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Protein- und KH-Analytik WS: 2012/2013<br />
14. LV<br />
Massenspektrometrie-2<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik MS-2<br />
1
Massenspektrometrie-2<br />
� 1. Einführung<br />
� 2. Aufbau eines Massenspektrometers<br />
� 2.1 Einlaßsysteme<br />
� 2.2 Ionenquelle<br />
� 2.3 Trennsystem/Auflösung<br />
� 2.4 Detektor<br />
� 2.5 Massenspektrum<br />
� 3. Harte Ionisationsarten<br />
� 4. Weiche Ionisationsarten<br />
� 4.1 Chemische Ionisation<br />
� 4.2 Fast Atom Bombardement<br />
� 5. Spektrometertypen<br />
� 5.1 Magnetfeld-Massenspektrometer<br />
� 5.2 Flugzeit-Massenspektrometer<br />
� 5.3 Quadrupol-Massenspektrometer<br />
� 5.4 Ionenfallen-Massenspektrometer<br />
� 6. Spektrenvergleich zwischen harter und weicher Ionisation<br />
� 7. “Anhang” Fragmentierungen in der MS, Applikationen<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik MS-1/2<br />
2
Massenspektrometrie-2<br />
� 1. Einführung<br />
• Analysenmethode zur Bestimmung chemischer<br />
Elemente od. Verbindungen.<br />
• Die Massenspektrometrie ist eine wichtige Methode der<br />
analytischen Chemie bei der Aufklärung der Struktur<br />
und Zusammensetzung von Verbindungen und<br />
Gemischen.<br />
• Bestimmung der Molmassen (Molekulargewichte).<br />
• Detektor für GC und HPLC.<br />
• Ermittlung der Isotopenverhältnisse der Atome in einer<br />
Probe.<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik MS-1/2<br />
3
1. Einführung<br />
� Analyte werden in An- und Kationen ionisiert,<br />
die danach im gasförmigen Zustand vorliegen.<br />
• Die Ionen werden nach ihrem Masse-zu-<br />
Ladungsverhältnis (m/z) getrennt (“Abzisse”).<br />
• Für einen Analyten wird die Häufigkeit, mit der<br />
geladene Moleküle (Ionen) und deren Massen-<br />
fragmente auftreten, bestimmt. (“Ordinate”).<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik MS-1/2<br />
4
1. Einführung<br />
� Atomare Masseneinheit:<br />
Sie wird bei der Angabe von Atom- und Molekülmassen<br />
verwendet.<br />
Einheitenzeichen: u oder amu (atomic mass unit)<br />
Im anglo-amerikanischen Raum wird das Dalton anstatt der<br />
amu benutzt, wobei gilt:<br />
1 amu = 1 Da<br />
u/amu/Da: gleich 1/12 der Masse von einem<br />
Atom 12C und entspricht in etwa der<br />
Masse eines H-Atoms (1,66 · 10-27 kg).<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik MS-1/2<br />
5
1. Einführung<br />
� Dalton: (Da) ist eine nach dem englischen Naturforscher<br />
John Dalton benannte, nicht SI-konforme Masseneinheit<br />
(der Biochemie, organ. Chemie in den USA).<br />
Obwohl in Deutschland die atomare Masseneinheit eine<br />
gesetzliche Einheit im Meßwesen ist und das Dalton als<br />
besonderer Name hierfür betrachtet werden kann, ist<br />
das Dalton in Deutschland weder gesetzlich, noch<br />
normgerecht.<br />
Gebräuchlich ist vor allem das 1000-fache des Dalton:<br />
1000 Dalton = 1 Kilodalton = 1 kDa.<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik MS-1/2<br />
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1. Einführung<br />
� Der qualitative (Erkennung von unbekannten<br />
Substanzen) und der quantitative Nachweis<br />
sehr kleiner Substanzmengen (10 -15 g =<br />
femtogramm, fg) ist möglich.<br />
• Massenspektrometer dienen der Messung<br />
der Iosotopenzusammensetzung<br />
chemischer Elemente.<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik MS-1/2<br />
7
Massenspektrometrie-2<br />
� 2. Aufbau eines Massenspektrometers<br />
Steuer- und Auswerteeinheit<br />
Probeneinlaß Ionenquelle Analysator Detektor<br />
Moleküle Moleküle/Ionen Ionen Elektronen<br />
Vakuumsystem Vakuumsystem<br />
Vakuumsystem<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik MS-1/2<br />
8
2. Aufbau einer Massenspektrometers<br />
Datensystem:<br />
Steuerung der Geräteparameter,<br />
Aufnahme und Auswertung der MS-Spektren<br />
Steuer- und Auswerteeinheit<br />
Probeneinlaß Ionenquelle Analysator Detektor<br />
Moleküle Moleküle/Ionen Ionen Elektronen<br />
Vakuumsystem Vakuumsystem<br />
Vakuumsystem<br />
Vakuumsystem:<br />
mittlere freie Weglänge (Ionen),<br />
Isolation für Hochspannung (Detektor, Quelle)<br />
Drehschieberpumpe: Vorvakuum (< 10 -1 mbar)<br />
Turbopumpen : Hochvakuum (
2. Aufbau einer Massenspektrometers<br />
Trennsystem<br />
Magnet<br />
Probeaufgabe<br />
Einlaßsystem<br />
Probemoleküle<br />
Ionenquelle<br />
Ionen<br />
Beschleunigungsplatten<br />
100<br />
%<br />
0<br />
40<br />
Steuersystem-/<br />
Auswerteeinheit<br />
Massenspektrum<br />
60 80 100 140 180<br />
Verstärkung,<br />
Detektion<br />
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m/z<br />
10
2. Aufbau einer Massenspektrometers<br />
� 2.1 Einlaßsysteme<br />
• Injektion der Probe, ohne dass das Vakuum<br />
verloren geht!<br />
• 3 Injektionsvarianten.<br />
� Indirekter Einlaß<br />
- Gase ins MS, Probenverdampfung (flüssig, fest) bei<br />
500°C (unzersetzt) im Vorratsgefäß – dann zur IQ.<br />
� Direkter Einlaß<br />
- Für Substanzen, die sich schlecht verdampfen lassen.<br />
- Substanzen werden mit Schubstange in die Ionenquelle<br />
(IQ) eingeschleust.<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik MS-1/2<br />
11
2. Aufbau einer Massenspektrometers<br />
• 3 Injektionsvarianten.<br />
� Trennmethode – MS (Die Chromatographie als<br />
Einlaßsystem für die Massenspektrometrie?).<br />
� GC-MS<br />
� LC-MS<br />
• Ander Methoden<br />
o CE-MS<br />
o ICP-MS.<br />
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2. Aufbau einer Massenspektrometers<br />
� 2.2 Ionenquelle (Ionenerzeugung)<br />
• Erzeugung von Ionen aus neutralen Molekülen oder<br />
Elementen.<br />
• Quelle der Ionisation:<br />
� Elektronen,<br />
� Ionen,<br />
� Moleküle,<br />
� Photonen,<br />
� Thermische Energie,<br />
� Elektrische Energie.<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik MS-1/2<br />
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Abstoßungselektrode<br />
2. Aufbau einer Massenspektrometers<br />
� 2.2 Ionenquelle (Ionenerzeugung)<br />
Moleküle<br />
Elektronen<br />
Anode<br />
Glühkathode<br />
Ionen<br />
Ionen-Fokussierungselektroden<br />
Beschleunigungselektroden<br />
Ionenstrahl<br />
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Analysator<br />
14
2. Aufbau einer Massenspektrometers<br />
� 2.2 Ionenquelle (Ionenerzeugung)<br />
• Ionenquelle und Einlaßsystem bilden oft eine Einheit.<br />
• Am Ausgang der IQ resultieren meist positive Ionen.<br />
• Diese werden zum Anlysator hin beschleunigt.<br />
• Es werden in der MS unterschiedliche<br />
Ionisationsarten verwendet.<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik MS-1/2<br />
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2. Aufbau einer Massenspektrometers<br />
�2.2 Ionenquelle (Ionisationsarten)<br />
MS-Ionisationsart Ionisationsquelle Reaktionsablauf<br />
• Elektronenstossionisation Elektronen M + e - M + + 2e -<br />
• Chemische Ionisation Reagenzgasionen M + CH 5 + MH + + CH 4<br />
• Fast Atom Bombardement Atome M + X (M + X) +<br />
• Sekundärionenanregung Ionen M + Ar + M + + Ar<br />
• Photoionisation UV-Strahlung M + h·ν M + + e -<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik MS-1/2<br />
16
2. Aufbau einer Massenspektrometers<br />
� 2.3 Trennsystem (Analysator)<br />
• Elektrisches Sektorfeld<br />
• Ionentrennung im Magnetfeld<br />
• Flugzeitanalysator (TOF)<br />
• Quadrupol<br />
• Elektrische Ionenfalle (ion trap)<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik MS-1/2<br />
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2. Aufbau einer Massenspektrometers<br />
� 2.3 Trennsystem (Auflösung)<br />
• Vergleich mit Gitter in der Spektroskopie,<br />
• In der MS wird nicht nach der Wellenlänge bzw der<br />
Energie der Photonen zerlegt, sondern nach dem<br />
Masse-zu-Ladungsverhältnis.<br />
• Ziele:<br />
� Unterscheidung minimaler Massenunterschiede,<br />
� Hoher Durchfluss von Ionen ergibt einen gut<br />
auswertbaren Ionenstrom.<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik MS-1/2<br />
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2. Aufbau einer Massenspektrometers<br />
� 2.3 Trennsystem (Auflösung)<br />
Relative Intensität, %<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
Δm<br />
50 %<br />
m m + Δm<br />
10 %<br />
m/z<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik MS-2<br />
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2. Aufbau einer Massenspektrometers<br />
� 2.4 Detektor (“Auffänger”)<br />
• Photomultiplier<br />
• SEV<br />
• Faraday-Auffänger<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik MS-2<br />
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2. Aufbau einer Massenspektrometers<br />
� 2.5 Massenspektrum<br />
50<br />
Relative Intensität [%] 100<br />
Fragmentionenpeak<br />
15<br />
Basispeak 31<br />
Fragmentionenpeak<br />
29<br />
M +.<br />
Molekülpeak<br />
32<br />
Isotopenpeak<br />
10 20 30 40<br />
Masse/Ladung [m/z]<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik MS-1/2<br />
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3. Harte Ionisation<br />
� Elektronenstoßionisation, EI: electron impact<br />
• Gase, verdampfbare Flüssigkeiten Feststoffe können<br />
durch Elektronen-Stoß-Ionisation ionisiert<br />
werden.<br />
• Elektronen mit einer Energie von ca. 5 bis 200 eV<br />
werden verwendet (aus Stabilitätsgründen<br />
verwendet man oft 70 eV).<br />
• M + e - → M + + 2 e -<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik MS-2<br />
22
3. Harte Ionisation<br />
� Elektronenstoßionisation, EI: electron impact<br />
• Durch den Zusammenstoß der Elektronen mit den<br />
Molekülen wird Energie auf die Moleküle übertragen<br />
und es werden primäre positive Ionen erzeugt.<br />
• Diese primären Ionen sind meistens sehr<br />
instabil und zerfallen ganz oder teilweise zu<br />
kleineren geladenen Massenfragmenten.<br />
• Bei der Ionisation einer Substanz fragmentiert diese<br />
in ein vorhersehbares Ionen-Muster.<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik MS-2<br />
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4. Weiche Ionisationsarten<br />
� CI,<br />
� FAB,<br />
� ESI,<br />
� MALDI u.a.<br />
• Bildung von Quasimolekülionen.<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik MS-2<br />
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4. Weiche Ionisationsarten<br />
Bildungsprozesse von Quasimolekülionen<br />
Prozess-Bezeichnung Reaktionsablauf<br />
• Protonierung M + H + [M + H] +<br />
• Deprotonierung M [M – H] - + H +<br />
• Kationisierung M + K + [M + K] + od. Na<br />
• Hybridabstraktion M [M – H] + + H -<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik MS-2<br />
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4. Weiche Ionisationsarten<br />
4.1 Chemische Ionisation, CI: chemical ionisation<br />
• Bei der CI wird ein Gas zugeführt, das durch EI<br />
angeregt / ionisiert wird.<br />
• Die aus dem Gas gebildeten Ionen reagieren dann<br />
mit dem Analyten und ionisieren ihn.<br />
• Der Fragmentierungsgrad ist geringer als bei der<br />
Elektronen-Ionisation.<br />
• M + CH 5 + → MH + + CH4<br />
• Reagenzgasionen<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik MS-2<br />
26
4. Weiche Ionisationsarten<br />
� 4.1 Chemische Ionisation<br />
Primärelektronenstrahl<br />
Reaktionsgas<br />
Kathode<br />
Ionisierung<br />
Ionenstrom<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik MS-2<br />
Analysator<br />
27
4. Weiche Ionisationsarten<br />
� 4.2 Fast Atom Bombardement<br />
FAB-<br />
Kanone<br />
Target<br />
Probe<br />
Xenonstrahl<br />
Ionenstrom<br />
Analysator<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik MS-2<br />
28
5. Spektrometertypen<br />
5.1 Magnetfeld-Sektorfeld-Massenspektrometer<br />
• Grundlage der Probeionentrennung ist ihre<br />
Ablenkung in einem magnetischen Feld,<br />
• Die Ionisierung der Moleküle erfolgt mit Hilfe von<br />
Beschleunigungsplatten auf hohe Geschwindigkeiten.<br />
• Das erfolgt durch Umwandlung der in einem<br />
elektrischen Feld von einigen Kilovolt erzeugten<br />
potentiellen Energie in kinetische Energie.<br />
• Die beschleunigten Ionen gelangen in das Magnetfeld,<br />
in dem sie durch die Lorenzkraft auf eine<br />
Kreisbahn gelenkt werden.<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik MS-2<br />
29
5. Spektrometertypen<br />
5.1 Magnetfeld-Sektorfeld-Massenspektrometer<br />
Ionisation Beschleunigung Ablenkung im Magnetfeld<br />
Zentrifugalkraft<br />
r<br />
m 1 > m 2 > m 3<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik MS-2<br />
Lorenzkraft<br />
30
5. Spektrometertypen<br />
5.1 Magnetfeld-Sektorfeld-Massenspektrometer<br />
Dabei ist die Bewegung, die durch die Zentrifugalkraft F Z<br />
(1) entsteht, der Lorenzkraft F L (2) in einem bestimmten<br />
Maß entgegen gerichtet (siehe vorheriges Bild).<br />
F Z ist proportional der Masse m des Ions und dem Quadrat<br />
seiner Geschwindigkeit v und indirekt dem Radius r der<br />
Flugbahn.<br />
F<br />
Z<br />
m⋅ν<br />
2<br />
=<br />
r<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik MS-2<br />
31
5. Spektrometertypen<br />
5.1. Magnetfeld-Sektorfeld-Massenspektrometer<br />
F L ist direkt proportional der Elementarladung e (e =<br />
1,6 × 10 −19 C) und der Geschwindigkeit des Ions sowie<br />
der angelegten Magnetfeldstärke H.<br />
F = e⋅ν ⋅ H<br />
L<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik MS-2<br />
32
5. Spektrometertypen<br />
5.1 Magnetfeld-Sektorfeld-Massenspektrometer<br />
Beide Kräfte gelangen in einen Gleichgewichtszustand,<br />
dessen mathematischer Zusammenhang aus folgender<br />
Gleichung hervorgeht:<br />
m⋅<br />
ν<br />
r<br />
2<br />
ν<br />
= e⋅<br />
⋅<br />
H<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik MS-2<br />
33
5. Spektrometertypen<br />
5.1 Magnetfeld-Sektorfeld-Massenspektrometer<br />
Schwere Ionen werden bei konstanten<br />
Magnetfeldbedingungen auf kleinere und<br />
Ionen geringerer Massen auf größere<br />
Kreisbahnen abgelenkt.<br />
Ionen mit identischem Masse-zu-<br />
Ladungsverhältnis befinden sich auf<br />
identischen Flugbahnen und werden am<br />
gleichen Punkt des Detektors registriert.<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik MS-2<br />
34
5. Spektrometertypen<br />
5.1 Magnetfeld-Sektorfeld-Massenspektrometer<br />
Ionisation Beschleunigung Ablenkung im Magnetfeld<br />
Zentrifugalkraft<br />
r<br />
m 1 > m 2 > m 3<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik MS-2<br />
Lorenzkraft<br />
35
5. Spektrometertypen<br />
5.2 Flugzeit-Massenspektrometer<br />
Kathode Flugrohr<br />
Ionenquelle<br />
Beschleunigungsgitter<br />
schwere<br />
langsame<br />
Ionen (M2)<br />
leichte<br />
schnelle<br />
Ionen (M1)<br />
Detektor<br />
100<br />
%<br />
Massenspektrum<br />
10 000<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik MS-2<br />
0<br />
M1<br />
M2<br />
20 000<br />
m/z<br />
36
5. Spektrometertypen<br />
5.3 Quadrupol-Massenspektrometer<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik MS-2<br />
37
5.4 Ionenfalle<br />
Ringelektrode<br />
Abstandshalter<br />
Austrittslinse<br />
Ionenauslass<br />
eingeschlossene<br />
Ionen<br />
VerschlusselektrodeEinlassfokussierung<br />
Ioneneinlass<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik MS-2<br />
38
Relative Intensität, %<br />
6. Spektrenvergleich harte/weiche Ionisation<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
40<br />
60<br />
61<br />
73<br />
Mannose<br />
M Mannose<br />
50 60 70 80 90 100 120 140 160 180 200<br />
m/z<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik MS-2<br />
39
(Relative Intensität, %)<br />
6. Spektrenvergleich harte/weiche Ionisation<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
40<br />
Mannose<br />
162<br />
+<br />
[M+NH 4 ]<br />
180<br />
50 60 70 80 90 100 120 140 160 180 200<br />
198<br />
m/z<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik MS-2<br />
40
7. Anhang<br />
7. Fragmentierungen in der Massenspektrometrie<br />
� 7.1 Benzylspaltung<br />
• Homolytische Spaltung einer Bindung.<br />
• Ausbildung eines Tropyl-Kations.<br />
.<br />
+<br />
CH2 R R<br />
CH2 M. Gey: Protein-/KH-Analytik MS-2<br />
Tropylium-Kation<br />
41
7. Fragmentierungen in der Massenspektrometrie<br />
� 7.2 Allylspaltung<br />
• Homolytische Fragmentierung einer Allylbindung.<br />
• Bildung eines stabilisierten Kations.<br />
CH CH CH 2 CH 2<br />
+<br />
.<br />
CH CH CH2 CH CH CH2 CH3 42
7. Fragmentierungen in der Massenspektrometrie<br />
� 7.3 Alkylspaltung<br />
• Spaltungen an Verzweigungspunkten der Kohlenstoffkette<br />
sind favorisiert.<br />
• Die positive Ladung verbleibt bevorzugt am<br />
höchstsubstituierten Kohlenstoffatom.<br />
CH 2 CH 2 C<br />
CH 3<br />
CH 3<br />
.<br />
+<br />
.<br />
CH2 CH2 C<br />
CH 3<br />
CH 3<br />
43
7. Fragmentierungen in der Massenspektrometrie<br />
� 7.4 α-Spaltung<br />
R<br />
• Positive Ladungen können durch benachbarte Heteroatome<br />
stabilisiert werden. Hier wird die Bindung in α-Stellung<br />
zum Heteroatom bevorzugt gespalten. Dabei erfolgt meist<br />
die Eliminierung der schwereren Substituenten.<br />
• Die α-Spaltungen treten oft in Carbonyl-Verbindungen<br />
und Ethern sowie in Nachbarschaft zu Thiol-, Amino- oder<br />
Hydroxylgruppen auf.<br />
O<br />
CH 2 C R´<br />
.<br />
+<br />
R<br />
O<br />
.<br />
CH2 C R´<br />
O<br />
C R´<br />
44
7. Fragmentierungen in der Massenspektrometrie<br />
� 7.5 Decarbonylierung<br />
• Der Fragmentierungsprozess der Decarbonylierung ist<br />
meist eine Folgereaktion nach der α-Spaltung.<br />
O<br />
C R´<br />
CO R´<br />
45
7. Fragmentierungen in der Massenspektrometrie<br />
� 7.6 Onium-Spaltung<br />
• Diese Fragmentierungsprozesse sind Folgereaktionen der<br />
bei der α-Spaltung gebildeten Oxonium- oder auch<br />
Ammonium-Kationen.<br />
• Bei einer Onium-Spaltung wird ein Wasserstoffatom aus<br />
einem an das Heteroatom gebundenen Rest unter<br />
Abspalten dieses Restes auf das Heteroatom übertragen.<br />
H<br />
CH 2<br />
N<br />
C 3H 6<br />
H<br />
CH 2<br />
N<br />
46
7. Fragmentierungen in der Massenspektrometrie<br />
� 7.7 Retro-Diels-Alder-Reaktion<br />
• Diese Spaltung tritt auf, wenn Sechsringe eine<br />
Doppelbindung im Molekül besitzen.<br />
• Die Fragmentierung kann als eine Art Umkehrung der<br />
Diels-Alder-Reaktion aufgefasst werden, jedoch entsteht<br />
hier eine Radikal-Kation.<br />
.<br />
+<br />
.<br />
+<br />
47
7. Fragmentierungen in der Massenspektrometrie<br />
� 7.8 McLafferty-Umlagerung<br />
• Bei dieser Umlagerungsreaktion wird ein Wasserstoffatom<br />
über einen „Sechsring-Übergangszustand“ auf eine<br />
Doppelbindung übertragen.<br />
• Zeitgleich erfolgt die Abspaltung eines Ethenmoleküls.<br />
C 3<br />
C 2<br />
H<br />
C 1<br />
X<br />
.<br />
+ C 3<br />
C 2<br />
H .<br />
X +<br />
C 1<br />
Y<br />
X = O, S, NR, CH2 Y = H, Alkyl, OH, SH, SR, NHR, NH2, NR2 Y<br />
48
� 7.9 Fragmentierung von Propyldiethylamin<br />
α−Spaltung<br />
H 3C<br />
- C 2 H 5<br />
CH 3<br />
M = 115<br />
N<br />
- CH 3<br />
CH 3<br />
CH 3<br />
H2C N + N+<br />
86<br />
CH3 H3C H<br />
Onium-Reaktion<br />
- C 3 H 6<br />
Propyldiethylamin<br />
α−Spaltung<br />
H<br />
CH 2<br />
100<br />
CH 2<br />
CH 3<br />
N+<br />
N<br />
+<br />
58 H2C 72<br />
CH 3<br />
H 2C<br />
H<br />
McLafferty-<br />
Umlagerung<br />
CH 2<br />
N<br />
+<br />
CH 3<br />
- C 2 H 4<br />
CH 3<br />
CH 3<br />
49
7. Fragmentierungen in der Massenspektrometrie<br />
� 7.10 MS von Propyldiethylamin<br />
50<br />
Relative Intensität [%] 100<br />
58<br />
72<br />
86<br />
100<br />
115<br />
M +.<br />
m/z 50 100 150<br />
50
7. Fragmentierungen in der Massenspektrometrie<br />
� 7.11 n-Propylbenzol: Fragmentierung und MS-Spektrum<br />
50<br />
Relative Intensität [%] 100<br />
51<br />
77<br />
65<br />
91<br />
M +.<br />
120<br />
m/z 50 100 150<br />
77<br />
CH 2 CH 2 CH 3<br />
91<br />
51
7. Fragmentierungen in der Massenspektrometrie<br />
� 7.12 n-Hepten: Fragmentierung und MS-Spektrum<br />
50<br />
Relative Intensität [%] 100<br />
41<br />
57<br />
M +.<br />
98<br />
m/z 50 100 150<br />
57<br />
H 3C CH 2<br />
41<br />
52
Protein- und KH-AnalytiK WS: 2012/13<br />
15. LV<br />
Kopplungstechniken-2<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik KT-2<br />
1
Kopplungstechniken-2<br />
1. Problem der LC-MS-Kopplung<br />
HPLC-Säule<br />
Flußrate :<br />
~1 ml/min<br />
Säuleneluat<br />
E<br />
Probemoleküle<br />
E<br />
E<br />
Interface<br />
E E<br />
E E<br />
E E<br />
E E<br />
E E<br />
Reduzierung der Elutionsmittelvolumens<br />
(Relative Intensität, %)<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
Hochvakuum<br />
MS<br />
Massenspektrum<br />
60 61<br />
40 50 60 70 80 90 100 120 140 160 180 200<br />
m/z<br />
145<br />
163<br />
181<br />
2
1. Interfacing (Conversion process)<br />
State-ofmatter:<br />
LC Conversion Process MS<br />
Liquidphase<br />
Pressure: Atmospheric<br />
Charge<br />
State:<br />
Neutral<br />
(ionic)<br />
Evaporation<br />
Pressure Reduction<br />
Gasphase<br />
High<br />
Vacuum<br />
Ionization Ionic<br />
3
Kopplungstechniken-2<br />
2. “LC-MS-Interfacing<br />
2.1 Moving-belt interface (MPI)<br />
(Transportband zwischen HPLC-Säule und MS)<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik KT-2<br />
4
Kopplungstechniken-2<br />
HPLC-<br />
Säule<br />
Flußrate :<br />
~1 ml/min<br />
E<br />
Erhitzen der Moleküle<br />
auf dem Band<br />
E E E E<br />
MS<br />
Transportband<br />
Vakuum<br />
Verdampfung<br />
des Elutionsmittels<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik KT-2<br />
E<br />
5
2. “LC-MS-Interfacing<br />
2.2 Direct Liquid Introduction (DLI)<br />
(Direkteinlass des Säuleneluates in<br />
das MS)<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik KT-2<br />
6
A: Microbore-Säule<br />
1-2 mm I.D.<br />
Fluss : ~ 0, 1 ml/min<br />
Säulen-Eluat und Probemoleküle<br />
Fluss: 0.1-0,01 ml/min<br />
B: Kapillare<br />
50-500 µm I.D.<br />
E Splitter<br />
E<br />
E<br />
Splitter<br />
E<br />
E<br />
E E<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik KT-2<br />
MS<br />
7
2. “LC-MS-Interfacing<br />
2.3 Particle-Beam Interface (PBI)<br />
(Partikelstrahl-Interface)<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik KT-2<br />
8
LC-<br />
Eluat<br />
Fused-Silica-<br />
Kapillare<br />
Nebulizer<br />
Particle-Beam-Interface<br />
Helium<br />
Partikel<br />
Desolvatationskammer<br />
Momentum-<br />
Separator<br />
Lösungsmitteldampf<br />
Transfer-<br />
Kapillare<br />
Ionenquelle<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik KT-2<br />
MS<br />
MS<br />
9
LC-MS Particle Beam Interface, PBI<br />
1. HPLC-Säule<br />
hochverdünnte Probemoleküle<br />
in der<br />
mobilen Phase (Eluat)<br />
4. Separation<br />
Dampf MS<br />
Dampf<br />
Vakuum<br />
PM<br />
PM<br />
Trennung der Probe- und<br />
Eluatmoleküle bei erhöhter<br />
T und niedrigem Druck<br />
2. Vernebelung 3. Desolvatisierung<br />
Helium<br />
Aerosolbildung mit Helium<br />
und durch Thermospray<br />
oder Pneumatikspray<br />
Konzentrierung der Probemoleküle<br />
bei erhöhter Temperatur<br />
und Niederdruck<br />
5. Ionisierung 6. MS-Analyse<br />
Ionisierung der Probemoleküle<br />
durch Chemische<br />
Ionisation (CI) oder EI<br />
Heizung Vakuum<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik KT-2<br />
Desolvatationskammer<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
Massenspektrum<br />
10 000<br />
m/z<br />
Trennung und Analyse<br />
der Ionen nach ihrem<br />
m/e-Verhältnis<br />
B<br />
A<br />
M<br />
10
2. “LC-MS-Interfacing<br />
2.4 Thermospray (TSP)<br />
(Zerstäubung in der erhitzten Kapillare)<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik KT-2<br />
11
LC-MS Thermospray, TSP<br />
1. HPLC-Säule<br />
hochverdünnte Probemoleküle<br />
in der<br />
mobilen Phase (Eluat)<br />
4. Vakuum<br />
Desolvatisierung der<br />
Droplets, keine Beeinflussung<br />
der Probemoleküle<br />
2. Verdampfer-<br />
Rohr<br />
Überführung des Eluates<br />
in eine geheizte Kapillare<br />
3. Vernebelung<br />
Bildung von Droplets beim<br />
Enspannen der Flüssigkeit<br />
aus der Kapillare<br />
5. Ionisierung 6. MS-Analyse<br />
Filament Entladungs-Elektrode<br />
Entstehung von Probeionen<br />
durch CI, Discharge-<br />
Elektrode, Filament<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
Massenspektrum<br />
10 000<br />
Trennung und Analyse<br />
der Ionen nach ihrem<br />
m/e-Verhältnis<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik KT-2<br />
�<br />
B<br />
A<br />
M<br />
m/z<br />
12
2. “LC-MS-Interfacing<br />
2.5 Electrospray (ESI)<br />
(Zerstäubung im elektrischen Feld)<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik KT-2<br />
13
LC-MS-IV HPLC - Electrospray - MS-MS<br />
O 2<br />
HPLC<br />
5 KV<br />
760 Torr<br />
Atmosphärendruckionenquelle<br />
Fused<br />
Silica<br />
Kapillare<br />
( ~75 µm )<br />
Stickstoff<br />
geladene<br />
Tröpfchen<br />
Stickstoff<br />
Öffnung (100 µm i.D.)<br />
Vakuum<br />
Quadropol -<br />
MS 1<br />
Stoßkammer<br />
10 - 6 Torr<br />
Quadropol -<br />
MS 2<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik KT-2<br />
Detektor<br />
14
LC-MS-IV Vorgänge beim Electrospray<br />
1. HPLC-Säule<br />
hochverdünnte Probemoleküle<br />
in der<br />
mobilen Phase (Eluat)<br />
2. Fused-silica<br />
Kapillare<br />
Überführung des Eluates<br />
in eine geheizte Kapillare<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik KT-2<br />
15
LC-MS-IV Vorgänge beim Electrospray<br />
3. Spannung<br />
~5 kV<br />
Bildung von geladenen<br />
Droplets bei einem Potential<br />
um 5kV i.d. Gasphase<br />
4. Desolvatisierung<br />
Reduzierung der mobilen<br />
Phase innerhalb<br />
geladener Droplets<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik KT-2<br />
16
LC-MS-IV Vorgänge beim Electrospray<br />
5. "Eruption"<br />
Rückstand<br />
Austreten (Eruption) der<br />
Probeionen aus den<br />
Droplets in der Gasphase<br />
6. MS-Analyse<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
Massenspektrum<br />
1 000<br />
m/z<br />
Trennung der Ionen<br />
nach m/z-Verhältnis<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik KT-2<br />
B<br />
A<br />
M<br />
17
LC-MS Electrospray, ESI<br />
1. HPLC-Säule<br />
hochverdünnte Probemoleküle<br />
in der<br />
mobilen Phase (Eluat)<br />
4. Desolvatisierung<br />
Reduzierung der mobilen<br />
Phase innerhalb<br />
geladener Droplets<br />
2. Fused-silica<br />
Kapillare<br />
Überführung des Eluates<br />
in eine geheizte Kapillare<br />
5. "Eruption"<br />
Rückstand<br />
Austreten (Eruption) der<br />
Probeionen aus den<br />
Droplets in der Gasphase<br />
3. Spannung<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik KT-2<br />
~5 kV<br />
Bildung von geladenen<br />
Droplets bei einem Potential<br />
um 5kV i.d. Gasphase<br />
6. MS-Analyse<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
Massenspektrum<br />
10 000<br />
m/z<br />
Trennung der Ionen<br />
nach m/e-Verhältnis<br />
B<br />
A<br />
M<br />
18
LC-MS-MS: Application, MS-MS-Spectra of sugars<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik KT-2<br />
19
2. “LC-MS-Interfacing<br />
2.6 Continuous-flow fast atom bombardment<br />
(CF-FAB)<br />
(Bombardierung mit energiereichen<br />
Atomen)<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik KT-2<br />
20
LC-MS Continuous Flow-FAB, CF-FAB<br />
1. Mikro-HPLC<br />
verdünnte Probemoleküle<br />
in der mobilen Phase<br />
(Eluat) aus der µ-LC-Säule<br />
4. Atombeschuß<br />
Target<br />
A<br />
Beschuß der Moleküle auf<br />
dem Target in der Ionenquelle<br />
mittels FAB-Kanone<br />
A<br />
FAB-kanone<br />
2. Glyzerinzufuhr 3. FAB-Target<br />
Zumischen von 10-15 %<br />
Glyzerin zum Eluat in einer<br />
Fused-silica Kapillare<br />
Überführung des "Glyzerineluates"<br />
über eine Fusedsilica<br />
Kapillare zum Target<br />
5. Ionisation 6. MS-Analyse<br />
Target<br />
Ionisation der Moleküle<br />
nach Beschuß mit der<br />
FAB-Kanone<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik KT-2<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
Massenspektrum<br />
10 000<br />
m/z<br />
Trennung und Analyse<br />
der Ionen nach ihrem<br />
m/e-Verhältnis<br />
B<br />
A<br />
M<br />
Target<br />
21
2. “LC-MS-Interfacing<br />
2.7 Atmospheric-Pressure Chemical Ionisation<br />
(APCI)<br />
(Chemische Ionisierung unter<br />
Normaldruck)<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik KT-2<br />
22
LC-MS Atmospheric Pressure Chemical Ion., APCI<br />
1. HPLC-Säule<br />
hochverdünnte Probemoleküle<br />
in der<br />
mobilen Phase (Eluat)<br />
4. Gaszufuhr, CI<br />
Gas<br />
Zufuhr von Gas zu der<br />
Mischung aus Eluat- und<br />
Dampf-Droplets, APCI<br />
2. Fused-silica<br />
Kapillare<br />
Überführung des Eluates<br />
in eine geheizte Kapillare<br />
3. Heated-Nebulizer<br />
5. Entladung, API 6. MS-Analyse<br />
Massenspektrum<br />
�<br />
Corona-Nadel<br />
Entladung der Droplets<br />
unter Atmosphärendruck<br />
mittels "Corona-Nadel"<br />
M. Gey: Protein-/KH-Analytik KT-2<br />
Verdampfung des Eluates<br />
in der geheizten Fused-silica<br />
Kapillare (Spray-Technik)<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
10 000<br />
m/z<br />
Trennung und Analyse<br />
der Ionen nach ihrem<br />
m/e-Verhältnis<br />
B<br />
A<br />
M<br />
23
LC-MS - Collision-induced Dissociation, CID<br />
MS spectrum of sulfamethazine without CID<br />
Only little fragmentation<br />
Applikationen, Firma Agilent KT-2<br />
24
LC-MS - without CID<br />
MS spectrum of sulfamethazine with CID<br />
More fragmentation<br />
= more structural<br />
information<br />
Applikationen, Firma Agilent KT-2<br />
25
LC-MS-II - Collision-induced Dissociation, CID<br />
Applikationen, Firma Agilent KT-2<br />
Sulfamethazine<br />
fragmentation<br />
26
3. Applications (Figure 23)<br />
Molecular Weight Determination (green fluorescent protein)<br />
MW = 26.828,84<br />
Applikationen, Firma Agilent KT-2<br />
27
LC-MS-II - Environmental-Applications (Figure 36)<br />
MS spectra of phenylurea herbicides,<br />
Applikationen, Firma Agilent KT-2<br />
28