Untersuchungen zur Struktur und Funktion des Multienzyms ...

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Diskussion 113 durchgeführt. Im Allgemeinen reagiert Glutardialdehyd spezifischer als Formaldehyd, zeigt jedoch ebenfalls Reaktionen mit mehreren Aminosäuren, bevorzugt mit Lysin, aber auch mit Cystein, Histidin und Tyrosin (Wang et al., 1975), wobei Sulfhydrylund Aminogruppen bevorzugte Angriffspunkte sind. In kommerziellen Lösungen existieren immer eine Vielzahl von polymeren Formen des cyclischen Hemiacetals nebeneinander, so dass der Abstand zwischen den gelinkten Gruppen nicht vorausgesagt werden kann, ein möglicher Reaktionsmechanismus (ähnlich einer Michael-Kondensation) wird bei Richards et al. beschrieben (Richards et al., 1968). Belädt man das Enzym erst mit L-Valin und cross-linkt anschließend, konnte durch Vergleich mit einem entsprechenden Kontrollexperiment gezeigt werden, dass der Linker die radioaktive Aminosäure nicht verdrängt und die Beladung die Kopplung nicht beeinflusst. Wird dagegen erst gekoppelt und dann versucht zu beladen, wird deutlich, dass das gekoppelte Enzym nicht mehr mit der Aminosäure beladen werden kann. Der Cross-Link-Ort wurde durch Proteaseverdau und Edmanabbau analysiert. Es konnte ein Peptid ermittelt werden; Aminosäureposition 2662 QLAKKL, ein zweites mögliches Peptid konnte nicht detektiert werden. Möglichkeiten für den zweiten Cross-Link-Ort ergeben sich aus der Tatsache, dass Glutardialdehyd bevorzugt Lysinreste vernetzt, die nach Wang et al. und Richards et al. einen geeigneten Cross- Link-Ort repräsentieren (Wang et al., 1975; Richards et al., 1968). Im Bereich der Enniatinsynthetase vom N-Terminus bis einschließlich der Antikörperbindungsstelle für mAB25.91 (Aminosäureposition 1-456) befinden sich 19 Lysinreste als potentielle Vernetzungskandidaten. Bei drei von diesen Lysinresten (Position 81,183 und 231) befindet sich N-terminal in direkter Nachbarschaft eine aromatische Aminosäure, was bei einem chymotryptischen Verdau dazu führt, dass der N-Terminus des Peptides durch die Vernetzung blockiert ist und damit nicht durch Edman-Abbau analysiert werden kann. Da eine Detektion des Peptides mit dem mAB25.91 möglich war, ist die Anwesenheit der Erkennungsstelle (Nukleotidposition 539-1368) im chymotryptischen Peptid zwingend notwendig. Das detektierte Peptid befindet sich innerhalb der zweiten Thiolierungs-Domäne C-terminal zu EB, d. h. das zweite, nicht eindeutige Peptid muss sich am Anfang des Enzyms befinden. Eine zweite Antikörperbindungsstelle konnte durch die Expressionsstudien und Immunanalysen von Haese et al. ausgeschlossen werden (Haese et al., 1993). Durch die Sequenzierung des benötigten PCR-Produkts konnten einige Fehlerpositionen innerhalb der ESYN-Sequenz korrigiert werden. Die
Diskussion 114 Nachsequenzierung von bereits vorhandenen Klonen (Haese et al., 1993) bestätigten diese Korrekturen. Die Änderungen in der Aminosäuresequenz haben keinen Einfluss auf die Homologie zu anderen Peptidsynthetasen, zur Überprüfung wurden Online- Vergleiche mit dem Programm BLAST (Altschul et al., 1997) durchgeführt.
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Untersuchungen zur Struktur und Fun
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I. Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung
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4.7.2 Test von Streptomyces- Transf
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8 Literaturverzeichnis 141 V
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Abbildung 17 Abbildung 18 Abbildung
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III. Tabellenverzeichnis Tabelle 1
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Abkürzungsverzeichnis dNTP Desoxyn
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Abkürzungsverzeichnis srfb Surfact
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Einleitung 2 Das Repertoire des Sek
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Einleitung 4 Nucleotiden (Anticodon
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Einleitung 6 Sequenz und die Strukt
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Einleitung 8 EA und EB sind hochkon
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Einleitung 10 Durch die Auswertung
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Einleitung 12 al. konnten diesen Re
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Einleitung 14 HHxxxDG-Motivs korres
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Einleitung 16 F. scirpi F. sambucin
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Einleitung 18 Sekundärmetabolismus
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Materialien und Methoden 20 2 Mater
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Materialien und Methoden 22 2.3 Che
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Materialien und Methoden 24 Pepstat
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Materialien und Methoden 34 4.2.3 P
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Materialien und Methoden 36 Primerp
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Materialien und Methoden 38 4.4.4 T
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Materialien und Methoden 40 LB/Anti
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Materialien und Methoden 42 von 10-
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Materialien und Methoden 44 1xTAE 4
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Materialien und Methoden 46 Fünfun
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Materialien und Methoden 48 betrage
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Materialien und Methoden 50 Lysozym
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Materialien und Methoden 52 PBS 8 g
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Materialien und Methoden 54 4.7.1.3
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Materialien und Methoden 56 gepuffe
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Seite 79 und 80: Ergebnisse 64 5.1.1 Klonierung des
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Seite 97 und 98: Ergebnisse 82 Tabelle 6 zeigt die A
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Seite 103 und 104: Ergebnisse 88 66kDa 45 36 29 24 1 2
Seite 105 und 106: a) b) c) d) Ergebnisse 90 Abbildung
Seite 107 und 108: Ergebnisse 92 66kDa 45 36 29 24 1 2
Seite 109 und 110: Ergebnisse 94 539-1368 (Aminosäure
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Seite 119 und 120: Diskussion 104 Polyketidsynthase ko
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Seite 123 und 124: Diskussion 108 ungeladendem Zustand
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