Abschlußbericht zum Projekt „Molekularbiologische ... - UOK

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Abschlussbericht FKZ UGV04070803084 • Thermomixer auf 70°C (± 2°C) vorheizen • 0,5 g Pilzmycel in die „Bead solution tubes“ einwiegen und vorsichtig vortexen (mithilfe eines sterilen Skalpells oder einer Impföse wird ein Stück Pilz vom Agar abgehoben) • Zugabe 60 µl Lösung S1, mischen durch Invertieren • Zugabe 200 µl IRS Lösung • 60 Sek. auf maximaler Stufe vortexen und 5 Min. bei 70°C (± 2°C) inkubieren • Vorgang wiederholen (60 Sek. vortexen und 5 Min. bei 70°C (± 2°C) inkubieren), anschließend erneut 60 Sek. vortexen • Zentrifugation für 30 Sek. bei 10 000 x g • Überstand in neues Mikrolitergefäß überführen • Zugabe von 250 µl Lösung S2 und anschließend 5 Sek. vortexen • 5 min bei 6 °C (± 2°C) inkubieren • Zentrifugation für 1 min bei 10 000 x g • 450 µl Überstand in neues Mikrolitergefäß überführen (restlichen Überstand und Pellet verwerfen) • Zugabe 900 µl S3 und anschließend 5 Sek. vortexen • Für jede Probe wird eine am Deckel beschriftete Spinsäule auf ein Auffanggefäß (oder alternativ ein 2-ml-Mikrolitergefäß) gesetzt und 700 µl des Gemisches auf die Säule gegeben. • 60 Sek. bei 10 000 x g zentrifugieren, Durchfluss verwerfen • Die restliche Lösung auf dieselbe Säule geben, erneut für 60 Sek. und 10 000 x g zentrifugieren und den Durchfluss verwerfen • Zugabe 300 µl Lösung S4 • Zentrifugation für 30 Sek. und 10 000xg, Durchfluss verwerfen • Zur Trocknung der Säule diese erneut zentrifugieren (60 Sek., 10 000 x g) und die Säule in ein neues Mikrolitergefäß überführen • Elution der DNA durch Zugabe von 50 µl Lösung S5 (mittig aufgeben!) • 2 min Inkubation bei RT • Zentrifugation für 30 Sek. und 10 000 x g • Spinsäule aus Mikrolitergefäß entfernen und verwerfen, das Mikrolitergefäß mit dem DNA-Extrakt verschließen, beschriften und bei -20 ± 2 °C gelagert. 4
Abschlussbericht FKZ UGV04070803084 3.2.2 Extraktion mithilfe der CTAB-Methode Die Extraktion von Schimmelpilz-DNA mithilfe der CTAB-Methode erfolgt nach folgendem Protokoll: • 2 g homogenisierte Probe in ein 50-ml-Falcon-Tube einwiegen • 10 ml CTAB-Puffer dazupipettieren • 30 µl Proteinase zugeben • Über Nacht bei 65° C im Thermoschüttler inkubieren • 5 Min. bei 14000 rpm zentrifugieren • 1 ml Überstand in neues 2 ml–Eppendorf-Tube überführen • 10 Min. bei 14000 rpm zentrifugieren • 650 µl Überstand in neues 2 ml–Eppendorf-Tube überführen • 1300 µl Präzipitationspuffer (für CTAB) zugeben • 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren • 5 Min. bei 14000 rpm zentrifugieren • Überstand verwerfen (Vorsicht: auf Pellet achten!) • Pellet in 350 µl NaCl lösen • 350 µl Chloroform zugeben • 10 Min. bei 14000 rpm, 10 °C zentrifugieren • Obere wässrige Phase in neues 1,5 ml–Eppendorf-Tube überführen • 2 µl Glycogen und 350 µl 100%igen Isopropanol zugeben • 15 Min. bei 14000 rpm zentrifugieren • Überstand verwerfen • 500 µl 70%igen Ethanol zugeben • 5 Min. bei 14000 rpm zentrifugieren • Überstand verwerfen • Pellet im Trockenschrank bei 50° C trocknen • Pellet in 100 µl 1x TE-Puffer aufnehmen • DNA durch kurzzeitiges Erwärmen bei 50° C lösen 3.2.3 Extraktion mithilfe des ZR Fungal/Bacterial DNA Kit Die Extraktion genomischer DNA aus Pilzen erfolgt ebenfalls mithilfe des ZR Fungal/Bacterial DNA Kit (Zymo Research D6005, Hiss Diagnostics). Auch hier 5
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