Abschlußbericht zum Projekt „Molekularbiologische ... - UOK

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Abschlussbericht FKZ UGV04070803084 4.4 Verwendung spezifischer Sonden 4.4.1 Anwendung einer PCR-basierten Methode (ERMIsmKit) zur Identifizierung von Schimmelpilzen in Innenraumproben und Umweltproben Des Weiteren werden zur Identifizierung von Pilzen in klinischen Proben, Innenraumproben und Umweltproben in der Literatur Methoden beschrieben, die eine PCR mit anschließender Sondenhybridisierung umfassen (Sandhu et al., 1995; Einsele et al., 1997; Waalwijk et al., 2004; Wu et al., 2002; Wu et al., 2003). Basierend auf diesem Prinzip, hat die U.S. Environmental Protection Agency die so genannte Schimmelpilz-spezifische quantitative PCR (MSQPCR) für den Nachweis von Wandschimmel entwickelt und in einer großen Studie in den USA getestet. (http://www.epa.gov/nerlcwww/moldtech.htm). Die entsprechenden Primer und Sonden sind in den 36 Detektions-Mixe des ERMI sm Kit (Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Deutschland) enthalten, mit dessen Hilfe sich 36 Schimmelpilzgattungen, teilweise bis auf Artniveau identifizieren lassen ( http://www.ermimoldtest.com). Da der ERMI sm Kit von Roche ebenfalls auf einer Amplifikation der ITS-Region basiert, können teilweise nur Gruppen nah verwandter Spezies (siehe Penicillien) erkannt werden (siehe Tabelle 4). Der Vorteil dieser Methode besteht jedoch darin, dass Mischkulturen identifiziert werden können, ohne diese vorher zu vereinzeln. Aspergillus fumigatus, Neosartorya fischeri Aspergillus ochraceus/ ostianus Aspergillus restricuts/ caesillus/ conicus Aspergillus sclerotiorum Aspergillus unguis Aspergillus versicolor Aspergillus penicillioides Eurotium [Aspergillus] amstelodami/ chevalieri/ herbariorum/ rubrum/ repens Aspergillus flavus/ oryzae Aspergillus niger/ awamori/ foetidus/ phoenicis Aspergillus sydowii Aspergillus ustus Acremonium strictum Alternaria alternata Aureobasidium pullulans Acremonium strictum Alternaria alternata Aureobasidium pullulans Chaetomium globosum Cladosporium cladosporioides, svar. 1 Cladosproium cladosporioides, svar. 2 Cladosporium herbarum Cladosporium sphaerospermum Epicoccum nigrum Geotrichum candidum Mucor amphibiorum/circinelloides/ hiemalis/ indicus/ mucedo/racemosus/ ramosissimus und Rhizopus azygosprous/ homothalicus/ microsporus/ oligosporus/ oryzae Rhizopus stolonifer Paecilomyces variotii 20 Scopulariopsis brevicaulis/ fusca Scopulariopsis chartarum Stachybotrys chartarum Trichoderma viride/ atroviride/ koningii Wallemia sebi Penicillium chrysogenum Penicillium brevicompactum/ stoloniferum Penicillium corylophilum Penicillium crustosum/ camembertii/ commune/ echinulatum/ solitum Penicillium glabrum/lividum/ purpurescens/ spinulosum/ thomii Penicillium variable Penicillium purpurogenum Tabelle 4: Die im Kit enthaltenen Primer- Sonde-Kombinationen sind für die aufgelisteten Stämme und Stammgruppen spezifisch.
Abschlussbericht FKZ UGV04070803084 Durchführung Zur Testung des Systems wurden 5 bekannte Proben (Aspergillus fumigatus, Alternaria alternata, Penicillium commune, Cladosporium sphaerospermum und Aspergillus flavus) mit dem Kit analysiert. Dazu wurden 1,5 ng/µl DNA auf die 36 verschiedenen, für jeden Pilz spezifischen Detektionsansätze des ERMI sm Kit gegeben und im LightCycler ® 480 System analysiert. Als Positivkontrolle wird ein Plasmid mit DNA des Organismus Geotrichum candidum mit dem entsprechenden Detektionsansatz eingesetzt. A1 G2 G1 Abbildung 4: Real-Time PCR Analyse von unterschiedlichen Kontrollplasmid-DNAs und Pilz- DNAs. DNA von Aspergillus fumigatus wurde in den ERMI sm Kit eingesetzt und eindeutig als Aspergillus fumigatus (A1) identifiziert. Plasmid- DNA von Aspergillus fumigatus wurde als Positivkontrolle (G2) eingesetzt und Geotrichum candidum Plasmid-DNA als Referenz (G1). Im Anschluss wurden 12 Wandschimmelproben aus der Routineanalytik des LGL mithilfe des Kits untersucht. Die Proben wurden entweder mit einem sterilen Wattestäbchen oder mit einem Skalpell direkt von der Wand genommen, auf einer Sabouraud-Glukose-Agarplatte kultiviert und anschließend morphologisch bestimmt. Wegen des erheblichen zeitlichen Aufwands und des erforderlichen taxonomischen Expertenwissens wurde die morphologische Bestimmung jedoch nur auf Gattungsebene durchgeführt. Die Sequenzierung wurde wie bereits beschrieben mit dem Primerpaar ITS-1 und ITS-4 durchgeführt und ausgewertet. Die DNS wurde mithilfe des MoBio-Kits (MoBio Laboratories, Carlsbad, Californien, USA) extrahiert und die Konzentration mit einer PicoGreen Messung (Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA) bestimmt. Es wurden 1,5 ng/µl DNA auf die verschiedenen, für jeden Pilz spezifischen, 21
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