Grundstudium Biologie Grundkurs V
Grundstudium Biologie Grundkurs V
Grundstudium Biologie Grundkurs V
Sie wollen auch ein ePaper? Erhöhen Sie die Reichweite Ihrer Titel.
YUMPU macht aus Druck-PDFs automatisch weboptimierte ePaper, die Google liebt.
<strong>Grundstudium</strong> <strong>Biologie</strong><br />
<strong>Grundkurs</strong> V<br />
Sommersemester 2004<br />
Teil Mikrobiologie<br />
Allgemeines und allgemeine Vorschriften (S. 3)<br />
Kursthemen:<br />
I. Anreicherungskulturen, Sterilisationsverfahren (S. 4 - 6)<br />
II. Anreicherungskulturen (S. 7 - 11)<br />
III. Auswertung der Anreicherungskulturen, Reinkulturen, (S. 12 - 16)<br />
Anaerobentechnik, steriles Arbeiten,<br />
mikroskopische Untersuchung von Bakterien<br />
IV. Identifizierung von Bakterien, Morphologie, Cytologie, (S. 17 - 22)<br />
spezifische Stoffwechselleistungen.<br />
V. Hemmung des Wachstums und Abtötung (S. 23 - 26)<br />
VI. Wachstum (S. 27 - 29)<br />
Anhang (ab S. 30 )<br />
2
Allgemeines<br />
Ziel dieses Praktikumteils ist es, die Studierenden der <strong>Biologie</strong> mit ausgewählten Gruppen von<br />
Bakterien und ihren Aktivitäten sowie mit einigen Arbeitstechniken der Mikrobiologie vertraut zu<br />
machen. Für die erfolgreiche Teilnahme wird der Stoff der einführenden Grundvorlesung in Mikrobiologie<br />
empfohlen.<br />
Über Beobachtungen, Versuchsablauf und die Ergebnisse soll von den einzelnen Teilnehmern ein<br />
Protokoll angefertigt werden. Das Protokollheft muss zu jedem Praktikumstag mitgebracht und<br />
gegebenenfalls dem Praktikumsleiter vorgelegt werden.<br />
Allgemeine Arbeitsvorschriften<br />
Zu Beginn des Praktikums werden Sie über die relevanten Vorschriften der Gefahrenstoffverordnung<br />
und Sicherheitsvorschriften belehrt.<br />
Aus Gründen der Hygiene und Arbeitssicherheit ist im Praktikumsraum Essen, Trinken und Rauchen<br />
strikt untersagt. Aus eigenem Interesse sollte ein Schutzkittel getragen werden. Zum Pipettieren<br />
müssen grundsätzlich Pipettierhilfen verwendet werden, denn Pipettieren mit dem Mund ist<br />
nicht statthaft. Nach dem Arbeiten sollen die Hände und die Tischflächen mit einer Desinfektionslösung<br />
desinfiziert werden.<br />
Bakterien werden so gehandhabt, dass sie sich nur in abgeschlossenen Gefäßen befinden. Impfösen,<br />
Impfnadeln und Drigalskispatel werden nach Berührung mit Standortmaterial oder Anreicherungskulturen<br />
abgeflammt. Gebrauchte Pipetten nicht auf den Tisch, sondern in die Ständer und<br />
nach dem Gebrauch in die mit Desinfektionslösung gefüllten Behälter stellen. Verunreinigungen<br />
des Arbeitsbereichs müssen sofort mit einem Desinfektionsmittel aufgewischt werden. Desinfizieren<br />
Sie bei Kontamination und immer nach dem Arbeiten die Hände bzw. andere kontaminierte<br />
Körperteile.<br />
Alle verarbeiteten Kulturgefäße und sonstige Ansätze werden von den Teilnehmern mit Versuchsnummer,<br />
Datum, Gruppennummer und anderen Kurzbezeichnungen beschriftet.<br />
Mikroskope, Wasserbäder und andere Geräte sowie Glasgeräte sorgfältig behandeln!<br />
Für Abfälle stehen Behälter zur Verfügung. Gebrauchte Petrischalen mit Kulturen werden in Metalleimern<br />
mit Plastiksäcken gesammelt. Gebrauchte Glasgefäße werden in Plastikschüsseln gesammelt.<br />
In die auf dem Fußboden stehenden Plastikeimer werden benutzte Zellstofftücher, Abstrichtupfer,<br />
Papier und Watte gegeben. Alle Pipettengefäße werden am Ende des Tisches zusammengestellt.<br />
Sämtliche Glasabfälle in den dafür vorgesehenen Behälter tun.<br />
Am Ende des Praktikums hinterlassen Sie bitte Ihren Arbeitsplatz aufgeräumt und mit Desinfektionsmittel<br />
gereinigt. Die Bunsenbrenner werden gelöscht und die Gashähne geschlossen. Die Mikroskope<br />
werden ausgeschaltet, Objektträger entfernt und Objektiv und Objekttisch sorgfältig mit<br />
einem Linsentuch gereinigt, am Objektivrevolver wird das kleine Objektiv eingerastet. Das Elektrokabel<br />
wird aufgerollt und am Okularteil aufgehängt.<br />
.<br />
3
I. KURS: ANREICHERUNGSKULTUREN;<br />
STERILISATIONSVERFAHREN<br />
Wie unter allen Lebewesen, so gibt es auch unter den Mikroorganismen anspruchsvolle und weniger<br />
anspruchsvolle Formen, - Spezialisten und Organismen mit weniger ausgeprägten Eigenschaften.<br />
Entsprechend lassen sich Mikroorganismen durch die Wahl der Kulturmethoden selektiv anreichern.<br />
Anreicherungskulturen dienen zur Gewinnung von Reinkulturen. Das Vorliegen von<br />
Reinkulturen aber ist im allgemeinen die grundlegende Voraussetzung für wissenschaftliche Untersuchungen<br />
an Mikroorganismen sowie für die medizinische, Lebensmittel-mikrobiologische<br />
und ökologische Diagnostik.<br />
Da Mikroorganismen definitionsgemäß < 1mm groß sind, lassen sie sich im allgemeinen erst dann<br />
feststellen, wenn sie bereits in größeren Mengen vorliegen. Für die Haltung von Reinkulturen ist<br />
es deshalb notwendig, dass rechtzeitig der Befall mit Fremdkeimen (Kontaminanten) verhindert<br />
wird. Hierzu sind sterile Arbeitstechniken erforderlich, die sowohl die Sterilisation der Nährmedien<br />
und der für die Kultur erforderlichen Gerätschaften als auch die Technik der Weiterführung<br />
von Reinkulturen (Umfüllen von Nährmedien und deren Beimpfung) umfassen.<br />
Der erste Kurstag soll die Studierenden mit grundlegenden Techniken des sterilen Arbeitens vertraut<br />
machen. Über geeignete Versuche soll verdeutlicht werden, weshalb bestimmte Sterilisationsbedingungen<br />
einzuhalten sind (z. B. Unterschiede zwischen Sterilisation durch trockene oder<br />
feuchte Hitze, Wahl genügend hoher Sterilisationstemperaturen). Darüber hinaus sollen erste Anreicherungskulturen<br />
auf der Grundlage relativ einfacher Selektionskriterien angesetzt werden.<br />
(Am 2. Kurstag werden dann Stoffwechselspezialisten angereichert).<br />
1. Ansetzen des Nährmediums GPH<br />
Versuch I. 1<br />
Das Medium “Glucose-Pepton-Hefeextrakt” (GPH, siehe Anhang) ist ein komplexes Nährmedi-<br />
um, das die Nährstoffansprüche einer Vielzahl an Bakterien erfüllt.<br />
• Von dem Nährmedium GPH setzt jede Gruppe ein Volumen von 500 ml an<br />
• nach dem Einstellen des pH-Wertes werden 100 ml davon (vor der Zugabe von Agar-Agar) in<br />
300 ml Erlenmeyerkolben abgefüllt (zur späteren Verwendung als Flüssigmedium),<br />
• die verbleibenden 400 ml werden in 500 ml Erlenmeyerkolben abgefüllt und mit der angege-<br />
benen Menge an Agar-Agar versetzt ( zur späteren Verwendung als Nähragar )<br />
• anschließend werden die Medien 15 - 20 min im Autoklaven sterilisiert<br />
• nach dem Abkühlen auf ca 50 °C werden mit dem GPH-Agar-Medium Platten (in die Unter-<br />
schale der Petrischale) unter Einhaltung steriler Bedingungen gegossen.<br />
• Die Flüssigmedien (100 ml) werden für anschließende Sterilisationsversuche benötigt.<br />
2. Sterilisationsverfahren<br />
Die Anwendung der gebräuchlichen Sterilisationsverfahren ist durch die Art des Sterilisiergutes<br />
bestimmt. Während temperaturresistente Gerätschaften (z. B. aus Glas oder Metall) bei trockner<br />
Hitze im Bereich um 180 °C sterilisierbar sind, können hitzelabile Materialien (Flüssigkeiten,<br />
Plastikmaterialien) bei mäßiger Hitze, mit Hilfe von chemischen Agenzien, durch Filtration oder<br />
durch kurzwellige Strahlung sterilisiert werden. Flüssigkeiten werden im Labor bevorzugt bei<br />
feuchter Hitze (Kochen, Autoklavieren) sterilisiert. Beim Kochen unter Normaldruck können maximal<br />
bis 100 °C erreicht werden. Diese Temperatur reicht häufig nicht aus, um hitzeresistente<br />
4
5<br />
Formen (z. B. Sporen) abzutöten. Deshalb sollte das Sterilisiergut nach 30 minütigem Aufkochen<br />
und einer 4 stündigen Standphase bei Raumtemperatur (Sporen keimen dann zu hitzelabilen vegetativen<br />
Zellen aus) ein zweites Mal gekocht werden (fraktionierte Sterilisation = Tyndallisation).<br />
Gebräuchlicher ist es jedoch, Flüssigkeiten im Dampfdrucktopf (Autoklav) unter gespanntem<br />
Dampf bei höheren Temperaturen zu sterilisieren (2 atm = 202,65 kPa ; 121 °C).<br />
Versuch I. 2<br />
Zur Überprüfung der Wirksamkeit üblicher Sterilisationsverfahren wird je eine Spatelspitze Spo-<br />
renerde (reife Komposterde) in fünf Reagenzgläser gegeben. Die Reagenzgläser werden mit Kap-<br />
pen verschlossen und beschriftet (Datum, Versuch, Gruppen-Nr., Röhrchen-Nr. ). Je ein Reagenz-<br />
glas wird anschließend<br />
• bei Raumtemperatur gehalten (Kontrolle, Rö. Nr. 1 )<br />
• 2 Minuten bei 180 °C im Heißluftsterilisator erhitzt ( Rö. Nr. 2 )<br />
• 30 Minuten bei 180 °C im Heißluftsterilisator erhitzt ( Rö. Nr. 3 )<br />
• 30 Minuten im Dampftopf gekocht ( Rö. Nr. 4 )<br />
• 15 Minuten im Autoklaven bei 2 atm gehalten ( Rö. Nr. 5 ).<br />
Nach dem Abkühlen werden die Reagenzgläser steril mit je 8 ml des autoklavierten GPH-<br />
Flüssigmediums versetzt ( von AssistentInnen) und bei 30 °C bebrütet.<br />
3. Luftkeimplatten<br />
Die Luft enthält feine Wassertröpfchen oder kleine Partikeln als Schwebestoffe, an die Bakterien<br />
oder Pilzsporen angeheftet sein können. Die Zusammensetzung solcher in der Luft enthaltenen<br />
Populationen wird durch den Grad der Luftfeuchtigkeit, die Temperatur, Art und Intensität der<br />
Strahlung oder auch durch spezifische Keimquellen (z.B. antibiotikaresistente Bakterien in Krankenhäusern)<br />
bestimmt. Bei niedrigem Feuchtigkeitsgehalt der Luft und intensiver Sonnenstrahlung<br />
bleiben nur wenige Organismen vermehrungsfähig. Viele dieser Bakterien sind pigmentiert,<br />
bilden Sporen oder haben einen hohen GC-Gehalt der DNA. Auf Luftplatten findet man häufig<br />
Vertreter der Gattungen Micrococcus, Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia, Streptomyces<br />
und die Hefe Rhodutorula.<br />
Versuch I. 3<br />
Material: Für die Anreicherung von Keimen aus der Luft verwenden wir Platten (Petrischalen) mit<br />
GPH- und MP-Agar (siehe Anhang). Jede Gruppe gießt oder erhält je eine Platte mit einem der<br />
beiden Nährböden.<br />
Durchführung:<br />
An einem vom Kursleiter angegebenen Standort werden die Petrischalen für 30 min mit abgeho-<br />
benem Deckels exponiert. Die auf der Unterschale außen beschrifteten Platten (Gruppen-Nr, Da-<br />
tum, Standort) werden bei 30°C bebrütet.
4. Isolierung von Bakterien und Pilzen aus Wasserproben<br />
Auch im Wasser kommen freilebende Bakterien und Pilze vor. Je nach Reinheitsgrad des Wassers<br />
kommen zahlen- und formenmäßig mehr oder weniger viele Mikroorganismen vor. Um einen<br />
Eindruck darüber zu gewinnen, werden Wasserproben von verschiedenen Standorten überprüft.<br />
Dazu werden die Proben durch Filtration angereichert.<br />
Versuch I. 4<br />
Material: Wasserproben (gerade Tisch-Reihen: Trinkwasser ; ungerade Reihen : Teichwasser<br />
GPH-Agarplatten, Filtrationsgerät ( je 1 für Trink- und für Teichwasser ), Filter, Pinzette.<br />
Durchführung:<br />
Die Wasserproben (jeweils 100 ml/Gruppe) werden durch Bakterien-dichte Membranfilter filtriert.<br />
Anschließend werden die Membranfilter mit einer sterilen Pinzette mit der Unterseite nach<br />
unten auf eine GPH-Agarplatte gelegt. Die Agarplatten werden bei 30°C im Brutraum bebrütet.<br />
Isolierung von Sporenbildnern<br />
Die Bildung hitzeresistenter Endosporen ist ein charakteristisches Merkmal der Gattungen Bacillus<br />
(aerob) und Clostridium (anaerob). Bacillen und Clostridien sind Gram-positive Eubakterien,<br />
die verschiedene organische C-Quellen (wie z.B. Zucker) verwerten können. Ihre sonstigen Nährstoffansprüche<br />
können durch ein mineralisches Nährmedium gedeckt werden. Im Gegensatz zu<br />
vegetativen Zellen überdauern Endosporen das Pasteurisieren (10 min feuchte Hitze bei 80°C).<br />
Bacillus subtilis ist zur Hydrolyse von Stärke befähigt. Die Hitzeresistenz der Sporen, die Fähigkeit<br />
zur Stärkehydrolyse sowie Wachstum in Gegenwart von 7% NaCl werden als selektive<br />
Merkmale zur Anreicherung von B. subtilis ausgenützt.<br />
Für die Anreicherung saccharolytischer Clostridien ist die Einstellung anaerober Bedingungen<br />
sowie eine Versorgung der Organismen mit Stärke ausreichend.<br />
5. Aerobe Sporenbildner (Bacillus-Arten)<br />
Vers. I. 5<br />
Material: Gartenerde, Aqua dest., Reagenzglas, Kappe, Pasteurpipette, Drigalski-Spatel, Petrischale<br />
mit Stärkeagar<br />
Anreicherungsprinzip : aerob, Stärke, Selektion von Sporenbildnern<br />
Durchführung: In einem Reagenzglas wird eine Spatelspitze Gartenerde mit etwa 5 ml Aqua dest.<br />
aufgeschwemmt; das Reagenzglas wird mit einer Kappe verschlossen und im Wasserbad 10 min<br />
bei 80°C erhitzt. Anschließend wird mit einer Pasteurpipette ein Tropfen der Erdaufschwemmung<br />
auf den Stärkeagar gegeben und mit dem Drigalski-Spatel ausgestrichen. Die Agarplatten werden<br />
bei 30°C bebrütet (3-4 Tage).<br />
6. Anaerobe Sporenbildner (Clostridien-Arten)<br />
Vers. I. 6<br />
Material: Gartenerde, Kartoffel, Schraubdeckelröhrchen mit Verschlusskappe, Korkbohrer<br />
Anreicherungsprinzip : anaerob, Stärke<br />
Durchführung :<br />
Eine Spatelspitze Gartenerde wird in das Röhrchen gegeben; darüber werden Kartoffelstückchen<br />
geschichtet, die mit einem Korkbohrer aus einer Kartoffel gebohrt wurden. Anschließend wird das<br />
Röhrchen vorsichtig (Vermeidung von Turbulenzen!) mit Leitungswasser nicht ganz voll ( ca. 2<br />
cm bis zum Rand ) aufgefüllt und mit der Kappe zugeschraubt. Bebrütung bei 30 °C im Brutraum.<br />
6
II. KURS: ANREICHERUNGSKULTUREN.<br />
1. Anreicherung von anoxygenen phototrophen Purpurbakterien<br />
Nicht nur Pflanzen, sondern auch einige Bakterien, die phototrophen Bakterien, können Lichtenergie<br />
in eine chemisch verwertbare Form umwandeln und mit Hilfe dieser Energie ihren Stoffwechsel<br />
betreiben (Phototrophie). Die phototrophen Bakterien kommen bevorzugt im Süßwasser<br />
vor. Mit Ausnahme der Photosynthese bei aeroben Cyanobacterien findet bakterielle Photosynthese<br />
unter Ausschluss von Sauerstoff (anaerobe Lebensweise unter anoxischen Bedingungen)<br />
statt, denn der Photosyntheseapparat dieser Organismen wird nur unter Sauerstoffmangel synthetisiert<br />
und die Umwandlung von Lichtenergie in chemische Energie (elektrochemisches Protonenpotential,<br />
∆p) läuft im Gegensatz zu Cyanobakterien und Pflanzen ohne Freisetzung von Sauerstoff<br />
(anoxygen) ab. Alle Vertreter der phototrophen Bakterien bilden als Komponenten des Photosynthese-Apparates<br />
Bacteriochlorophylle, Carotinoide, Cytochrome, Chinone und Nicht-Häm-<br />
Eisen-Verbindungen.<br />
Die schwefelfreien Purpurbakterien können zwar photolithoautotroph (Licht als Energiequelle,<br />
anorganischer Elektronendonor, CO 2 als C-Quelle) leben, bevorzugen aber photoorganoheterotrophe<br />
(organische C-Quelle) Bedingungen. Selektive Anreicherungsbedingungen bestehen unter<br />
Ausschluss von Sauerstoff und gleichzeitiger Beleuchtung (Spektralbereich des Lichtes: ca. 400-<br />
1000 nm). Allerdings können viele Vertreter der phototrophen Bakterien bei Gegenwart von Sauerstoff<br />
auch chemotroph im Dunkeln wachsen. Sie gewinnen dann Energie über die Atmungskette.<br />
Weil zahlreiche andere Bakterien zu diesem Stoffwechseltyp befähigt sind, eignen sich chemotrophe<br />
Bedingungen weniger gut für eine selektive Anreicherung phototropher Bakterien<br />
Vers. II. 1<br />
Material:<br />
Teichwasser, eine 50 ml Schraubdeckelflasche, ein Einmal-Röhrchen ( 10 ml ) mit Verschlusskappe,<br />
Erlenmeyer-Kolben mit RÄH Nährlösung, Pasteurpipetten.<br />
Anreicherungsprinzip : anaerob, Licht, Malat<br />
Durchführung:<br />
Als Impfmaterial dient Wasser (10 ml), das dicht über dem Schlamm eines nährstoffreichen Gewässers<br />
entnommen wurde. Das Impfmaterial wird in die Schraubdeckel-Flaschen pipettiert. Anschließend<br />
werden die Flaschen luftblasenfrei mit RÄH-Medium aufgefüllt. Die Flaschen werden<br />
sodann mit den Schraubdeckeln verschlossen und zum Verbrauch des gelösten Sauerstoffs zunächst<br />
für 2-3 h im Dunkeln bei 30°C bebrütet. Dann werden die Flaschen im Lichtbrutraum mit<br />
Glühbirnen bestrahlt. Dieses Licht enthält alle Bereiche, die von Photosynthesepigmenten der<br />
Purpurbakterien absorbiert werden.<br />
Nach 3-6 Tagen wird in den Flaschen die Entwicklung bräunlich, purpurrot oder grünlich gefärbter<br />
Mischpopulationen phototropher Bakterien sichtbar.<br />
Anreicherung von Organismen aus dem biologischen Schwefelkreislauf<br />
2. Desulfurizierer<br />
Im biologischen Schwefelkreislauf wird H2S sowie elementarer Schwefel über Sulfit zu Sulfat oxidiert.<br />
Die im Verlaufe dieser Oxidation frei werdende Energie können Mikroorganismen ( z. B.<br />
Thiobacillen ) zur Fixierung von CO2 und somit für eine autotrophe Lebensweise nutzen. Sulfat<br />
kann nach Reduktion einerseits in bioorganische Schwefelverbindungen eingebaut werden (assimilatorische<br />
Sulfatreduktion). Andererseits können anaerobe Organismen (Desulfurizierer) Sulfat<br />
im Zuge einer anaeroben Atmung zu Sulfid reduzieren (dissimilatorische Sulfatreduktion). Sulfid<br />
7
8<br />
wird auch im Verlaufe des Abbaus von bioorganischen Schwefelverbindungen ( S-haltige Aminosäuren<br />
) durch Desulfuration freigesetzt. Sulfid wird über Sulfit wiederum zu Sulfat oxidiert (s.o.).<br />
Desulfurizierer sind anaerobe Organismen. Ihre Anreicherung erfordert deshalb unter Ausschluss<br />
von Sauerstoff. Dies geschieht, indem Proben aus anoxischen Zonen von Gewässern ( Schlamm )<br />
in Schraubdeckelflaschen gegeben und nach dem Auffüllen mit Nährmedium (möglichst) luftblasenfrei<br />
verschlossen werden. Nachweis der erfolgreichen Anreicherung von Desulfurizierern:<br />
H2S-Entwicklung (Geruch !) und damit verbunden: Ausfällung von schwarzem FeS.<br />
Vers. II. 2<br />
Material:<br />
Faulschlamm aus dem Botanischen Garten ( wird gestellt ); Nährmedium (frisch angesetzt !); je<br />
Gr.: 5 u. 10 ml-Pipetten mit Pipettierhilfe, 50 (oder 100) ml Schraubdeckelflasche.<br />
Selektionsprinzip: anaerob, Elektronenakzeptor: Sulfat, C- und Elektronen-Quelle: Milchsäure<br />
Durchführung :<br />
Eine Schraubdeckelflasche mit 1 ml Faulschlamm aus dem Teich des Botanischen Garten beimpfen,<br />
dann mit Nährmedium für Sulfatreduzierer ( siehe Anhang ) randvoll auffüllen und verschließen.<br />
Bebrütung bei 30°C im Kursbrutraum.<br />
Anreicherung von Organismen aus dem biologischen Stickstoffkreislauf<br />
Der biologische Stickstoffkreislauf fasst die Aktivitäten verschiedener Mikroorganismen zusammen:<br />
Ammonium - vorwiegend aus dem Abbau von Aminosäuren und Protein - wird durch Nitrifizierer<br />
unter Energiegewinn über Nitrit zu Nitrat oxidiert. Nitrat und auch Ammonium können<br />
von Pflanzen zur Deckung ihres Stickstoffbedarfs aufgenommen werden. Unter anoxischen Bedingungen<br />
wird Nitrat als Elektronenakzeptor (Nitratatmung) von einigen Bakterien zu Stickstoff<br />
(N2) reduziert (Denitrifikation) und geht damit dem Boden verloren. N2 kann jedoch durch N2bindende<br />
Bakterien fixiert und damit wieder der Biosphäre zugeführt werden.<br />
3. Nitrifizierer<br />
Die Oxidation von Ammoniak zu Nitrat wird im Boden durch zwei Gruppen chemolithoautotropher<br />
Bakterien bewirkt:<br />
1. NH 4 + + 1,5 O 2 - → NO 2 - + H 2 O + 2 H +<br />
(Nitrosomonas, Nitrosocystis, Nitrosococcus u.a.)<br />
2. NO 2 - + 0,5 O 2 → NO 3 -<br />
(Nitrobacter, Nitrocystis)<br />
NH 4 +/NH 3 entstehen bei der Mineralisierung stickstoffhaltiger Verbindungen. Durch die Oxidation<br />
dieser anorganischen Verbindungen über die Atmungsketten der genannten Organismen wird<br />
das elektrochemische Protonenpotential (∆p) aufgebaut, das für die ATP-Produktion genutzt werden<br />
kann (Chemotrophie). Ein Teil von ∆p wird auch dazu verwendet, über einen rückläufigen<br />
Elektronentransport Reduktionsäquivalente (NADH + H + ) für die Assimilation von CO 2 (Autotrophie)<br />
zu bilden. Die bei der Nitrifizierung gebildete Salpetersäure erhöht die Löslichkeit vieler<br />
Mineralien im Boden. Nitrat wird aus dem Boden leichter ausgewaschen als Ammonium-<br />
Ionen. Die Isolierung und Charakterisierung der Nitrifizierer gelang erstmals Winogradsky<br />
(1890).<br />
Selektiv für eine Anreicherung sind das rein anorganische Nährmedium und Ammoniak als Elektronendonator<br />
(Chemolithoautotrophie).
Vers. II. 3<br />
Material: Jede Gruppe erhält einen 100 ml-Erlenmeyerkolben mit 30 ml der fertigen Nährlösung<br />
für Nitrifizierer (siehe Anhang), Gartenerde.<br />
Anreicherungsprinzip : anorganisches Nährmedium, Ammoniak als Elektronendonator<br />
Durchführung:<br />
Der Kolben wird mit einer Spatelspitze Gartenerde beimpft. Vier unbeimpfte Kolben pro Kurs<br />
werden als Kontrollen geführt.<br />
4. Denitrifizierer<br />
Eine Reihe von Bakterien kann bei Sauerstoffausschluss (anoxische Bedingungen) die Elektronen<br />
über die Atmungskette auf NO 3 - übertragen und dieses schrittweise reduzieren. Nitrat wird in dieser<br />
Reaktionskette nicht assimilatorisch als Stickstoffquelle, sondern dissimilatorisch als Elektronenakzeptor<br />
in der Atmungskette benutzt.<br />
G o (kJ/Reaktion)<br />
NO 3 - + 2e - + 2H + → NO 2 - + H 2 O - 163<br />
NO 2 - + e - + H + → NO + OH - - 73<br />
NO + 2e - + 2H + → N 2 O + H 2 O - 306<br />
N 2 O + 2e - + 2H + → N 2 + H 2 O<br />
Als Stickstoffquelle dient NH 4 + oder eine Aminosäure (siehe Anhang). Selektiv für eine Anreicherung<br />
sind Anaerobiose und Nitrat als Elektronenakzeptor.<br />
Vers. II. 4<br />
Material: Jede Gruppe erhält 1 Schraubverschlussröhrchen mit 15 ml Medium und einem Durham-Röhrchen<br />
(siehe S. 20). Jede 5. Gruppe erhält ein zusätzliches Röhrchen für eine Kontrolle.<br />
Anreicherungsprinzip: anoxisch, Nitrat als Elektronenakzeptor<br />
Durchführung:<br />
Die Röhrchen werden mit einer Spatelspitze Erdprobe versetzt. Die Kontrollröhrchen bleiben unbeimpft.<br />
Die Gasbildung kann mit Hilfe des Durham-Röhrchens verfolgt werden. Die Bildung<br />
von Nitrit und die Abnahme von Nitrat wird mit Teststäbchen gemessen. Das Bakterienwachstum<br />
wird als Zunahme der Trübung registriert.<br />
Nitrat- und Nitritbestimmungen von der Kontrolle und zur Messung der Stoffwechsel-Leistung<br />
in den beimpften Röhrchen werden eine Woche später durchgeführt und protokolliert.<br />
5. Biologische Stickstoffbindung<br />
Die Fähigkeit zur biologischen Fixierung von Stickstoff (N2) ist ausschließlich auf Prokaryoten<br />
beschränkt, kommt hier aber unabhängig von der taxonomischen Zugehörigkeit bei Vertretern<br />
verschiedenster Bakteriengruppen vor. Die Reduktion von N2 wird durch den Nitrogenase-<br />
Enzymkomplex katalysiert und verläuft über folgende Reaktion:<br />
N2 + 8 H + + 8 e + 16 MgATP → 2 NH3 + H2 + 16 MgADP + 16 Pi<br />
Als Selektionskriterium zur Anreicherung dient die Abwesenheit gebundenen Stickstoffs und (für<br />
die Anreicherung von Azotobacter) aerobe Lebensweise plus Mannit als Kohlenstoff-Quelle.<br />
9
Versuch II. 5<br />
Material: Gartenerde, Mannit, K2HPO4 , pro Gruppe ein 100 ml Erlenmeyerkolben<br />
Anreicherungsprinzip : Aerob, N-Mangel, gute C-Quelle (Mannit)<br />
Durchführung:<br />
In den Erlenmeyerkolben wird in flacher Schicht Leitungswasser eingefüllt und dann mit je einer<br />
Spatelspitze Gartenerde ( wenig Material !) , Mannit und K2HPO4 versetzt.<br />
Die Proben werden bei 30 °C bebrütet.<br />
6. Anreicherung von Hefen und anderen Pilzen<br />
Sprosshefen und Hyphenpilze sind weit verbreitete Mikroorganismen mit sehr verschiedenem Organisationsgrad<br />
und unterschiedlicher taxonomischer Zugehörigkeit. Die meisten Hefen und Pilze<br />
können auf einem schwach sauren (pH 6) Nährboden mit einer zuckerhaltigen Kohlenstoffquelle<br />
wachsen. Zur Unterdrückung des Bakterienwachstums wird das Antibiotikum Chloramphenicol<br />
zugesetzt, das die eubakterielle Proteinsynthese hemmt.<br />
Vers. II. 6<br />
Material:<br />
a) eine Aufschwemmung von käuflicher Bäckerhefe in sterilem Leitungswasser<br />
b) Aufschwemmung einer Erdprobe aus einer Rebanlage in Leitungswasser<br />
Anreicherungsprinzip:<br />
Pilzagar mit Malzextrakt, aerob.<br />
Durchführung:<br />
Jede Gruppe erhält 2 fertige Nährboden-Platten (MP, siehe Anhang). Eine Platte wird mit einem<br />
Tropfen aus a), die zweite Platte mit einem Tropfen aus b) beimpft. Der Tropfen wird mit dem<br />
Drigalski-Spatel unter gleichzeitigem Drehen der Platte auf der Tischfläche über die Agar-<br />
Oberfläche verteilt. Bebrütung: 30°C im Brutraum.<br />
10
AUSWERTUNG DER ANREICHERUNGSKULTUREN<br />
Es sollen die makroskopisch erfassbaren Merkmale der angereicherten Mikroorganismen beschrieben<br />
werden.<br />
7. Luftkeimplatten<br />
Vers. II. 7<br />
Material:<br />
Luftkeimplatten von Vers. I.3, Tropfflasche (braun) mit 10%iger Wasserstoffperoxid-Lösung,<br />
Pasteurpipette, Binokular .<br />
Auswertung: Protokollieren: Zahl, Aussehen und Farbe der Kolonien. Betrachten der Kolonien<br />
mit dem Binokular. Auf eine gelbe Kolonie H 2 O 2 (10%ig) mit der Pasteurpipette auftropfen. Aus<br />
H 2 O 2 wird durch Katalase O 2 freigesetzt (Blasenbildung). 2H 2 O 2 → O 2 + 2H 2 O<br />
Luftkeimplatten zur weiteren mikroskopischen Untersuchung (3. Kurs) bei 4°C aufbewahren.<br />
8. Bakterien und Pilze aus Wasserproben<br />
Versuch II. 8<br />
Material:<br />
GPH-Agarplatten mit Anreicherungskulturen von Vers. I. 4, Binokular<br />
Auswertung:<br />
Zum Vergleich der beiden Wasserproben ( Trinkwasser/Teichwasser) werden Aussehen und Farbe<br />
der Kolonien protokolliert. Die Kolonien werden mit dem Binokular betrachtet.<br />
9. Aerobe Sporenbildner ( Bacillus-Arten )<br />
Vers. II. 9<br />
Material: Agarplatte von Vers. I.5 mit Anreicherungskultur von Bacillus spec; verdünnte Lugolsche-Lösung<br />
( 1:10, wässerig) , Pasteurpipetten.<br />
Auswertung:<br />
• Kolonien nach Form, Farbe, Konsistenz (fest, schleimig), Rand der Kolonie (glatt, gewellt),<br />
Oberfläche (glänzend, stumpf, runzelig) beschreiben.<br />
• Die Hydrolyse von Stärke wird nach Auftragen der Lugolschen-Lösung auf die Agaroberfläche<br />
(mit Pasteurpipette) durch eine farblose Zone um die Kolonien herum nachgewiesen.<br />
10. Anaerobe Sporenbildner (Clostridien-Arten)<br />
Vers. II. 10<br />
Material: wassergefülltes Schraubröhrchen mit Kartoffelstücken von Vers. I.6<br />
Auswertung :<br />
Sicht- und Geruchs-Kontrolle. Bei erfolgreicher Anreicherung: Zersetzung der Kartoffelstücke ,<br />
penetranter Geruch nach Buttersäure, Gasentwicklung.<br />
11
III. KURS: AUSWERTUNG DER ANREICHERUNGSKULTUREN,<br />
REINKULTUREN, ANAEROBENTECHNIK, STERILES ARBEITEN,<br />
MIKROSKOPISCHE UNTERSUCHUNG VON BAKTERIEN<br />
Es sollen die makroskopisch und mikroskopisch erfassbaren Merkmale der angereicherten Mikroorganismen<br />
beschrieben und Reinkulturen angelegt werden.<br />
1. Luftkeimplatten<br />
Vers. III.1<br />
Material: Luftkeimplatten von Vers. I.3, Mikroskop, Objektträger, Deckgläser, Immersionsöl,<br />
Linsenpapier, Impföse<br />
Auswertung: Zunächst erfolgt eine makroskopische Begutachtung der Platten hinsichtlich Form<br />
und Farbe der Kolonien.<br />
Mikroskopische Untersuchung:<br />
Von einer einzelnen Kolonie wird mit der Impföse etwas Material entnommen und in einem Tropfen<br />
Wasser auf einem Objektträger verrieben. Bedecken Sie die Probe mit dem Deckgläschen.<br />
Objektträger und Deckgläschen nur an den Rändern anfassen!<br />
Der Objektträger wird in den Kreuztisch des Mikroskopes so eingespannt, dass sich die Probe im<br />
Strahlengang befindet. Am Objektivrevolver wird das 10er Objektiv (10/0,25) eingestellt. Nun<br />
wird das Mikroskop für das Phasenkontrastverfahren justiert (siehe Anhang ).<br />
Nach Justierung des Mikroskopes erfolgt die Betrachtung der Zellen bei höherer Auflösung im<br />
Phasenkontrast mit dem 100er Phasenkontrast-Objektiv (100/1,25 Oil, Ph 3 ). Dazu senken Sie<br />
zunächst den Objekttisch durch Drehung (gegen den Uhrzeigersinn!) des Grobtriebes ca. 1 cm<br />
nach unten. Jetzt können Sie den unteren, beweglichen Teil des 100er Objektives nach oben in die<br />
Schutzstellung schieben und ihn durch eine Drehung gegen den Uhrzeigersinn in dieser Position<br />
arretieren. Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl auf das Deckglas unterhalb des Objektives, lösen<br />
Sie nun die Arretierung des Objektives, und bewegen Sie den Objekttisch mit dem Grobtrieb<br />
langsam (unter Beobachtung von der Seite her ) nach oben bis das Objektiv in das Immersionsöl<br />
eintaucht. Bewegen Sie von nun an den Objekttisch unter mikroskopischer Kontrolle mit dem<br />
Feintrieb langsam nach oben bis die Zellen im Bild erscheinen. Nach dem Auflegen eines Deckglases<br />
wird dieses Präparat mit dem Mikroskop (100er Phasenkontrast-Objektiv 100/Oil Ph 3) betrachtet.<br />
Gelbliche Kolonien könnten aus Zellpaketen von Micrococcus luteus bestehen. Micrococcus<br />
luteus bildet Tetraden und ist Katalase positiv.<br />
2. Aerobe Sporenbildner ( Bacillus-Arten )<br />
Vers. III.2<br />
Material: Agarplatte von Vers. I.5 mit Anreicherungskultur von Bacillus spec; Mikroskop, Ob-<br />
jektträger, Deckgläser, Immersionsöl, Linsenpapier<br />
Auswertung:<br />
Bakterien mikroskopisch untersuchen. Sporen erscheinen als stark lichtbrechende, helle Gebilde<br />
in der dunklen Sporenmutterzelle (endständig oder mittelständig, ovoid bis kugelig) oder als<br />
dunkle Vorspore in der helleren Mutterzelle.<br />
3. Anoxygene phototrophe Purpurbakterien<br />
12
Vers. III.3a<br />
Material: Mikroskop, Objektträger, Deckgläser, Immersionsöl, Linsenpapier, Impföse, Anreiche-<br />
rungskultur, Petrischalen mit RÄH-Agar, Anaerobentopf, Gasentwickler, Sauerstoffindikator<br />
Auswertung:<br />
Protokollieren Sie die Farbe der Anreicherungskultur der anoxygenen, phototrophen Bakterien<br />
(braun, grün, purpurfarben, andere Farben).<br />
Mikroskopische Untersuchung:<br />
Entnehmen Sie mit einer abgeflammten Impföse (siehe unten) einen Tropfen aus der Flaschenkultur,<br />
geben diesen auf einen Objektträger und bedecken ihn mit dem Deckgläschen.<br />
Fragen: Welche Formen und Bakterien erkennen Sie in Ihrem Präparat? Bewegen sich die Zellen<br />
aktiv oder werden sie passiv durch Brown'sche Molekularbewegung oder durch Strömung hin-<br />
und herbewegt?<br />
Isolierung von Klonkulturen anoxygener phototropher Purpurbakterien<br />
Mit Hilfe des Verdünnungsausstrich-Verfahrens mit der Impföse werden aus den stark angereicherten<br />
Mischkulturen phototropher Bakterien isoliert und Reinkulturen gewonnen.<br />
Eine Impföse besteht aus einem ca. 6 cm langen Platin-Iridium-Draht (80% Pt + 20% Ir) mit einem<br />
Durchmesser von ca. 0,6 mm. Das eine Ende des Drahtes ist kreisförmig zu einer Öse gebogen.<br />
Das andere Ende ist im Spannfutter des Kollehalters fixiert (Abb. 1A).<br />
Impfösen werden stets mit dem Halter in einem Ständer stehend aufbewahrt. Die Öse soll nie in<br />
Berührung mit anderen Gegenständen oder der Tischplatte kommen. Grundsätzlich werden<br />
Impfösen vor und nach jedem Gebrauch durch Ausglühen in der Bunsenbrennerflamme sterilisiert,<br />
und zwar im Außenkegel der prasselnden, vollständig entleuchteten Flamme. Größere Mengen<br />
an Bakterienmaterial an der Öse neigen vor dem Ausglühen zum Verspritzen. Um dies zu<br />
vermeiden, wird die Öse zunächst im Innenkegel der Flamme getrocknet und dann im Außenkegel<br />
ausgeglüht (Abb. 1B).<br />
13
Verdünnungsausstrich<br />
Ziel dieses Verfahrens ist es, einzelne Zellen auf der Agaroberfläche getrennt von anderen Zellen<br />
festzulegen. Aus diesen Einzelzellen entwickeln sich Kolonien. Um Klonkulturen zu erhalten,<br />
müsste das Verfahren wiederholt werden (im Kurs nicht möglich). Form, Farbe, Rand und Oberfläche<br />
der Kolonie sind charakteristische Eigenschaften einer Bakterienkultur.<br />
Vers. III.3 b<br />
Durchführung:<br />
Durch Eintauchen der ausgeglühten und wieder abgekühlten Impföse in die Anreicherungskultur<br />
werden der Suspension Bakterien entnommen und auf dem Nähragar RÄH in der Petrischale wie<br />
folgt ausgestrichen. Dabei wird der Deckel der Petrischale mit den mittleren Fingern schützend<br />
über die Petrischale gehalten, während die beiden äußeren Finger die Petrischale festhalten(Abb.<br />
2).<br />
Impfstriche 1 - 3 werden direkt aus der Anreicherungskultur ausgestrichen (Abb. 3). Dann wird<br />
die Öse ausgeglüht. Nach dem Abkühlen werden die Impfstriche 4 -6 durch 1 -3 gezogen. Der<br />
gleiche Vorgang wird für 7- 9 und 10 - 13 wiederholt. Ein "Pflügen" des Agars ist unerwünscht<br />
und wird dadurch vermieden, dass man die Impföse möglichst flach und ohne Druck über die Agaroberfläche<br />
gleiten lässt. Es werden je 2 Platten beimpft.<br />
14
Vers. III. 3 c<br />
Anaerobentopf<br />
Durchführung :<br />
Die beimpften Petrischalen werden in einem Plattenkorb übereinander geschichtet. Der Platten-<br />
korb wird dann in den Anaerobentopf gestellt. Wegen der Kondenswasserbildung empfiehlt es<br />
sich, zuunterst eine leere Petrischale in den Plattenkorb zu stellen sowie die gefüllten Schalen mit<br />
dem Agarboden nach oben einzulegen. Dann wird der Gasentwickler in den Topf gestellt. Nach<br />
Zugabe von Aqua dest. zum Gasentwickler wird der Anaerobentopf rasch dicht verschlossen. Nun<br />
erfolgt die Entwicklung von H 2 + CO 2 . Mit Hilfe eines Katalysators im Topf wird unter Sauer-<br />
stoffverbrauch H 2 zu H 2 O oxidiert. Der Anaerobentopf wird zunächst bei 30°C im Dunkeln<br />
gehalten. Ein Teststreifen (oxidiert blau, reduziert farblos) zeigt an, wann die Atmosphäre im<br />
Topf Sauerstoff frei ist. Nun werden die Anaerobentöpfe in den Lichtbrutraum gestellt. Nach<br />
mehreren Tagen Bebrütung (30°C) im Licht werden aus den isolierten Bakterien hervorgegangene<br />
Einzelkolonien auf den Agarplatten sichtbar.<br />
4. Desulfurizierer<br />
Vers. III.4<br />
Material :<br />
Schraubdeckelflasche beimpft mit Faulschlamm von Vers. II.2<br />
Auswertung:<br />
Schwarzfärbung durch FeS , Geruchsprobe auf H2S.<br />
Vers. III.5<br />
5. Nitrifizierer<br />
Material:<br />
Kulturen von Vers. II.3, Nitrit-Nitrat-Teststäbchen, universal pH Messpapier.<br />
Auswertung:<br />
Wachstum: Zunahme der Trübung der Kultur<br />
Chemischer Nachweis: Messung des pH-Wertes, Bestimmung von Nitrit und Nitrat mit Teststäb-<br />
chen (unverdünnte Proben).<br />
15
6. Denitrifizierer<br />
Vers. III.6<br />
Material: Nitrat-Nitrit-Teststäbchen, Röhrchen mit Denitrifikanten (von Vers. II.4), Aqua dest.<br />
Messzylinder 100 ml.<br />
Auswertung:<br />
In der unbeimpften Probe (Kontrolle) sowie in der mit Erde beimpften Probe von Vers. II.4 wer-<br />
den die Bildung von Nitrit und die Abnahme von Nitrat mit den Nitrat-Nitrit-Teststäbchen ver-<br />
folgt. Die Proben werden unverdünnt verwendet. Der Konzentrationsbereich wird nach der Farb-<br />
skala auf der Packung bestimmt.<br />
Die Gasbildung (N 2 ) kann an den Gasblasen im Durham-Röhrchen verfolgt werden.<br />
Ansatz Nitrit Nitrat<br />
=====================================================================<br />
Anreicherungskultur:<br />
(7. Tag)<br />
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------<br />
unbeimpfte Kontrolle:<br />
(7. Tag)<br />
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------<br />
7. Stickstoff-Fixierer<br />
Vers. III. 7<br />
Auswertung:<br />
Aus der Anreicherungskultur ( von Vers. II.5 ) wird mit der abgeflammten Impföse schleimiges<br />
Material entnommen und mit dem Phasenkontrast mikroskopiert.<br />
Vers. III. 8<br />
Auswertung:<br />
8. Hefen und andere Pilze<br />
Die Platten mit Pilzkulturen ( von Vers. II.6 ) werden mit dem Stereomikroskop, Einzelzellen mit<br />
dem Lichtmikroskop zunächst ohne und dann mit Phasenkontrast betrachtet.<br />
Protokoll: Luftmyzel, Myzel im Nährboden, Farbe, Beschaffenheit der Kolonien, Sporen? Hefen<br />
werden in einem Tropfen Wasser suspendiert und im Lichtmikroskop mit Phasenkontrast 40 x be-<br />
trachtet. Spalthefe oder knospende Hefe, Form der Zellen, Zellstrukturen.<br />
16
IV. KURS: IDENTIFIZIERUNG VON BAKTERIEN.<br />
MORPHOLOGIE, CYTOLOGIE UND<br />
SPEZIFISCHE STOFFWECHSELLEISTUNGEN<br />
Bakterien sind aufgrund charakteristischer Eigenschaften im Rahmen der binären Nomenklatur<br />
taxonomisch klassifizierbar. Zu ihrer Beschreibung dienen Eigenschaften wie Biotop, Form der<br />
Kolonien auf Agar, Pigmentierung, Größe und Form von Einzelzellen und von Zellaggregaten,<br />
cytologische Eigenschaften, Art der Ernährung, Spektrum der Substratverwertung, spezifische<br />
Stoffwechselleistungen, Pathogenität oder serologische Spezifität der Zelloberfläche. Im Kurs lernen<br />
wir, dass die Merkmale für die Klassifizierung der Bakterien in Abhängigkeit von der Bakteriengruppe<br />
unterschiedlich angewendet werden müssen.<br />
1. Morphologie und Pigmentierung<br />
Es sollen Zellformen wie z.B. Stäbchen, Kokken, Spirillen sowie Knospungswachstum im Lichtmikroskop<br />
betrachtet werden. Dazu soll das Phasenkontrastmikroskop verwendet werden, denn<br />
Bakterien sind für die normale Durchlichtmikroskopie zu kontrastarm. Wenn die Zellform charakteristisch<br />
ist und/oder die Bakterien zusätzlich pigmentiert sind, kann in einigen Fällen bereits<br />
aufgrund dieser Merkmale eine taxonomische Zuordnung erfolgen. Meistens ist man jedoch auf<br />
weitere Eigenschaften angewiesen. Dieses verdeutlichen folgende Beispiele.<br />
Beispiel 1: In Gegenwart von Sauerstoff (aerob) wachsende, orange (Carotinoide) pigmentierte<br />
Kokken. Diese Eigenschaften erlauben eine wahrscheinliche Zuordnung zu der Gattung Micrococcus<br />
(häufige Bakterien in der Luft).<br />
Beispiel 2: Fakultativ anaerobe, rotbraun pigmentierte phototrophe Spirillen. Die Spirillenform,<br />
die Pigmentierung und die phototrophe Lebensweise erlauben eine Zuordnung zu der Gattung<br />
Rhodospirillum. Die Identifikation der Art erfordert aufwendigere Methoden, wie die Analyse des<br />
Absorptionsspektrums, der Substratverwertung oder der Feinstruktur.<br />
Beispiel 3: Fakultativ anaerobe, rotbraun pigmentierte, knospende phototrophe Bakterien. Die<br />
Merkmale Knospungswachstum und Photosynthese (rotbraune Pigmente) erlauben direkt die Bestimmung<br />
der Art Rhodomicrobium vannielii der schwefelfreien Purpurbakterien.<br />
Beispiel 4: Aerobe Stäbchen, die nicht pigmentiert sind. Hier ist man bei der Identifizierung auf<br />
weitere Merkmale (siehe unten) angewiesen.<br />
Vers. IV.1<br />
Material:<br />
• Plattenkulturen von Micrococcus luteus (Beisp. 1) Escherichia coli (Beisp. 4) und Bacillus sp.<br />
(Beisp. 4, jeweils aerob im Dunkeln gewachsen), sowie Flaschenkulturen von Rhodospirillum<br />
rubrum (Beisp. 2) und Rhodomicrobium vannielii (Beisp. 3, anaerob im Licht gewachsen)<br />
• Phasenkontrastmikroskop, Objektträger, Deckgläser, Immersionsöl Impföse, Pasteurpipetten,<br />
Pipettenhütchen<br />
Vorsicht ! Escherichia coli, Proteus mirabilis und Pseudomonas fluorescens sind in der Regel<br />
nicht pathogen. Die Arten können aber mit opportunistischen Infektionen des Menschen in<br />
Verbindung gebracht werden. Der Hautkommensale Micrococcus luteus , sowie Bacillus sp.<br />
und die phototrophen Bakterien sind ebenfalls nicht pathogen. Dennoch ist beim Umgang<br />
mit diesen Organismen in jedem Fall auf mikrobiologisch korrekte Arbeitsweise zu achten.<br />
17
Durchführung:<br />
Stellen Sie sich wie folgt die Präparate für die mikroskopische Betrachtung aller vorgegebenen<br />
Bakterien her: Geben Sie mit einer Pasteurpipette einen Tropfen Wasser auf den Objektträger.<br />
Daneben geben Sie mit der Impföse wenig Bakterienmasse von den Plattenkulturen. Verreiben<br />
Sie die Bakterien mit der Impföse homogen auf dem Objektträger. Ziehen Sie dann die Bakterien-<br />
suspension homogen in den Wassertropfen hinein. Die Impföse ist nach jedem Gebrauch auszu-<br />
glühen! Von den Flüssigkeitskulturen geben Sie 2-3 Impfösen direkt auf den Objektträger. Legen<br />
Sie dann das Deckglas auf, und mikroskopieren Sie zunächst mit dem 40er und dann mit dem<br />
100er Objektiv (mit Immersionsöl). Skizzieren Sie die jeweiligen Zellformen und notieren Sie die<br />
Pigmentierung der Ausgangskolonie.<br />
2. Cytologie<br />
Viele Bakterien sind stäbchenförmig und wenig pigmentiert (siehe Beispiel 4). Hier kann man zur<br />
Identifizierung zunächst zelluläre Strukturen nachweisen, indem man diese durch Färbung sichtbar<br />
macht. Eine für diagnostische und taxonomische Zwecke wichtige Färbe-Methode ist die<br />
"Gram-Färbung" (H. C. Gram war ein dänischer Mikrobiologe). Sie erfordert 4 Teilschritte, gefolgt<br />
von einer Gegenfärbung: 1) strukturschonende Hitzeabtötung (Fixierung) der Zellen. Färbung<br />
der gesamten Zelle in zwei Teilschritten (2 und 3) mit einem Kristallviolett-Jod Komplex als<br />
dunkelviolettem Farblack. 4) Differenzierung, d.h. selektive Entfärbung der Zellen mit Ethanol. 5)<br />
Gegenfärbung mit Fuchsin. Bei den Gram-positiven Bakterien wird durch den vielschichtigen, dickeren<br />
Peptidoglycan-Sacculus der Farblack beim Differenzierungsschritt besser in der Zelle zurückgehalten<br />
als bei den Gram-negativen Bakterien mit ihrer dünnen Peptidoglycanschicht. Grampositive<br />
Bakterien bleiben bei der Differenzierung daher dunkelviolett. Gram-negative werden<br />
entfärbt, sie werden bei einer anschließenden Gegenfärbung mit Fuchsin rot gefärbt. Damit kann<br />
man Bakterien mit Hilfe der Gram-Färbung in zwei große Gruppen einteilen, die sich anhand der<br />
Zellwandstruktur voneinander unterscheiden.<br />
Vers. IV.2<br />
Material:<br />
- Platten-Kulturen von Escherichia coli und Bacillus sp..<br />
- Färbelösung nach Gram: Kristallviolett (1:5 mit Aqua dest. verdünnt).<br />
- Lugolsche Lösung (Iod-Kaliumiodid-Lösung): 1g Jod + 2g KJ in 300 ml Aq. dest.(unverd. 1%)<br />
- Ethanol: 96%ig.<br />
- Fuchsinlösung: gesättigte, filtrierte Fuchsinlösung mit Aqua dest. 1:10 verdünnt.<br />
- Mikroskop (Hellfeldeinstellung), Objektträger, Immersionsöl, Impföse, Pasteurpipetten,<br />
- Pipettenhütchen<br />
Durchführung:<br />
Führen Sie die Gram-Färbung mit (a) Escherichia coli und (b) Bacillus sp. sowie mit einer Mi-<br />
schung von (a) und (b) wie folgt durch (die Reagenzien sind gebrauchsfertig vorgerichtet):<br />
18
19<br />
Vorbereitung der Präparate: Entfetten Sie drei Objektträger durch Spülen mit 96%igem Ethanol<br />
und Trockenreiben mit Zellstoff. Auf den Objektträger tragen Sie wie schon bei Vers. III.1 angegeben<br />
die Bakterien auf. Die Mischung von (a) und (b) stellen Sie durch homogenes Vermischen<br />
der beiden Bakterienstämme mit der Impföse auf dem Objektträger her. Für die Herstellung des<br />
Ausstrichpräparats ziehen Sie die Bakteriensuspensionen mit einem weiteren Objektträger zu einem<br />
dünnen Film (ca. 3/4 der Fläche des Objektträgers) aus (Abb. 4).<br />
Fixierung (durch Hitze): Präparat lufttrocknen und mehrmals langsam durch die leuchtende<br />
Flamme des Bunsenbrenners ziehen, ohne daß die Bakterien dabei verkohlen.<br />
Färbung: Präparat auf einer Färbebank mit Kristallviolettlösung bedecken, nach 4 min den Farbstoff<br />
in die Wanne abgießen, mit wenigen Tropfen Lugolsche-Lösung noch haftenden Farbstoff<br />
abspülen, erneut Lugolsche-Lösung auftropfen, nach 2 min die Lösung abgießen.<br />
Differenzierung: Auf den schräg gehaltenen Objektträger wenige Sekunden lang 96%iges Ethanol<br />
einwirken lassen, abtropfen lassen, restliche Farbstoffwolken mit Wasser abspülen, Präparat gut<br />
mit Wasser spülen. Vorsicht: Bei zu kurzer Einwirkungsdauer des Ethanols werden Gramnegative<br />
Bakterien nicht entfärbt; bei zu langer Einwirkungsdauer werden jedoch auch Grampositive<br />
entfärbt. Daher ist manchmal Wiederholung der Färbung notwendig.<br />
Gegenfärbung: Fuchsin-Lösung auf Präparat auftropfen, 10-15 sec einwirken lassen, gründlich<br />
mit Aqua dest. abspülen, lufttrocknen. Anschließend wird das luftgetrocknete Präparat mikroskopisch<br />
betrachtet, dazu ohne Phasenkontrast und ohne Deckglas zunächst die Objektebene<br />
mit dem 40er Trockenobjektiv einstellen, dann auf das 100er Ölimmersionsobjektiv umstellen.<br />
3. Atmungskette<br />
Manche Bakterien sind weder morphologisch noch durch Färbeverfahren voneinander zu unterscheiden.<br />
Zum Beispiel sind viele Arten der medizinisch wichtigen Pseudomonadaceae und der<br />
Enterobacteriaceae stäbchenförmig, nicht pigmentiert und Gram-negativ. Um zwischen den beiden<br />
Familien zu unterscheiden, nützt man beim sog. "Oxidase-Test" einen Unterschied in der Zusammensetzung<br />
der Atmungskette: Pseudomonaden haben Cytochrom c -Oxidase (lösliches Cytochrom<br />
c mit Cytochrom c-Oxidase) und sind somit "Oxidase-positiv", Enterobakterien dagegen<br />
sind "Oxidase-negativ". Das Vorhandensein der Cytochrom c -Oxidase wird bei atmendenden<br />
Zellen mit N,N,N'-N'-Tetramethyl-p-phenylendiamin, einem künstlichen Elektronendonator für<br />
Cytochrom c, nachgewiesen. Bei Oxidase-positiven Bakterien wird N,N,N'-N'-Tetramethyl-pphenylendiamin<br />
(farblos im reduzierten Zustand) durch Elektronenabgabe an Cytochrom c oxidiert<br />
und dadurch blau, bei den Oxidase-negativen Bakterien bleibt es farblos.
20<br />
Die Gattung Proteus gehört der biologischen Risikogruppe S2 an. Mit diesen Organismen<br />
darf nur nach vorheriger Belehrung unter Einhaltung strenger Sicherheitskriterien gearbeitet<br />
werden!<br />
Vers. IV.3<br />
Material:<br />
- Plattenkulturen von Pseudomonas fluorescens, Proteus mirabilis und Escherichia coli<br />
- Oxidase-Reagenz (N,N,N'-N'-Tetramethyl-p-phenylendiamin)<br />
- Impföse<br />
Durchführung: Tropfen Sie einen Tropfen des gebrauchsfertigen Oxidase-Reagenz direkt auf ein-<br />
zelne Kolonien von P. fluorescens P. mirabilis oder E. coli. Ablesen der Farbreaktion nach 15 sec.<br />
4. Spezifische Stoffwechselleistungen<br />
Wenn man einen Enterobakterienstamm (als Oxidase-negativ geprüft) einer bestimmten Art zuordnen<br />
will, so ist man im Rahmen der "Differentialdiagnose" auf die Testung stoffwechselphysiologischer<br />
Eigenschaften angewiesen. Dabei prüft man zunächst, ob der Stamm - wie alle Enterobakterien<br />
(im Gegensatz zu den obligat aeroben Pseudomonaden) - zur fakultativen anaeroben<br />
Vergärung von Glucose befähigt ist. Die Vergärung weiterer Zucker unter Säure- oder unter Gasbildung,<br />
die Freisetzung von H 2 S oder Indol, Harnstoffabbau, Gelatineverflüssigung oder die Acetoin-Bildung<br />
erlauben dann innerhalb der Enterobakterien die Zuordnung zu einer Art. Man<br />
prüft dabei eine größere Anzahl von spezifischen Stoffwechselleistungen, da - nach statistischer<br />
Auswertung - nur die Summe mehrerer Eigenschaften eine sichere Grundlage für die Identifizierung<br />
einer Art ist. Da bei vielen Testansätzen Farbindikatoren zum Nachweis von Säure- oder<br />
Lauge-Bildung verwendet werden, spricht man bei der Auswertung von der "Bunten Reihe" zur<br />
Differentialdiagnose der Enterobakterien-Arten. Die Bunte Reihe wird gut deutlich bei den von<br />
der Industrie angebotenen "Enterotubes", die mehrere spezifische Stoffwechselreaktionen in einem<br />
System hintereinander angeordneter, getrennter Testkammern zusammenfasst.<br />
Vers. IV.4<br />
Material:<br />
- Plattenkulturen von Escherichia coli und Proteus mirabilis<br />
- Impföse<br />
- 5 Reagenzgläser mit je einem Durham-Röhrchen und je 10 ml sterilem Grundmedium darin,<br />
mit Kapsenbergkappen verschlossen<br />
- Sterile Zuckerlösungen (20%ig) von Glucose, Lactose, Galactose, Arabinose,<br />
- steriles Aqua dest.<br />
- Sterile 1 ml Pipetten<br />
- Bromthymolblaulösung<br />
- Nährmedium: 10 g Bacto-Trypton und 1 g L-Tryptophan in 1 l Aqua dest. gelöst (pH 7,0)<br />
- Teststreifen: Filterstreifen, für den Indolnachweis getränkt mit Ehrlichs-Reagenz<br />
(1 g p-Dimethylaminobenzaldehyd in 95 ml 96%igem Ethanol lösen und dann 20 ml konz.
HCl zusetzen, leicht feucht bei 4 ° C im Dunkeln aufbewahrt, gebrauchsfertig, wenn gelb),<br />
oder für den H2S-Nachweis getränkt mit Bleiacetat (10%ig, leicht feucht aufbewahrt)<br />
- Enterotubes<br />
Durchführung:<br />
Geben Sie in je 1 der Reagenzgläser mit 1 ml Pipetten steril je 0,3 ml der folgenden vorsterili-<br />
sierten Zuckerlösungen (20%ig): (a) Glucose, (b) Lactose, (c) Galactose, (d) Arabinose und zur<br />
Kontrolle (e) Aqua dest. hinzu. Beimpfen Sie unter Verwendung der Impföse mit Escherichia coli<br />
(ger. Gruppen-Nr.) bzw. Proteus mirabilis (unger. Gruppen-Nr.). Verreiben Sie dazu die Bakteri-<br />
en mit der Impföse gut an der Glasinnenseite und ziehen Sie dann die Bakterien in das Nährmedi-<br />
um hinein (Impföse jeweils gut durchglühen und vor Aufnahme der Bakterien abkühlen lassen).<br />
Hängen Sie schließlich mit einer sterilen Pinzette je einen Teststreifen für Indol- (mit Ehrlich's<br />
Reagenz getränkt) bzw. H 2 S-Freisetzung (mit Bleiacetat getränkt) in die beiden Reagenzgläser<br />
mit Glucose und der Kontrolle hinein (Abb. 5), so dass keine Benetzung mit dem Nährmedium er-<br />
folgt (einige cm Abstand vom oberen Rand des Nährmediums), indem Sie die Streifen beim Ver-<br />
schließen der Reagenzgläser mit den Verschlusskappen befestigen. Die Teststreifen sind<br />
gebrauchsfertig vorgerichtet.<br />
Abb. 5. Reagenzglas mit Durhamröhrchen zum Nachweis von Säure- und Gasbildung aus<br />
Zuckern. Die Teststreifen für den Nachweis der Bildung von Indol und H 2 S werden mit<br />
der Kapsenberg-Kappe befestigt.<br />
Es werden zusätzlich einige Enterotubes zur Beimpfung ausgegeben. Diese erfolgt durch Abnahme<br />
der beiden Schraubkappen, Beimpfen der Impfspitze unter der weißen Verschlusskappe<br />
mit einer Einzelkolonie der Platte, langsames Durchziehen der Impfnadel unter leichtem Drehen<br />
durch alle Kammern, danach zurückschieben bis zur Einkerbung der Nadel und Abknicken der<br />
Impfnadel an dieser Stelle, danach Durchstoßen der Luftlöcher der letzten 8 Kammern mit dem<br />
abgebrochenen Teil der Impfnadel und Wiederaufsetzen der Schraubkappen.<br />
Die Bebrütung der Ansätze (Reagenzgläser und Enterotubes) erfolgt 24 h bei 37 ° C, die Auswertung<br />
am darauffolgenden Tag, bzw. im nächsten Kurs nach Lagerung im Kühlschrank. Zur Auswertung<br />
geben Sie in jedes Röhrchen einen Tropfen Bromthymolblaulösung (sauer: gelb; alkalisch:<br />
blau; Farbumschlagsbereich: pH 6,0 bis 7,6) als Indikator für die Zuckervergärung unter<br />
Säurebildung.<br />
21
Im Verlaufe des Kurses haben wir uns an dem folgenden sehr vereinfachten Weg orientiert:<br />
K L O N - K U L T U R<br />
⇓<br />
⇓<br />
Zellform/Pigmentierung<br />
⇓<br />
==============================================<br />
⇓ ⇓ ⇓ ⇓<br />
Kokken Spirillen knospend Stäbchen<br />
orange rotbraun rotbraun farblos<br />
⇓<br />
(Micrococcus (Rhodospirillum (Rhodomicrobium ⇓<br />
sp.) sp). vannielii) ⇓<br />
⇓<br />
Gram-Färbung<br />
==================<br />
⇓ ⇓<br />
Gram-negativ Gram-positiv<br />
(Escherichia (Bacillus<br />
coli) sp.)<br />
⇓<br />
⇓<br />
⇓<br />
Oxidase-Test<br />
======================<br />
⇓ ⇓<br />
Oxidase-negativ Oxidase-positiv<br />
Dextrose-Vergärung (Pseudomonadaceae)<br />
(Enterobacteriaceae)<br />
⇓<br />
⇓<br />
Spezifische Stoffwechselleistungen<br />
⇓ ⇓<br />
Lactose-Verwertung keine Lactose-Verwertung<br />
Indol-Freisetzung keine Indol-Freisetzung<br />
keine H 2 S-Bildung H 2 S-Bildung<br />
(Escherichia coli) (Proteus mirabilis)<br />
22
V. KURS: HEMMUNG DES WACHSTUMS UND ABTÖTUNG<br />
Um eine unkontrollierte Ausbreitung von Mikroorganismen zu verhindern, ist es nötig, entweder<br />
das Wachstum der unerwünschten Organismen zu hemmen oder sie gar abzutöten. Dies geschieht<br />
mit Hilfe von antimikrobiellen Agenzien oder physikalischen Methoden, die geeignet sind, essentielle<br />
Zellfunktionen zu schädigen. Bei einem Einsatz solcher Methoden ist aber immer daran zu<br />
denken, dass durch Mutation zufällig entstandene resistente Formen unter dem herrschenden Selektionsdruck<br />
zur Anreicherung kommen und sich dann ausbreiten können.<br />
Im Falle einer Wachstumshemmung spricht man bei Bakterien von einem bakteriostatischen und<br />
bei Pilzen von einem fungistatischen Effekt, während Abtötung auf bakteriziden oder fungiziden<br />
Effekten beruhen. Vielfach ist der Übergang von der Hemmung des Wachstums zur Abtötung abhängig<br />
von der Konzentration des antimikrobiellen Agens. Im typischen Falle wird Abtötung<br />
durch folgende Exponential-Funktion beschrieben:<br />
N = N 0 e -kt<br />
wobei N die Zahl an Bakterien zum Zeitpunkt t ist und N 0 die Zahl zu Beginn der Behandlung; k<br />
[h -1 ] wird als Absterberate bezeichnet. (Die Ableitung der Funktion entspricht der Ableitung der<br />
Wachstumskinetik).<br />
Beispiele für die Auslösung antimikrobieller Wirkungen:<br />
A) Physikalische Methoden:<br />
• Hitzebehandlung<br />
• Bestrahlung mit UV- oder Röntgen-Strahlen<br />
• Kältebehandlung<br />
• Wasserentzug<br />
B) Chemische Methoden:<br />
• Ansäuern<br />
• Detergentien (amphiphile Moleküle, stören Membranfunktionen)<br />
• Schwermetall-Ionen (können an aktive Zentren von Enzymen binden)<br />
• CN-, CO (hemmen Atmung über Cytochromoxidase)<br />
• Antimetabolite (Strukturanaloge zu normalen Substraten, hemmen Enzymfunktionen)<br />
• Enzymatischer Angriff (Abbau von Zellwänden und Proteinen)<br />
• Antibiotika (Substanzen biologischer Herkunft, die in geringen Mengen das Wachstum<br />
von Mikroorganismen hemmen)<br />
1. Wirkung von UV-Licht<br />
UV-Strahlung mit Wellenlängen um 260 nm wird in erster Linie von Nukleinsäuren absorbiert<br />
und führt damit zu Änderungen im genetischen Material der Zellen. Hierdurch können Mutationen<br />
bis zu letalen Effekten ausgelöst werden.<br />
23
Vers. V.1<br />
Material:<br />
- 4 Petrischalen mit GPH-Nähragar für Staphylococcus epidermides<br />
- Übernachtkultur von Staphylococcus epidermides (flüssig)<br />
- sterile Pasteurpipetten, Pipettenhütchen<br />
- Drigalski-Spatel (steril)<br />
- Schalen mit Alkohol<br />
Durchführung:<br />
Auf die Agar-Oberfläche jeder Petrischale werden mit einer Pasteurpipette 3 Tropfen der Bakteri-<br />
enkultur aufgetragen und mit dem Drigalski-Spatel gleichmäßig auf der Oberfläche verteilt.<br />
Pipetten und Spatel nach dem Gebrauch nicht auf dem Tisch, sondern gleich in einem Ge-<br />
fäß mit 70% Ethanol ablegen.<br />
Platten sofort am Boden beschriften mit: Datum, Gruppen-Nr., Versuchs-Nr., Expositionszeit. Ei-<br />
ne der beimpften Platten dient als Kontrolle, die verbleibenden drei Platten werden mit geöffne-<br />
tem Deckel im UV-Licht (Impfraum) exponiert.<br />
Vorsicht ! UV-Strahlung ist gefährlich für Haut und Augen! Deshalb vor dem Betreten des<br />
Impfraumes UV-Licht abschalten (Schalter außen) und nach dem Verlassen einschalten !<br />
Nach 1; 5; bzw. 10 min Expositionszeit werden die Platten mit dem Deckel verschlossen und zu-<br />
sammen mit der Kontrolle bebrütet (30 °C, ca. 2 Tage). Auswertung am 6. Kurstag<br />
2. Minimale Hemmstoff-Konzentration von Ampicillin<br />
Zur Ermittlung der minimalen Grenzkonzentration eines Hemmstoffes wird eine Reihe von Test-<br />
Röhrchen angelegt, die Nährlösung enthält und in abgestuften Konzentrationen den zu untersuchenden<br />
Hemmstoff. Nach dem Beimpfen mit einer konstanten Menge an Bakterien werden die<br />
Röhrchen bebrütet. Bei der anschließenden Auswertung wird diejenige Hemmstoff-<br />
Konzentration, die in der absteigenden Verdünnungsreihe als niedrigste Konzentration im Vergleich<br />
zur Kontrolle kein Wachstum (= keine Trübung) aufweist, als minimale bakteriostatische<br />
Hemmkonzentration festgelegt.<br />
Vorsicht ! Ampicillin gehört (wie die Penicilline) zu den ß-Lactam-Antibiotika, deren Einsatz<br />
zum Auftreten von Allergien führen kann. Kursteilnehmer, die solch eine Allergie haben,<br />
können die folgenden Versuche nicht durchführen und müssen sich zu Kursbeginn<br />
beim Kursleiter melden !<br />
24
Vers. V.2:<br />
Material:<br />
- 10 sterile Reagenzgläser im Reagenzglasständer<br />
- sterile Nährlösung (LB)<br />
- sterile Stammlösung mit Ampicillin (1 mg/3,3 ml)<br />
- sterile, physiologische Kochsalzlösung (0,9 % NaCl)<br />
- sterile Pipetten (5 ml und 10 ml), Pasteurpipetten, Pipettierhilfen<br />
- Impfsuspension (Escherichia coli DH5α)<br />
Durchführung:<br />
Zunächst werden unter Einhaltung steriler Bedingungen in jedes der zuvor nummerierten Röhrchen<br />
3,0 ml Nährlösung pipettiert. Mit einer sterilen Pipette werden nun in das erste Röhrchen der<br />
Reihe 3,0 ml der Ampicillin-Stammlösung gegeben (⇒ 150 µg/ml). Der Inhalt des Röhrchens<br />
wird mit der Pipette durch Aufsaugen und Wiederauslaufenlassen gemischt (nicht mit dem Mund,<br />
sondern mit Pipettierhilfen pipettieren!). Anschließend werden 3,0 ml aus dem ersten in das zweite<br />
Röhrchen überführt, wie oben beschrieben durchmischt und in Portionen zu 3,0 ml weiter übertragen.<br />
Auf diese Weise wird mit insgesamt 9 Röhrchen verfahren, so dass eine geometrische<br />
Verdünnungsreihe des Antibiotikums entsteht. In dem 10. Röhrchen werden 3,0 ml Nährlösung<br />
mit 3,0 ml phys. Kochsalzlösung versetzt und durch Entnahme und Verwerfen von 3,0 ml (nach<br />
Mischen) auf das Volumen der anderen Testansätze reduziert. Schließlich werden mit einer sterilen<br />
Pasteur-Pipette in sämtliche Röhrchen 2 Tropfen der Kultursuspension von E. coli gegeben<br />
und bei 30 °C bebrütet. Nach ca. 48 h Bebrütung werden die Röhrchen bis zum 6. Kurs kühl<br />
gehalten.<br />
3. Natürliche Resistenz gegenüber ß-Lactam-Antibiotika<br />
ß-Lactam-Antibiotika (z.B. Penicilline) hemmen wachsende Bakterien auf der Stufe der Zellwandsynthese,<br />
und zwar der Biosynthese von Peptidoglycan (= Murein). Peptidoglycan wird von<br />
verschiedenen ß-Lactam-sensitiven Enzymen synthetisiert. Unter dem Einfluss von Antibiotika<br />
können Organismen, die ursprünglich empfindlich sind, Resistenzen erwerben. Daneben ist aber<br />
auch die natürliche Resistenz bekannt, die in erster Linie auf einen verminderten Zutritt der Antibiotika<br />
zum Wirkort zurückzuführen ist. Im Falle der ß-Lactam-Antibiotika kann die äußere<br />
Membran Gram-negativer Bakterien den Zugang zu den Enzymen der Peptidoglycan-Synthese<br />
behindern. Die Organismen sind dann resistent. Bei der anschließenden Auswertung weisen die<br />
mit Antibiotikum versetzten Röhrchen im Falle resistenter Bakterien Wachstum (= Trübung) auf,<br />
während die Röhrchen mit nicht resistenten Bakterien kein Wachstum ( = keine Trübung ) zeigen<br />
und klar bleiben..<br />
Vers. V.3<br />
Material:<br />
- sechs Reagenzröhrchen mit je 5 ml GPH-Medium, davon je zwei mit Penicillin G (7.5 E/ml),<br />
zwei mit Ampicillin (150 µg/ml ) und zwei als Kontrolle ohne Zusatz eines Antibiotikums.<br />
- Übernachtkulturen (flüssig in GPH) von Pseudomonas fluoreszenz, Staphylococcus aureus<br />
25
- sterile Pasteurpipetten mit Saughütchen<br />
Durchführung:<br />
Je drei Reagenzröhrchen ( eines mit Penicillin, eines mit Ampicillin und eines ohne Zusatz als<br />
Kontrolle ) werden mit je einer der zwei Bakterienarten beimpft. Dafür wird jedes der Röhrchen<br />
mit je zwei Tropfen der betreffenden Übernachtkultur mit der Pasteurpipette beimpft. Die<br />
Röhrchen werden im Dunkeln bei 30°C bebrütet und am 6. Kurstag ausgewertet.<br />
4. Bacterizide Wirkung von Desinfektionsmitteln<br />
Der Begriff der Desinfektion stammt aus dem Bereich der medizinischen Bakteriologie und bezeichnet<br />
die Abtötung aller pathogenen Mikroorganismen. Um die bakterizide Wirkung eines<br />
Hemmstoffs festzustellen, werden Bakterien mit verschiedenen Konzentrationen des Hemmstoffes<br />
über einen konstanten Zeitraum inkubiert. Anschließend werden Petrischalen mit Nähragar mit<br />
vier Tropfen aus der hemmstoffhaltigen Suspension beimpft und bebrütet. Bakterizide Wirkung<br />
liegt vor, wenn die Organismen auf den Agarplatten (d.h. ohne Hemmstoff) kein Wachstum (d.h.<br />
keine Kolonienbildung) mehr zeigen.<br />
Vers. V.4<br />
Material:<br />
- 5 sterile Reagenzgläser<br />
- 5 Petri-Schalen mit GPH-Nähragar (siehe Anhang)<br />
- sterile Pipette (5,0; 1,0 ml)<br />
- Übernachtkultur von Staphylococcus epidermides (Sicherheitsmaßnahmen, siehe oben !)<br />
- Pasteurpipette<br />
- Desinfektionsmittel (Sterilliumlösung)<br />
- phys. Kochsalzlösung (0.9 %)<br />
- Drigalskispatel<br />
Durchführung:<br />
Die Röhrchen werden in einer Reihe aufgestellt und mit je 1,0 ml physiologischer Kochsalzlösung<br />
versehen. Dann wird in das erste Röhrchen 1,0 ml Sterilliumlösung gegeben. Nach dem Mischen<br />
wird 1,0 ml entnommen und auf das nächste Röhrchen übertragen usw.. Auf diese Weise wird<br />
wiederum eine geometrische Verdünnungsreihe hergestellt. Als Kontrolle wird das 5.Röhrchen<br />
nicht mit Sterillium versetzt. Sämtliche Röhrchen in der korrekten Reihenfolge beschriften !<br />
Die Verdünnungsreihe wird nun mit 0,1 ml ( genau !) Bakteriensuspension je Röhrchen versetzt<br />
und für die Dauer von 15 min inkubiert. In der Zwischenzeit werden die Petrischalen beschriftet (<br />
Versuchs-Nr., Gruppen-Nr., Sterillium-Konzentration ), so dass sie nach Ablauf der Versuchszeit<br />
mit 4 Tropfen ( Pasteurpipette ) aus der Sterillium-Reihe beimpft werden können. Mit dem Drigalski-Spatel<br />
werden die aufgetropften Bakterien auf der Agaroberfläche gleichmäßig ausgespatelt.<br />
Die Petrischalen werden 4 Tage bei 30 °C bebrütet und dann bis zum 6. Kurstag kühl gestellt.<br />
26
VI. KURS: WACHSTUM<br />
Werden physiologisch aktive Bakterienzellen mit geeigneten Substraten versorgt, so werden diese<br />
Substrate von den Organismen in zelleigene makromolekulare Bausteine umgesetzt: die Biomasse<br />
der Zellen - und damit die Biomasse der Kultur - nimmt zu.<br />
Zellwachstum erfolgt bis zu einer kritischen Zellgröße; die darüber hinausgehende Zunahme der<br />
Biomasse einzelner Zellen ist nun nur nach Zellteilung möglich: die Zellen vermehren sich.<br />
Das Wachstum einer Bakterienkultur lässt sich somit anhand der Zunahme der Zellzahl oder der<br />
Biomasse beschreiben. Im folgenden wollen wir uns auf die Ermittlung von Parametern beschränken,<br />
die eine Quantifizierung des Wachstums auf der Grundlage der Biomasse (X) ermöglichen.<br />
Die Geschwindigkeit des Wachstums ist:<br />
dX / dt = µ X (1)<br />
Die Konstante µ besitzt die Dimension einer reziproken Zeit [h -1 ] und wird als Wachstumsratenkonstante<br />
oder in der gängigen Literatur kurz auch als Wachstumsrate bezeichnet. Zur Bestimmung<br />
von µ lösen wir die Gleichung nach Umformung durch Integration:<br />
dX / X = µ dt<br />
ln (X / X 0 ) = 1 / log e x log (X / X 0 ) = µ t (2)<br />
µ = (log X t - log X 0 ) / (log e (t - t 0 )) = (ln X t - ln X 0 ) / (t - t 0 )<br />
(2a)<br />
[log e = 0,43429 ]<br />
X = X 0 x e µt (3)<br />
Anschaulicher als die Wachstumsrate (µ) einer Kultur ist die Verdopplungszeit t d . Nach (2a) ist:<br />
t d = (ln 2 X 0 - ln X 0 ) / µ = ln 2 / µ [h -1 ] (4)<br />
Wachstum im geschlossenen Kultursystem<br />
Zur Anzucht von Bakterien wird vorwiegend das geschlossene Kultursystem genutzt, in dem ein<br />
geeignetes steriles Kulturgefäß (z.B. ein Erlenmeyerkolben) mit Nährlösung versehen und mit<br />
Bakterien beimpft wird. Anschließend wird die Kultur bebrütet. Dabei werden die Komponenten<br />
der ursprünglich eingebrachten Nährlösung verbraucht und das Bakterienwachstum klingt aus.<br />
(Bei einem offenen Kultursystem wird durch laufende Zufuhr frischer Nährlösung die Kultur in<br />
der Phase aktiven Wachstums gehalten).<br />
27
28<br />
Im geschlossenem System durchlaufen die Kulturen aufgrund der sich ständig ändernden Bedingungen<br />
verschiedene Phasen. Nach dem Beimpfen können die Organismen im Prinzip gleich mit<br />
der maximalen Rate wachsen (exponentielle oder auch logarithmische Phase). Voraussetzung<br />
hierfür ist, dass sie in ihrem Stoffwechsel auf eine optimale Verwertung der Nährstoffe eingestellt<br />
sind. Sie wachsen mit dieser maximalen Rate solange, bis die Konzentration einer begrenzt vorhandenen<br />
Komponente des Mediums (dies wird in erster Linie das Substrat sein) auf limitierende<br />
Werte absinkt, so daß das Wachstum der Kultur ausklingt. Verbunden damit wird zunächst die<br />
Wachstumsrate geringer (Verzögerungsphase) bis das Wachstum letztlich ganz zum Stillstand<br />
kommt (stationäre Phase). Auch die Bildung von Stoffwechsel-Endprodukten kann über eine<br />
Hemmung zum Stillstand des Wachstums führen (z. B. Änderung des pH-Wertes bei der Produktion<br />
von Säuren).<br />
Werden Zellen aus suboptimalen Wachstumsverhältnissen als Impfmaterial in frisches Medium<br />
übertragen, so sind sie zunächst nicht gleich auf die günstigeren Bedingungen eingestellt. Die Adaptation<br />
an das frische Medium erfolgt dann in einer ersten Phase, die noch kein Wachstum erkennen<br />
lässt ("lag"-Phase). Anschließend (Anlaufphase) wird die Wachstumsrate bis zu ihrem<br />
maximalen Wert (exponentielle Phase, s.o.) gesteigert. Lag- und Anlaufphase können auch auftreten,<br />
wenn die Komposition des Mediums geändert wird.<br />
Wachstumsprozesse gehorchen Exponentialfunktionen. Deren graphische Darstellung wird in<br />
halblogarithmischem Maßstab überschaubar. Zum einen wird in dieser Auftragung der Übergang<br />
zwischen verschiedenen Wachstumsphasen deutlicher und zum anderen lässt sich die maximale<br />
Wachstumsrate (µ max ) aus der Steigung des Geradenbereichs ablesen.<br />
Messung der Biomasse<br />
Eine Reihe von Methoden steht dem Experimentator zur Verfügung, um die Biomasse direkt oder<br />
indirekt zu quantifizieren. Zu den direkten Methoden gehören die Ermittlung von Trockengewicht,<br />
Zellprotein oder des Gesamtstickstoffs der Biomasse einer Kultur. Zur routinemäßigen Bestimmung<br />
der Biomasse hat sich als indirekte Methode die Messung optischer Eigenschaften einer<br />
Population bewährt. Dabei wird die in der Mikrobiologie übliche optische Dichte (O.D.) der Suspension<br />
in einem Wellenlängenbereich des Spektrums gemessen, in dem keine Pigmente der Bakterien<br />
absorbieren. Damit ist gewährleistet, dass in erster Linie die Lichtstreuung an den Zellen in<br />
die Messung eingeht.<br />
Aufgaben:<br />
Bestimmen Sie mit den unten aufgeführten Kulturen von Escherichia coli:<br />
a) die Wachstumsrate (µ)<br />
b) die Verdopplungszeit (td ) und<br />
c) gegebenenfalls die Zeit vom Animpfen bis zum<br />
Erreichen der exponentiellen Phase<br />
Vorsicht ! Escherichia coli ist im Prinzip kein pathogener Organismus. Dies bedeutet jedoch<br />
nicht, dass mit ihm sorglos umgegangen werden kann; denn ein Auftreten in größeren Mengen<br />
kann, z.B. über Hautverletzungen auch zur Infektion führen. Es gilt das grundsätzliche<br />
Gebot des sauberen Arbeitens in der Mikrobiologie.
Vers. VI.1:<br />
Material:<br />
- Schüttelwasserbäder: mindestens 2 Stück pro Kurs<br />
- Eppendorf oder vergleichbares Photometer: 2 Stück plus Filter<br />
- Erlenmeyerkolben (300 ml, 1 Stück pro Gruppe), die in Einsätze für Wasserbäder passen<br />
- sterile Pasteurpipetten (lange Spitze) in Pipetten-Dose: (10 Pip. und 1 Dose pro Gruppe)<br />
- Einmal-Küvetten, 1,0 cm, halbmikro (1 Stück pro Gruppe)<br />
- Gefäß für gebrauchte Pipetten<br />
- Desinfektionslösung (Sterillium)<br />
- Nährmedien in Kolben (alternativ können den Kursteilnehmern gleich die mit den richtigen<br />
Mengen an Nährlösung gefüllten Kulturkolben vorbereitet werden)<br />
- 3 Eisbäder, Gummihütchen zum Pipettieren, 5 Reagenzröhrchen, Log-Papier<br />
- 2 Stationen zum Animpfen der Kulturen:<br />
mit je 1 Übernacht-Kultur und sterilen 10 ml Pipetten<br />
- Taschenrechner ( bitte mitbringen !)<br />
Durchführung:<br />
Jede Gruppe bearbeitet jeweils eine Kultur mit Zellen von Escherichia coli, die in Voll-<br />
Medium als Schüttelkultur (= gute Belüftung) entweder bei 37 °C ( optimale Wachstumstem-<br />
peratur; gerade Gruppen-Nr.) oder bei 27 °C ( suboptimale Wachstumstemperatur; ungerade<br />
Gruppen-Nr.) wachsen. Die Anzucht erfolgt in 300 ml Erlenmeyerkolben, das Kulturvolumen<br />
beträgt 100 ml. Um gutes Wachstum zu erhalten, sollten die Kulturen mit einer O.D. 623 von<br />
0.05 - 0.1 (Messung in Halbmikro-Küvetten, 1,0 cm Strahlengang) angeimpft werden.<br />
Probennahme mit sterilen Pasteurpipetten: ca. 3/4 gefüllt, in Abständen von 20 min (Zeiten ge-<br />
nau protokollieren!).<br />
Sollte die Messung nicht sofort nach der Probenahme durchführbar sein: Proben im Eisbad<br />
rasch abkühlen und dort bis zur Messung aufbewahren. Vor der Messung die Proben kurz auf-<br />
schütteln, dabei jedoch Schaum- oder Bläschenbildung vermeiden! Ab einem O.D.-Wert von<br />
0,5 muss die Probe vor der O.D.-Bestimmung mit Medium verdünnt werden, damit die Mes-<br />
sung weiterhin im linearen Bereich erfolgen kann.<br />
Tragen Sie die Messwerte in halblogarithmischem Maßstab gegen die jeweilige Kulturdauer<br />
auf und berechnen Sie die gewünschten Werte.<br />
29
Nährböden für Anreicherungskulturen<br />
Anhang<br />
Glucose-Pepton-Hefeextrakt (GPH)-Medium Glucose-Pepton-Hefeextrakt (GPH)-Agar<br />
(Vers. I.1) (Vers. I.1)<br />
Glucose 1 g Glucose 1 g<br />
Pepton 5 g Pepton 5 g<br />
Hefeextrakt 2 g Hefeextrakt 2 g<br />
Agar-Agar 18 g<br />
Aqua dest. ad 1.000 ml Aqua dest. ad 1.000 ml<br />
pH 7,0 pH 7,0<br />
Das GPH-Medium ist nicht selektiv,- auf ihm können verschiedene Bakterien wachsen<br />
MP - Agar Stärke-Agar<br />
(Vers. I.3 und II.6) (Vers. I.5)<br />
Malzextrakt (fest) 3,0 g Lösliche Stärke 20 g<br />
Caseinpepton 0,5 g NaCl 70 g<br />
Agar 15,0 g Pepton 3 g<br />
Aqua dest. ad. 900 ml Agar 18 g<br />
pH 5,9 Aqua dest. ad. 1.000 ml<br />
pH 7,0<br />
Nach dem Autoklavieren und Abkühlen<br />
auf 60 °C (im Wasserbad) wird dem MP-Agar<br />
0,1 g Chloramphenicol zur Unterdrückung<br />
des bakteriellen Wachstums zugemischt<br />
(in 100 ml Aq. dest. gelöst und sterilfiltriert).<br />
Nährlösung für phototrophe Bakterien<br />
(RÄH, Vers. II.1)<br />
Hefeextrakt 1,0 g<br />
Äpfelsäure 3,0 g<br />
NH4Cl 1,2 g<br />
MgSO4 x 7 H2O 0,2 g Mit 20%iger NaOH auf pH 6,8 einstellen und<br />
CaCl2 x 2 H2O 0,07 g nach dem Autoklavieren 10 ml eines<br />
Spurenelemente-Lösung * 2,0 ml sterilen0,5 mol K-Phosphatpuffers (pH 6,8)<br />
Aqua dest. ad 1.000 ml sowie 1 ml sterilfiltrierter Vitamin-Lsg.<br />
zusetzen<br />
30
Nährlösung für Desulfurizierer# Nährlösung für Nitrifizierer<br />
( Vers. II.2 ) (Vers. II.3)<br />
Na-Lactat (50%ig) 4,9 g (NH 4 ) 2 SO 4 700 mg<br />
KH 2 PO 4 0,5 g K 2 HPO 4 200 mg<br />
NH 4 Cl 1,0 g MgSO 4 7H 2 O 50 mg<br />
CaSO 4 1,0 g CaCO 3 50 mg<br />
MgSO 4 x 7 H 2 0 2,0 g CaCl 2 x 2 H 2 O 20 mg<br />
Ammoniumeisen(II)sulfat 0,5 g Spurenelemente Lösung 1 ml<br />
Na 2 S (10 -3 M) 10 ml Aqua dest. ad 1.000 ml<br />
Aqua dest. ad 1.000 ml<br />
pH 7,0 Nach dem Autoklavieren mit<br />
steriler Na 2 CO 3 -Lösung<br />
# Erst am 2. Kurstag ansetzen, da sonst (2 g/100 ml H 2 O) auf pH 7,5-8,0<br />
Oxidation des FeII erfolgt ! einstellen<br />
Nährlösung für Denitrifizierer Nährlösung LB (Vollmedium für E.coli )<br />
(Vers. II.4) (Vers. V.1, V.2)<br />
Pepton 5 g NaCl 5,0 g<br />
Hefeextrakt 1 g Hefeextrakt 5,0 g<br />
NaCl 8 g Trypton 10,0 g<br />
KNO3 10 g Aqua dest. ad 1000 ml<br />
Aqua dest. ad 1.000 ml pH 7,1<br />
pH 6,9<br />
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------<br />
Phosphat wird bei allen Nährlösungen getrennt gelöst und autoklaviert. Nach dem Autoklavieren<br />
wird mit dem Nährboden gemischt und der pH Wert kontrolliert. Auch Zuckerlösungen sollen<br />
getrennt gelöst und erst nach dem Autoklavieren mit dem Nährboden vermischt werden.<br />
Spurenelement-Lösung :. Der Bedarf an Spurenelementen ist - abhängig vom Bakterium - unterschiedlich.<br />
Alle Bakterien benötigen Fe 2+ . Weitere wichtige Spurenelemente sind: Mn 2+ , Co 2+ ,<br />
Cu 2+, Ni 2+, Molybdat, Zink und Selen.<br />
Die Zusammensetzung der im Kurs verwendeten Spurenelement-Lösung:<br />
Stamm-Lösung für Spurenelemente<br />
( nach Drews, Mikrobiologisches Praktikum, 4. Auflage (1984)<br />
EDTA ( Ethylendiamintetraessigsäure ) 500 mg Die Substanzen werden ge-<br />
FeSO4 x 7 H2O 300 mg trennt in Aqua dest. gelöst,<br />
MnCl2 x 4 H2O 3 mg zur EDTA-Lösung gegeben,<br />
CoCl2 x 6 H2O 5 mg der pH-Wert auf etwa 4<br />
CuCl2 x 2 H2O 1 mg eingestellt und auf 1000ml mit<br />
NiCl2 x 6 H2O 2 mg Aqua dest. aufgefüllt.<br />
Na2MoO4 x 2 H2O 3 mg Zu den verschiedenen Nähr-<br />
ZnSO4 x 7 H2O 5 mg lösungen werden 1 – 10 ml/l<br />
H3BO3 2 mg zugegeben.<br />
31
Vitamin-Stammlösung<br />
Biotin 10,6 mg Von dieser Stamm-Lösung<br />
Nicotinsäure 266,0 mg wird 1 ml pro 1000 ml<br />
Nicotinsäureamid 266,0 mg Nährmedium zugegeben.<br />
Thiaminhydrochlorid (Vitamin B1) 533,0 mg<br />
Aqua dest. ad 1000 ml<br />
Auszug aus den Sicherheitsregeln für das Arbeiten in biologischen Laboratorien<br />
Zu Beginn des Kurses erfolgt eine Belehrung über allgemeine Sicherheitsbestimmungen einschließlich<br />
der Hinweise auf :<br />
- Fluchtwege<br />
- Standort von Feuerlöschern und Erstehilfe-Einrichtungen<br />
- Pläne für Notruftelephon-Nr.<br />
- Verhalten bei Alarm<br />
( siehe hierzu auch die entsprechenden Aushänge im Kursraum und in den Fluren )<br />
Rauchverbot beachten !<br />
Bei vorliegenden Verletzungen an den Händen : mit Schutzhandschuhen arbeiten!<br />
Bei Allergien : Kursleiter informieren !<br />
Sämtliche Vorfälle, die die Sicherheit beeinträchtigen könnten, Kursleiter oder Kurs-Assistenz<br />
melden!<br />
Bei der praktischen Arbeit:<br />
- Im Kursraum muss ein Schutzkittel getragen werden.<br />
- Schutzbrillen mit Seitenschutz müssen immer getragen werden, wenn mit Gefahrstoffen umgegangen<br />
wird, die auf dem Originaletikett ein Gefahrsymbol tragen sowie bei Laborarbeiten<br />
, bei denen Apparaturen evakuiert bzw. mit Überdruck betrieben werden.<br />
- Grundsätzlich darf nicht mit dem Mund pipettiert werden, Pipettierhilfen benutzen.<br />
- Im Kursraum darf weder gegessen noch getrunken werden.<br />
Vor Beginn der Arbeiten : Verpflichtung zur Information über Gefahren, die von Chemikalien,<br />
Organismen und Geräten ausgehen können, mit denen gearbeitet wird.<br />
Chemikalien: Giftigkeit, Stabilität, Brennbarkeit, Entsorgung.<br />
Organismen: Im Praktikum wird vorwiegend mit apathogen Bakterien gearbeitet. Dies schließt<br />
nicht aus, dass von Anreicherungskulturen mit unbekannter Zusammensetzung oder von massi-<br />
ven Infektionen gesundheitliche Gefahren ausgehen können. Deshalb grundsätzlich mit<br />
Mikroorganismen vorsichtig arbeiten!<br />
o Arbeiten mit den Organismen auf den definierten Arbeitsplatz beschränken und unkontrollierte<br />
Ausbreitung in die Umgebung vermeiden.<br />
o Unvermeidbare Verunreinigungen sofort beheben ( zunächst mit Wasser aufwischen<br />
und anschließend mit Desinfektionsmittel nachbehandeln).<br />
Vor dem Verlassen des Labors die Hände mit den bereitgehaltenen Desinfektionsmit<br />
teln reinigen<br />
Geräte: sämtliche Geräte nur nach vorheriger Einweisung durch erfahreneMitarbeiter/innen nutzen.<br />
Bei Unsicherheit ( auch nach der Einweisung) über genauen Gebrauch informieren.<br />
Es sollten ohne vorherige Absprache mit dem Kursleiter keine anderen , als im Programm vorgesehenen<br />
Experimente durchgeführt werden.<br />
Aus dem Kursraum dürfen ohne Anweisung keine Materialien ( Chemikalien, Organismen<br />
und Geräte ) entfernt werden.<br />
32
33<br />
Nach Beendigung des Tagesprogrammes:<br />
Gashähne schließen, Geräte ausschalten, Stecker elektrischer Geräte abziehen,<br />
Wasserhähne schließen,<br />
Kursmaterialien auf dem dafür vorgesehenen Platz sammeln,<br />
nach Abschluss der Experimente: Gefäße von Beschriftungen reinigen,<br />
Arbeitsplatz aufräumen und von eventuellen Verschmutzungen reinigen und mit Desinfek<br />
tionsmittel einsprühen,<br />
Vor dem Verlassen des Labors die Hände mit den bereitgehaltenen Desinfektionsmitteln<br />
reinigen.<br />
Phasenkontrastmikroskop ( Zeiss, neuer Typ)<br />
Zuerst Hellfelddurchlicht-Verfahren einstellen ( „Köhlern“) :<br />
- Beleuchtung einschalten (10) . Mittlere Helligkeit (9) einstellen.<br />
- Präparat auflegen.10er Objektiv (gelber Kennring) einstellen. Auf „0“-Stellung amTubusrohr<br />
(1)<br />
- Aperturblende (4) halb geschlossen<br />
- Okularstutzenabstand auf Ihren Augenabstand einstellen (helle Kreise, die Okularblenden, zu<br />
einem Kreis vereinen<br />
Köhlern:<br />
- Scharfstellen des Präparates (11): Grob-, dann erst Feintrieb. ( Hilfe: Kante des Objektträgers)<br />
- Mäßiges Schließen der Leuchtfeldblende (7), die jetzt im Bild erscheint (A)<br />
- Falls Blendenbild unscharf, mit (6) möglichst scharf stellen (B)<br />
- Mit den beiden Schrauben (5a, 5b) Blendenbild zentrieren ©<br />
- Leuchtfeldblende (7) gerade soweit öffnen, bis sie aus Sehfeld verschwindet (D)<br />
Bei Objektivwechsel muss die Einstellung der Leuchtfeldblende neu erfolgen<br />
( wegen Änderung des Sehfeldes und der Apertur!)<br />
Dann Phasenkontrast-Verfahren einstellen :<br />
- Objekt im Hellfeld eingestellt und so gut wie möglich fokussiert (s.o.)<br />
- Gewünschtes Phasenkontrast-Objektiv in den Strahlengang (40er oder 100er. Jeweils mit<br />
„Ph“)<br />
- Aperturblendenhebel (4) auf Linksanschlag (öffnet Aperturblende vollständig)<br />
- Zum Objektiv passenden Blendenschieber (12) bis zum Anschlag in Kondensor einschieben (<br />
die Angabe Ph2 bzw. Ph3 auf dem Blendenschieber muss mit der Ph-Angabe auf dem Objektiv<br />
identisch sein)
34<br />
- Lampenhelligkeit (9) nachregulieren<br />
- Die helle Ringblende im Blendenschieber (13) und der dunkle Phasenring im Objektiv müssen<br />
sich genau decken.Die Kontrolle erfolgt durch Abnehmen des Okulars ( und evtl. durch<br />
Einsetzen eines Hilfsmikroskopes). Ringblende und Phasenring mittels der beiden Inbuss-<br />
Schrauben (14) am Blendenschieber zur Deckung bringen.<br />
- Das Mikroskop ist nun für den Phasenkontrastbetrieb justiert.<br />
Bei Objektivwechsel: bei einigen Mikroskopen Blendenschieber wechseln, bei anderen Mikroskopen<br />
nicht nötig. Gegebenenfalls Phasenkontrast nachjustieren ( Ringblende und Phasenring deckungsgleich<br />
s.o. )<br />
Nach Beendigung des Mikroskopierens :<br />
Bei Verwendung von Immersionsöl : Objektive mit Linsenpapier reinigen ( ggf. mit etwas Alkohol).<br />
100er Objektiv in die Schutzarretierung bringen.<br />
Phasenkontrastmikroskop ( Zeiss, älterer Typ)<br />
Zeiss Standard Mikroskop :<br />
1 Okulare 12 Oberer Halter für Hilfslinse<br />
2 Tubus 13 Unterer Filterhalter<br />
3 Optovar 14 Knopf zum Ausklappen der<br />
4 Wahlscheibe Optovar-Einstellung Kondensorfrontlinse<br />
5 Scharfstellung Optovar 15 Kondensorjustierung ( li u. re )<br />
6 Objektivrevolver, 4fach 16 Kondensorhöhenverstellung ( li )<br />
7 Objektiv 17 Leuchtfeldblende<br />
8 Objekttischverstellung 18 Fuß<br />
9 Objekttisch 19 Stativ<br />
10 Kondensor mit Kondensorwahlscheibe 20 Grob- und Feintrieb<br />
11 Zentrierung für Phaseneinstellung 21 Mikroskopleuchte<br />
nicht sichtbar : Kondensorfrontlinse und Kondensorhilfslinse
Justierung :<br />
( 1 ) Zuerst Hellfeld-Einstellung, einschließlich „Köhlern“ :<br />
- Lampe einschalten.Mittlere Helligkeit ( 5,5 V ) auf Transformator einstellen<br />
- Präparat auflegen. 10er Objektiv ( 7 ) wählen<br />
- Kondensor in höchste Stellung bringen ( 16 )<br />
- Frontlinse ( direkt unter Objekttisch ( 9 ), Hebel rechts ) in den Strahlengang bringen, alle<br />
weiteren Zusatzlinsen (unterhalb des Kondensors ) vollständig aus dem Strahlengang nehmen.<br />
- Kondensorblende mit Kondensorwahlscheibe ( 10 ) auf „J“ = Hellfeld auf weißen Markierungsstrich<br />
einstellen ( links unter Objekttisch )<br />
- Okulare ( 1 ) auf richtigen Augenabstand einstellen<br />
- Mit dem 10er Objektiv das Präparat scharf einstellen : Grob- , dann erst Feintrieb (20 ) ( Hilfe<br />
dabei : Kante des Objektträgers, Objekt dabei bewegen)<br />
- Leuchtfeldblende ( 17 ) unten im Fuß ( 18 ) des Mikroskopes ganz schließen<br />
- Kondensor ( Triebknopf ( 16 ) links ) gerade soweit senken, bis Leuchtfeldblende möglichst<br />
scharf erscheint<br />
- Bild der Leuchtfeldblende zentrieren ( Triebknöpfe ( 15 ) am Kondensor rechts und links<br />
- Leuchtfeldblende( 17 ) unten im Fuß soweit öffnen, bis Sehfeld gerade ganz ausgeleuchtet ist,<br />
dabei Kondensor ggfls. nachzentrieren<br />
Ab hier , selbst bei Objektivwechsel , weder Verschiebung noch Höhe des Kondensors verändern,<br />
sonst wird korrektes Köhlern wieder aufgehoben.<br />
( 2 ) Wechsel vom 10er auf das 40er oder 100er Objektiv :<br />
- Im Fall von Objektivwechsel muss die Einstellung der Leuchtfeldblende ( 17 ) ( siehe oben )<br />
neu erfolgen ( wegen Änderung des Sehfeldes und der Apertur )<br />
( 3 ) Dann Phasenkontrast-Einstellung :<br />
- Objekt im Hellfeld einstellen ( s. o. )<br />
- Gewünschtes Phasenkontrast-Objektiv ( 7 ) in den Strahlengang ( 40er oder 100er, jeweils<br />
mit „Ph“ ). Bei 100er Objektiv Ölimmersion<br />
- Dem gewählten Objektiv entsprechende Phasenkontrastringblende mit Kondensorwahlscheibe<br />
(10) auf weißen Markierungsstrich einstellen („2“ entspricht dem 40er, „3“ dem 100er Objektiv<br />
)<br />
- Am Optovar (3 ) mit Wahlscheibe ( 4 ) auf „PH“ drehen . („PH“ ist Hilfsmikroskop zur<br />
Sichtbarmachung der hellen Ringblende im Kondensor und des dunklen Phasenringes im Objektiv)<br />
- Ringblendenbild und Phasenring zur Deckung bringen ( Triebknöpfe ( 11 ) gleich unterhalb<br />
des Objekttisches vorne und seitlich am Kondensor )<br />
- Gewünschte Zwischenvergrößerung mit Wahlscheibe ( 4 ) am Optovar einstellen, dabei förderlichen<br />
Vergrößerungsbereich beachten !<br />
- Objektebene vorsichtig scharf stellen ( Feintrieb ! )<br />
- Nach Bedarf Bildhelligkeit regulieren<br />
Bei Objektivwechsel ( 40er zum 100er, bzw. umgekehrt) muss auch der Phasenkontrast neu eingestellt<br />
werden ( wegen neuer Justierung von Ringblende und Phasenring)<br />
35
Platz für Notizen :<br />
36