Untersuchungen zur Struktur und Funktion des Multienzyms ...

Diskussion 109
welches den N-terminalen Bereich der A-Domäne des aminosäureaktivierenden
Moduls EB repräsentiert (Haese et al., 1994). Eigene Untersuchungen innerhalb
dieser Arbeit ergaben, dass der Antikörper mAB21.1 unter anderem mit dem Peptid
LVVT reagiert. In einem Verdrängungs-ELISA wurde die Reaktion der ESYN mit
dem Antikörper um 77% bei einer Peptidkonzentration von 2 mg/ml gesenkt.
Stachelhaus et al., (1995a) konnten über Deletionsstudien an GrsA die minimale
Größe einer Aminosäure-aktivierenden Domäne mit 556 Aminosäuren festlegen. Es
wurden drei verkürzte Versionen des GrsA-Gens erzeugt. Der Klon PheATS-His
wurde um die vermeintliche Racemerisierungeinheit (291 Aminosäuren ) verkürzt.
Ein zweites amplifiziertes GrsA-Fragment (PheAT-His) reduziert das Wildtypprotein
durch eine Deletion von 656 Aminosäuren, bis zu einer konservierten Region, die
typisch für Adenylat- und Thioester-bildende Enzyme ist. Eine Deletion von weiteren
100 Aminosäuren ergab einen Klon PheA-His, der den Aufbau eines Adenylatbildenden
Enzyms hat. Alle drei Derivate von GrsA aktivieren Phenylalanin als
Substrataminosäure in der gleichen Größenordnung, wie der Wildtyp. Die Varianten
PheATS-His und PheAT-His sind auch zur Thioesterbildung befähigt, während PheA-
His diese Aktivität vollständig verloren hat. Für PheATS-His und PheAT-His wurden
dem Wildtyp vergleichbare Werte gefunden. PheA-His besitzt nur 13% der
Wildtypaktivität. Kinetische Untersuchungen haben gezeigt, dass alle drei Varianten
ATP und Phenylalanin mit annähernd der Wildtypaffinität binden. Weiterhin konnte
gezeigt werden, dass PheATS-His nur L-Phenylalanin als Substrat aktivieren kann,
die Fähigkeit zur Erkennung vom entsprechenden D-Isomer ist nicht mehr vorhanden.
Dieckmann et al., (1995) konnten diese Ergebnisse ebenfalls für TycA zeigen, indem
der C-terminale Teil der Domäne bis zum Motiv LTXXGKLXRKAL deletiert wurde.
Die Mutante konnte Phenylalanin nicht als Thioester aktivieren, aber die
Adenylatbildung fand in der Größenordnung des Wildtyplevels statt. Phenylalanin-
Analoga und andere Aminosäuren wurden deutlich weniger (teilweise überhaupt
nicht) aktiviert als das natürliche Substrat L-Phenylalanin (Pavela-Vrancic et al.,
1994c).
Es konnte also gezeigt werden, dass die Substratspezifität in der einzelnen Domäne
lokalisiert ist.
Stachelhaus et al. (1995b) konnten zeigen, dass es möglich ist, über gezielten
Austausch von Domänen im Srf-Operon, Surfactine mit veränderten
Aminosäurebausteinen zu erhalten. Aus Bacillus brevis wurden die Phenylalanin-,