Abschlußbericht zum Projekt „Molekularbiologische ... - UOK

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Abschlussbericht FKZ UGV04070803084 Komponenten Volumen Endkonzentration Hot StarTaq Master Mix 12,5 µl 2,5 Units HotStarTaq DNA Polymerase 1x PCR Puffer 200 µM je dNTP Primer ITS-1 (20 µM) 0,5 µl 0,4 µM Primer ITS-4 (20 µM) 0,5 µl 0,4 µM H2O 10,5 µl + DNA oder Kontrollen 1 µl Total volume 25 µl • Je 25 µl Mastermix in RNase-, DNasefreie PCR–Strips vorlegen • Jeweils 1 µl der zu untersuchenden Proben-DNA, Extraktions- und Negativkontrolle bzw. H2O (Mastermixkontrolle) zupipettieren • Deckel schließen • Stripes kurz zentrifugieren, im Thermocycler gemäß folgendem Temperatur-Zeit- Programm inkubieren Temperatur-Zeit-Programm Programmeigenschaften Temperatur (°C) Zeit (Min.) Hold 95°C 10:00 Denaturierung 30x Annealing Extension 95°C 0:20 52°C 0:30 72°C 1:30 Extension 72°C 10:00 Hold 10°C forever Das PCR-Produkt (500-600 bp) wurde im Anschluss gelelektrophoretisch nachgewiesen. Beide Kontrollen dürfen kein Amplifikat ergeben. Die mit Hilfe des DNA Purification Kits der Firma Qiagen aufgereinigten PCR Produkte wurden zur Sequenzierung zur Firma MWG (Eurofins MWG GmbH, Martinsried, Deutschland) geschickt oder zur Sequenzierung im Haus in Auftrag gegeben. 8
Abschlussbericht FKZ UGV04070803084 Auswertung: Die DNA-Sequenzen wurden für die weitere Auswertung in eine geeignete DNA- Analyse-Software geladen und mittels Datenbankvergleich analysiert. Die Erstellung einer Consensus-Sequenz aus Vorwärts-und Rückwärtssequenz erfolgte mithilfe der DNASTAR Software. Die Analyse der Gensequenzen erfolgte über die öffentliche und universelle Datenbank von NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast), die Datenbanken von Gene Bank, EMBL und DDBJ enthält (Achtung: nicht qualitätskontrolliert). Es werden aus den erhaltenen Übereinstimmungen nur solche gewählt, die folgende Bedingungen erfüllen: Der „score“ als quantitative Beurteilung der Sequenzübereinstimmung zwischen Suchsequenz und Datenbanksequenz sollte mindestens 700 bits betragen; Der „e-value“, als Angabe der Wahrscheinlichkeit, Sequenzen mit gleichem Score zu finden sollte möglichst gegen 0 gehen. Die Sequenzhomologie sollte bei ≥ 98 % liegen. In dieser Arbeit wurden Modifikationen dieser Kriterien entwickelt. 3.5 Durchführung des ERMIsm Kits zur Identifizierung von Schimmelpilzen in Innenraumproben und Umweltproben Die Durchführung des ERMIsm Kits (Fa. Roche) erfolgt wie im beiliegendem Protokoll beschrieben. Mitgeführt wird je Detektions-Mix eine Mastermixkontrolle (5 µl Reinstwasser statt Proben-DNA). Zusätzlich wird pro PCR-Platte eine Positivkontrolle (Geotrichum candidum Plasmid-DNA) mitgeführt. Auf je 10 µl Master-Mix pro Well werden je (für Probe und Mastermixkontrolle) 2,8 µl des jeweiligen Detektions-Mixes und 2,2 µl Reinstwasser pipettiert. Für die Mastermixkontrolle werden 5 µl Reinstwasser, für die Analyse der Probe je 5 µl Proben-DNA (Konz. 1,5 ng/µl) zugegeben. Im Anschluss werden die Proben im Light-Cycler 480 analysiert. 9
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