also ein essentielles, ein „house keeping“-
Gen betroffen, oder ruft die RNAi einen Oogenese-Defekt hervor, so können keine
Embryonen zur Auswertung gesammelt werden. Im Rahmen des Pilot-Screens
führten 20 Injektionen zu Letalität, sechs zu einem Ovarphänotyp und fünf zu einem
Eiablagehemmungsphänotyp („held egg“) und konnten somit nicht auf ihren embryo-
nalen Phänotyp hin überprüft werden. Diese Einschränkung könnte nur durch zusätz-
liche embryonale Injektionen (Brown et al., 1999b) vollständig umgangen werden,
was wegen des sehr hohen Aufwands im Rahmen von iBeetle nicht möglich ist.
Während der Planungsphase wurde der Einsatz von adulten dsRNA-Injektionen
als Alternative diskutiert, die möglicherweise weniger häufig zu reduzierter Legeleis-
tung der injizierten Tiere führt (van der Zee et al., 2006). Obwohl dies möglicherweise
z.B. die Zahl der „held egg“-Phänotypen reduzieren würde, wurde diese Alternative
aus mehreren Gründen als nicht sinnvoll verworfen: 1. RNAi gegen essentielle Gene
führt vermutlich auch nach adulter Injektion zu Letalität. 2. Adulte RNAi führt im
Allgemeinen zu schwächeren embryonalen Phänotypen (nicht gezeigt, Erfahrungen
der Labore Klingler, Schoppmeier). 3. Adulte RNAi führt erst mehrere Tage nach
Injektion zu den maximalen RNAi-Effekten und scheint weniger lange anzuhalten als
pupale RNAi. Dabei ist fraglich, ob der Zeitpunkt der maximalen Effizienz für unter-

II. 3. Diskussion
schiedliche Gene vergleichbar ist, und somit ein standardisiertes Screening-Protokoll
möglich ist. 4. Die Tribolium-Community hat jahrelange Erfahrung mit pupaler, nicht
aber mit adulter RNAi.
Somit muss auch im pupalen Screen diese Einschränkung der Effektivität zu-
gunsten der Gesamt-Performance in Kauf genommen werden.
3.2.4. Der Pilot-Screen suggeriert eine hohe Zahl an Tribolium-Genen
deren Verlust zu Letalität in unterschiedlichen Stadien führt
Wie bereits erwähnt, konnten bereits im Laufe des Prescreens etliche neue Phä-
notypen detektiert werden. Unter Berücksichtigung der Injektionen, die bald nach der
Injektion zur Letalität der injizierten Tiere ohne interessante Phänotypen führten,
zogen insgesamt 55 % der Injektionen Letalität in unterschiedlichen Entwicklungs-
stadien nach sich. 33 % führten dabei zu für den Screen interessanten Phänotypen.
Dies ist zunächst erfreulich, da dies zeigt, dass iBeetle mit hoher Effizienz Phänoty-
pen erzeugen wird. Allerdings scheint dieser Wert im Verhältnis zu Studien in ande-
ren Arten sehr hoch zu sein. So geht man beispielsweise davon aus, dass nur ca. ein
Drittel aller Drosophila-Gene zu Letalität mutieren kann (Nüsslein-Volhard, 1994;
Miklos und Rubin, 1996).
Prinzipiell ist durchaus denkbar, dass zwischen Tribolium und Drosophila Unter-
schiede in der Zahl der essentiellen Loci bestehen. So wäre es möglich, dass in
Drosophila ein höherer Redundanz-Level die Zahl an zu Letalität mutierbaren Genen
im Vergleich zu Tribolium reduziert, und somit die Diskrepanz dieser Zahlen auf
tatsächliche biologische Unterschiede beider Arten hinweisen.
Man muss allerdings davon ausgehen, dass die hier verglichenen Zahlen vermut-
lich durch diverse Umstände beeinflusst werden, und die Diskrepanz in Wirklichkeit
weniger ausgeprägt ist. So fokussierten die klassischen Drosophila-Screens der
Vergangenheit beispielsweise entweder auf zygotische oder maternale Genfunktio-
nen (Gans et al., 1975; Nüsslein-Volhard und Wieschaus, 1980; Nüsslein-Volhard et
al., 1987; Schüpbach und Wieschaus, 1989; St Johnston und Nüsslein-Volhard,
1992), während parentale RNAi in Tribolium beides gleichermaßen betrifft (Schinko
et al., 2008). Außerdem werden in iBeetle innerhalb eines genomweiten Screens
mehrere sowohl embryonale als auch post-embryonale Prozesse untersucht, wobei
Screens in Drosophila häufig auf einen bestimmten Entwicklungsprozess (z.B. Gao
et al., 1999) und oft einen genomischen Bereich fokussierten (z.B. Lewis et al.,
201

II. 3. Diskussion
1980). Bei der Kalkulation der Gesamtzahl letaler Gene in Drosophila mussten also
mehrere Arbeiten ausgewertet und die Ergebnisse insgesamt extrapoliert werden
(Miklos und Rubin, 1996), während der iBeetle-Screen ein direkteres und somit
möglicherweise realistischeres Bild liefern wird. Zudem muss davon ausgegangen
werden, dass die klassischen Drosophila-Mutagenese-Screens nicht vollständig
saturiert waren (Pollock und Larkin, 2004), und somit auch die Kalkulationen der
essentiellen Loci nicht akkurat sind. Die Schätzungen der Zahl der Drosophila-Loci,
die zu Letalität führen können, könnten also zu niedrig sein und zumindest einen Teil
der Differenz erklären.
202
Als mögliche Erklärung aus anderer Sicht ist denkbar, dass die Zahl der zu Letali-
tät führenden Injektionen des Pilot-Screens nicht repräsentativ für den iBeetle-
Hauptscreen ist und somit der eigentliche Anteil niedriger läge. Zunächst ist offen-
sichtlich, dass die Stichprobe der 82 zufällig gewählten Klone zu klein ist, um eine
statistisch signifikante Aussage über alle Tribolium-Gene zu machen. Vor allem aber
könnte die Verwendung einer embryonalen cDNA-Bank zur Überrepräsentierung von
wichtigen Entwicklungsgenen und damit zu einem erhöhten Anteil an letalen Injektio-
nen geführt haben. Auch die schon in 3.2.1 erwähnten, noch nicht perfektionierten
Injektionen könnten diese Anzahl beeinflussen, und in einigen Fällen den Grund für
den Tod der injizierten Tiere darstellen. Allerdings ist dies nur in maximal 8 % der
Injektionen denkbar, da die restlichen Fragmente (20 %) in beiden unabhängigen
Injektionen zum Tod führten (Abb. 30) und somit höchstwahrscheinlich als spezifi-
scher Effekt der RNAi und nicht als Schwäche der Methode zu werten sind. Auch
ohne Injektion und ohne ersichtlichen Grund kommt es hin und wieder zum Tod
einzelner Käferpopulationen (J.Trauner, persönl. Mitteilung), eine Problematik, mit
der während des iBeetle-Screens gerechnet werden muss.
Eine letzte Möglichkeit, die zu einer Erhöhung der Zahl letaler Injektionen in Tri-
bolium führen könnte, ist das Auftreten von „Off-target effects“ der injizierten RNAs.
Solche sind in Tribolium zwar bisher nicht beschrieben worden, es ist aber denkbar,
dass sie häufiger vorkommen, aber wegen der relativen Seltenheit von Genen mit
starken frühembryonalen Phänotypen übersehen wurden. Der RNAi-Mechanismus
basiert auf siRNAs mit einer Länge von 21 Nukleotiden (Meister und Tuschl, 2004).
Es ist möglich, dass solche kurze, zufällig zu anderen Genen identische Abschnitte in
einigen dsRNA-Fragmenten vorkommen. Dabei ist anzunehmen, dass der Effekt
solcher kurzer Abschnitte im Vergleich zur langen Gesamt-dsRNA nicht in der Lage

II. 3. Diskussion
ist, einen spezifischen Phänotyp zu überdecken. Verursacht der Verlust des eigentli-
chen Zielgens aber keinen sichtbaren Defekt, wäre es möglich, dass sich die „off
target“-Sequenz auswirkt. In Drosophila RNAi-Screens wurden solche „off target“-
Effekte tatsächlich beschrieben (Ma et al., 2006), es ist somit wahrscheinlich, dass
sie auch in Tribolium auftreten. Um diese Möglichkeit bei der Auswahl von Kandida-
tengenen mit interessanten Phänotypen auszuschließen, sieht die Planung des
iBeetle-Projekts vor, dass für alle Teilprojekte zunächst eine Anzahl an potentiellen
Kandidaten mit nicht überlappenden RNA-Fragmenten auf die Spezifität des Phäno-
typs hin überprüft wird. Sollten „off target“-Effekte auftreten, wird gegebenenfalls
versucht, das eigentlich für den Phänotyp verantwortliche Gen zu identifizieren.
Dieses Vorgehen wird somit auch erlauben, das Auftreten solcher „off target“-Effekte
in Tribolium zu quantifizieren.
Zusammenfassend wird klar, dass der iBeetle-Pilot-Screen die Effektivität eines
Tribolium-RNAi-Screen deutlich macht, obgleich die Zahl an bisher erhaltenen letalen
Effekten möglicherweise etwas höher liegt, als im Hauptscreen zu erwarten.
3.2.5. Die Auswertung und Kategorisierung der Phänotypen ist von
größter Bedeutung für den Erfolg des Screens
Es liegt auf der Hand, dass neben einer effizienten Durchführung die Auswertung
der Experimente und der gesammelten Daten den kritischen Punkt für den Erfolg und
die Nutzbarkeit eines Screen-Projekts darstellt. Dabei kommt es vor allem darauf an
eine Balance zwischen Sensitivität und der Rate an falsch-positiven Ergebnissen zu
finden.
Der erste Schritt im iBeetle-Screening-Ablauf, der diese Balance beeinflusst, ist
die Auswertung der Präparate im Rahmen der experimentellen Analysen. Hier ist es
wichtig, dass den Screenern klare Vorgaben an die Hand gegeben werden, welche
Aspekte bei der Auswertung zu beachten sind und wie ein stereotypes Vorgehen
eingehalten werden kann um die höchstmögliche Effizienz und Sensitivität zu errei-
chen. Hierfür sollen die Screener in einem Einführungslehrgang geschult werden,
und außerdem sollen detaillierte Screening-Tafeln der zu untersuchenden Strukturen
entworfen werden, die auch ein bestimmtes Vorgehen bei der Auswertung der Prä-
parate vorgeben (s. 4.2). Um bereits an diesem Punkt die Zahl an falsch positiven
Ergebnissen zu reduzieren, ist es nötig, bei den Screenern ein Bewusstsein für die
Art und die Häufigkeit natürlich auftretender Entwicklungsdefekte zu schaffen. Dieser
203

II. 3. Diskussion
phänotypische Hintergrund sollte vor Beginn des Screens sorgsam für die verwende-
ten Stämme beschrieben und den Screenern zugänglich gemacht werden.
204
Die wichtigste Stellschraube für die Balance zwischen sensitiver Phänotypdetek-
tion und der Falsch-positiv-Rate ist die Kategorisierung der beobachteten Defekte
und die Definition dieser Kategorien. Fasst man die Grenzen der Kategorien sehr
weit, wird man selbst schwach penetrante Phänotypen detektieren, aber auch etliche
unspezifisch auftretende Defekte fälschlicherweise als potentiell interessant festhal-
ten. Im Rahmen des Pilotscreens wurden durch die Auswertung der Positiv-
Kontrollen und der unbekannten Fragmente solche Definitionen erarbeitet, die ich als
Grundlage für den iBeetle-Hauptscreen empfehle. Die genauen Beschreibungen
finden sich im Anhang. Für die meisten Kategorien halte ich eine Grenze von 50 %
der untersuchten Tiere für sinnvoll. Tritt ein Defekt mit einer niedrigeren Frequenz
auf, so gilt dieser zunächst als nicht signifikant. Allerdings empfehle ich, für jede
Injektion auch die Möglichkeit einzuräumen, einen weniger penetranten Phänotyp
anzugeben, der zwischen 25 und 50% der Tiere betrifft. Dies ermöglicht die Daten-
bank auch nach weniger penetranten Phänotypen zu durchsuchen und stellt so die
höchstmögliche Effizienz sicher. Außerdem erlaubt es die Detektion von Phänotypen,
die von anderen Effekten, beispielsweise von Letalität, überdeckt werden. So führte
beispielsweise die larvale Injektion eines Fragments mit Homologie zu dem Dro-
sophila TGF-!-Rezeptor thickveins (RNA# 19) zu einer verlängerten Larvenphase in
nur 37 % der Tiere, während die Injektion aufgrund der Zahl früh verstorbener Larven
als larval letal gewertet wurde. Zudem kann dieser zusätzliche Phänotyp auch eine
Hilfe bei der Priorisierung potentieller Kandidatengene sein, indem beispielsweise ein
Phänotyp, der mit einer leichten Erhöhung der Letalität einhergeht, eine niedrigere
Priorität erhalten würde, als einer, bei dem das nicht der Fall ist.
Bei der Entscheidung über die Priorität eines potentiellen Kandidatengens, und
damit der Frage nach der Wahrscheinlichkeit mit der ein beobachteter Defekt spezi-
fisch ist, ist der Vergleich der Ergebnisse der beiden unabhängigen Injektionen eine
unschätzbare Hilfe. Aufgrund des methodischen Aufwands des iBeetle-Screens ist
es nicht möglich, echte Replikate im gleichen Umfang durchzuführen, wie sie in Zell-
Kultur-Screens üblich sind (Zhang und Heyse, 2009). Dennoch wird die gleiche
dsRNA während des Prescreens zweimal injiziert, und die Information dieser beiden
Injektionen steht zur Beurteilung des betreffenden Gens zur Verfügung. So kann
beispielsweise vermutet werden, dass ein wenig auffälliger Ovar-Phänotyp im pupa-

II. 3. Diskussion
len Screen, dessen dsRNA nach larvaler Injektion zu Letalität führt, nur auf reduzier-
te Fitness der injizierten Tiere zurückzuführen sein könnte (s. 2.3.1) und somit eher
als unspezifisch zu werten ist.
Neben der Ausbildung und Anleitung der Screener ist für alle im letzten Abschnitt
behandelten Punkte vor allem die Gestaltung der Datenbank iBeetlebase von grund-
legender Bedeutung. Diese erfüllt für iBeetle einen doppelten Zweck. Einerseits
erlaubt sie die direkte Protokollierung der Beobachtungen während des Screen-
Ablaufs, andererseits ermöglicht sie den langfristigen Zugang zu den Daten und
Ergebnissen des Screens, und soll dabei zu einer Genfunktions-orientierten Triboli-
um Datenbank wachsen.
In Zusammenhang mit dem ersten Punkt ist es notwendig, dass die Datenbank
zu jedem Arbeitschritt während des Screens die Möglichkeit bietet Beobachtungen
festzuhalten, auch wenn diese nicht direkt ergebnisrelevant sind. So ist es für den
Screener beispielsweise wichtig einzugeben, wie viele Tiere die Injektion überlebten,
auch wenn dies kein auffälliger Wert ist, da diese Information für spätere Auswertun-
gen wie beispielsweise der Bestimmung der Eimenge wichtig ist. Die Zahl der noch
im Screen verbleibenden, bzw. der verstorbenen Tiere ist eine Information, deren
redundante Angabe zu Beginn jedes neuen Auswertungsschritts die Orientierung
erleichtert. Es sollte auch zu jedem Arbeitsschritt die Möglichkeit bestehen, digitale
Fotografien zur Dokumentation unvorhergesehener Beobachtungen einzufügen.
Bei den Auswertungsschritten ist geplant, die Beschreibung festgestellter Phäno-
typen über Auswahlmenüs zu organisieren, um die Nomenklatur möglichst einheitlich
und vergleichbar zu halten. Diese Auswahlmenüs müssen sehr detailliert entworfen
werden, um möglichst viele Eventualitäten abzudecken, und sie müssen die Be-
schreibung mehrerer unabhängiger Phänotypen erlauben. Sie sollten zudem freie
Felder zur Dokumentation unvorhergesehener Effekte vorsehen und für jeden Phä-
notyp die Angabe der beobachteten Frequenz fordern. Somit kann die Datenbank die
Kategorisierung des Phänotyps aufgrund der Auswahlmenüs und der eingegeben
Frequenz automatisch vornehmen. Hier sollten ein oder mehrere Hauptphänotypen
und ein oder mehrere weniger penetrante Phänotypen als Ergebnis jeder Injektion
ermittelt werden. Um die Unvoreingenommenheit der Screener zu gewährleisten,
sollten die Sequenzen oder Annotationen der injizierten RNAs während des Scree-
nings nicht einsehbar, nach Abschluss des Screening-Durchgangs, also nach der
Eingabe aller relevanten Beobachtungen, aber abrufbar sein.
205

II. 3. Diskussion
3.2.6. iBeetle hat sehr gute Chancen, seine Ziele zu erreichen
206
Ein genomweiter RNAi-Screen ist der effektivste Weg, um Tribolium als Modell-
system der modernen Entwicklungsbiologie weiter zu entwickeln. iBeetle als umfas-
sender genomweiter Ansatz ist nötig, um die Einschränkungen zu überwinden, die
dem bisher verfolgten, auf Homologie zu Drosophila beruhenden, Kandidatengenan-
satz innewohnen. Dabei wird dies nicht nur der Tribolium-Forschung, sondern auch
Arbeiten an allen anderen Insekten und Arthropoden von Nutzen sein, wenn neben
den Drosophila-Daten eine weitere Quelle umfassender funktioneller Informationen
zur Verfügung steht.
iBeetle nimmt im Vergleich zu anderen großen Screen-Projekten eine ganz be-
sondere Stellung ein. Bisher wurden genomweite in-vivo RNA-Intereferenz-Screens
der Entwicklung vor allem in C. elegans durchgeführt (Fraser et al., 2000; Gönczy et
al., 2000; Sönnichsen et al., 2005) und können erst seit kurzem durch die Verfügbar-
keit von transgenen RNAi-Bibliotheken (Dietzl et al., 2007) auch in Drosophila reali-
siert werden (Neely et al., 2010; Schnorrer et al., 2010). Dort wurden bis dato nur
Studien in Zell-Kultur durchgeführt (Kiger et al., 2003; Boutros et al., 2004; Friedman
und Perrimon, 2006). iBeetle ist also Teil einer sehr aktuellen Entwicklung der Insek-
ten-Forschung. Einzigartig ist iBeetle aber vor allem durch seinen umfassenden
Ansatz. Zum einen werden die Experimente nicht auf genomische Bereiche oder
Gengruppen eingeschränkt, sondern umfassen das gesamte Genom. Zum anderen
werden zwei wesentliche Entwicklungsprozesse, die Embryonalentwicklung und die
Metamorphose untersucht. Dies erlaubt eine Breite der untersuchten Fragestellun-
gen, wie sie auch in genetischen Screens bisher nicht möglich war. Zudem werden
sowohl zygotische als auch maternale Effekte auf die Embryonalentwicklung detek-
tiert. Genetische Screen-Projekte der Embryonalentwicklung in Drosophila fokussier-
ten beispielsweise auf zygotische oder maternale Genfunktionen (Nüsslein-Volhard
und Wieschaus, 1980; Schüpbach und Wieschaus, 1986), oder konzentrierten sich
nur auf spezielle Fragestellungen (Collins und Cohen, 2005). Solche spezifischen
Screening-Projekte herrschen auch in anderen Modellorganismen wie dem Zebra-
fisch oder der Maus vor (Sun et al., 2004; Rubio-Aliaga et al., 2007).
Im Vergleich zu genetischen Screen-Projekten (Maderspacher et al., 1998; Trau-
ner et al., 2009), ist die Verwendung von RNA-Interferenz in Tribolium deutlich bes-
ser geeignet, um ein solches genomweites Vorhaben zu realisieren. Vor allem einige
praktische Faktoren spielen dabei eine grundlegende Rolle. So erfordert ein RNAi-

II. 3. Diskussion
Screen keine teure, dauerhafte und arbeitsintensive Stammhaltung der Linien mit
interessanten Phänotypen, was noch schwerer wiegt, da diese Stammhaltung in
Tribolium wegen des Mangels an Balancer-Chromosomen äußerst aufwändig ist
(Berghammer et al., 1999a). Ebenfalls nicht nötig ist die sehr zeitintensive Identifizie-
rung der betroffenen Gene. In einem RNAi-Screen als einer Methode der reversen
Genetik (Adams und Sekelsky, 2002) ist das Zielgen der injizierten dsRNA bereits
zum Zeitpunkt des Screens bekannt. Schließlich kommt der Frage der Saturierung
nur mehr eine untergeordnete Rolle zu, da diese nun leichter zu bestimmen und zu
beeinflussen ist, als das bei klassischen genetischen Screens der Fall war (Pollock
und Larkin, 2004). Die Kombination aus cDNA-basierter und Genom-Annotations-
basierter Genauswahl sollte dazu führen, dass nahezu alle Tribolium-Gene für iBeet-
le verfügbar sind.
Obwohl der Pilot-Screen von dieser Saturierung natürlich weit entfernt ist, konn-
ten dennoch weitere Vorteile bereits bei dessen Durchführung illustriert werden. So
erlaubt beispielsweise die larvale Injektion von dsRNA die Analyse von Entwick-
lungsprozessen während der Metamorphose, ohne von einer eventuellen embryona-
len Funktion der untersuchten Gene verhindert zu werden, was in klassischen gene-
tischen Screens ein Problem darstellt (St Johnston, 2002). Bereits im Pilot-Screen
führten beispielsweise die RNAs #8 und 78 (similar to rac, similar to thioredoxin-like
protein, Abb. 36, Abb. 37) nach larvaler Injektion zu Defekten der pupalen Flügel
bzw. der adulten Beine, nach pupaler Injektion aber zu frühembryonaler Letalität. Ein
weiteres Beispiel in diesem Zusammenhang stellen die neu gefundenen Metamor-
phose-Phänotypen der für embryonale Funktionen bekannten Positiv-Kontrollen dar
(Abb. 38).
Während des Pilot-Screens wurde zudem deutlich, dass eine relativ kleine Zahl
injizierter Tiere ausreicht, um die Screen-Ziele zu erreichen. Auch dieser Punkt ist ein
Vorteil eines RNAi- gegenüber einem genetischen Screen. Durch die hohe Penet-
ranz der RNAi genügen wenige Tiere zur Auswertung. In klassischen genetischen
Screens ergibt sich hingegen schon aus den nötigen Kreuzungen, dass nur 1/3 bis
1/4 der untersuchten Tiere die Mutation homozygot tragen (St Johnston, 2002).
Unter Ausnutzung dieser Vorteile sollen durch iBeetle drei übergeordnete Ziele
erreicht werden. Erstens sollen durch die Detektion interessanter Genfunktionen in
Tribolium die Grundlagen für neue und bisher in Drosophila vernachlässigte For-
schungsrichtungen gelegt werden. Zweitens sollen Kandidatengene für wichtige
207

II. 3. Diskussion
Prozesse der Insektenembryologie entdeckt werden, die in Drosophila keine oder
andere Funktionen erfüllen, bzw. die bisher nicht erkannt wurden. Diese sind beson-
ders interessant in Zusammenhängen mit Prozessen, die trotz intensiver Forschung
in Tribolium noch Fragen offen lassen. Drittens soll Tribolium schließlich als Screen-
fähiges Modellsystem etabliert werden, dessen Möglichkeiten für zukünftige Frage-
stellungen und Arbeitsgruppen, die andere Insektenarten untersuchen, benutzt
werden können.
208
Auf dem Weg zum Erreichen des dritten Ziels wurde durch die Etablierung und
Durchführung des Pilot-Screens bereits ein großer Schritt getan. Es konnten Vorge-
hensweisen entwickelt und getestet werden, deren Prinzipien sich an andere Frage-
stellungen und Zielsetzungen anpassen lassen. Nachdem dann im Rahmen von
iBeetle eine genomweite Bibliothek von dsRNAs etabliert worden ist, und die Durch-
führung des Screens auch im großen Maßstab erfolgreich war, werden auch in
Tribolium spezifische biologische Fragestellungen genomweit und funktionell unter-
sucht werden können.
Der Pilot-Screen konnte zudem zeigen, dass iBeetle zumindest in der Lage sein
kann, auch die beiden ersten Ziele zu erreichen. Es konnten bereits Gene identifiziert
werden, für die bisher keine Funktion in Drosophila beschrieben wurde und die
deshalb als neue Gene von besonderem Interesse sind. Auch für Prozesse, die in
iBeetle erstmalig systematisch untersucht werden sollen oder, die bisher nur wenig
bearbeitet wurden, konnten potentielle Kandidatengene identifiziert werden.
Somit habe ich keinen Zweifel daran, dass das iBeetle-Konsortium seine Ziele er-
reichen wird. Ich bin überzeugt davon, dass iBeetle die Entwicklung Triboliums zu
einem wichtigen Modellsystem weiter vorantreiben wird und durch die öffentlich
verfügbare Datenbank iBeetle-Base einen weitreichenden und nachhaltigen Nutzen
für die Insekten-Biologie haben wird.

4. Material und Methoden
II. 4. Material und Methoden
4.1. Synthese doppelsträngiger RNA komplementär zu zufällig
gewählten cDNA Klonen
Die im Pilot-Screen verwendeten dsRNAs wurden auf Basis von amplifizierten
cDNA-Fragmenten einer embryonalen Lamda-Phagen cDNA-Bank synthetisiert, die
ursprünglich von R.Schröder erstellt wurde (Wolff et al., 1995). Diese wurde im
wesentlichen wie in der Herstellerangabe des Uni-ZAP XR Vector Kits (Stratagene,
La Jolla, CA) und in Sambrook and Russel (2001) beschrieben, unter Verwendung
der dort angegebenen Medien und Reagenzien eingesetzt. Der Titer der amplifizier-
ten Phagen betrug 4,9 x 10 7 pfu/ml. Das Äquivalent von 50 pfu wurde mit 200 !l XL1-
blue MRF E. coli (Stratagene) in 3 ml NZY-top-Agar auf 12 x 12 cm LB-Agar-Platten
ausplattiert, um klar voneinander abgegrenzte Plaques zu erhalten.
Einzelne Plaques wurden mit Hilfe einer sterilen Pipettenspitze in einen 20 !l
PCR-Ansatz überführt. Durch Verwendung eines T7-Promotor-spezifischen und
eines T3-Promotor-spezifischen Primers, der zusätzlich eine T7-Promotor-Sequenz
trägt, wurden die Matrizen für die dsRNA-Synthese hergestellt. Dabei wurde die
peqGOLD Taq-Polymerase und Reagientien von Peqlab (Erlangen) verwendet.
Tab. 9: PCR zur Synthese der Matrize für die dsRNA-Synthese
Primer Annealingtemperatur
Zyklen Elongation
T7 5´-TAATACGACTCACTATAGG-3´ 40 °C 5 2 min
T3-T7 5´-TAATACGACTCACTATAGG
AATTAACCCTCACTAAAGGG-3´
55 °C 30 2 min
Die PCR-Reaktionen mit einem Insert zwischen 450 und 2000 bp wurden aufge-
reinigt (Roche High Pure PCR cleanup Micro Kit) und in 10 !l eluiert. Die Konzentra-
tion wurde durch Gelelektrophorese bestimmt (i.d.R. zwischen 50 und 100 ng/!l) ca.
150 ng jeder Probe zur Sequenzierung eingeschickt (Seqlab, Göttingen) und ca. 250
ng zur RNA-Synthese mit Hilfe des MEGAScript T7 Kits von Ambion verwendet.
Dabei wurde ein Viertel der vom Hersteller empfohlenen Menge an Enzym und
Nukleotiden im halben empfohlenen Volumen eingesetzt. Die RNA wurde in 10 !l
Injektionspuffer (1,4 mM NaCl, 0,07 mM Na2HPO4, 0,03 mM KH2PO4, 4 mM KCL; 4%
209

II. 4. Material und Methoden
Phenolrot, Sigma) gelöst und per Spektrophotometrie die Konzentration bestimmt
(typischerweise zwischen 3 und 4 !g/!l). Die RNA wurde auf ca. 1 !g/!l verdünnt
(Injektionspuffer mit 4% Phenolrot, Sigma), wobei für die Berechnung 5 % der ge-
messenen Konzentration abgezogen wurden, um trotz eventueller Messfehler die
ausreichende Konzentration zu erhalten.
Abb. 39: Zusammenfassung der Sequenzierungsergebnisse der Matrizen zur dsRNA-
Synthese
Das Diagramm zeigt das Ergebnis der Matrizen-Synthese für die dsRNA-Synthese. Von 227
durchgeführten PCRs zeigten 179 eine Insertgröße zwischen 450 und 2000 bp. Davon
erwiesen sich nach der Sequenzierung 18 % als nicht auswerbar, weil sie entweder, wahrscheinlich
wegen zu geringer Konzentration, nicht sequenzierbar waren, das Sequenzierergebnis
nicht eindeutig ausgewertet werden konnte, sie Doppelsignale zeigten, oder einen
Mikrosatelliten enthielten. 14 % konnten als ribosomale, 11 % als mitochondriale Gene
identifiziert werden. Die restlichen 58 % representierten weitere annotierte und nicht annotierte
Transkriptionseinheiten des Tribolium-Genoms. Insgesamt 11 % der Fragmente fanden
sich mehrfach, die Hälfte davon ribosomale und mitochondriale Gene.
Die erhaltenen Sequenzen sind auf einer CD die dieser Arbeit beiliegt gespeichert.
4.2. Detaillierte Durchführungsanweisung zum iBeetle Screening
210
Schema
Im Folgenden werde ich, in detaillierterer Form als an dieser Stelle üblich, auf die
Durchführung der Injektionen und Auswertungen im Rahmen des iBeetle-Pilot-
Screens eingehen. Diese Aufstellung kann so als Durchführungsanweisung für
iBeetle genutzt werden.

II. 4. Material und Methoden
Bei Arbeitsschritten die im Pilotscreen auf andere Art und Weise durchgeführt
wurden, als es im Hauptscreen geplant oder angezeigt ist, sind die Varianten deutlich
mit (H) für Haupt- und (P) für Pilotscreen gekennzeichnet.
Bei Detektion eines Phänotyps werden höchstens fünf digitale Aufnahmen zur
Dokumentation festgehalten, in begründeten Ausnahmen (z.B. mehrere unabhängige
Defekte) eventuell auch mehr.
Inkubationen finden bei 32°C, ca. 60 % Luftfeuchtigkeit und Dauerlicht statt, In-
jektionen bei 23 °C.
4.2.1. Verwendete Stämme
Im Pilotscreen wurden für den pupalen Screenteil weibliche Tiere des pig19-
Stamms verwendet (Lorenzen et al., 2003). Dieser trägt einen eGFP-enhancer trap
in der Nähe eines actin-Gens (Lorenzen et al., 2007). Die Expression des Enhancer-
Traps im Großteil der somatischen Muskulatur der Tribolium-L1 Larve erlaubt die
Analyse embryonaler Muskeltypen am Fluoreszenzmikroskop.
Im Rahmen des larvalen Screenteils wurden Tiere des mD17-Stammes
(Pavlopoulos et al., 2004) injiziert. Der Enhancer-Trap eines minos-eGFP-Konstrukts
unbekannter Integrationsstelle führt zur Expression in der Thoraxmuskulatur adulter
Tiere (Pavlopoulos et al., 2004). Es stellte sich jedoch heraus, dass diese nur in
jugendlichen Tieren feststellbar, dort aber wegen der sich differenzierenden Kutikula
nur innerhalb eines kurzen Zeitfensters nach der Ecdysis durch äußere Inspektion
detektierbar ist. Die Expression in den sich entwickelnden Muskeln in pupalen Sta-
dien eignet sich hingegen zur Auswertung an einem Fluoreszenz-Stereomikroskop,
wobei erst ältere Puppen ab ca. 70 % des Puppenstadiums (bereits sklerotisierende
Mandibeln, Schachtner, nicht veröffentlicht) das volle Muster zeigen.
Für den Hauptscreen wird der pig19-Stamm um ein Konstrukt ergänzt werden,
das dsRedexpress-Expression im zentralen Nervensystem hervorruft (Bucher, nicht
veröffentlicht) und der mD17-Stamm wird einen dominanten Augenmarker auf dem
Y-Chromosom tragen (Lorenzen et al., nicht veröffentlicht), der die Unterscheidung
von männlichen und weiblichen Larven erlaubt.
Zur Verpaarung der Tiere werden während des Haupt-Screens Männchen des
black Stammes zur Verwendung kommen (Sokoloff et al., 1960), während im Vor-
screen der San-Bernardino(SB)-Stamm (Klingler, nicht publiziert) benutzt wurde. In
ersterem Stamm dient eine dunklere Kutikulafärbung, im zweiten die dunkle Augen-
211

II. 4. Material und Methoden
pigmentierung zur Unterscheidung von injizierten Weibchen und nicht inzierten
Männchen im weiteren Screeningverlauf.
4.2.2. Pupale Injektion und darauf folgende Auswertungen
1) Bereitstellung von männlichen Tieren zur Verpaarung
212
(H) Wöchentlich sollten black-Puppen nach Geschlecht sortiert und z.B. in Ein-
heiten von ca. 50 Tieren aufbewahrt werden, damit immer männliche Tiere zum
Verpaaren verfügbar sind, und bei Kontamination mit Weibchen nur ein kleine Menge
verworfen werden muss. Eine Kontamination mit Weibchen lässt sich nach 3 Wo-
chen am Vorhandensein von Larven erkennen. Dies sollte von studentischen oder
technischen Assistenten durchgeführt werden.
(P) Ca. 3 Wochen vor der Injektion wurden SB-Puppen nach Geschlecht sortiert.
Der zeitliche Abstand erlaubt die Kontrolle auf Kontamination durch Weibchen an-
hand An- oder Abwesenheit von Larven.
2) Sortieren der Puppen zur Injektion
Männliche und weibliche Puppen werden am effektivsten an einem Stereomikro-
skop mit Durchlichteinrichtung unter Verwendung einer zum Saug-Greifer umgebau-
ten Aquariumspumpe sortiert und Weibchen im injektionsfähigen Alter (ca. 75 – 90 %
der Puppenentwicklung abgeschlossen) gesammelt. Bei einer Stammhaltung bei ca.
23 °C und einer dreitägigen Eiablage zur Etablierung einer Population sind in einer
Population mit ca. 50 % adulten Tieren, wiederum ca. 50 % der weiblichen Puppen
im richtigen Alter für die Injektion. Die restlichen weiblichen Puppen können für
Injektionen späterer Injektionstage herangezogen werden.
3) Injektion (Tag 0)
8 weibliche Puppen pro Gen (ca. 4!l 1 !g/!l RNA pro Gen) werden auf einem
Objektträger (OT) fixiert, und wie von Bucher beschrieben injiziert (Bucher et al.,
2002; Bucher und Klingler, 2004). 1 zusätzliche Puppe wird aufgeklebt um für even-
tuelle Schwierigkeiten zu kompensieren und gegebenenfalls nach der Injektion
wieder entfernt. Als Orientierung für die richtige Lumenweite der Kapillarspitze dient
der Übergang vom distalen, dunklen zum proximalen hellen Bereich der Urogomphi
der Puppe.

II. 4. Material und Methoden
Bei der Injektion werden zur Vermeidung von Kreuzkontaminationen drei Nadel-
halter verwendet. Nach einer Injektion wird der verwendete Nadelhalter in Wasser
eingelegt (sinnvollerweise während der nächsten Injektion), dann kurz in 70% EtOH
gespült, und getrocknet. Vor der Wiederverwendung wird mit Druckluft nachgetrock-
net. So wird ständig ein Nadelhalter benutzt, einer ist in Wasser eingelegt und einer
trocknet.
! Besonderheiten beim Verlauf der Injektion werden festgehalten.
Nach der Injektion werden die Puppen in ca. 10 g doppelt-griffigem Mehl in einer
Petrischale (9 cm, rund) bis zum Schlupf inkubiert, vier adulte Männchen werden
zugegeben (H: black, P: SB).
4) Pupale Analyse und Umsetzen (Tag 3)
OT werden entfernt, Käfer und Mehl werden per Trichter in ein Blocksystem
(Berghammer et al., 1999a) transferiert. Nicht geschlüpfte Puppen werden bei Auffäl-
ligkeiten (z.B. erhöhter Letalität) auf Phänotypen untersucht.
! Festhalten der Schlupfrate.
! Gegebenenfalls Festhalten von Auffälligkeiten/Phänotypen.
5) Erste Ablage (Tag 9)
Ablage zum Nachreifen für Kutikulapräparate. Die Eier werden in einem doppel-
ten Reifungsblock mit Auffangblöckchen inkubiert (300 !m Maschenweite erlaubt
Durchschlüpfen der Larven), geschlüpfte Larven werden in Speiseöl aufgefangen.
! Festhalten der Eimenge (0: keine Eier, -: reduzierte Eimenge, +: durchschnitt-
liche Eimenge, ++: hohe Eimenge). Als Orientierung dienen Kontrollablagen von
einem bis acht uninjizierten Tieren (H: eine zu erstellende Abbildung von Beispielge-
legen von einem bis acht Tieren) und der Vergleich der Gelege untereinander.
6) Zweite Ablage (Tag 11)
Ablage zum Nachreifen für Lebendpräparate. Die Eier werden in einem einfachen
Reifungsblock inkubiert. Der Reifungsblock (100 !m Maschenweite) steht auf Mehl,
das durch die Maschen in den Block gelangt und Kannibalismus verhindern soll.
! Festhalten der Eimenge (0, -, +, ++)
213

II. 4. Material und Methoden
214
Empfehlung: Die Dokumentation des (mit Beschriftung versehenen) Reifungs-
blocks mit einer einfachen Digitalkamera dient als Sicherheit und erlaubt im Notfall
die nachträgliche Kontrolle der Ablagemenge.
Bei deutlich verminderter Legeleistung werden pro betreffenden Ansatz 4 Weib-
chen auf das Vorhandensein eines unspezifischen „held-egg“-Phänotyps getestet
(Ovarpräparation).
egg“)
! Festhalten und Dokumentation potentieller Oogenese-Phänotypen (kein „held
Ovarpräparation (Rechtshänder): Käfer mit linker Dumont-Pinzette fest an T2
greifen, dabei öffnen sich die Elytren. Mit rechter Pinzette an den letzten beiden
Abdominalsegmenten fassen und halten. Mit linker Pinzette loslassen und den Käfer
dann nach dorsal klappen, bis die ventrale Epidermis und Kutikula aufreißt. Nun mit
links anterior festhalten (z.B. mit geöffneter Pinzette von dorsal auf beiden Seiten so
lateral wie möglich im Bereich des Thorax bzw. des anterioren Abdomens den Käfer
auf die Unterlage drücken) und mit rechts in einer flüssigen Bewegung die letzten
beiden Abdominalsegmente wegziehen. Dabei sollte im Idealfall das vollständige
Ovar mit aus der Karkasse gezogen werden. Dies erfordert Übung!
7) Kutikulapräparate herstellen (Tag 13)
! Menge der geschlüpften Larven festhalten (0, -, +, ++)
Verbleibende Eier in flaches (0,7 cm) Blöckchen (180 !m) transferieren. Vorsicht,
um die Orientierung zu behalten muss zweimal umgeschüttet werden! Die Eier 2 x 3
min in 50% Klorix dechorionisieren, dabei durch auf und ab Bewegen aus der Flüs-
sigkeit heraus möglichst viel Mehl wegwaschen. Danach mit Wasser aus einer
Spritzflasche spülen, dabei am besten von unten Kontakt zur Beckenkante halten,
damit das Wasser abläuft und sich nicht im „Well“ sammelt („Überlaufgefahr“).
An einem Stereomikroskop mit ausreichend Arbeitsabstand mit einem Pinsel die
Eier aus dem „Well“ in ca. 70 !l Hoyers Medium/Milchsäure (1:1) übertragen. Vorher
das „Well“ auf ein Tuch trockentupfen und zur Orientierung markieren. Ca. 2/3 der
Eier eines Geleges als Quetschpräparat. Dabei mit einem stumpfen Gegenstand an
mehreren Stellen vorsichtig Druck auf das Deckglas ausüben, bis die Eihüllen auf-
platzen. 1/3 ungequetscht auf dem gleichen OT einbetten.

II. 4. Material und Methoden
Bei sehr wenigen Eiern wird ein Quetschpräparat hergestellt, wenn viele schlupf-
reife Larven sichtbar sind. Bei vielen scheinbar unentwickelten Eiern wird nicht
gequetscht. Die Präparate werden über Nacht bei 60°C inkubiert.
8) Auswertung der Kutikulapräparate
Die Auswertung der Präparate am Fluoreszenz-Mikroskop erfolgt zu unterschied-
lichen Zeitpunkten. Verwendet wird ein YFP-Filter und eine Dunkelfeldeinstellung des
Mikroskops. Die Präparate werden zunächst unter Verwendung eines 10fach Objek-
tivs in horizontalen Linien „gescannt“. Dabei wird auf deutliche Veränderungen der
Morphologie und die Zahl an nicht-entwickelten Embryonen geachtet. Hierfür emp-
fiehlt sich die Dunkelfeldeinstellung. Anhand des Dotters sind dann nicht entwickelte
Eier gut von leeren Eihüllen (Larve geschlüpft) zu unterscheiden. Defekte werden bei
höherer Vergrößerung (20fach - 40fach Objektiv) analysiert und charakterisiert, um
dann ihre Häufigkeit zu bestimmen. Werden keine deutlichen Veränderungen festge-
stellt, werden ca. 25 % der Larven, mindestens aber fünf Tiere, im Detail (20fach -
40fach Objektiv) auf subtile Veränderungen der Morphologie (va. Kopfborstenmuster,
Mundwerkzeuge, Beine) untersucht.
! Festhalten und Dokumentation von Veränderungen der Eiform und -größe.
! Festhalten des Anteils nicht-entwickelter Eier.
! Festhalten und Dokumentation morphologischer Veränderungen, also embry-
onaler Phänotypen, und deren Häufigkeit.
(H) Die zu screenenden morphologischen Aspekte sollen zur Orientierung der
Screener auf einer „Screening-Tafel“ zusammengefasst sein.
9) Lebendpräparate herstellen und auswerten (Tag 14)
Nach 72-stündiger Inkubation Embryonen und geschlüpfte Larven umschütten
und dechorionisieren wie in Schritt 7 beschrieben. Mit einem Pinsel je die Hälfte der
Eier und Larven eines Geleges in je einen Tropfen Voltaleföl (10s) auf einem Objekt-
träger überführen, und die eine Hälfte als Quetschpräparat (siehe Schritt 7) die
andere Hälfte ungequetscht einbetten. Bei wenigen Eiern/Tieren zunächst nicht
quetschen, gegebenenfalls nach einer ersten Inspektion noch quetschen.
Die Auswertung am Fluzoreszenz-Mikroskop muss am gleichen Tag durchgeführt
werden. Zur Analyse eines Injektionsblocks von 30 Injektionen muss der Screener
215

II. 4. Material und Methoden
bei der Herstellung der Präparate von einem technischen Mitarbeiter unterstützt
werden.
216
Das Vorgehen bei der Auswertung entspricht der in Schritt 8 angegebenen, au-
ßer der Verwendung eines GFP-Filters. Die Muskulatur, im speziellen die Muskulatur
der Beine wird dabei inspiziert. Bei einer erhöhten Zahl nicht zur Schlupfreife entwi-
ckelter Eier wird durch die Verwendung von DIC-Optik entschieden, ob embryonales
Gewebe nachweisbar ist.
! Festhalten und Dokumentation von Veränderungen der Eiform und -größe.
! Festhalten früh- und mesoembryonaler Defekte und ihrer Häufikeit.
! Festhalten und Dokumentation von Defekten der Muskulatur.
(H) Die zu screenenden morphologischen Aspekte sollen zur Orientierung der
Screener auf einer „Screening-Tafel“ zusammengefasst sein.
Die Verwendung von Hoechst 33342 oder TRITC-markiertem Phalloidin im
Einbettungsmedium könnte die Sensitivität der Analyse früh-embryonaler
Phänotypen verbessern (noch zu testen).
Durch die zusätzliche Verwendung eines RFP-Filters kann im Hauptscreen ein
Defekt des zentralen Nervensystems detektiert werden. Der dafür nötige zusätzliche
Zeitaufwand muss dabei in Betracht gezogen werden.
4.2.3. Larvale Injektion und darauf folgende Auswertungen
Bei Detektion eines Phänotyps werden höchstens fünf digitale Aufnahmen zur
Dokumentation festgehalten, in begründeten Ausnahmen (z.B. mehrere unabhängige
Defekte) eventuell auch mehr.
1) Bereitstellung von männlichen Tieren zur Verpaarung
Siehe Punkt 1) bei 4.2.2.
2) Sammeln der Larven zur Injektion
Eine Mischung älterer Larvenstadien mit 700 !m, 600 !m und 500 !m sieben,
das 700 !m-Sieb mit Puppen und Präpuppen entfernen. Nach " h Inkubation haben
sich die Larven der anderen Siebe ausreichend gut getrennt. Larven im letzten
Larvenstadium bleiben im 600 !m Sieb zurück, Larven im 500 !m Sieb sind zu

II. 4. Material und Methoden
injizieren (angenommenes L5- und L6-Stadium). Möglicherweise könnte durch Ver-
wendung eines 650 !m-Siebs die Trennung von L5 und L6 noch verbessert werden.
4.2.1).
(H) Die Larven werden nach Geschlecht sortiert (Y-chromosomaler Marker, s.
3) Injektion (Tag 0)
Injektion von 20 Larven (P) bzw. 10 weiblichen Larven (H) pro Gen. Die Larven
werden in einer Petrischale auf Eis kryoanästhesiert. Je 5 werden mit einem feuchten
Pinsel in eine kalte Metallinjektionsplatte (gefräste Vertiefungen für die Larven; auf
einem kaltem Alublock, siehe Anhang) überführt, injiziert und das pro Gen zweimal
wiederholt. Injiziert wird in der Regel lateroventral zwischen das fünfte und sechste
Abdominalsegment, was nicht immer möglich ist. Als Orientierung für die richtige
Lumenweite der Kapillarspitze dient der Übergang vom distalen, dunklen zum proxi-
malen hellen Bereich der Beinkrallen der L6-Larve.
Es wird injiziert bis die Larve vollständig gestreckt ist. Nach der Injektion werden
die Larven in eine Glaspetrischale auf RT überführt wo sie während der Injektion der
nächsten dsRNA trocknen. Es werden wie in Schritt 3) bei 4.2.2 drei Nadelhalter
verwendet und ebenso mit drei Metall-Injektionsplatten verfahren.
! Besonderheiten beim Verlauf der Injektion festhalten.
4) Analyse der pupalen Morphologie und Verpaarung (Tag 11)
Die Tiere werden abgesiebt und in einen Inspektionsblock (1,5 cm Höhe) über-
führt (zweimaliges Umschütten nötig, wegen der Orientierung!). Die Auswertung
erfolgt an einem Fluoreszenz-Stereomikroskop. Die Tiere werden zunächst nach
Geschlecht getrennt, und die Weibchen von ventral und dorsal auf Auffälligkeiten
untersucht. Beides in Auf- oder Durchlicht und im UV-Licht unter Verwendung eines
GFP-Filters. Es empfiehlt sich die zu untersuchenden Tiere aufzureihen und einem
stereotypen Vorgehen zu folgen (von posterior nach anterior etc.).
(H) Die zu screenenden morphologischen Aspekte sollen zur Orientierung der
Screener auf einer „Screening-Tafel“ zusammengefasst sein.
! Festhalten der Anzahl toter Larven
! Festhalten und Dokumentation von Defekten der Metamorphosekontrolle
! Festhalten und Dokumentation morphologischer Defekte
! Festhalten und Dokumentation von Defekten der thorakalen Muskulatur
217

II. 4. Material und Methoden
218
Tiere mit Defekten der Thoraxmuskulatur sollen wenn möglich bis zu Ecdysis
weiter beobachtet (separate Haltung) und gegebenenfalls erneut dokumentiert wer-
den.
Beispielhafte Exemplare interessanter Phänotypen werden in 75% EtOH 25%
Glycerin („strump hapely“; (Lawrence et al., 1986) konserviert. Phänotypen die die
Ecdysis möglicherweise durchlaufen können werden zunächst weiter prozessiert.
5) Verpaarung
(P) 8 der injizierten weiblichen Puppen (sofern vorhanden) werden jeweils einzeln
mit zwei adulten SB-Männchen verpaart.
(H) Die überlebenden Tiere werden mit 4 adulten black-Männchen verpaart.
6) Kontrolle der Ecdysis, Start der Eiablage (Tag 20 – 23)
Dieser Schritt muss in ausreichendem zeitlichen Abstand zur Ecdysis stattfinden,
lässt aber ein relative großes Zeitfenster zu.
(P) Bei erhöhter Letalität im Puppenstadium oder Auffälligkeiten bei der Ecdysis,
Analyse einzelner Tiere am Stereomikroskop.
(H) Bei erhöhter Letalität im Puppenstadium oder Auffälligkeiten bei der Ecdysis,
Analyse im Inspektionsblock (1,5 cm Höhe) am Stereomikroskop.
! Festhalten und Dokumentation von Defekten der Metamorphosekontrolle (falls
bei 4) kein Phänotyp beschrieben wurde).
7) Kontrolle der adulten Morphologie und Kontrolle der Eimenge (Tag 23 – 26)
Dieser Schritt findet drei Tage nach 6) statt.
Ablage absieben, Kontrolle der Eimenge.
! Festhalten der Eimenge (0, -, +, ++)
Empfehlung: Die Dokumentation des (mit Beschriftung versehenen) Reifungs-
blocks mit einer einfachen Digitalkamera dient als Sicherheit und erlaubt im Notfall
die nachträgliche Kontrolle der Ablagemenge.
Zunächst Kontrolle der Adultmorphologie, dann Kontrolle der Ovarmorphologie.
Weibliche Käfer werden einzeln aus dem Inspektionsblock (H) oder aus der Ein-
zelverpaarung (P) entnommen, durch CO2-Begasung betäubt und ihre Morphologie
untersucht. (H) Die zu screenenden morphologischen Aspekte sollen zur Orientie-
rung der Screener auf einer „Screening-Tafel“ zusammengefasst sein.

! Festhalten und Dokumentation morphologischer Defekte
! Festhalten deutlich auffälliger Verhaltensabnormalien
II. 4. Material und Methoden
Beispielhafte Exemplare interessanter Phänotypen werden in 75% EtOH 25%
Glycerin („strump hapely“,(Lawrence et al., 1986) konserviert.
(H) Bei deutlich verminderter Legeleistung werden pro betreffenden Ansatz 4
Weibchen auf das Vorhandensein eines unspezifischen „held-egg“-Phänotyps getes-
tet (Ovarpräparation). Zumindest ein Tier sollte für die Kontrolle der Stink-Drüsen
zurückbehalten werden.
(P) Bei deutlich verminderter Legeleistung in der Mehrheit der Verpaarungen ei-
ner Injektion werden die betreffenden Verpaarungen (maximal 4 Weibchen) auf das
Vorhandensein eines unspezifischen „held-egg“-Phänotyps getestet (Ovarpräparati-
on).
Die Ovarpräparation wird wie in 4) beschrieben durchgeführt, es soll aber bei der
Präparation auf das Vorhandensein der abdominalen Stinkdrüsen geachtet werden.
! Festhalten und Dokumentation potentieller Oogenese- und Ovariogenese-
Phänotypen (kein „held egg“)
! Festhalten und Dokumentation eventueller Stinkdrüsendefekte.
8) Kontrolle der Stinkdrüsen (6 – 8 Wochen nach Injektion)
Weibliche Käfer werden aus dem Inspektionsblock (H) bzw. aus der Einzelver-
paarung (P) entnommen, durch CO2-Begasung betäubt und auf das Vorhandensein
von Defekten der Stinkdrüsen untersucht. Durch Andrücken des Tieres auf die Unter-
lage spreizen sich die Elytren und das Abdomen wird gestreckt, so dass die abdomi-
nalen Stinkdrüsen gut durch die dünne dorsale Kutikula erkennbar sind (Empfehlung:
Verwendung einer „zweizinkigen Holzgabel“, die genug Druck aufbaut, ohne das Tier
zu verletzen).
! Festhalten der Anzahl toter Käfer
! Festhalten und Dokumentation eventueller Stinkdrüsendefekte.
219

Allgemeine Diskussion
Allgemeine Diskussion
In den beiden Kapiteln der vorangegangenen Arbeit wurden unterschiedliche An-
sätze zur Untersuchung von Entwicklungsprozessen in Tribolium castaneum verfolgt.
Beide Herangehensweisen nutzten dabei die Verfügbarkeit systemischer RNAi-
Anwendungen in Tribolium, um Genfunktionen zu analysieren. Die Möglichkeit durch
einfache Injektion von doppelsträngiger RNA die Expression eines beliebigen Prote-
ins zu jeder Zeit und in praktisch jedem Gewebe zu reduzieren, ist einer der Haupt-
vorteile von Tribolium als Insekten-Modellsystem und ermöglichte den Großteil der
Tribolium-Studien der letzten zehn Jahre.
Im ersten Kapitel dieser Arbeit wurde vor allem die sehr gut etablierte parentale
RNAi genutzt (Bucher et al., 2002), um die Funktion von nanos und pumilio für die
Embryonalentwicklung in Tribolium zu untersuchen. Dabei konnte ich zeigen, dass
beide Gene eine Rolle für die Entwicklung abdominaler Segmente spielen und offen-
bar mit dem terminalen System interagieren. Außerdem wurde ein Einfluss auf die
Entwicklung von Kopfsegmenten festgestellt. Diese Befunde zeigen, dass die Rolle
von nanos und pumilio in Tribolium nicht direkt mit ihren Aufgaben für die frühe
blastodermale Regionalisierung in Drosophila vergleichbar ist (Nüsslein-Volhard et
al., 1987). Zudem konnte ich zeigen, dass beide Gene nicht, wie bisher vermutet
(Schröder, 2003), für die posteriore Repression der ORTHODENTICLE-1-Expression
verantwortlich sind.
Diese Ergebnisse verdeutlichen zwei wichtige Schwierigkeiten der vergleichen-
den Entwicklungsbiologie in Tribolium. Erstens werden trotz großer Gemeinsamkei-
ten zunehmend Unterschiede zwischen der Embryonalentwicklung von Drosophila
und Tribolium deutlich. Gene wie nanos und pumilio sind zwar an ähnlichen Prozes-
sen wie in Drosophila beteiligt, ihre Rolle ist jedoch weniger fundamental und in
diesem Fall erfüllte sich die Hoffnung nicht, durch die Untersuchung dieser Kandida-
tengene eine zentrale posteriore Determinante in Tribolium aufzudecken. Andere
Gene, wie z.B. knirps oder hairy spielen in Tribolium sogar eine deutlich geringere
Rolle als in Drosophila (Aranda et al., 2008; Cerny et al., 2008) und mittlerweile
wurden auch Beispiele für Faktoren gefunden, die wiederum in Drosophila keine zu
Tribolium vergleichbare Funktion erfüllen, wie z.B. mille-pattes oder mex-3 (Savard et
al., 2006a; Schoppmeier et al., 2009).
221

Allgemeine Diskussion
222
Zweitens zeigten die Arbeiten an nanos und pumilio Lücken auf, die momentan
nicht durch eventuelle Funktionen bereits aus Drosophila bekannter Faktoren erklärt
werden können. So bleibt beispielsweise unklar, wie die Expression von OTD-1
reguliert wird. Die anterioren Defekte nach nanos/pumilio-RNAi legen außerdem die
Beteiligung eines bisher unbekannten anterioren Faktors nahe. Solche Lücken
offenbaren sich auch in anderen Zusammenhängen, wie beispielsweise der Regula-
tion des CAUDAL-Repressors mex-3 (Schoppmeier et al., 2009).
In diesem Kapitel wurden also etablierte Methoden verwendet um die Funktion
zweier aus Drosophila bekannter Faktoren in Tribolium zu untersuchen. Dabei zeig-
ten sich anhand der Ergebnisse die Schwächen dieses auf Kandidaten-Genen aus
Drosophila basierten Ansatzes.
Im zweiten Kapitel wurden sowohl parentale als auch larvale RNAi (Tomoyasu
und Denell, 2004) verwendet, um ein Vorgehen zu entwickeln, das die Limitierungen
dieses Kandidaten-Gen-Ansatzes überwinden kann. Dabei konnte ein Protokoll für
den genomweiten Einsatz pupaler und larvaler RNAi entworfen und in einem Pilot-
screen getestet werden, das im Rahmen des geplanten iBeetle-Projekts die Analyse
aller Tribolium-Gene auf ihre Funktion in embryonalen und postembryonalen Ent-
wicklungsprozessen ermöglichen wird.
Durch dieses Vorgehen wird es möglich sein Gene zu identifizieren, die eine Rol-
le für die Embryonalentwicklung Triboliums spielen, in diesem Zusammenhang aber
nicht aus Drosophila bekannt sind. So könnten solche Gene beispielsweise durch
technische Schwierigkeiten wie unvollständige Saturation oder dem Vorhandensein
von maternaler und zygotischer Aktivität in genetischen Screens unentdeckt geblie-
ben sein. Oder sie haben ihre Funktion in Drosophila verloren bzw. dort oder in
Tribolium ihre Funktion verändert und sind somit nur aus anderen Zusammenhängen
bekannt. Schließlich könnten solche Faktoren auch im Laufe der Fliegen-Evolution
verlorengegangen sein, aber trotzdem anzestrale Gene darstellen, die somit in
Tribolium untersucht werden könnten. Diese Annahme wird durch den Befund ge-
stützt, dass die Genomsequenz von Tribolium einer langsamer verlaufenden evoluti-
onären Veränderung unterlag als die von Drosophila und sich viele Vertebraten-
Gene finden lassen zu denen ein Tribolium- aber kein Drosophila-Ortholog existiert
(Tribolium Genome Sequencing Consortium, 2008).
Somit wird iBeetle mit hoher Wahrscheinlichkeit Kandidatengene liefern, die auch
bei der Aufklärung der noch offenen Fragen über die blastodermale Musterbildung

Allgemeine Diskussion
und Achsendetermination helfen können. Zudem werden Kandidatengene für neue
Forschungsrichtungen gefunden werden und die Beschränkungen des Drosophila-
basierten Kandidaten-Gen-Ansatzes durch die Schaffung einer breiten funktionellen
Tribolium-Datenbasis in mehreren Bereichen überwunden werden.
Beide in der vorliegenden Arbeit präsentierten Projekte haben ihren Beitrag zur
Weiterentwicklung Triboliums als Modellsystem geleistet und stellen auf unterschied-
liche Art und Weise einen Anknüpfungspunkt für zukünftige Forschungprojekte dar.
223

Anhang
1. Sequenzen
1.1. nanos (TC030446)
Putative Proteinsequenz
Anhang
MSFNNYNKTPKCYDSPTLRNQQFSNVLRSIENVQPPPPSPSFYQNQPIKFQNQQFSQDVENYQRPKI
CTLCWKNCETPEVFQSHTVKAEDGRVTCPILRRHICDICGATGDYAHTRRHCPNFVQNEEVIRPKPKY
KVLSNGKTTKFINH
Fragment für dsRNA-Injektionen
CCCCAAAATGTTACGACTCCCCAACGCTCCGAAATCAACAGTTTTCCAACGTTTTACGAAGCATC
GAAAATGTTCAACCACCACCACCATCCCCCAGTTTCTATCAAAACCAAGCAATAAAATTTCAAAAT
CAACAATTTTCGCAAGATGTTGAAAGTTATCAACGACCGAAAATCTGCACTCTGTGCTGGAAAAAC
TGTGAAACGCCTGAAGTATTTCAATCGCATACTGTAAAAGCCGAAGATGGGAGAGTTACTTGTCC
GATTTTAAGACGGCATATTTGCGATATATGTGGGGCTACGGGCGATTATGCCCACACTCGACGCC
ACTGCCCCAATTTTGTGCAAAACGAAGAAGTGATTCGACCCAAACCAAAATACAAGGTTTTGTCCA
ACGGGAAAACGACCAAATTTATCAACCACAAGTAATTTATTGCATTGTTTATTCGATACGCACTTTA
TAATCCGTTTTGTGAATTTATTCAATAAACTTTTTACACACAAAAATTCAGCCTCGTTTATTAAAACT
ATCAATCTCGTCAAAAAAAAAAATAATAAGAAAACCGAATGGAAATCTTTTTCTTTTAATGTAAGAG
CTGAGACTGTGGGTGTAAAGGGACGGGTTAAGCTGAGTGAAATAAAACGAGCTTTGTTGTAGTTT
TATTTATAATGGCGGTCGCTTAACATTGTGAACTAACACTTATATTATTATAAAAGTAAATGGTACC
TATTTACATTAGTTATAAAAACTTAAATAATTGACTAACTCGAGAAAATAGGGAATTATCATGTTATA
TACAATGTAATTTGG
1.2. pumilio (TC005073)
Putative Proteinsequenz
MMLQLVMFSKDNQTQNFHLSDQSSCVGLLETTNHDKWKYPVNSKVGTPPNSMSYIGASSTMPGLYD
LGQNKSIPSEHLVYMSNQIPGGMHMHPQYLQQPLTPQMQMRQGPIAPAAKKLWGLEAKDAKSLALN
HLNHEQVWRDSTWAAPEHAVSASLAMGRRGGFVGGDTGSILSPRGSDNGGLGVKMVEYVLGGSPT
NKDNIGLEPRMRALHLVDDKDKDKPQSPKEEVNGQAVQNGQVSEDEKGFNRTPGSRQPSPAEEELT
KNGISLDPTVVVMKPQEQLPPHLQHHHLPPHLAPHLGVTLTESVNQQFDHFEQPPPAPYDQQPHQY
PPPPPQQHQVDSAVLQQQQHNFDVQAPAALLDPLDYRQTPTCLKMLPKRYINVHQWLGPVCPKDLK
AQLQLFRSQQTQAATPSGAAQLQLLQQQQQYLAQQQQQAAFPQPPYVLNHQQEPSYLITAGVPQYY
GVGPWVYPAPANLIQQGASNGARRPLTPNGTAEAQQQVQPQVPGGYIVPYYDQNTPILMAQGAAMR
NGTPMRLVSPAPVLVQPQANRQTPAGASLYSSTPQSLYGANVNTSVNGGTLGGVAQGVGSGLFPPL
HAAPPSAPFGSSSLGNIGSSATTTSLHTGLGLNTTSSGRRDSFDRNTSAFSPSLDYRQKWPTSYNIGS
SPSPLTGSLTPPPSAPLQLGGLMTSRVLSAAPGAEAKYRNSVAAGLTTNAMFGSTNSLFTKINSSLST
VPSSLDKGQQGRSRLLEDFRNNRYPNLQLRDLANHIVEFSQDQHGSRFIQQKLERASATEKQMVFNE
ILSAAYNLMTDVFGNYVIQKFFEFGTAEQKTTLAQKVRGHVLPLALQMYGCRVIQKALESIPPEQQQEI
VRELDGHVLKCVKDQNGNHVVQKCIECVDPNALQFIIQSFSGQVYTLSTHPYGCRVIQRILEHCTPEQ
TAPILAELHQHTDQLIQDQFGNYVIQHVLEHGKPEDKSQLISSVRGKVLALSQHKFASNVVEKCVTHAT
RAERALLIEEVCGFNDNALHVMMKDQYANYVVQKMIDVSEPTQRKVLMHKIRPHLNSLRKYTYGKHII
AKLEKYFMKTPGSMGSIGGELGPIGPPTNGVL
Fragment für dsRNA-Injektionen
CAATCACATCGTGGAGTTCTCGCAGGACCAGCACGGGTCGCGGTTTATCCAACAGAAGTTAGAA
CGGGCTTCGGCGACCGAAAAACAGATGGTTTTTAATGAAATTTTATCGGCAGCTTATAATCTTATG
ACTGACGTCTTCGGCAATTATGTTATACAAAAATTCTTCGAATTCGGGACCGCTGAACAGAAGAC
GACGTTGGCGCAGAAAGTCAGAGGTCACGTGCTTCCATTAGCTCTACAAATGTATGGTTGTCGG
GTCATTCAAAAGGCTCTCGAATCGATTCCGCCTGAACAACAGCAAGAAATTGTGAGAGAATTGGA
CGGGCATGTTTTGAAGTGCGTCAAGGACCAAAACGGAAATCATGTGGTCCAAAAGTGCATCGAAT
GTGTCGACCCCAACGCCTTGCAGTTTATTATTCAGTCATTCTCGGGGCAAGTGTACACGTTATCG
225

Anhang
ACCCATCCGTACGGCTGCCGGGTCATTCAACGCATTTTAGAGCATTGCACACCTGAGCAGACTG
CTCCAATTTTAGCCGAATTGCACCAACACACCGATCAGTTGATCCAGGATCAGTTTGGAAACTAT
GTCATCCAGCATGTGTTGGAACACGGAAAGCCCGAAGATAAGAGTCAGCTGATTAGCAGCGTGA
GAGGGAAAGTTTTAGCTTTAAGTCAGCATAAATTCGCCAGTAACGTCGTCGAGAAGTGCGTCACT
CACGCGACCCGGGCCGAGAGGGCGCTACTAATCGAGGAAGTGTGTGGATTTAACGACAATGCTC
TCCATGTCATGATGAAAGATCAGTATGCGAATTACGTGGTTCAAAAAATGATAGACGTGAGTGAG
CCAACACAGCGAAAGGTGTTGATGCATAAAATCAGGCCTCATCTTA
1.3. brain-tumor (TC008260)
Putative Proteinsequenz
MASPTPSIESLPRANSIGSFGDQADYLSLSPLEDSPLSVSGSSPPVSDSVDRDSDPSELHCQQCREP
VADPKLLACFHTFCNPCLEKNKLICPRCNSESIEGILNSLLFSSDSTTDSFHPTVRCTGCKTKKLDAVA
RCVDCANYLCPNCVMAHQFMHCFEGHRVVNLNEIKDESKNGLISNSTITNGENKNTVCPRHKGELLK
YFCRTCSIPICKECLNLEHPAGIHEYEHISEAAPKQVEAIQHAVQEAKTKATDIRNILKNVEHVSSRLQV
QYHKAQNEINDTFMFYRSMLEERKQELLKELESVFSAKQISLGVATQKGQETVEQIYKTCEFVERLNK
CATIVEILMIRKLLDTKLQGLLSYNIDQSVQSACELEFVSNYQAIQVGVRNTFGYVRSNSEAVVGPSKQ
PPIARPTGGSSSSGSSVNGSSGSLNGGIHCPFTISGSSQSTSPFESNIISKRFSSANSLGPFSTTIGDLN
LNGINPYEKWSNGGTDTMFQNGSSDPYSLTSTGHTDPMLDLTSKLMSTAIFPPKSQIKRQKMIYHCKF
GEFGVMEGQFTEPSGVAVNAQNDIIVADTNNHRIQIFDKEGRFKFQFGECGKRDGQLLYPNRVAVVR
TSGDIIVTERSPTHQIQIYNQYGQFVRKFGANILQHPRGVTVDNKGRIVVVECKVMRVIIFDQTGTVLQK
FGCSKHLEFPNGVVVNDKQEIFISDNRAHCVKVFSYEGVYLRQIGGEGITNYPIGVGINANGEILIADNH
NNFNLTIFTQDGQLVSALESKVKHAQCFDVALMDDGSVVLASKDYRLYIYRYVQVPPIGL*
Fragment für dsRNA-Injektionen
GCAAGTTCGGCGAGTTTGGCGTGATGGAAGGCCAGTTTACTGAGCCGAGCGGTGTTGCGGTCAA
CGCTCAAAACGACATCATCGTCGCCGACACGAACAATCATCGAATCCAGATCTTTGACAAAGAGG
GCCGCTTCAAGTTCCAATTCGGCGAGTGCGGGAAACGCGACGGCCAGCTCCTGTATCCGAATCG
CGTCGCTGTCGTGCGTACCTCAGGCGATATCATCGTCACGGAGCGTTCGCCCACGCACCAGATC
CAAATCTACAACCAATACGGACAGTTTGTGCGAAAGTTCGGCGCCAACATCCTGCAGCATCCGC
GCGGCGTCACCGTCGACAACAAAGGCCACATCGTCGTCGTCGAGTGCAAAGTGATGCGTGTGAT
CATTTTCGACCAAACCGGGACCGTGCTGCAAAAATTCGGCTGTTCTAAGCACTTGGAGTTCCCGA
ACGGTGTCGTCGTCAACGACAAGCAGGAGATTTTCATCAGCGATAATCGTGCTCACTGCGTCAAG
GTGTTCAGTTACGAGGGTGTTTATCTGCGACAAATCGGAGGCGAAGGCATCACCAACTATCCGAT
TGGTGTCGGTATCAATGCCAATGGCGAGATTCTGATCGCCGATAACCACAACAACTTCAACTTGA
CCATCTTCACCCAAGACGGACAGTTGGTGTCCGCGTTAGAGAGCAAAGTGAAGCACGCCCAATG
TTTC
226

1.4. Potentielle Nanos-Response-Elemente
Abb. 40: Sequenzvergleich veröffentlichter und potentieller NRE
Anhang
cDNA-Sequenzen aus den 3’-UTR-Bereichen (gt, Kr, tll, fkh) oder den putativen 3’-UTR-
Bereichen (kni, cic) einiger Tribolium Gene wurden mit bekannten NRE verglichen. Fett
gedruckt sind zwischen den bereits veröffentlichten NRE konservierte Nukleotide. Farbig
hervorgehoben sind Nukleotide die als wesentlich für die Bindung in vitro oder die Funktion
in vivo beschrieben wurden. grün: wichtig für Funktion (Curtis et al., 1997), türkis: wichtig für
PUM-Bindung, rot: wichtig für Funktion (Sonoda und Wharton, 1999), orange: wichtig für
NOS-Bindung (Sonoda und Wharton, 1999), blau: wichtig für PUM-Bindung (Murata und
Wharton, 1995). In violett sind die Nukleotide hervorgehoben (nur beispielhaft in der Musca-
Sequenz), die in einem Screen nach PUM-bindenden RNAs als Konsensus-Sequenz identifiziert
wurden (Gerber et al., 2006). Diese Sequenz stellt die von Puf-Proteinen gebundene
„Core“-Sequenz dar, wie sie in Kristallisationsexperimenten mit einem menschlichen PUM-
Homolog bestimmt (Wang et al., 2002) und im wesentlichen für ein C. elegans-Protein
bestätigt wurden.
1 : (Wharton und Struhl, 1991) 2 : (Patel et al., 2001) 3 : (Wolff et al., 1995) 4 : (Schröder, 2003);
227

Anhang
2. Ergänzende Ergebnisse zu nanos/pumilio pRNAi
2.5. Phänotypische Auswertung der RNAi-Experimente I
Tab. 10: Verteilung der Phänotypen nach nanos- und pumilio-RNAi
Phänotyp Wildtyp schwach stark unspezifisch unklar
dsRNA total n % n % n % n % n %
nanos 179 81 45,3 51 28,5 41 22,9 4 2,2 2 1,1
pumilio 65 4 6,2 35 (9) 53,8 18 27,7 0 0,0 8 12,3
nanos + pumilio 60 0 0,0 9 (9) 15,0 48 80,0 3 5,0 0 0,0
dsred (Kontrolle) 295 275 93,2 0 0 0 0,0 19 6,4 1 0,3
Ergebnisse der phänotypischen Auswertung einzelner RNAi Experimente. Die geringere
Gesamtzahl nach pum oder nos/pum Injektionen ist auf reduzierte Eiproduktion zurückzuführen.
“schwach”: Larven mit reduzierter Zahl an Abdominalsegmenten, oder (selten)
Veränderungen der Mundwerkzeuge (Kopfdefekte ohne Abdominaldefekte nur nach nos
RNAi, in 6 von 51 Fällen). „stark“: Larven mit anterioren und posterioren Defekten. In
Klammern steht die Zahl derjenigen Larven der Kategorie “schwach” bei denen ein
anteriorer Phänotyp nicht zweifelsfrei nachgewiesen werden konnte, weshalb sie als
“schwach” statt “stark” gewertet werden mussten. “Unspezifisch” sind natürlicherweise
auftretende Defekte, “unklar” Larven die wegen Präparationsartefakten nicht auswertbar
waren.
2.6. Phänotypische Auswertung der RNAi-Experimente II
Tab. 11: Ausprägung der Kopfdefekte nach nanos- und pumilio-RNAi
Phänotyp - schwach intermediär stark
dsRNA total n % n % n % n %
nanos 92 45 48,9 27 29,4 17 18,5 3 3,3
pumilio 44 26 59,1 15 34,1 3 6,8 0 0,0
nanos + pumilio 48 0 0,0 2 4,2 17 35,4 29 60,4
Ergebnisse der phänotypischen Auswertung einzelner RNAi Experimente. „schwach“: Es
treten nur Transformationen auf. „intermediär“: Es treten Transformationen und in einzelnen
Segmenten auch Deletionen auf. „stark“: Es treten Deletionen im mandibulären und
antennalen Segment auf, selten gepaart mit Transformationen. Die Transformationen
nach pum oder nos/pum RNAi sind in der Regel partielle Transformationen von Mandibeln
zu möglicherweise maxillärem Schicksal, nach nos RNAi partielle Transformationen
der Labialpalpen zu beinähnlichen Strukturen.
228

2.7. Phänotypische Auswertung der RNAi-Experimente III
Abb. 41: Verteilung der abdominalen Phänotypen nach pRNAi
Anhang
Es wird deutlich, dass sowohl in Folge der Einzel- als auch der Doppel-RNAi mit nanos und
pumilio der Großteil der Larven noch 5 – 7 abdominale Segmente ausbildet. Gezählt wurden
Larven mit unregelmäßiger abdominaler Segmentierung und klar bestimmbarer Zahl der
abdominalen Semente. Die Verteilung ist repräsentativ für typische Injektionen. Basis der
Grafik sind die Zahlen in Tab. 12.
Tab. 12: Abdominale Phänotypen nach nos/pum-pRNAi
A8 A7 A6 A5 A4 A3 keine Summe
nos RNAi 4 17 30 20 7 7 1 86
pum RNAi 1 12 19 10 1 43
nos+pum
RNAi
1 2 16 14 2 35
Ergebnisse der Auswertung larvaler Phänotypen nach pRNAi. Angegeben ist
das posteriorste, noch ausgebildete abdominale Segment zweifelsfrei analysierbarer
larvaler Kutikulas als Ergebnis representativer RNA Injektionen.
Terminale Strukturen wurden nicht einbezogen.
229

Anhang
3. Zeitaufwand der iBeetle-Arbeitschritte
Tab. 13: Zeitaufwand der iBeetle-Arbeitsschritte
Arbeitsschritt Zeitaufwand pro dsRNA Zeitaufwand für 30/23 dsRNAs
pupaler Screen
Injektion (inkl. Vorbereitung) 19,5 min 9 h 45 min
Injektion 11 min 5 h 30 min
Vorbereitung (Puppen sortieren,
Aufkleben etc.)
230
8,5 min 4 h 15 min
Transfer 2,5 min 1 h 15 min
Sieben - 40 min
Kutikula-Präparate anfertigen 6 min 3 h
Kutikula-Präparate auswerten 12 min 6 h
Muskel-Präparate anfertigen 6,5 min 3 h 15 min
Muskel-Präparate auswerten 9 min 4 h 30 min
Präparation potentieller Ovar-
Phänotypen
larvaler Screen
3 min 1 h 30 min
Injektion 15 min 5 h 45 min
Pupale Analyse 18 min 6 h 54 min
Schlupfkontrolle 4,5 min 1 h 44 min
Adulte Analyse 12 min 4 h 35 min
Stinkdrüsenkontrolle 4 min 1 h 32 min
Die angegebenen Zeiten sind Durchschnittswerte, die während der Durchführung des Pilot-
Screens ermittelt wurden. Diese wurden in der zweiten Spalte für 30 (pupaler Screenteil)
bzw. 23 (larvaler Screenteil) Injektionen/Gene/dsRNAs extrapoliert.

4. Alublöcke für larvale Injektionen
Abb. 42: Maße der für die larvalen Injektionen verwendeten Aluminiumblöcke
Anhang
A Injektionsplatte. Die Larven werden in fünf 1 mm breite und 10 mm lange Vertiefungen
(Tiefe: 1 mm) platziert und dort injiziert.
B Dieser Block wird gekühlt in einem Zeiss Stereomikroskop platziert und hält die Temperatur
ausreichend für die Injektion einer dsRNA. Auf Eis kann der Block in wenigen Minuten
wieder gekühlt werden.
231

Anhang
5. Zusammenfassung der Ergebnisse des iBeetle Pilot-Screens
Tab. 14: Zusammenfassung der Ergebnisse des iBeetle Vorscreens
Pupale Injektion Larvale Injektion
Adult letal/kachektisch 21 Larval letal 21
früh-embryonal letal/nicht befruchtet 6 Adult letal 6
Meso-embryonal letal 1 Metamorphose Block I 1
gemischt embryonal letal 2 Metamorphose Block II 2
starker Musterbildungsdefekt 1 Metamorphose Block III 1
Segmentierung 1 Pupaler Flügeldefekt 4
Borstenmusterdefekt 1 Pupaler Kopfdefekt 1
Kopfdefekt 2 Defekt der Thoraxmuskulatur 1
Beindefekt 1 Adulter Flügeldefekt 1
232
Adulter Beindefekt 1
Stinkdrüsendefekt 1
Oogenesedefekt 1 Oogenesedefekt 1
Ovaratrophie 5 Ovaratrophie 3
Nekrotisches Gewebe 1
Andere 1
Kein Phänotyp 42 Kein Phänotyp 40
! 42 Phänotypen in 42 Injektionen ! 46 Phänotypen in 40 Injektionen

233
6. Liste der im Pilot-Screen injizierten Fragmente
Seq. #
Insert
(bp)
RNA
# Gen (NCBI o. GLEAN) Acc. # (NCBI) GLEAN #
bester D.m. Hit
(Acc.#, BlastX) protein e-value
Phänotyp pupale
Injektion (Penetranz)
a21 1400 1 similar to Exportin 1 XM_968740 12162 NP_723391 embargoed 2,00E-11 adult lethal (100 %)
a31 800 2
similar to eukaryotic
translation initiation factor
3, subunit 12 XM_968233 7178 NP_611604 CG10306 1,00E-65 - -
124 550 3 similar to predicted protein XM_962797 3920 NP_649293 CG12975 5,00E-22 oogenesis
a15 1350 5
113 800 6
similar to AGAP005116-
PA (coiled-coiled domain
containing?) XM_970351 8842 NP_726051 CG30390 5,00E-83 - -
similar to kynurenine
aminotransferase XM_961781 11119 (w. gap) NP_650121
CG6950,
isoform B
1,00E-
106 - -
29 800 7 GLEAN_08250 - 8250 NP_608350 CG12531 1,10 - -
a16 550 8 similar to rac XM_962956 7747 (w. gap) NP_647718 CG15877 2,00E-10
33 630 9
gene without clear
homologs
no NCBI
annotation no GLEAN
early embryonic
lethal/not fertilized
(100 %)
none, best
BLAST-X hit:
XP_001983639 3,60 legs, head (30/90 %)
Phänotyp larvale
Inj.(Penetranz) Beschreibung
larval lethal (100
%)
pupal appendages
(wings; 80 %)
pupal appendages
(wings; 80 %)
stink glands (40
%)
106 850 10 similar to calcineurin B XM_970177 7534 NP_524874 calcineurin B2 1,00E-88 - adult lethal (66 %)
a30 850 11 similar to translin
no NCBI
annotation 9885 NP_610591 translin 8,00E-66 segmentation (30 %) -
eggs accumulating in
ovarioles/elytra membranous?
membranous deleted?,
antennae shortened, legs sticky
outer rim of elytra slightly bent
upwards
several show one or more legs
or/and antennae tilted inside
the body; most of them and
some others show diff.
misshapings of the hindgut;
alterations of gena triplet: closer
to each other and closer to the
vertex triplet, the bell row
seems to be reduced/prothoracic
stink glands
seem melanotic, but in one it
was gone after co2 anaesth
and pressure; both SPM had no
offspring
anterior defects, ranging from
deletion of some thoracic or
head segments to deletion of
head and thorax and "cuticle
balls",; not dev is increased
Anhang

234
134 900 14
similar to D123 (cdc123)
gene product XM_962202 4132
a25 750 15 hypothetical LOC658140 XM_971179
142 700 16
a07 750 18
06107
(partial?)
none, best
BLAST-X hit:
XP_001660790
none, best
BLAST-X hit:
2,00E-32 - -
XP_001911083 3,20 - oogenesis (50 %)
similar to smt3 CG4494
(prot bind, ap patterning)
ribosomal protein L7e
XM_965688 3790 NP_477411 smt3
ribosomal
6,00E-39 adult lethal (100 %)
XM_969254 2951 NP_523531 protein L7 1,00E-51 adult lethal (100 %)
46 1700 19 similar to thickveins XM_965585 6474 NP_787990
82 550 20
a23 1400 21
51 1600 22
thickveins,
isoform C 9,00E-82 starved (100 %)
similar to lethal (3) 87Df
CG7620 XM_962830 12336 NP_524942 lethal (3) 87Df 1,00E-06 -
similar to CG15786
(unknown function) XM_967940 15490 ACQ57830 IP21342p 3,00E-54 - -
similar to CG14435
(protein binding; zinc ion
binding) XM_965538 11545 (partial) NP_572359 CG14435 1,00E-48 - -
larval lethal (90
%)
larval lethal (90
%)
larval lethal
(metamorph.
block I below
50%)
small ovary, adult
lethal (1 of 1/75
%)
30 1500 25
similar to CG17593
(coiled-coil domain
containing 47) XM_963528 5820 NP_608786 CG17593 2,00E-98 - adult lethal (75 %)
larval lethal (100
111 1250 26 similar to Bmsqd-2 XM_971104 928 CAA44504 hrp40.2 2,00E-78 adult lethal (100 %) %)
118 450 27
a26 1400 30
a13 1450 31
GLEAN_8888 (low
similarity to mammalian
dedicator of cytokinesis 3)
no NCBI
annotation 8888
similar to putative
accessory gland protein XM_971100 4988
none, best
BLAST-X hit:
XP_001493405
none, best
BLAST-X hit:
0,84 - -
ABG01786 3,00E-06 - -
similar to CG10222
(nucleotide binding, fct
unknown) XM_970185 2915 NP_648641 CG10222 5,00E-47 adult lethal (100 %)
128 550 32 similar to growl CG14648 XM_961388 12407 (w. gap) NP_730830 growl, isoform B 0,007 - -
22 900 33
similar to Cuticular protein
66D XM_001816297 8767 NP_729400
cuticular protein
66D 5,00E-08 - -
larval lethal (78
%)
1 held egg, 2 WT? (scope: WT)
no Pupation, even at 12 dai; 7
died early, 1 as late larva;
larvae have through shining
cuticles; larval epidermal GFP
expr seems to be reduced
very small ovary
Anhang

235
112 500 35
139 1100 36
123 900 38
88 1800 39
62 1300 40
138 800 41
similar to CG14959 (chitin
binding) XM_967188 9887 (w. gaps) NP_995986
CG14959,
isoform C 4,00E-40 - -
similar to GA21389
(copper binding,
cytochrom c oxidase
assembly?) XM_964262 12108 NP_608884 CG8885 1,00E-85 starved (100 %)
similar to succinate
dehydrogenase XM_967320 992 (w. gap) NP_650047 CG6666 3,00E-27 starved (100 %)
similar to heterogeneous
nuclear ribonucleoprotein
U-like 1 XM_962401 3021 ABV82195 GH01011p 2,00E-06
metamorphosis
block II (100 %)
larval lethal (90
%)
early embryonic
lethal/not fertilized
(100 %) other (100 %)
similar to glucuronyltransferase
I XM_969551 7027 NP_726910 GlcAT-I 2,00E-38 bristle pattern (50 %)
similar to X box binding
protein-1 XM_968587 12878 AAL13348 GH09250p 0.002
67 1700 43 similar to nuclear fallout XM_969969 3516 NP_001034006
a03 450 44
66 1600 45
127 700 47
83 1500 48
GLEAN (low similarity to
CG12531, amino acid
transmembrane
transporter)
similar to Protein
phosphatase XM_968453
adult lethal, small
ovary (60/75 %)
nuclear fallout,
isoform F 7,00E-40 head (30 %) -
no NCBI
annotation 8250 NP_608350 CG12531 0.57 - -
5366
(incomplete?) NP_476805 microtubule star
similar to AGAP012549
(osiris 19) XM_964122 12822 AAT94470 RE01054p 2,00E-28
similar to ADP ribosylation
factor 79F XM_963294 12647 NP_476955
5,00E-
164 adult lethal (100 %)
mixed embryonic
lethal (30 + 30 %) -
ADP ribosylation
factor 79F 2,00E-99 adult lethal (100 %)
91 1600 49 similar to RAS XM_963733 14613 NP_730950 rheb, isoform A 9,00E-56
47 1600 51
78 1700 53
114 650 55
similar to AGAP006173-
PA XM_962354 12411 NP_610165 CG10465 5,00E-43
mixed embryonic
lethal (20 + 40 %)
adult lethal/starved (87
%)
similar to smooth muscle
caldesmon XM_967986 6147 (w gap) NP_648781 CG12301
ubiquitin
1,00E-18 adult lethal (100 %)
similar to ubiquitin-
conjugating
conjugating enzyme E2I XM_966712 15328 NP_477414 enzyme 10 9,00E-60 small ovary (100 %)
pupal appendages
(wings; 90 %)
larval lethal (68
%)
larval lethal (94
%)
larval lethal (100
%)
necrotic
processes (90 %)
metamorphosis
block I (90 %)
larval lethal (89
%)
adult lethal (100
%)
larvae fail to pupate and die as
prepupa w pupal features
(muscle, eyes)
gfp is downreg everywhere
apart from the brain
bristle arrangment defects
dorsal/pupal lethal, elytrae
misshaped, look like burst in
strong phenotypes
3xsmall ovaries without growing
Oozytes
antenna bristle missing, some
with vertex and gena
abnormalties
necrotic (?) processes at the
dorsal midline (heart?)
delayed pupation (18 dai still 3
larvae alive)? Died as L7 (21
dai all dead) without pupal
features
Anhang

236
77 1500 57
gene without homologs
(UTR?)
no NCBI
annotation no GLEAN no BLAST-X hit - - - -
54 1300 58 similar to gp150 protein XM_963069 1743 AAM11421 SD01674p 8,00E-07 - -
73 900 59
similar to growth
hormone-inducible
transmembrane protein,
transcript variant 2 XM_971009 13110 NP_572681 CG2076 1,00E-70 - -
44 450 61
similar to CG32479
(ubiquitin thiolesterase) XM_967104 45 NP_728554
none, best
BLAST-X hit:
XP_001689324
CG32479 2,00E-39 - -
a32 600 63 similar to mCG129107 XM_969313 5738 (partial) (Anopheles) 1,00E-09 - -
98 1600 64
similar to GA20229 (Sof1?
snorna assoc. prot?) XM_969695 707 NP_648767 CG7275 2,00E-91 starved (100 %)
40 1600 65 similar to tetraspanin 97e XM_963485 4558 NP_524524 tetraspanin 97E 1,00E-67 - -
metamorphosis
block II (90 %)
similar to signal peptidase
spase 18/21-
larval lethal (100
103 700 67 18 kDa subunit
similar to apolipophorin-III
XM_961787 179 NP_649676 subunit 8,00E-81 adult lethal (100 %) %)
a08 650 69
isoform 2
XM_970691 15373 NP_001097539 Ank2, isoform K 0.30 - -
95 600 70
68 1400 71
72 600 72
similar to AGAP001229
(similar to Dynein light
chain 90F) XM_968380 9745 NP_477356
similar to pentatricopeptide
repeat domain 2 (evtl
mitochondrial RNA
binding) XM_961818 9300
dynein light
chain 90F 8,00E-44 small ovary (100 %)
none, best
BLAST-X hit:
XP_001946785
(Acyrthosiphon) 6,00E-74 - -
similar to CG5112 (fatty
acid amide hydrolase
activity; carbon-nitrogen
ligase activity) XM_962350 5582 NP_651400 CG5112 3,00E-27 adult lethal (80 %) -
pupal appendages(wings),
pupal
head; adult wings;
small ovary
(60/100/40 %)
7 died early, 21dai: 3 are dying
as early prepupae, rest died at
this stage or as L7; 24 dai still 2
praepupae alive --> prepupal
block! animals finally died
wings shortened, strange
antennae/deranged wings, not
properly closed elytra/ovaries
very reduced/without germ
cells?
Anhang

237
102 1400 73
24 1700 76
17 850 78
105 1100 79
similar to MGC89587
protein (unknown
function) XM_965319 12928 NP_610851 CG12765 3,00E-08 - -
similar to AGAP002501-
PA (evtl Protein
phosphatase 4 regulatory
subunit 2-related protein) XM_001807941 8382 NP_727427
similar to thioredoxin-like
protein XM_962894 15376
none because
of bad seq rct
similar to lipid storage
droplets surface-binding
protein 1 XM_971027 8057 NP_732904
protein
phosphatase 4
regulatory
subunit 2related
protein,
isoform A 8,00E-46 -
lipid storage
droplet-1 2,00E-15 adult lethal (100 %)
pupal musculature
(100 %)
early embryonic
lethal/not fertilized
(100 %) adult legs (66 %)
35 480 80 hypothetical LOC660532 XM_971256 2718 no BLAST-X hit - - -
a05 450 82
similar to putative
nucleoside diphosphate
kinase
57 1300 85 GLEAN_12525+12526
XM_962410 2492 NP_476761
no NCBI
annotation 12525+12526
a01 650 87 ATP-citrate synthase XM_001808289 15096 NP_001137674
2 550 88
similar to electrontransfer-flavoprotein
beta
polypeptide XM_965164.2| 8707
31 900 89 similar to Histone H3.3B XM_970796 5398 NP_038576
131 1000 90 similar to SET XM_001812881
abnormal wing
discs 7,00E-30
none, best
BLAST-X hit:
XP_001949547 2,00E-11 -
ATP citrate
lyase, isoform C 2,00E-47 -
none because
of bad seq rct -
early embryonic
histone cluster
lethal/not fertilized
1, H3f 4,00E-67 (100 %)
12877 (w.
gaps) NP_650438 Set 1,00E-48 small ovary (100 %)
larval lethal (100
%)
early embryonic
lethal/not fertilized (70
%) adult lethal (75 %)
37 1600 93 similar to cyclophilin XM_966143.1 12378 NP_611113 CG7747 1,00E-94 - -
42 1100 94
56 1000 95
similar to xpa-binding
protein 1 XM_961556 15364 (w. gap) NP_569872 CG3704 9,00E-40 adult lethal (100 %)
GLEAN_13466
(hypothetical protein)
a29 1800 96 similar to Arc-p34 XM_001809897
no NCBI
annotation 13466 NP_725169 CG30051 2,00E-38 - -
6545 (6546
partial) NP_610033 Arc-p34
2,00E-
136 adult lethal (100 %)
small ovary (75
%)
larval lethal (95
%)
metamorphosis
block III (100 %)
adult lethal,
cuticle (60/100 %)
larval lethal (100
%)
larval lethal (100
%)
larval lethal (96
%)
1 of the longitud is missing; 6 of
the pupae did not completely
hatch from the larval cuticle
distal claws are shortened
30 % did develop embryonic
tissue
4x very small, deg ovaries
50% died with black head
slightly darker color, bit irregular
surface of elytra
1x no growing Oozytes, 1x just
4 ovarioles at one, no at the
other half-ovary, 2x deg
Oozytes in oviduct
Anhang

238
43 1000 99 similar to Rab-protein 1 XM_970057 09965 (partial) NP_732610 Rab-protein 1 5,00E-41 adult lethal (100 %)
ribosomal protein L31e
ribosomal
protein L31,
a06 400 100
XM_969233 8311 NP_610503 isoform B 2,00E-42 adult lethal (100 %)
9 1800 101
similar to HIF prolyl
hydroxylase XM_963205
none because
of bad seq rct mid embryonic lethal
80 500 102 similar to AGAP001220 XM_965249 2298 NP_651664 Sirt7 0.005 - -
21 1100 104 similar to CG10264 XM_967867 13404 NP_650518 CG10264 4,00E-57 - -
a28 650 106
prob. in mitochondrial
genome, unknown gene
63 600 107 GLEAN_01054
no NCBI
annotation 4368
no NCBI
annotation
1054 (w. gap)
16006 (partial) NP_524526
none, best
BLAST-X hit:
CAM36311
(Thermobia) 3,00E-12 - -
spatzle, isoform
A 1,00E-04 - -
a10 750 108 similar to apolipoprotein D XM_965938 15563 NP_523727 glial lazarillo 2,00E-10 - -
a04 450 110
glucose-6-phosphate
dehydrogenase
XM_969003 13648 AAB02801
a11 1100 112 similar to GLT8D3 protein XM_964705 12364 (w. gap) NP_001097911 CG9996
28 1700 116
135 1050 117
a22 1700 118
a02 350 119
1 650 120
similar to CG33936 (zinkfinger)
XM_970938 4368 NP_001027161
glucose-6phosphate1dehydrogenase
2,00E-53 - -
1,00E-
102 - -
CG33936,
isoform B 3,00E-49 - -
PREDICTED: Tribolium
castaneum hypothetical
LOC661204 XM_001813911 7458 NP_001097122 lemming 3,00E-41 small ovary (100 %)
Tribolium castaneum Rabprotein
14 NM_001160311 13891 (w gap) NP_788057
Rab-protein 14,
isoform C
3,00E-
103
early embryonic
lethal/not fertilized (95
%) -
similar to CG6770
(involved in oxidative
stress; DNA-binding
nuclear protein p8?) XM_961771 6610 NP_609539 CG6770 2,00E-24 - -
PREDICTED: Tribolium
castaneum misc_RNA XR_043115 182 NP_572576
lethal (1)
G0232, isoform
A 1,00E-05
strong patterning
defect (50 %) -
larval lethal (100
%)
larval lethal (100
%)
larval lethal (70
%; 40%
metamorphosis
block I)
larval lethal (100
%)
metamorph block I, most (70%)
died as late L7 without pupal
features, but ca. 40% of them
very late (ca. 30 dai) until then
they were not able to walk, but
trembled with their legs.
1/2 very small (other half prep
fail), 3x no growing Oozytes,
deg egg-material in oviduct
cuticle balls w. gut, weaker
phenotypes prob. background
Anhang

Anhang
7. Definition der im Pilot-Screen zu dokumentierenden Phänoty-
pen
Angegeben sind sowohl die im Pilot-Screen angesetzten Definitionen (P), als auch
die für den Hauptscreen vorgeschlagenen (H), sofern sich diese unterscheiden.
Phänotypkategorie Definition
larval letal > 50 % der injizierten Tiere sterben in larvalen Stadien
Metamorphose Block I
(Eintritt in die Metamorphose)
Metamorphose Block II
(Verpuppung)
Metamorphose Block III
(Ecdysis)
(H) > 50 % der Tiere, die die Injektion überlebten durchlaufen
zusätzliche oder verlängerte Larvenstadien
(P) > 50 % der Tiere durchlaufen zusätzliche oder verlängerte
Larvenstadien
> 50 % der Tiere, die die Injektion überlebten sterben als
Präpuppe oder unvollstänige Puppe
> 50 % der Tiere, die die Injektion überlebten sterben als
Puppe oder durchlaufen eine unvollständige Ecdysis
vorzeitige Metamorphose > 50 % der Tiere, die die Injektion überlebten treten frühzeitig
in die Metamorphose ein und führen zu deutlich kleineren
Puppen oder Adulten
adult letal/kachektisch > 50 % der Tiere, die die Injektion überlebten sterben als
Adulte oder zeigen „leere“ Abdomina
Oogenese > 50 % der analysierten Tiere einer Injektion mit reduzierter
Eimenge zeigen ein verkleinertes Ovar
(P) larvaler Screen-Teil: > 50 % der Einzelverpaarungen
zeigen reduzierte Eiproduktion und davon > 50 % keinen „held
egg“-Phänotyp
Ovaratrophie > 50 % der analysierten Tiere einer Injektion mit reduzierter
früh embryonal letal / nicht
entwickelt / unbefruchtet
Eimenge zeigen keinen „held egg“-Phänotyp
(P) larvaler Screen-Teil: > 50 % der Einzelverpaarungen
zeigen reduzierte Eiproduktion und davon > 50 % ein verklei-
nertes Ovar
min. 50 % der Eier zeigen keine Kutikula und kein embryona-
les Gewebe
meso-embryonal letal min. 50 % der Eier zeigen keine Kutikula aber embryonales
Gewebe
239

Anhang
gemischt embryonal letal von min 50% der Eier zeigt ein Teil keine Kutikula und kein
240
embryonales Gewebe, ein Teil keine Kutikula aber embryona-
les Gewebe und evtl. ein weiterer Teil Kutikulareste, keine
Kategorie erreicht aber für sich genommen > 50 %
Eiform oder Eigröße min. 50 % der Eier zeigen Veränderungen der Eiform oder der
Eigröße
Allgemeiner Muskeldefekt min. 50 % der Larven/Embryonen zeigen Defekte von Teilen
oder der gesamten Rumpfmuskulatur aber keinen Defekt der
Kutikula
Beinmuskulaturdefekt min. 50 % der Larven/Embryonen zeigen Defekte der Bein-
muskulatur bzw. der thorakalen oder ventralen abdominalen
Muskulatur
Segmentierungsdefekt min. 30 % (P) bzw. 50 % (H) der Larven (Kutikulae) zeigen
Veränderungen der Segmentzahl, -anordnung oder der
Segmentgrenzen
Borstenmusterdefekt min. 30 % (P) bzw. 50 % (H) der Larven (Kutikulae) zeigen
Veränderungen der Borstenanordnung des Rumpfes
starker Musterbildungsdefekt min. 30 % (P) bzw. 50 % (H) der Eier (Kutikulae) enthalten
Reste von Kutikula ohne oder nur mit rudimentären Anzeichen
von Segmentierung
larvaler Kopfdefekt min. 30 % (P) bzw. 50 % (H) der Larven (Kutikulae) zeigen
Veränderungen der Kopfkapsel, der Kopfborsten oder der
Mundwerkzeuge
larvaler Beindefekt min. 30 % (P) bzw. 50 % (H) der Larven (Kutikulae) zeigen
Veränderungen der Beine
pupaler Kopfdefekt > 25 % (P) bzw. > 50 % (H) der verpuppten Tiere zeigen
Veränderungen der pupalen Kopfmorphologie
pupaler Flügeldefekt > 25 % (P) bzw. > 50 % (H) der verpuppten Tiere zeigen
Veränderungen der pupalen Flügel
Defekt pupaler Beine > 25 % (P) bzw. > 50 % (H) der verpuppten Tiere zeigen
Veränderungen der pupalen Beine
pupaler Torsodefekt > 25 % (P) bzw. > 50 % (H) der verpuppten Tiere zeigen
Veränderungen der pupalen Morphologie an Thorax oder
Abdomen

Anhang
Defekt der Thoraxmuskulatur > 25 % (P) bzw. > 50 % (H) der verpuppten Tiere zeigen
Veränderungen der GFP-positiven Thoraxmuskulatur
adulter Flügeldefekt > 25 % (P) bzw. > 50 % (H) der verpuppten Tiere zeigen
Veränderungen der adulten Flügel
(H) ... zeigten aber zuvor keine Flügeldefekte in pupalen
Stadien
Adulter Beindefekt > 25 % (P) bzw. > 50 % (H) der überlebenden Tiere zeigen
Veränderungen der adulten Beine
(H) ... zeigten aber zuvor keine Beindefekte in pupalen Sta-
dien
Adulter Kopfdefekt > 25 % (P) bzw. > 50 % (H) der überlebenden Tiere zeigen
Veränderungen der adulten Kopfmorphologie
(H) ... zeigten aber zuvor keine Kopfdefekte in pupalen Sta-
dien
Adulter Torsodefekt > 25 % (P) bzw. > 50 % (H) der überlebenden Tiere zeigen
Veränderungen der adulten Morphologie an Thorax oder
Abdomen
(H) ... zeigten aber zuvor keine solchen Defekte in pupalen
Stadien
nekrotisches Gewebe > 25 % (P) bzw. > 50 % (H) der überlebenden Tiere zeigen
dunkle, möglicherweise abgestorbene Gewebebereiche
Dieser Befund könnte auch auf verfrühte Kutikula-
Melanisierung in einzelnen Arealen hinweisen.
Stinkdrüsendefekt > 25 % (P) bzw. > 50 % (H) der überlebenden Tiere zeigen
Veränderungen der Stinkdrüsen
anderer Defekt > 25 % der Tiere zeigen einen anderen interessanten Phäno-
typ
241

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