Untersuchungen zur Struktur und Funktion des Multienzyms ...

Materialien und Methoden 31
4 Methoden
4.1 Standardmethoden
wie Restriktionsanalyse, Agarose-Gelelektrophorese und Ligation wurden nach
Sambrook et al., 1989 durchgeführt.
4.2 DNA-Präparation
4.2.1 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli
a) Plasmid-DNA für Restriktionsanalysen
Zur schnellen Isolierung von Plasmid-DNA aus einer großen Anzahl von Klonen
eignet sich folgendes Protokoll nach Birnboim & Doly, (1979).
In 2 ml LB/amp wurde eine E. coli Einzelkolonie über Nacht bei 37°C und 250 rpm
angezogen. Die Zellen wurden abzentrifugiert und in 100 µl Puffer 1 durch vortexen
resuspendiert. Nach 5 min Inkubation bei Raumtemperatur wurden 200 µl Puffer 2
zugegeben, durch Schwenken vorsichtig gemischt und 5 min auf Eis gestellt. Nach
Zugabe von 150 µl Puffer 3 wurde weitere 5 min auf Eis inkubiert, 1 min zentrifugiert
und der Überstand mit 400 µl Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25/24/1) extrahiert.
Die wässrige Phase wurde mit 800 µl Ethanol versetzt und 5 min zentrifugiert. Das
DNA-Pellet wurde mit 50 µl Ethanol (70%) gewaschen, getrocknet und in 50 µl
0,5mM EDTA aufgenommen.
Die Plasmid-DNA konnte dann mit Restriktionsenzymen verdaut werden.