Praktikumsunterlagen für das Praktikum ... - Pharmazie

Professor D. Steinhilber 

Institut für Pharmazeutische Chemie 

Max-von-Laue-Straße 9 

60438 Frankfurt am Main 

Praktikumsunterlagen 

für das Praktikum 

BIOCHEMISCHE 

UNTERSUCHUNGSMETHODEN 

UND 

KLINISCHE CHEMIE 

D. Werner, B. Lachmann, B. Sorg 

und M. Messinger 

22. überarbeitete Fassung November 2012 von 

B. Gilbert, A.K. Häfner, B. Hofmann, C. Rödl

ALLGEMEINE HINWEISE................................................................................................................3 

TEIL 1 ENZYMATIK ..........................................................................................................................9 

1 BC-1: QUANTITATIVE GLUCOSE-BESTIMMUNG 10 

2 BC-2: BESTIMMUNG DER MICHAELIS-MENTEN KONSTANTE VON TRYPSIN 25 

TEIL 2 PROTEINBIOCHEMIE UND MOLEKULARBIOLOGIE..............................................33 

3 BC-3: DISKONTINUIERLICHE SDS-ELEKTROPHORESE NACH LÄMMLI 34 

4 BC-4: WESTERN-BLOTTING: PROTEINTRANSFER UND IMMUNDETEKTION 52 

5 BC-5: ELISA (ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY) 61 

6 BC-6: KOMPETITIVE PCR 73 

7 BC-7: DER AMES TEST 84 

8 BC-8: TAQ-DNA-POLYMERASE: ISOLIERUNG UND AUFREINIGUNG 93 

TEIL 3 METABOLISIERUNG VON ARZNEISTOFFEN ..........................................................103 

9 BC-9: BESTIMMUNG DES PROTEINGEHALTES UND DER ENZYMAKTIVITÄT DER 

CYTOCHROME B5 UND P- 450 104 

10 BC-10: BIOTRANSFORMATION VON ACETYLSALICYLSÄURE 110 

TEIL 4: KLINISCHE CHEMIE.....................................................................................................116 

11 KC-1: IMMUNHÄMATOLOGIE 118 

12 KC-2: HÄMATOLOGIE 123 

13 KC-3: KOHLENHYDRAT- UND LIPIDSTOFFWECHSEL 131 

14 KC-4: NIERENFUNKTIONSDIAGNOSTIK, ENZYMDIAGNOSTIK 138

Allgemeine Hinweise

Allgemeine Hinweise 

Hinweise zur Sicherheit im Praktikum 

� Im Praktikumsskript finden Sie bei der Beschreinung jeder Übung einen Abschnitt („Kurzzusammenfassung 

der Sicherheitsinformationen“), der gefahrstoffbezogen die wesentlichsten 

sicherheitsrelevanten Informationen zur jeweiligen Übung in Kurzform wiedergibt. 

Die vollständige Information zu den Gefahrstoffen steht Ihnen in den Ordnern „Gefahrstoffinformationen 

für das Praktikum Biochemische Untersuchungsmethoden einschließlich 

Klinischer Chemie (Teil I bzw. II)“, der im Praktikumssaal ausliegt, zur Verfügung. 

� Zum generellen Umgang mit Gefahrstoffen finden Sie Informationen in den Betriebsanweisungen/ 

Unfallverhütungsvorschriften, die im Praktikum aushängen sowie auf der Internetseite 

des Instituts für Pharmazeutische Chemie zugänglich sind. 

� Ausführliche Informationen zur Sicherheit im Praktikum, auch bezogen auf die einzelnen 

Übungen, erhalten Sie während der Sicherheitsunterweisung zu Beginn des Praktikums. 

� Im Praktikumssaal sind weiterhin Listen mit aktuellen Notrufnummern sowie Ersthelferlisten 

ausgehängt!


Benutzung der Pipetten im Praktikum 

Da Sie in den Praktika Biochemie und Klinische Chemie erstmals mit Kolbenhubpipetten 

arbeiten, und dies erfahrungsgemäß einige Übung erfordert, hier eine kurze Einführung. 

Generell: die Pipetten sind Präzisionsinstrumente (Abweichung i.A.


Benutzung der Photometer im Praktikum 

Beckman UV DU-70 

1.) Das Photometer wird durch Einstecken der Netzstecker von Photometer und Thermostat 

eingeschaltet. Self-check des Photometers abwarten. 

2.) Am Photometer Taste „ON/IDLE“ (oben links) betätigen. 

3.) Thermostat einschalten (separates kleines Gerät, Taste „ON/OFF“). Die Funktion des 

Thermostats im Anzeigenfenster rechts unten überprüfen (Soll: 25°C). Wird der Thermostat 

nicht eingeschalten besteht die Gefahr des Überhitzens der Kammer! 

4.) Benötigte Lichtquellen (UV und/ oder VIS) anschalten. (UV: 190-320nm, VIS: 320- 

900nm). Solange die Anzeige UV blinkt, ist die Lampe noch nicht aufgewärmt. 

5.) Zur Messung bei einer bestimmten Wellenlänge „SINGLE λ“ (linker Tastenblock) wählen 

6.) Parameter einstellen und jeweils mit „ENTER“ bestätigen (zwischen den Menüpunkten 

mit Pfeiltasten wechseln): 

Function: [ABS] 

Read Average 01 

Wavelength: Meßwellenlänge über Zahlenblock eingeben 

Concentration: [None] 

Sample device: one cell (Auswahl über Taste "SEL") 

Cell No. [Cell 1] 

7.) Nullabgleich durchführen: Leerwert in hinterste Kammer einstellen und „START“ drücken 

8.) Messung durchführen: Probe einstellen und „RUN“ drücken. 

Eppendorf ECOM-D 

1.) Gerät an der Rückseite einschalten (Mindestens 10 min. UV-Lampe vorwärmen lassen 

bis zur 1. Messung). 

2.) Nach dem self-check wird das Startdisplay mit der zuletzt verwendeten Methode angezeigt, 

z.B.: 

Ist: 25 Grad 

002 Ü2 Soll: 25 Grad


3.) Methode wählen : "METHOD" drücken, Zahl eingeben (Methodenauflistung s. u.), 

"ENTER" drücken. Erneut "ENTER" drücken um die Methode zu laden �Filterrad dreht 

sich deutlich hörbar 

4.) Das Gerät verlangt nun die Messung eines Nullwerts "RL" (=Reagenzienleerwert): Küvette 

mit Meßlösung einstellen. 

5.) Nullwertessung mit "MEASURE" (!!!) auslösen. NICHT mit "ENTER", da sonst ein 

Programm ausgelöst wird, welches spezielle Küvetten zum Mischen von Lösungen erfordert. 

Wichtig: im Gegensatz zu anderen Photometern stellt das Gerät die Absorption 

am Display nicht auf "000" ein, sondern speichert die gemessene Absorption des 

Leerwerts und zieht diesen automatisch bei weiteren Messungen ab. Der rechts oben 

angezeigte Wert ist also für Sie irrelevant! Sie können die Nullwerteinstellung überprüfen, 

indem Sie einfach Ihren Leerwert nochmals mit "MEASURE" messen. Dann sollte 

das Display z.B. wie folgt aussehen: 

002 Ü2 RL -0.089 

002 0.000 EXT JA 

6.) Küvette mit Probenlösung einstellen, weitere Messungen (der Probenwerte "P") mit 

MEASURE auslösen. 

Die Meßwerte werden unten in der Mitte angezeigt (X.XXX EXT). 

Mit CLEAR und/oder METHOD kommt man prinzipell zurück zum Startdisplay. 

Methode Nr. Name der Methode Wellenlänge des Filters 

001 Ü1 340 nm 

002 Ü2 405 nm 

003 Ü3 578 nm

Enzymatik 8 

Hitachi U-2000 Spectrophotometer 

� Gerät an der Vorderseite einschalten (Kippschalter „Power“ unter Tastenfeld) und Abschluss 

des Selbsttests abwarten. Für alle Punkte muss „OK“ angezeigt werden, ansonsten 

Assistenten kontaktieren! 

� Gerät für ca. 5 min warm werden lassen 

� Mit „Main Menu“ in das Hauptmenü wechseln 

� Menüpunkt „1. Photometrie“ wählen: „1“ auf dem Zahlenblock drücken und mit „Enter“ 

bestätigen 

� Mit 2 x „Enter“ die Messart „Abs.“ für Absorption bestätigen, 

� Durch mehrmaliges Drücken der „Enter“-Taste weiter durch das Menü navigieren und unter 

dem Menüpunkt „Proben-Parameter“ bei „WL (nm)“die Wellenlänge über das Tastenfeld 

eingeben, mit „Enter“ bestätigen 

� Mit „Forward“ gelangt man zum Messbildschirm. Nullabgleich durchführen: In einen der 

beiden Küvettenhalter eine Küvette mit Lösungsmittel einstellen (Strahlengang ist von 

rechts nach links!). Mit „Auto Zero“ gefolgt von „Start“die Messung auslösen. 

� Nullwert-Küvette entnehmen und Küvette mit zu messender Lösung in den selben Küvettenhalter 

stellen. Messung mit „Start“ auslösen.

Enzymatik 9 

Teil 1 

Enzymatik

1 BC-1: Quantitative Glucose-Bestimmung 

1.1. Einleitung 

Die quantitative Bestimmung von Glucose muss meistens in einer Vielzahl verschiedener 

Proben in Gegenwart zahlreicher anderer Substanzen erfolgen (Blut, Harn). Die Bestimmung 

muss daher rasch und einfach durchzuführen sein (Routinemethode in medizinischen Labors) 

und muss so selektiv sein, dass keine aufwendige Vorbehandlung der Proben notwendig ist. 

Daher verwendet man zur Glucose-Bestimmung enzymatische Methoden, denn Enzyme besitzen 

meist eine hohe Substrat-Spezifität und arbeiten auch in komplexen biologischen Medien. 

Als Vorbehandlung ist z.B. bei Blut eine Deproteinierung ausreichend, ein Verfahren, 

das auch für viele andere Bestimmungen notwendig ist. 

In unserem Praktikum werden zwei Methoden verwendet: 

1.) Glucose-Peroxidase (GOD-POD)-Methode 

2.) Hexokinase-Methode. 

1.1.1. Glucoseoxidase-Peroxidase (GOD-POD)-Methode 

Glucoseoxidase (GOD) ist ein pflanzliches und mikrobielles Flavoprotein. Es wird meist aus 

Schimmelpilzen gewonnen und katalysiert die folgende Reaktion: 

Glucose + [GOD]-FAD � �-Gluconolacton + [GOD]-FADH 2 

Gluconolacton wird spontan zur Gluconsäure hydrolysiert. Bei der Reoxidation der reduzierten 

prosthetischen Gruppe des Enzyms entsteht H2O2 : 

[GOD]-FADH 2 + O 2 � [GOD]-FAD + H 2 O 2

Molekularbiologische Methoden 11 

Der biologische Aufschluß der Glucose durch GOD ist somit mit dem Gewinn von toxischem 

Wasserstoffperoxid verbunden. Dieses stöchiometrisch anfallende H2O2 dient in einer zweiten 

enzymatischen Reaktion einer Peroxidase als Oxidationsmittel. 

Peroxidasen (POD) sind vor allem im Pflanzenreich weit verbreitet und werden meistens aus 

Meerrettich gewonnen ('horseradish peroxidase'). Peroxidasen sind in der Zelle meist in Peroxisomen 

lokalisiert. Die physiologische Rolle ist die Reduktion von Wasserstoffperoxid: 

POD 

H2O2 + 2 AH 2 H2O +2 A 

AH ist eine reduzierende Verbindung; physiologisch kann z.B. Glutathion diese Rolle übernehmen. 

Hierbei wirkt der Cysteinrest über seine SH-Gruppe reduzierend. 

N 

H 2 

COOH 

Glu Cys Gly 

H 

N 

O 

N 

H 

O 

SH 

Glutathion: 

�-Glutamyl-cysteinylglycin 

COOH 

Nützt man die beschriebenen Reaktionen zu analytischen Zwecken, so setzt man Verbindungen 

ein, die im oxidierten Zustand stark gefärbt sind. Hierzu wird 2,2'-Azino-di(3- 

ethylbenzthiazolin)-6-sulfonat (ABTS � ) verwendet, woraus durch Oxidation ein blaugrünes 

Radikalkation entsteht: 

- 

O3S S 

S 

- 

SO3 - 

O3S S 

S 

- 

SO3 N 

N N 

N 

Ox. 

+ N 

N N 

N 

Für die photometrische Bestimmung von Glucose werden die zu analysierenden Proben 

gleich mit beiden Enzymen und dem reduzierten Farbstoff inkubiert. Bei 25 °C laufen die 

Reaktionen praktisch vollständig in 30 - 40 min ab, d.h. die vorhandene Glucose wird vollständig 

umgesetzt, daher die Bezeichnung „Endwertmethode“.


1.1.2. Hexokinase-Methode 

Eine weitere enzymatische Methode, Glucose zu bestimmen, bedient sich zweier besonders 

prominenter Enzyme: der Hexokinase (sozusagen die Eingangspforte zur Glykolyse) und der 

Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (G6P-DH, 'Zwischenferment', das Schlüsselenzym des 

Pentosephosphatweges). Im ersten, von Hexokinase katalysierten Schritt wird ein ATP verbraucht: 

Glucose + ATP � G6P + ADP, 

Diese Investition zahlt sich aber aus, da im zweiten, durch G6P-DH katalysierten Schritt ein 

wertvolles Reduktionsäquivalent in Form von NADPH gewonnen wird: 

G6P + NADP � � 6-Phosphoglucono-�-lacton + NADPH + H � 

Der Pentosephosphatweg ist der wichtigste Lieferant von NADPH, das für zahlreiche biosynthetische 

Reaktionen benötigt ist. 

Die G6P-DH ist einigermaßen rein erhältlich und besitzt ausreichende Spezifität, um zu einem 

raschen (5 - 10 Min) und praktisch vollständigen Umsatz zu führen (auch dies also eine 

'Endwertmethode'). Der Verlauf der Reaktion kann, dank der guten Absorptionseigenschaften 

des NADPH, photometrisch im UV-Bereich verfolgt werden. 

In der reduzierten Form verschiebt sich das Absorptionsmaximum der Nicotinamid- 

Partialstruktur des NADP in den längerwelligen Bereich. Der Anstieg der Absorption durch 

die Bildung von NADPH + H + kann also bequem photometrisch gemessen werden. Dieser 

sog. „optische Test“ wurde vom Nobelpreisträger Otto Warburg in die biochemische Praxis 

eingeführt.


1.2. Praktischer Teil: 

1.2.1. Glucose-Oxidase (GOD-POD)-Methode 

1.2.1.1 Folgende Lösungen stehen zur Verfügung: 

1. 'Glucose-Reagenz': ABTS � 57 mg 

(pH 7.0) Na 2 HPO 4 . 2H2 O 595 mg 

2. Glucose-Standard 

(1 mg/ml) 

3. Glucose-Proben 1,2,3 

(x mg/ml) 

Bei 4°C sind die Lösungen ca. 6 Wochen haltbar. 

NADP O 

H H 

+ NADPH+H + 

RO 

O N+ 

OH OH 

NaH 2 PO 4 . 2H2 O 260 mg 

GOD, Reinheitsgrad II (Asperg.nig.) 275 U (= 1.4 mg) 

POD, Reinheitsgrad II (Meerrettich) 100 U (= 1.0 mg) 

aqua bidest ad 50 ml 

NH 2 

+H 2 

-H2 

Glucose, wasserfrei 100 mg 

Glucose, wasserfrei x mg 

RO 

O N 

OH OH 

O 

NH 2 


aqua bidest ad 100 ml


Lösung Lagerort 

Glucose-Reagenz Kühlschrank, 100 ml Plastik-Schraubdeckelgefäss 

Glucose-Standard Gefrierfach, 1.5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäss 

Glucose-Probe Gefrierfach, 1.5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäss 

1.2.1.2 Vorgehensweise: 

Ihnen stehen zur Bestimmung drei Glucose-Proben „1“, „2“ oder „3“ zur Verfügung. Jede 

Gruppe sucht sich eine dieser Proben aus und bestimmt den Gehalt dieser Probe durch Vergleich 

mit der Standardlösung mit der Konzentration 1 mg/ml (Anmerkung: dieselbe Probe 

bestimmen Sie später auch mit der Hexokinase-Methode. Die Messung erfolgt bei 436nm. 

Eine lineare Beziehung zwischen Glucosekonzentration und Extinktion besteht nur bis zu 

einer Konzentration von etwa 7.5 µg Glucose/ml Testvolumen (5.1 ml). 

1.) Daher verdünnen Sie Probe und Standard zuerst 1:10 mit aquabidest . 

2.) Dann pipettieren Sie in 3 x 3 Reagenzgläser folgende Volumina: 

Leerwert 

Röhrchen 1, 4 und 7 

Standard 


Probe 


aqua bidest 100 µl - - 

Standard (1:10) - 100 µl - 

Probe (1:10) - - 100 µl 

Glucose-Reagenz 5.0 ml 5.0 ml 5.0 ml 

3.) Mischen Sie die Lösungen und verfolgen Sie am Photometer die Extinktionsänderung. 

Es dauert etwa 30 - 40 min bis die Reaktion vollständig abgelaufen ist (kann u.U. 

auch etwas länger dauern). Messen Sie die Extinktionen von Standards und Proben 

gegen den jeweiligen Leerwert (bei jedem neuen Leerwert: Nullabgleich!). 

4.) Sollten Sie bei den Messungen Ausreisser dabei haben, setzen Sie bitte gleich weitere 

Ansätze nach obigem Pipettierschema an.


1.2.2. Hexokinase-Methode 

1.2.2.1 Die folgenden Lösungen stehen zur Verfügung: 

1. TEA-Puffer 0.3 M, pH7.6 Triethanolamin . HCl 

11.2 g 

MgSO 4 . 7H2 O 200 mg 

aqua bidest ca. 150 ml 

5 N NaOH ca. 4 ml (� pH 7.6) 

2. ATP-Lösung ATP-Na 2 . 3H2 O 50 mg 

NaHCO 3 , wasserfrei 50 mg 

3. NADP � -Lösung NADP-Na 2 . 3H2 O 10 mg 

4. Hexokinase-Suspension Hexokinase (Hefe) 280 U (= 2 mg) 

5. G6P-DH-Suspension G6P-DH, Reinheitsgrad II (Hefe) 140 U (= 1 mg) 



TEA-Puffer 0.3 M, pH7.6 Laborbank (RT), 50 ml Plastikzentrifugenröhrchen 

Glucose-Probe Gefrierfach, 1.5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäss 

ATP-Lösung Gefrierfach, 1.5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäss 

NADP + -Lösung Gefrierfach, 1.5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäss 

Hexokinase-Suspension Kühlschrank, 1.5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäss 

G6P-DH-Suspension Kühlschrank, 1.5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäss 




aqua bidest ad 1 ml


1.2.2.2 Durchführung: 

Da Proben biologischen Ursprungs üblicherweise sowohl Glucose als auch G6P enthalten, 

erhält man die Summe beider Konzentrationen, wenn man Glucose-6-Phosphat- 

Dehydrogenase (G6P-DH) und Hexokinase gleichzeitig zusetzt. Daher läßt man bei biologischen 

Proben zuerst G6P-DH auf die Probe einwirken, bis das G6P umgesetzt wurde. Dann 

wird die Extinktion E1 gegen den Leerwert bei 334nm abgelesen. Danach wird Hexokinase 

zugesetzt und nach Ende der Reaktion die Extinktion E2 abgelesen. Aus der Differenz der 

Extinktionen E1 und E2 ergibt sich dann der G6P-Anteil, der aus Glucose gebildet wird und 

somit die Glucosekonzentration. 

In unserem Versuch wird jedoch eine (fast) reine Glucoselösung verwendet. 

1.) Pipettieren Sie die der unter 2.) stehenden Tabelle („Leerwert/ Küvette 1“) angegebenen 

Volumina in eine Plastikküvette, mischen die Lösung und führen einen Nullabgleich 

des Photometers bei 334nm durch. 

2.) Zur Messung der Glucoseprobe pipettieren Sie die unter „Probe/ Küvetten 2, 3 und 4“ 

angegebenen Volumina in drei Plastikküvetten, mischen die Lösung und verfolgen die 

Extinktionsänderung am Photometer: 

Leerwert 

Küvette 1 

Probe 

Küvetten 2, 3 und 4 

TEA-Puffer 2.5 ml 2.5 ml 

NADP � -Lösung 100 µl 100 µl 

ATP-Lösung 100 µl 100 µl 

aqua bidest 200 µl - 

Probe - 200 µl 

G6P-DH-Susp. 10 µl 10 µl 

Nun wird eventuell vorhandenes G6P durch die G6P-DH umgesetzt. Man wartet ca. 5 

min und liest die Extinktion E1 ab. Da in unserem Versuch höchstens Spuren von G6P 

vorhanden sind, ergeben sich hier nur geringe Extinktionsänderungen.


3.) Dann setzen Sie allen 4 Küvetten je 10 µl der Hexokinase-Suspension zu, mischen 

noch einmal und lesen nach Stillstand der Reaktion (ca. 15 min) die Extinktion E2 ge- 

gen den Leerwert ab. 

4.) Sollten Sie bei den Messungen Ausreißer dabei haben, setzen Sie bitte gleich weitere 

Ansätze an. 

bereits vorhandene 

Reaktionslösung 

Hexokinase- 

Suspension 

1.2.3. Auswertung 

Leerwert 

Küvette 1 

Probe 

Küvetten 2, 3 und 4 

2.91 ml 2.91 ml 

10 µl 10 µl 

1.2.3.1 Einführung: Fehlerrechnung/ Fehlerfortpflanzung 

Es gibt zwei Arten von Fehlern: zufällige und systematische. Mit einem systematischen Fehler 

hätte man es beispielsweise zu tun, wenn man die Extinktionen für Standards und Proben 

mit zwei verschiedenen Photometern bestimmt, die sich in ihren Kennlinien unterscheiden. 

Da Sie natürlich darauf geachtet haben, dass für Standards und Proben immer exakt gleiche 

Bedingungen herrschten, haben wir es hier nur mit zufälligen Fehlern zu tun. Als Abschätzung 

dient die Standardabweichung: 

x i � i-ter Meßwert der Größe x 

x � arithmetisches Mittel der Meßwerte von x 

n = Anzahl der Meßwerte 

s 

x 

� 

n 

��xi�x� 

i�1 

n �1 

2


Der Gesamtfehler ist mit den Regeln der Fehlerfortpflanzungsrechnung aus den Einzelfehlern 

errechenbar. Dazu wird in der Regel das Gauß’sche Fehlerfortpflanzungsgesetz angewendet. 

EXKURS FEHLERFORTPFLANZUNG: 

SD: Standardabweichung; 

RSD: relative Standardabweichung = Standardabweichung (SD) dividiert durch den Mittelwert 

einer Zufallsvariablen X 

Meßgröße: direkt experimentell abgelesenes Ergebnis z.B. Absorption. Außerdem hieraus 

berechnete Größen, wenn zu deren Berechnung kein weiteres Messergebnis benutzt werden 

muss, also z.B. die Multiplikation mit einer Konstante etwa des Absorptionskoeffizienten, 

wenn man davon ausgehen kann, dass diese Konstante nicht selbst fehlerbehaftet ist. Nach 

den Regeln wissenschaftlichen Arbeitens ist hierunter in der Regel der Mittelwert einer Messreihe 

also zumindest einer Dreifach-Bestimmung anzusehen. Im Gegensatz zu: 

abgeleiteter Messwert: aus einer Messgröße unter Einbeziehung weiterer Messgrößen berechneter 

Wert. Also z.B. der Messwert minus den Nullwert oder aber jegliche Normierung 

gegen einen Standard. 

Der Fehler einer einzelnen Messgröße errechnet sich über die Standardabweichung (SD). Zur 

Berechnung des Fehlers eines abgeleiteten Messwerte müssen die Fehler aller in die Berechnung 

eingegangenen Messgrößen berücksichtigt werden. Hierzu hält man sich an die Regeln 

der Gauß’schen Fehlerfortpflanzung. Danach gilt, dass bei der 

Addition oder Subtraktion von Messgrößen deren die Standardweichungen (SD) quadriert 

werden. Aus der Wurzel der Summe aller SD 2 ergibt sich dann der Fehler des abgeleiteten 

Messwertes. 

SDa+b= (SDa 2 + SDb 2 ) 1/2 

Multiplikation oder Division von Messgrößen: hierbei geht man analog vor, nur dass man 

anstatt der absoluten Standardabweichung SD, die relative Standardabweichung RSD benutzt. 

RSDa+b= (RSDa 2 + RSDb 2 ) 1/2


Fehlerfortpflanzung: tauchen beide Rechenschritte zusammen in der Berechnung eines 

Endergebnisses auf, werden beide Rechenoperationen nacheinander entsprechend dem Rechenweg 

durchgeführt. 

Beispiel: (a – b)/c =d 

1. SDa-b= (SDa 2 + SDb 2 ) 1/2 

2. RSDd=(RSDa-b 2 + RSDc 2 ) 1/2 

Angabe des Endergebnisses: Als Endergebnis gibt man üblicherweise den Mittelwert der 

berechneten Größe ± den absoluten/relativen Fehler an. 

Beispiel für eine Gehaltsbestimmung: Die Probe enthielt 100,0 ± 8,2 mg Glucose. 

1.2.3.2 Auswertung Glucose-Oxidase-(GOD-POD) Methode 

Beispielrechnung: 

Der jeweilige Leerwert sollte bei der Messung zunächst auf Null gesetzt werden, d.h. die Extinktion 

des Leerwertes wird dann automatisch von den entsprechenden weiteren Messungen 

abgezogen und muss bei den folgenden Berechnungen (SD, RSD etc.) nicht mehr berücksichtigt 

werden 

Auch wenn dieser Schritt nicht durchgeführt wurde und man die Extinktionen der Leerwerte 

ermittelt hat, muss zur weiteren Berechnung lediglich in einem ersten Schritt die Extinktion 

des Leerwertes einmalig von den entsprechenden weiteren Messungen abgezogen werden. 

Alle Folgerechnungen werden dann mit den korrigierten Werten durchgeführt, die Extinktion 

des Leerwertes spielt dann keine Rolle mehr. D.h. es muss auch keine SD, oder RSD des 

Leerwertes berechnet werden! 

ELeerwert E1 Standard E2 Probe 

0,143 

0,141 

0,142 

0,474 - ELeerwert = 0,331 

0,473 - ELeerwert = 0,332 

0,481 - ELeerwert = 0,339 

0,285 - ELeerwert = 0,143 

0,285 - ELeerwert = 0,144 

0,286 - ELeerwert = 0,144 

Bzw. wenn man den Leerwert „genullt“ hat, erhält man gleich die Endergebnisse


Bestimmung der Mittelwerte: 

x (Standard) = 0,334; x (Probe) = 0,144 

Bestimmung der Glucosekonzentration: 

Da die Extinktion linear von der Glucose-Konzentration abhängt - vorausgesetzt, die Konzentration 

war nicht zu hoch, siehe oben - gilt die folgende einfache Beziehung: 

[Glucose]Probe = [Glucose]Standard x EProbe/EStandard 

1mg/ml x 0,144/0,334 = 0,4311 mg/ml � 43,11 mg/dl 

Soll-Wert war: 44,85 mg/dl 

Bestimmung der Standardabweichungen: 

1. SD(Standard) 

2. SD(Probe) 

Fehlerfortpflanzung: 

Zunächst erfolgt die Bestimmung der relativen Standardabweichung, da die Messgrößen dividiert 

werden (vgl. Skript) 

2 

2 

S tan dard 

Pr obe 

RSD Standard+Probe = ( RSD � RSD ) 

Die relative Standardabweichung ist definiert als die Standardabweichung durch den Mittelwert 

einer Zufallsvariablen x d.h. für uns: 

SDS 

tan dard 2 SDPr 

obe 2 

RSD Standard+Probe = (( ) � ( ) ) 

x 

x 

Also: 

s x 

s 

x 

� 

� 

2 

(( 0, 

331 � 0, 

334) 

(( 0, 

143 � 0, 

144) 

S tan dard 

( 0, 

332 

Pr obe 

� 0, 

334) 

2 

0, 

004358 0, 

00057735 2 

RSD Standard+Probe = (( ) ( ) ) 

0, 

334 0, 

144 

2 

� 

� 

( 0, 

144 

( 0, 

339 

� 0, 

334) 

2 � = 0,01365532 

2 

� 0, 

144) 

2 

2 

� 

� 

( 0, 

144 

2 

) 

� 

0, 

004358 

2 

� 0, 

144) 

) 

� 0, 

00057735 

s 

x 

� 

n 

� 

i�1 

�x�x� i 

n �1 

2


Daraus berechnet sich der absolute Fehler wie folgt: 43,11 mg/dl x 0,01365532 = 0,587369 

mg/dl 

Absoluter Fehler: 43,11mg/dl ± 0,587369 mg/dl 

Relativer Fehler: 43,11mg/dl ± 1,36553% 

Für das Protokoll berechnen Sie 

� die Glucosekonzentration der Probe (in mg/ 100 ml) [Glucose: Mr = 180.2 g / Mol.] 

� die Standardabweichung der Meßwerte 

� und daraus den relativen (in %) sowie den absoluten Fehler der Messung (in mg/ 100 ml) 

1.2.3.3 Hexokinase-Methode 

Beispielrechnung 

Gemessen bei: 340nm 

Mittelwerte: 

x (E1) = 0,01006; x (E2) = 0,6345 

∆E = E2-E1 = 0,6244 

E1 E2 

0,0003 

0,0256 

0,0043 

Bestimmung der Glucosekonzentration: 

Die Glucosekonzentration der Probe läßt sich nach folgender Gleichung berechnen: 

�E 

c x 

� ��d 0,6395 

0,6424 

0,6216 

�E = E2 - E1 

Vges. 

V Probe 

Die Schichtdicke der Lösung d ist 1 cm (Innenmaß der Küvette). Da die Reaktion stöchiome- 

trisch verläuft und für jedes Molekül Glucose ein Molekül NADP � zu NADPH reduziert


wird, ist der molare Konzentrationszuwachs an NADPH gleich der molaren Menge an Gluco- 

se. Für den Extinktionskoeffizienten � ist die Einheit cm 2 /µMol üblich (Werte für NADPH: � 

= 3.5, 6.3, bzw. 6.18 cm2 /µMol bei 365, 340, bzw. 334 nm), was zur Folge hat, daß man 

Konzentrationen in der Einheit µMol/ml erhält. 

Für unser Beispiel bedeutet das 

C= 

�E 

V 

� 

�xd 

V 

ges 

Pr obe 

= 

0, 

6244 2, 

91ml 

� = 1,442µMol/ml 

6, 

3 x1 

0, 

2ml 

2 

cm / µMol 

ε= 6,3cm 2 /µMol, da bei Wellenlänge 340 gemessen wurde 

[Glucose: M=180,2g/mol] 

1,442x10 -6 mol/ml x 180,2g/mol = 0,0002598g/ml � 0,2598 mg/ml � 25, 98 mg/dl 

Soll-Wert: 27,44 mg/dl 

Bestimmung der Standardabweichungen: 

1. SD(E1) 

2.SD(E2) 

s x 

s 

x 

� 

� 

Fehlerfortpflanzung: 

(( 0, 

0003 

(( 0, 

6395 

� 

Im Unterschied zur GOD-POD-Methode erfolgt hier zunächst die Bestimmung der absoluten 

Standardabweichung, da die Messgrößen subtrahiert werden (E2-E1) 

2 

2 

E1 

E 2 

� 

0, 

01006) 

0, 

6345) 

2 

2 

� 

� 

( 0, 

0256 

( 0, 

6424 

� 0, 

01006) 

2 

� 0, 

6345) 

2 

2 

SD E1+E2= ( SD � SD ) Also: SD E1-E2= ( 0, 

013600125 0, 

011265 ) 

SDE1� E 2 

( 0, 

0043 

0, 

01006) 

0, 

013600125 

2 � = 0,017659 

0, 

017659 

Die relative Standardabweichung beträgt somit: RSD = = = 0,02828155 

x 0, 

6244 

Hieraus berechnet sich der absolute Fehler wie folgt: 25,98mg/dl x 0,02828155 = 0,73475 

mg/dl 

Absoluter Fehler: 25,98mg/dl ± 0,73475 mg/dl; Relativer Fehler: 25,98mg/dl ± 2,828% 

2 

2 

� 

� 

( 0, 

6216 

� 

� 

0, 

6345) 

2 

2 

) 

� 

) 

� 

0, 

011265


Für das Protokoll geben Sie an bzw. berechnen Sie: 

� die Meßwellenlänge 

� die Glucosekonzentration der Probe (in mg/ 100 ml) [Glucose: Mr = 180.2 g / Mol.] 

� die Standardabweichung der Meßwerte 

� und daraus den relativen (in %) sowie den absoluten Fehler der Messung (in mg/ 100 ml) 

� diskutieren Sie kurz Ihr Ergebnis in Bezug auf den „wahren Wert“ und vergleichen Sie 

dabei die beiden Methoden. Argumentieren Sie mit den Begriffen „Richtigkeit“ und „Präzision“. 

1.3. Kurzzusammenfassung der Sicherheitsinformationen 

Stoff Kennzeichen/ Klassifizierung 

sowie R-Sätze bzw. H- 

Sätze 

ABTS Angabe nach alter EU- 

Verordnung 

Xi 

R: 36/37/38 

Glucoseoxidase 

Peroxidase 

Signalwort : “Gefahr” 

H334 

Verwendete Menge/ Konzentration 

pro Praktikumstag 

und Gruppe 

200 ml einer Lösung mit 

1,14 mg/ ml ABTS, ca. 40µg/ 

ml Glucoseoxidase 

(1100 U/ 200 ml) und ca. 8 

µg/ml Peroxidase (400 U /200 

ml) 

Signalwort : “Gefahr” 

H334, H317 

Durch weitere in der Übung vorkommende und nicht in dieser Tabelle genannte Stoffe 

sind bei Handhabung der Reagenzien nach üblichem Laborstandard keine besonderen 

Gefahren zu erwarten.


Sicherheitsmaßnahmen: 

� Üblicher Laborstandard (Laborkittel, Schutzbrille…, s. Allgemeine Betriebsanweisung) 

� Keine Handschuhe erforderlich bei ordnungsgemäßem Versuchsablauf (D. h. kontaminationsfreie 

Handhabung der Lösungen mit Eppendorf-Pipetten) 

� Bei versehentlicher Kontamination sofort Hände waschen 

� Einmalhandschuhe verwenden zum Beseitigen verschütteter Reagenzien


2 BC-2: Bestimmung der Michaelis-Menten Konstante von Trypsin 


Das Enzym Trypsin, eigentlich seine Vorstufe Trypsinogen, wird von der Bauchspeicheldrüse 

in den Dünndarm sezerniert und spaltet dort Proteine. Es werden solche Peptidbindungen hydrolysiert, 

deren Carboxylgruppe von einer der beiden basischen Aminosäuren Lysin oder 

Arginin stammt. Auch die Aktivität von Trypsin läßt sich photometrisch verfolgen, wenn man 

dem Enzym ein künstliches Substrat, ein “Pseudopeptid”, anbietet, das nach Spaltung einen 

Farbstoff abgibt. Ein solches Substrat ist N-Benzoyl-arginin-p-nitroanilid (BAPA), das folgendermaßen 

von Trypsin gespalten wird: 

Benzoesäure[-NH-arg-CO-]anilid-NO 2 + H 2 O = Benzoesäure[-NH-arg] + Anilin-NO 2 

Die Extinktion des dabei entstehenden Farbstoffes p-Nitro-Anilin wird bei 405 nm gemessen. 

Eigentlich gibt es keinen besonderen Grund, gerade diese Reaktion im Detail zu studieren. Im 

Vergleich zur Glucosekonzentration im Blut ist die Trypsinaktivität im Dünndarm medizinisch-diagnostisch 

gesehen von eher geringem Interesse. Allerdings ist Trypsin eines der am 

leichtesten in großer Menge zu gewinnenden Enzyme und daher sehr preiswert (auf Unit- 

Basis ist Hexokinase 50 x, G6PDH sogar 300 x teurer). Es wäre daher unvernünftig, Trypsin 

in einem Praktikum nicht einzusetzen. Am Beispiel der von Trypsin katalysierten Spaltung 

von BAPA sollen einige Grundbegriffe der Enzymkinetik praktisch demonstriert werden: 

� Die Anfangsgeschwindigkeit einer enzymatischen Reaktion 

� Die Ermittlung der sogenannten Michaelis-Menten-Konstante im Bezug auf das 

Substrat BAPA 

� Der Einfluß einer hemmenden Substanz (Aprotinin).


Die Michaelis-Menten Gleichung, 

beschreibt die Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit V von der Substratkonzentration 

S. Bei einer enzymatische Reaktion nimmt die Reaktionsgeschwindigkeit durch den 

Verbrauch von Substrat allmählich ab, bis sich ein Gleichgewicht zwischen Hin- und Rückreaktion 

einstellt und die Reaktion zum Stillstand kommt (siehe Übungen 1.1 und 1.2., 'Endwertmethoden'). 

Die hier zum Einsatz kommende 'kinetische Methode' untersucht hingegen 

die Situation wie sie ganz zu Beginn einer Enzymreaktion gegeben ist. Man beschränkt sich 

dabei auf jenen kurzen Zeitraum, in dem die Abnahme der Substratkonzentration noch nicht 

ins Gewicht fällt und die Konzentration des gebildeten Produktes annähernd linear mit der 

Zeit ansteigt (das heißt: die Reaktionsgeschwindigkeit ist in diesem Zeitraum annähernd konstant!). 

Dies entspricht auch dem ausschließlichen Gültigkeitsbereich der Michaelis-Menten- 

Gleichung! Mit ihr lassen sich lediglich Anfangsgeschwindigkeiten enzymatischer Reaktionen 

berechnen. Mißt man die Extinktion des Produktes in regelmäßigen Abständen innerhalb 

der ersten Minuten der Reaktion, so sollten die Meßwerte, gegen die Zeit aufgetragen, auf 

einer Geraden liegen. 

In folgender Abbildung werden die Verhältnisse für die Substratkonzentration, gemessene 

Extinktion, Produktkonzentration und Reaktionsgeschwindigkeit, wie sie zu beginn einer 

Enzymreaktion gegeben sind, in einer idealisierten Darstellung zusammengefasst. 

[S] E bzw. [P] 

([E]~[P]) 

252 

251 

250 

200 

100 

0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 

Zeit [min] 

V 

� 

V 

max 

* S 

�KS� M � 

v 

Zeit [min] Zeit [min]


Im Versuch sollen aus den mit verschiedenen Substratkonzentrationen erhaltenen Anfangsgeschwindigkeiten 

graphisch (Stichwort: Lineweaver-Burk) VM und KM ermittelt werden. Hier- 

zu benötigen Sie die Lineweaver-Burk-Gleichung, die den Kehrwert der Michaelis-Menten- 

Gleichung darstellt: 

1 � K 

� 

v � 

� 

� v 

Um die Lineweaver-Burk-Gleichung anwenden zu können, benötigen Sie die Substratkonzentration. 

Im Unterschied zu theoretischen Berechnungen, wie sie z.B. im begleitenden Seminar „Enzymkinetik“ 

behandelt werden, nimmt man hier bei der Berechnung der Substratkonzentration 

eine Vereinfachung vor, die nicht der strengen Definition der Substratkonzentration in der 

Michaelis-Menten-Gleichung entspricht, aber laborpraktisch sinnvoll ist und der Genauigkeit 

keinen Abbruch tut. Die Substratkonzentration S in der Michaelis-Menten-Gleichung ist die 

Konzentration an freiem, d.h. nicht enzymgebundenem Substrat. Diese ist zu unterscheiden 

von der totalen Substratkonzentration, die auch den enzymgebundenen Anteil enthält: [S]T = 

[S] + [ES]. (Hierbei bedeutet [ES] die Konzentration an Enzym-Substrat-Komplex). Da die 

Konzentration an Enzym im Vergleich zum Substrat in unserem Versuch recht gering ist, 

(und damit der Anteil an ES auch nicht hoch sein kann), entspricht die korrekterweise zu 

verwendende freie Substratkonzentration [S] annähernd der totalen Substratkonzentration 

[S]T. Sie berechnen also für die Auswertung die (totale) Substratkonzentration aus den Angaben 

unter „Lösungen und Materialien“ und verwenden diesen Wert als [S]. 

2.2. Lösungen und Materialien 

�S� vmax 

1. TEA-Puffer 0.3 M, pH7.8 Triethanolamin.HCl 22.4 g 

M 

max 

� 

� 

�* 

� 

(ohne Mg) aquabidest ca. 300 ml 

1 

� 

1 

5 N NaOH ca. 8 ml (� pH 7.8) 

aquabidest ad 400 ml


2. Substrat-Lösung BAPA . HCl 0,5% (m/v) in DMF 2.18 ml 

TEA-Puffer ad 10 ml 

3. Trypsin-Lösung Trypsin (Rinderpankreas) 2 mg 

mit 60 mM CaCl2 CaCl2 x 2H2O 0.176 g 


4. Trypsin-Inhibitor Aprotinin (Rinderlunge) 2 mg (= 14.300 KIE) 


BAPA muß in der Wärme gelöst werden (fällt manchmal wieder aus; nicht im Kühlschrank 

aufbewahren). Aprotinin ist ein endogenes Peptid, das Serin-Proteasen wie Trypsin hemmt; 

andere von Aprotinin gehemmte Serin-Proteasen sind Kallikreïn, Plasmin und verschiedene 

Gerinnungsfaktoren. KIE steht für Kallikreïn Inaktivator Einheiten (1 KIE hemmt 2 units 

Kallikreïn zu 50%). Das Präparat Trasylol ® (20.000 KIE in 1 ml isotoner NaCl-Lösung) wird 

bei bestimmten Gerinnungsstörungen klinisch eingesetzt. 


TEA-Puffer 0.3 M, pH7.8 

ohne Mg 2+ 

Laborbank (RT), 50 ml Plastikzentrifugenröhrchen 

Substrat-Lösung (BAPA) Laborbank (RT), 15 ml Plastikzentrifugenröhrchen 

Trypsin-Lösung Kühlschrank, 50 ml Plastikzentrifugenröhrchen 

Trypsin-Inhibitor (Aprotinin) Laborbank (RT), 15 ml Plastikzentrifugenröhrchen 

2.3. Durchführung: 

2.3.1. Bestimmung der Michaelis-Menten-Konstante von Trypsin für 

BAPA 

Die Anfangs-Reaktionsgeschwindigkeit wird mit 4 verschiedenen BAPA-Konzentrationen 

gemessen. Es sind die folgenden Volumina in Küvetten zu pipettieren:


1. Meßreihe 2. Meßreihe 3. Meßreihe 4. Meßreihe 

TEA-Puffer 1.5 ml 1.5 ml 1.5 ml 1.5 ml 

1 mM HCl 0.9 ml 0.8 ml 0.5 ml - 

Trypsin-Lösung 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 

BAPA-Lösung 0.1 ml 0.2 ml 0.5 ml 1.0 ml 

Die 4 Meßreihen müssen hintereinander (!!) ausgeführt werden. Das Gesamtvolumen beträgt 

immer 3.0 ml. Zuletzt wird die BAPA-Lösung zugegeben, sofort gemischt und mit der Zeit- 

nehmung begonnen. Die erste Extinktion (� = 405 nm) wird unmittelbar nach dem Mischen 

abgelesen, und weitere Werte nach 1, 2, 3, 4 und 5 min. Als Vergleichsprobe für den Nullabgleich 

wird der TEA-Puffer zur Verfügung gestellt. Die Reaktion erfolgt bei 25°C (Thermostat); 

die zu pipettierenden Lösungen müssen vor dem Zugeben auf Raumtemperatur gebracht 

werden. Trypsin- und Aprotinin-Lösungen dürfen nur in Gegenwart des TEA-Puffers mit 

1mM HCl gemischt werden (ansonsten Denaturierungsgefahr), daher TEA-Puffer immer als 

ersten pipettieren. 

2.3.2. Hemmung durch Aprotinin: 

Ähnliche Vorgangsweise wie unter 2.3.1. beschrieben. Um die Zugabe der Aprotinin-Lösung 

zu ermöglichen, wird das Pipettierschema von Beispiel 2.3.1. geringfügig geändert. 

Die Aprotinin-Lösung muss vor Gebrauch 1:5 verdünnt werden! 

1. Meßreihe 2. Meßreihe 3. Meßreihe 4. Meßreihe 

TEA-Puffer 1.4 ml 1.4 ml 1.4 ml 1.4 ml 

Aprotinin (1:5) 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 

1 mM HCl 0.9 ml 0.8 ml 0.5 ml - 

Trypsin-Lösung 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 

BAPA-Lösung 0.1 ml 0.2 ml 0.5 ml 1.0 ml


2.4. Auswertung/ Protokoll: 

V = �E / (d x e) 

e = Extinktionskoeffizient von p-Nitro-Anilin = 9,9 cm 2 / µmol 

MBAPA HCl = 434,9 g/mol 

Für das Protokoll: 

� geben Sie Ihre Meßwerte vollständig an und berechnen Sie die Mittelwerte der Extinktionsdifferenzen 

[min -1 ] 

� hieraus berechnen Sie die Reaktionsgeschwindigkeit. 

� berechnen Sie aus den Angaben über die Zusammensetzung der BAPA-Lösung aus 2.2) 

die jeweilige Konzentration des Substrates (Stoffmengenkonzentration) in µM! 

� Erstellen Sie das Lineweaver-Burk-Diagramm und bestimmen Sie hieraus Km und vmax! 

Achten Sie hierbei auf einen vernünftigen Maßstab des Diagramms. 

� Bitte achten Sie auch hier auf die Angabe von Einheiten und die Anzahl der angegebenen 

Dezimalstellen ! 

� Diskutieren Sie kurz Ihre Ergebnisse!


2.5. Kurzzusammenfassung Sicherheitsinformationen Übung 2 

Stoff Kennzeichen/ Klassifizierung sowie 

R-Sätze bzw. H-Sätze 

Dimethylformamid 

BAPA-HCl 

Produkt: p-Nitroanilin 

Trypsin 

Signalwort: „Gefahr“ 

H 360D, H226, H332, H312, H319 

BAPA: 

Angabe nach alter EU Verordnung: 

Gemäß Richtlinie 67/548/EWG nicht als 

gefährlich eingestuft. 

p-Nitroanilin: 


H331, H311, H301, H373, H412 

[Anmerkung: Die MAK-Kommission hat 

folgende Einschätzung: Krebserzeugend 

Kategorie 3A (Stoffe, die wegen erwiesener/ 

möglicher krebserzeugender Wirkung Anlass 

zur Besorgnis geben.)] 

H315, H319, H334, H335 


pro Praktikumstag und Gruppe 

10 ml Puffer mit 21,8% (v/v) Dimethylformamid 

und ~0,1% (m/v) 

BAPA-HCl 

20 ml Puffer mit 0,1 mg/ ml Trypsin 

Aprotinin Angabe nach alter EU Verordnung: 20 ml Puffer mit 0,1 mg/ ml Aproti- 

Xn 

R: 22-42/43 

Noch keine Angaben nach EU-GHS- 

Verordnung verfügbar. 

nin 

Durch weitere in der Übung vorkommende und nicht in dieser Tabelle genannte Stoffe sind bei Handhabung 

der Reagenzien nach üblichem Laborstandard keine besonderen Gefahren zu erwarten.


Sicherheitsmaßnahmen 

� üblicherLaborstandard (Laborkittel, Schutzbrille…, s. Allgemeine Betriebsanweisung) 

und 

� Einmalhandschuhe tragen und bei Kontamination sofort wechseln/ Hände waschen 

� Gekennzeichnete Pipetten werden hier ausnahmsweise nicht verwendet und es wird ausnahmsweise 

auf einer Laborbank in der Nähe des Photometers gearbeitet (geringes Kontaminationsrisiko 

aufgrund Mengen/ einfacher Versuchsablauf). Sofortige Reinigung 

kontaminierter Flächen/ Gegenstände. 

� Pipetten nach Versuchsende reinigen (Wasser/ Einmaltücher) 

� Kontaminierter Festabfall (Küvetten, Pipettenspitzen…) in Abfallflaschen, die mit der 

Nummer der Übung gekennzeichnet sind, sammeln. Inhalt der Abfallflasche nach Versuchsende 

in gekennzeichnete Behälter (Feststofftonne) entsorgen. 

� Inhalt der Küvetten direkt in Abfallkanister (schwermetallhaltige Lösungsmittel) entsorgen.


Teil 2 

Proteinbiochemie und Molekularbiologie

Proteinbiochemie und Molekularbiologie 34 

3 BC-3: Diskontinuierliche SDS-Elektrophorese nach Lämmli 

3.1. Theoretischer Teil 

3.1.1. Einführung 

Seit Arne Tiselius 1937 seine Methode der wandernden Grenzschichten-Elektrophorese publizierte, 

für die er (unter anderem) 1948 den Nobelpreis erhielt, haben sich elektrophoretische 

Techniken zum allgemeinen Laborstandard entwickelt. Bei kaum einem anderen Trennverfahren 

gibt es so viele methodische und apparative Neu- und Weiterentwicklungen. Unterschiedliche 

Elektrophoresetechniken finden Anwendung in biologischer/biochemischer 

Forschung, Molekularbiologie, Forensik, klinischer Routineanalytik, Lebensmittelüberwachung, 

etc., etc... 

3.1.2. Physikalische Grundlagen 

Um die Vorgänge bei der Gelelektrophorese zu verstehen, ist die Kenntnis einiger physikalischer 

Grundlagen nötig. 

Bei der Elektrophorese werden geladene Teilchen in einem elektrischen Feld bewegt. 

Befindet sich ein Teilchen mit der Ladung q in einem elektrischen Feld E, so wirkt auf das 

Teilchen die Kraft K mit 

K = q � E 

Bewegt sich das Teilchen in einem Medium, so wirkt auf dieses eine Reibungskraft. Die 

Kraft, die auf ein kugelförmiges Teilchen in einer Flüssigkeit wirkt, wird durch das Stokes’sche 

Gesetz beschrieben 

K = 6� � v � r � � 

mit � = Viskosität der Flüssigkeit v = Wanderungsgeschwindigkeit des Teilchens 

r = Radius des Teilchens


Gleichsetzen der Kräfte ergibt 

woraus folgt 

q � E = 6� � v � r � � 

q * E 

v = 

6� 

� r 

Die Wanderungsgeschwindigkeit eines Teilchens ist also proportional seiner Ladung und der 

elektrischen Feldstärke (Spannung/Elektrodenabstand), und sie ist umgekehrt proportional 

seiner Größe (Radius r) und der Viskosität des Mediums. Die Ladung eines Moleküls ist von 

vielen Parametern abhängig: Anzahl und Art der geladenen Gruppen (pK etc.), Dielektrizitätskonstante 

des Mediums, pH des Puffers, Ionenstärke. Es ist also bei der klassischen 

Elektrophorese allein aufgrund der elektrophoretischen Beweglichkeit eines Moleküls nicht 

möglich, eine eindeutige Aussage über Eigenschaften wie beispielsweise das Molekulargewicht 

zu machen. 

3.1.3. Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) 

In den meisten Fällen wird, anders als bei Tiselius’ Methode, die Elektrophorese heute in 

stabilisierenden Medien durchgeführt, in der Regel in Gelen. Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese 

(PAGE), erstmals 1959 von Raymond und Weintraub publiziert, spielt eine besonders 

große Rolle. 

3.1.3.1 Polyacrylamidgele 

Durch Polymerisation von Acrylamidmonomeren mit einem Vernetzer, N,N´- 

Methylenbisacrylamid, erhält man ein klares durchsichtiges Gel mit sehr geringer Elektroosmose 

und sehr guter chemischer und mechanischer Stabilität. Die Polymerisation erfolgt radikalisch, 

als Radikalspender fungiert Ammoniumperoxodisulfat. Die freien Radikale werden 

durch das Tetramethylethylendiamin (TEMED) stabilisiert. 

O 

NH 2 

Acrylamid 

+ 

O 

N 

H 

N 

H 

O 

O 

NH + 4 O S O O S O NH + 4 

O 

TEMED 

(Me) 2 N 

N,N-Methylenbisacrylamid 

O 

O 

APS 

N(Me) 2 

O 

O 

NH CONH 2 

NH 

CONH2 PAG


Totalamid-Konzentration T (Masseprozent [Acrylamid + Bisacrylamid]) und Vernetzungsgrad 

C (steht für Crosslinking, %-Anteil Bis an T) bestimmen die Porengröße des Gels: bei 

konstantem C wird mit steigendem T die Porengröße linear kleiner. 

3.1.3.2 SDS-Gelelektrophorese 

Wie oben beschrieben ist es bei der klassischen Elektrophorese allein aufgrund der 

elektrophoretischen Beweglichkeit eines Moleküls nicht möglich, das Molekulargewicht von 

Proteinen zu bestimmen. 

Dies ändert sich, wenn man die Elektrophorese in Gegenwart eines ionischen Detergenz 

durchführt, z.B. SDS (Na-Dodecylsulfat, engl. Sodium-). 

SDS ummantelt Proteinmoleküle micellenartig und bricht dabei durch Wasserstoffbrücken 

gebildete Raumstrukturen auf, d.h. denaturiert die Proteine und löst sie (Vorteil: es werden 

auch schwer wasserlösliche Proteine wie Membranproteine der Analyse zugänglich!). Schwefelbrücken 

zwischen Cysteinen können durch reduzierende Thiolverbindungen aufgelöst 

werden, z.B. Mercaptoethanol oder Dithiothreitol. Somit werden durch SDS unterschiedliche 

Molekülformen ausgeglichen, die Proteine nehmen eine ellipsoide Form an. Durch die Ummantelung 

mit SDS werden die Eigenladungen der Proteine so effektiv überdeckt, daß (fast) 

alle Proteine (außer extrem positiv geladene) anionisch werden und somit bei der Elektrophorese 

in dieselbe Richtung wandern. Von zentraler Bedeutung ist, daß anionische Micellen mit 

einem konstanten Masse/Ladungsverhältnis entstehen! Es werden nämlich im Schnitt 1,4 

Gramm SDS pro Gramm Protein gebunden. Dies enstspricht ca. 1 SDS-Molekül pro 2 Aminosäuren. 

Da es bei den mit SDS beladenen Proteinen wiederum eine feste Beziehung zwischen 

dem Teilchenradius und der Masse (bzw. dem Molekulargewicht MW) gibt, erfolgt in 

einem Gel durch den Siebeffekt die elektrophoretische Trennung nur noch nach dem Molekulargewicht. 

Die Wanderungsgeschwindigkeit ist dabei proportional dem log(MW). 

Die Einführung des SDS in die Proteinelektrophorese war übrigens nicht, wie oft fälschlich 

angenommen, die Idee von Lämmli. Das hatten Shapiro et al. bereits 3 Jahre zuvor getan. 

Lämmlis Verdienst war vielmehr die Kombination der Anwendung von SDS und dem diskontinuierlichen 

(oft abgekürzt “disk” oder engl. “disc” = discontinous) Gelsystem von 

Ornstein und Davis.


3.1.3.3 Die diskontinuierliche Gelelektrophorese nach Ornstein und Davis 

Die Einführung des Disk-Systems in die Proteinbiochemie führte zu einer starken Erhöhung 

der Bandenschärfe und damit der Auflösung der Proteinelektrophorese. Die Diskontinuität 

bezieht sich auf vier Parameter: 

� Gelstruktur: ein engporiges Trenngel wird mit einem großporigen Sammelgel überschichtet. 

� pH-Wert der Puffer (pH 8,8 im Trenngel, pH 6,8 im Sammelgel) 

� Ionenstärke der Puffer (0,375 M Tris/HCl im Trenngel, 0,125 M Tris/HCl im Sammelgel) 

� Art der Ionen im Gel und im Elektrodenpuffer (Glycin im Elektrodenpuffer, Cl – im Gel) 

Funktionsprinzip der Disk-Elektrophorese (aus: Westermeier 1990) 

Wird in diesem Disc-System nach Ornstein und Davis ein Strom angelegt, so wandern die 

Glycinat- und Chlorid-Ionen sowie die neg. geladenen Proteine in Richtung Anode. Wenn das 

Glycinat ins Sammelgel eintritt, so trifft es dort auf den niedrigen pH. Das Dissoziationsgleichgewicht 

verschiebt sich vom Glycinat zum Glycin. Ungeladenes Glycin wandert aber 

nicht im elektischen Feld. So eilt Cl – als “Leition” voraus, Glycin bleibt als “Folgeion” zurück. 

Würden sie tatsächlich dort zurückbleiben, würde kein Strom fließen. Alle Ionen müssen 

sich also mit gleicher Geschwindigkeit bewegen (Prinzip der “Isotachophorese”, 

griechisch “iso” = gleich, “tachos” = Geschwindigkeit). So bildet sich ein el. Feldstärkegradient 

zwischen Leit- und Folgeion aus: im Bereich der Folgeionen ist die Feldstärke höher. 

Die Proteine, die sich zwischen Leit- und Folgeion befinden, bilden Zonen gemäß ihrer elektrophoretischen 

Beweglichkeiten (“stacking”-Effekt). Diese Zonen sind sehr scharf, weil Mo-


leküle, die in eine Zone höherer Mobilität diffundieren, durch die dort herrschende niedrigere 

Feldstärke langsamer wandern und somit wieder in die ihnen entsprechende Zone gelangen. 

Wenn die Proteine auf das Trenngel treffen, werden sie durch die geringer Porengröße darin 

abgebremst. Das kleine Glycinmolekül kann sie jetzt überholen, wodurch der pH im Trenngel 

auf 9,5 ansteigt (der pK der Aminogruppe des Glycins). Während die isotachophoretische 

Wanderung der Proteine im weitporigen Sammelgel nur nach ihrer Ladung erfolgte, spielen 

im homogenen Puffermilieu des engporigen Trenngels Ladung und Molekülgröße eine Rolle. 

3.1.3.4 SDS-Gelelektrophorese nach Lämmli 

Lämmli hat das System von Ornstein und Davis direkt für die SDS-Gelelektrophorese übernommen, 

obwohl der pH-Wert- und Ionenstärke-Sprung zwischen Sammel- und Trenngel 

nicht benötigt wird, denn 

� die Mobilität des Glycins ist im (großporigen) Sammelgel auch bei pH 8.8 niedriger als 

die der stark negativ geladenen Protein-SDS-Mizellen 

� während des "stacking" erfolgt keine Auftrennung nach einem Feldstärkegradienten, da es 

keine Ladungsunterschiede innerhalb der Probe gibt (SDS überdeckt die Eigenladungen). 

Also benötigt man im Sammelgel eigentlich keine niedrigere Ionenstärke. 

Es zeigt sich jedoch, daß die Diskontinuität zwischen Sammelgel und Trenngel durch die 

unterschiedliche Gelporosität sowie die Diskontinuität der Anionen hilfreich für die Trennung 

sind, so daß sich dieses System in der Praxis gut bewährt hat. 

Die Auftrennung im engporigen Trenngel, die wie bereits erwähnt nach Ladung und Molekülgröße 

erfolgt, findet im Lämmli-System aufgrund der festen Beziehung der beiden Größen 

nach der Molekülgröße bzw. dem Molekulargewicht statt, so daß sich dieses System zur Molekulargewichtsbestimmung 

eignet. 

Die SDS-Gelelektrophorese hat einige Vorteile: 

� mit SDS gehen fast alle Proteine in Lösung 

� die hoch geladenen SDS-Protein-Komplexe haben eine hohe elektrophoret. Mobilität 

� die einheitlich negativ geladenen Proteine haben eine einheitliche Laufrichtung 

� hohes Auflösungsvermögen, da SDS die Peptidketten entfaltet und stark restriktive Gele 

verwendet werden können 

� Trennung nach einem einzigen physikochemischen Parameter (Molekulargewicht)


3.2. Praktischer Teil 

Folgende Lösungen stehen zur Verfügung: 

Für das Gießen des Gels: 

Acrylamid-Stammlösung (30,8 % T) 

g/100 ml 

Acrylamid 30 

Bisacrylamid 0,8 

Sammelgelpuffer (4x) pH 6,8 

Konzentration g/100 ml 

Tris 0,5 M 6,06 

SDS 0,4 % 0,4 

Trenngelpuffer (4x) pH 8,8 


Tris 1,5 M 18,2 

SDS 0,4 % 0,4 

Sammelgelpuffer und Trenngelpuffer sind 4x konzentriert. Wie aus der Vorschrift zum Gießen 

des Gels (s. unten) ersichtlich, werden diese Puffer bei der Herstellung des Gels automatisch 

um Faktor 4 verdünnt, müssen also von Ihnen nicht separat verdünnt werden. 

Starter 

N,N,N´,N‘-Tetramethylethylendiamin (TEMED) 

10 % Ammoniumperoxodisulfat (APS) in Wasser (bei –20 °C nahezu unbegrenzt lagerfähig!)


Für die Probenvorbereitung und die Elektrophorese 

Probenpuffer pH 8,0 


Tris 0,01 M 0,121 

EDTA, di-Na-Salz 0,001 M 0,029 

SDS 2 % 2 

Glycerin 20 % 20 ml 

Bromphenolblau 0,005 % 5 ml einer 0,1 % Lsg. 

MilliQ-Wasser ad 95 ml 

Probenpuffer mit ß-Mercaptoethanol ist nur wenige Tage lagerfähig! Daher wird Ihnen die 

Stammlösung ohne ß-Mercaptoethanol zur Verfügung gestellt. Das ß-Mercaptoethanol geben 

Sie erst direkt vor Versuchsbeginn zu. 

ß-Mercaptoethanol 5 % 5 ml 

Da nur wenig Probenpuffer benötigt wird, reicht 1ml Probenpuffer pro Versuchstag, 

also 950 µl Probenpuffer-Stammlösung + 50 µl ß-Mercaptoethanol mischen (Abzug!). 

Elektrodenpuffer (10x) pH 8,4 

Konzentration g/l 

Glycin 1,92 M 144 

Tris 0,25 M 30,3 

SDS 1 % 10 

Der Elektrodenpuffer muß am Versuchstag 1:10 verdünnt werden. Es reicht eine Menge 

von 1l für beide Versuchsgruppen! 

Molekulargewichtsstandard 

Es kommt ein "Broad Range" Standard zum Einsatz. Im folgenden werden die enthaltenen 

Proteine mit Ihren Molekulargewichten sowie ein typisches Bandenmuster auf einem SDS- 

Gel gezeigt.


Färbung des Gels: Schnellfärbung mit Mikrowellenprotokoll 

Färbelösung: SimplyBlue SafeStain (Invitrogen) 

Precision Plus � unstained Marker 

Lösung Lagerort Bemerkung 

Acrylamid-Stammlösung Kühlschrank, 50 ml Falcon-Röhrchen - 

Probenpuffer ohne 

Mercaptoethanol 

von Bio-Rad 

Protein MW (kDa) 

250 

150 

100 

75 

50 

37 

25 

20 

15/10 

Laborbank, 50 ml Falcon-Röhrchen Mercaptoethanol- 

Zugabe! 

Sammelgelpuffer Laborbank, 50 ml Falcon-Röhrchen - 

Trenngelpuffer Laborbank, 50 ml Falcon-Röhrchen - 

10 x Elektrodenpuffer Blaue Box, 1l-Flasche Verdünnen! 

TEMED Kühlschrank, 50 ml Falcon-Röhrchen - 

APS-Lösung Gefrierteil, Eppendorfgefäß - 

3.3. Durchführung 

Die Übung „Diskontinuierliche Gelelektrophorese nach Lämmli“ findet an zwei aufeinanderfolgenden 

Versuchstagen statt. Der zweite Teil des Versuchs wird parallel mit Übung 4 (Western-Blotting) 

durchgeführt. Folgende Aufgaben stehen jeweils an:


1. Tag � Zusammenbau der Gelkassetten und Gießen der Gele (2 Gele/ Gruppe) 

� Fertigstellung der Lösungen zur Elektrophorese, soweit noch nicht 

gebrauchsfertig (s.o.!) 

� Verdünnung und Vorbereitung der Proteinproben zur Elektrophorese 

� Durchführung der Elektrophorese (Parallel hierzu findet die Vorbesprechung 

statt) 

� Färben des Gels in der Mikrowelle 

2. Tag � Trocknen des Gels 

3.3.1. Gießen der Gele 

Zur Vorbereitung räumen Sie die Laborbank im Abzug, auf der Sie das Gel gießen, völlig frei 

und legen einige Papier-Einmalhandtücher unter. Sie stellen an diesem Platz nur die benötigten 

Geräte und Lösungen bereit! Diese Maßnahmen helfen, Kontaminationen bzw. deren 

Verschleppung zu vermeiden und ermöglichen ggf. eine einfache Dekontamination. 

1.) Gelkassetten gemäß Anleitung in den Gießstand einsetzen. Gewünschte Gelhöhe (Trenngel 

sollte ca. 1cm unter den Probentaschen enden) mit einem wasserfesten Stift markieren 

(an der Außenseite der dickeren Platte). 

2.) Sie gießen ein Gel mit einer Totalacrylamidkonzentration von 10%. Die in der Tabelle 

angegebenen Mengen reichen für die Herstellung von zwei Mini-Gelen. 

Zusammensetzung Trenngel: 

Acrylamid- 

Stammlsg. 

10 % T 

(ml für 15 ml Gel 

= 2 Mini-Gele) 

4,9 

Trenngelpuffer 3,75 

Wasser 6,2 

TEMED 0,015 

APS (10 %) 0,15 

3.) Hierzu werden Acrylamid-Lösung, Puffer und Wasser nach den Angaben in der Tabelle 

in ein beschriftetes 50 ml Plastikschraubgefäß zusammenpipettiert und gemischt. Bevor


Sie die Polymerisation durch Zugabe von TEMED und APS auslösen, stellen Sie sicher 

daß Sie alles Nötige für die weiteren Schritte (Einfüllen des Gels und Überschichten mit 

Wasser) bereitliegen haben! Dann wird TEMED und zuletzt APS zugegeben und nochmals 

gemischt. Jetzt muß zügig gearbeitet werden! Das Gemisch bis zur Markierung in 

die Gelkassetten füllen und vorsichtig mit Wasser überschichten. So erhalten Sie eine absolut 

glatte und gerade Geloberkante. Die Pipettenspitze, die Sie zum Pipettieren des Acrylamids 

verwendet haben, werfen Sie nach dem Gießen des Gels in das 50ml- 

Schraubgefäß mit dem restlichen Gel, um alle Acrylamidreste durch Polymerisation zu 

inaktivieren. Das Trenngel ist polymerisiert, wenn die Trennlinie zwischen Gel und Wasser 

deutlich zu sehen ist. 

4.) Wenn das Trenngel auspolymerisiert ist entfernen Sie das Wasser darüber und stellen Sie 

in analoger Weise das Sammelgel her: 

Zusammensetzung Sammelgel: 

Acrylamid- 

Stammlsg. 

4% T 

(ml für 10 ml) 

1,3 

Sammelgelpuffer 2,5 

Wasser 6,1 

TEMED 0,01 

APS (10 %) 0,1 

Füllen Sie den verbleibenden Raum über dem auspolymerisierte Trenngel mit Sammelgel-Lösung 

übervoll auf. Setzen Sie dann die Taschenformer (“Kämme”) in die Kassetten 

ein und drücken den Kamm ganz hinein. 

5.) Wenn das Sammelgel auspolymerisiert ist, können Sie die Glasplatten mit dem Gel aus 

dem Gießstand entnehmen. Dann zeichnen Sie die Taschen des Gels mit einem wasserfesten 

Stift auf der großen Glasplatte an, um Ihnen das Auftragen der Proben nach dem 

Entfernen des Kamms zu erleichtern.


3.3.2. Probenvorbereitung für die SDS-Elektrophorese 

Jede Gruppe belädt zwei Gele, dazu werden unterschiedliche Proben hergestellt. 

� Für das Gel, das später mit Coomassie Blue angefärbt wird, wird der Überstand einer 

100‘000�g Zentrifugation eines E.coli-Lysates aufgetragen. Vorher müssen die Pro- 

ben allerdings noch weiter verdünnt werden. Da die Proben so zu konzentriert sind, 

stellen sie bitte von der Probe eine 1:2, 1:4 und 1:8 Verdünnung mit MilliQ-Wasser 

her, 100 µl Gesamtvolumen reichen dabei für beide Gruppen. 

� Für das zu blottende Gel wird eine fertige Probe mit unbekannter Konzentration an 

BSA (bovines Serumalbumin) ausgegeben. Um diese quantifizieren zu können, stellen 

sie bitte aus dem Feststoff BSA zunächst eine Stock-Lösung mit einer Konzentration 

von 10 mg/ml her. Aus dieser Lösung stellen sie eine Standardreihe (jeweils 1000 

µl) mit den Konzentrationen 25, 50, 75, 100, 150 und 200 µg/ml her, um die unbekannte 

Probe anschließend quantifizieren zu können. 

� Nach dem Verdünnen des E.coli-Lysats und der BSA-Lösung werden 100 µl der jeweiligen 

Lösung mit 100 µl fertigen Probenpuffer (mit Mercaptoethanol!) versetzt, so 

dass Sie von beiden Reihen ein finales Volumen von 200 µl haben. Der Probenpuffer 

enthält Glycerin, welches eine höhere Dichte als Wasser besitzt, und somit ein Einsinken 

der Probe in die Tasche ermöglicht. Die Molekulargewichtsstandards liegen bereits 

fertig vor. 

� Nach Zugabe des Puffers werden die Proben gemischt und 5 Minuten im Heizblock erhitzt. 

Tip: Einstechen des Deckels mit einer Kanüle verhindert das Aufspringen des 

Deckels! 

� Nach dem Abkühlen werden die Proben 2 Minuten bei 15‘000�g zentrifugiert, um evtl. 

vorhandene Partikel zu sedimentieren. Diese würden sonst Streifen im Gel verursachen. 

� Von jeder fertigen Probe mit Mercaptoethanol werden 20 µl aufgetragen. In die äußersten 

Taschen wird der Proteinstandard aufgetragen; je 5 µl Unstained Marker auf dem 

Coomassie-Gel, je 2 µl All-Blue auf dem Western Blot-Gel.


3.3.3. Durchführung der Elektrophorese 

1.) Die fertigen Gele werden aus dem Gießstand herausgenommen und auf die Dichtungen 

am Elektrodenrahmen gesetzt (kurze Platte nach innen, darauf achten, daß die Dichtung 

richtig sitzt!). Dieser wird dann in die Klemmvorrichtung gebracht und bei gleichzeitigem 

Druck nach unten auf den Elektrodenrahmen (siehe Abbildung auf der Vorrichtung!) 

werden die Klammern geschlossen. Das Herunterdrücken stellt sicher, daß die Dichtungen 

gut mit den Kanten der kurzen Glasplatten abschließen. Der Kamm kann nun entfernt 

werden. Diese Einheit wird bis kurz unter den Rand mit Elektrodenpuffer (1x, also 

Stammlösung 1/10 mit Wasser verdünnen; 0,5l werden benötigt) gefüllt, so dass dieser in 

die entstandenen Taschen fließt. Prüfen Sie, ob der innere Puffertank dicht ist! 

Aufbau der Mini-PROTEAN 3 Kammer (BioRad) 

2.) Danach tragen Sie die Proben mit der Pipette auf.


3.) Wenn alle Proben aufgetragen sind: Den äußeren Tank bis zur Markierung mit Elektrodenpuffer 

füllen, den Deckel aufsetzen (paßt nur richtig herum!) und Kabel an Stromversorger 

anschließen (auf Polung achten!). Die Elektrophorese dauert bei konstant 200 V 

etwa 45-60 Minuten. Sie ist beendet, wenn der Frontmarker Bromphenolblau den unteren 

Rand des Gels erreicht hat. Dann: Strom abschalten! Sicherheitsdeckel abnehmen, den 

Einsatz mit den Gelen herausnehmen, den inneren Puffertank ausleeren und die Gelkassetten 

ausbauen. Zum Entnehmen der Gele aus den Glaskassetten nur Plastikspatel verwenden! 

Mit diesen kann die kleine Glasplatte aufgehebelt werden. Bei allen weiteren 

Operationen das Gel nur noch mit befeuchteten Handschuhen berühren, da es sonst irreversibel 

beschädigt wird. Das Gel liegt dann auf der großen Platte. Dann das Gel welches 

mit Coomassie gefärbt werden soll über einer Schale mit MilliQ-Wasser von der Glasplatte 

lösen und in das MilliQ-Wasser hineingleiten lassen, das Gel, das geblottet wird, 

wird in eine Schale mit Transferpuffer gegeben. 

4.) Die Gele in MilliQ werden in der Mikrowelle erhitzt bis das Wasser fast kocht, anschließend 

eine Minute geschüttelt. Das MilliQ wird getauscht und die Prozedur noch zweimal 

wiederholt. Anschließend werden ca. 20 ml Färbelösung auf die Gele gegeben, ebenfalls 

kurz erhitzt und für 5 min geschüttelt. Zum Schluss werden die Gele über Nacht zur Entfärbung 

des Hintergrunds in MilliQ gelagert. Das andere Gel wird über Nacht in Transferpuffer 

gelagert und am nächsten Tag geblottet. 

3.3.4. Einschweißen der Gele (zweiter Versuchstag) 

1.) Die Gele werden am nächsten Tag im Geltrockner im Heißluftstrom getrocknet werden. 

Zur Auswertung kann an einem Kopiergerät oder Scanner ein Bild des Gels auf Papier 

übertragen werden. 

3.4. Auswertung/ Protokoll 

� Ordnen Sie die Proteine des Molekulargewichtsstandards unter Angabe der Molekülmasse 

und log(MW) den Banden des Standards im Gel zu (in Kopie des Gels die Banden 

kennzeichnen!)


� Erstellen Sie durch Auftragung von log(MW) gegen die relative Beweglichkeit u 

(Laufstrecke der jeweiligen Bande / Laufstrecke Front) eine Eichgerade Ihrer Standardproteine. 

� Bestimmen Sie mit Hilfe der Eichgerade die Molekulargewichte von fünf Proteinen Ihrer 

Wahl in Ihren Proben! Achten Sie bei der Erstellung der Eichgeraden auf eine sinnvolle 

Skalierung der Achsen! Die von Ihnen ausgewählten Proteine müssen in der Kopie Ihres 

Gels eindeutig markiert sein! 

� Bewerten Sie kurz das Ergebnis.



Kurzzusammenfassung Sicherheitsinformationen 


sowie R-Sätze bzw. H-Sätze 

Acrylamid 

Bis-Acrylamid 

Ammoniumperoxidisulfat 

Dodecylsulfat-Natriumsalz 

(SDS) 

TEMED 


H350, H340, H361f, H301, 

H372, H332, H312, H319, H315, 

H317 

Signalwort: „Achtung“ 

H302 

Signalwort: “Gefahr” 

H272, H302, H315, H319, H335, 

H334, H317 


H228, H302, H311, H315, H319, 

H335 


H225, H332, H302, H314 



6,3 ml Lösung mit 30% (m/v) Acrylamid 

und 0.8% (m/v) Bisacrylamid 

(Verhältnis 37,5:1) 

= 300 mg/ ml Acrylamid und 8 mg/ 

ml Bis-Acrylamid 

500 µl Lösung mit 10% (m/v) 

APS 

Bestandteil div. Puffer. Max. Menge: 1 l 

Lösung mit 1% (m/v) SDS (Elektrodenpuffer), 

Max. Konz.: 2% (m/v) SDS (Probenpuffer) 

< 100 µl Reinsubstanz


ß-Mercaptoethanol 


H301, H310 + H330, H315, 

H318, H410 

< 100 µl Reinsubstanz 


der Reagenzien nach üblichem Laborstandard keine besonderen Gefahren zu erwarten. 


� üblicher Laborstandard (Laborkittel, Schutzbrille…, s. Allgemeine Betriebsanweisung) 

und 

� Einmalhandschuhe (Nitrilhandschuhe) tragen und bei Kontamination sofort wechseln/ 

Hände waschen 

� unter gekennzeichnetem Abzug arbeiten 

� gekennzeichnete Pipetten benutzen 

� Abfall in gekennzeichnete Behälter


Zusammenfassung: 

3.6. Literatur 

1) Raymond S., Weintraub L., Science 130 (1959) 711 

2) Ornstein L., Ann. NY Acad. Sci. 121 (1964) 321-349 

3) Davies BJ., Ann NY Acad. Sci. 121 (1964) 404-427 

4) Maurer R.H. Disk Elektrophorese, W. d Gruyter Berlin 1968 

5) Lämmli, U.K., Nature 227 (1970) 680-685 

6) Wagner H., Blasius E. Hersg. Praxis der elektrischen Trennmethoden, Springer Verlag, 

Berlin Heidelberg (1989) 1-2, 223-261


7) T. Andrews, Electrophoresis 

8) Westermeier, R., Elektrophorese-Praktikum, VCH Weinheim 1990


4 BC-4: Western-Blotting: Proteintransfer und Immundetektion 

4.1. Allgemeines 

Das Western-Blotting wurde von Tombin und Renard 1979 eingeführt und bezeichnet den 

Vorgang der Übertragung von Proteinen (Protein-„Flecken“ = Blots) auf eine Membran mit 

anschließender Immundetektion. Die Bezeichnung Western-Blotting geht auf den Namen des 

Erfinders der Blotting-Technik namens Southern zurück, der die Methode 1971 für die Auftrennung 

von DNA-Fragmenten und nachfolgender Hybridisierung als Southern-Blotting 

eingeführt hat. In Anlehnung an seinen Namen wurde die entsprechende Auftrennung von 

RNA-Fragmenten ironisierend Northern-Blotting genannt und das Proteinblotting eben Western-Blotting. 

Dabei werden die im Gel aufgetrennten Proteine (vergl. Übung 3: Diskontinuierliche 

SDS-Elektrophorese nach Lämmli) über Elektrotransfer auf einen Träger (z. B. 

Nitrocellulose- oder PVDF-Membran) übertragen und für die nachfolgende Immundetektion 

immobilisiert. Durch das Anlegen eines elektrischen Feldes wandern die Proteine aus dem 

Acrylamidgel heraus und bleiben auf der Membran haften. Wichtig ist, dass bei der Übertragung 

die Proteine auf dem Träger in derselben geometrischen Anordnung erscheinen, wie sie 

nach Auftrennung im Gel vorliegen. Diese in der Molekularbiologie weithin angewendete 

Methode ist äußerst vielseitig, da auch Proteine aufgetrennt und immundetektiert werden 

können, die unter physiologischen Bedingungen unlöslich sind (z. B. Membranproteine). 

Blot-Membranen: 

Die am häufigsten verwendeten Blot-Memberanen bestehen aus Nitrocellulose, Polyvinylidendifluorid 

(PVDF) oder positiv geladenem Nylon ( + Nylon). Die Membranen binden Proteine 

durch hydrophobe (Nitrocellulose), hydrophile (PVDF) oder ionische Wechselwirkungen 

( + Nylon). Selbst Peptide mit nur 20 Aminosäuren haften noch auf Nitrocellulose. Im Vergleich 

zum Gel ist die Membran leicht handzuhaben und aufzubewahren.


Blotting + 

Detektion 

Acrylamidgel, Coomassie-Färbung Nitrocellulose-Membran nach elektrophoretischem 

Transfer und Immunodetektion 

Anmerkung: Vor dem Blotting-Vorgang werden Proteine im Gel nicht mittels Coomassie angefärbt. Die Färbung 

wird nur für direkten Nachweis der Proteine im Acrylamidgel verwendet und ist hier zur Veranschaulichung 

dargestellt. 

Immundetektion: 

Im Gegensatz zu Proteinfärbemethoden mittels Coomassie-Blue oder Silber können einzelne 

Proteine nach dem Elektrotransfer auf die Nitrocellulose-Membran durch Reaktion mit einem 

spezifischen Antikörper selektiv nachgewiesen werden. Zuvor müssen allerdings unspezifische 

Proteinbindungsstellen der Blotmembran abgesättigt werden, in dem die Membran vor 

der Inkubation mit dem spezifischen Antikörper in einer Lösung „geblockt“ wird, die Magermilchpulver, 

BSA (= Bovine Serum Albumin) oder FCS (= Fetal Calf Serum) enthält. 

Bei der anschließenden Inkubation der Membran mit dem spezifischen Serum bzw. Antikörper 

reagiert nur das gesuchte Protein (Antigen) mit dem Antikörper. Dabei kommt es zur Bildung 

eines Protein-Antikörper-Komplexes auf der Membran.


Der visuelle Nachweis erfolgt dann durch die Inkubation der Membran mit einem sekundären 

Antikörper, der gegen das IgG-Protein gerichtet ist und außerdem mit einem Enzym, z. B. 

einer alkalischen Phosphatase, gekoppelt ist. Dieses Enzym katalysiert eine Reaktion an den 

Farbstoffen BCIP (= 5-Bromo-4-Chloro-3-indolylphosphat) und NBT (= Nitroblau Tetrazolium). 

Durch die katalytische Aktivität des Enzyms wird die Phosphatgruppe des BCIP abgespalten, 

gleichzeitig wird durch die alkalische Phosphatase NBT reduziert. In 

dephosphorylierter Form erscheint BCIP blau, die reduzierte Form von NBT bildet einen violetten 

schwerlöslichen Niederschlag, gemeinsam ergeben beide Frabstoffe ein blauviolettbraunes 

Präzipitat, welches an der Stelle, an der das primär nachzuweisende Protein lokalisiert 

ist, ausfällt. 

Da sich die Methode mit NBT/BCIP nur bedingt zur Quantifizierung unbekannter Proteinproben 

eignet, werden wir einen, mit einem im Nahinfrarotbereich detektierbaren Farbstoff 

gekoppelten 2. Antikörper verwenden und den Blot anschließend per NIR-Scan (Nearinfrared: 

680 bzw. 800 nm) auf einem Licor Odyssey ® Gerät auswerten. Das Verfahren hat 

den Vorteil einer geringeren Nachweisgrenze gegenüber der Färbung mit NBT/BCIP, außerdem 

kann der Blot zweifarbig (rot und grün) detektiert werden. 

(Bild aus der Broschüre „Odyssey ®“ der Firma Licor entnommen.)


4.2. Puffer und Lösungen 

Odyssey ® Blocking Buffer LI-COR, Cat. #927-40000 +4°C 

Tween ® -20, 10% (v/v) Lösung 

in Wasser 

PBS 0.1% Tween 9.55g 1000ml Milli Q Wasser, 

1ml Tween 

PBS 9.55g 1000ml Milli Q water 

1. Antikörper 

Infrared (IR)-labeled 2. Antikörper 

Transfer buffer w/o SDS 12.5x 

Transfer buffer 1x 

RT 

RT 

Lagerung 

Fa. LI-COR Lichtgeschützt lagern!, + 4°C 

37.9g Tris 

180g Glycin 

ad 1000ml MilliQ Wasser 

200ml of 12.5x stock ad 2000ml 

MilliQ Wasser + 500ml MeOH 

Antikörper-Lösungen: 

Prim. AK-Lösung 

Volumen 

Blocking Buffer 10 ml 

Tween 20 10% 0,1 ml 

Prim. AK 0,01 ml 

Sek. AK-Lösung 

PBS 

Volumen 

10 ml 

SDS 10% 0,02 ml 

Tween 20 10% 0,1 ml 

Sek. AK 0,01 ml 

RT 

RT


Molekulargewichtsstandards: 

All Blue � Marker von Bio-Rad 

Protein MW (kDa) 

250 

150 

100 

75 

50 

37 

25 

20 

15/10 


Wegen des hohen Gefährdungspotentials von Acrylamid in den Gelen stets Handschuhe tragen! 

Tankblotting: 

Es wird eine Elektroelution mittels Tankblotting (im Gegensatz zum Halbtrockenverfahren) 

durchgeführt. 

Das vorbereitete Gel wird kurz im Transferpuffer inkubiert. Die Membran wird kurz im Wasser 

und dann im Blotpuffer (= Transferpuffer) equilibriert. In einer Plastikwanne wird von 

unten nach oben folgendes „Sandwich“ aufgebaut: 

Sandwich packen: 

� Den „Sandwicher“ mit der schwarzen Seite nach unten in die Plastikwanne legen, 

Transferpuffer in die Wanne einfullen 

� Schwamm darauflegen (dabei an die oberen Schrauben anstoßen)


� 4 Lagen Transferpuffer-getränktes Filterpapier (in der Größe des Gels) auflegen 

- Transferpuffer darübergießen 

� SDS-Polyacrylamidgel (blauer Rand oben) auflegen 


� Nitrocellulose-Membran (in der Größe des Gels) auflegen 

- Membran kurz mit Wasser tränken, dann mit Transferpuffer 

- Membran auf dem Gel mittig ansetzen, möglichst keine Luftblasen einschlie- 

ßen 


- Mit Fingerrücken die Luft herausstreichen 

� 3 Lagen Transferpuffer-getränktes Filterpapier auflegen 


� Schwamm auflegen 

� Sandwicher zumachen (drücken und nicht verkanten, an den Seiten darf nichts heraus- 

stehen) 

Blotting Apparatur: 

Pro Blottingtank werden zwei Sandwicher eingesetzt 

� Sandwicher und Einsatz: black to black 

� Kühlsystem an schwarze Seite des Einsatzes setzen 

� Rührfisch in Blottingtank geben, den Tank in einer Plastikwanne auf dem Magnetrührer 

platzieren 

� Transferpuffer einfüllen bis knapp unter den oberen Rand 

� den Transferpuffer auf der Kammer entfernen 

� rühren lassen 

� Deckel schließen, Zuordnung der Polung beachten: black to black 

� Spannungsgeber programmieren: 

- 95 V 

- 230 mA als Obergrenze 

- 1h 20 min


Kühlsystem 

Einsatz mit Sandwicher 

Mini Trans-Blot � Schwamm 

„Sandwicher“ 

Apparatur für Western-Blotting (Bio-Rad) 

Blottingtank 

Nach Abschluß der Elektrophorese: Strom abschalten! Sicherheitsdeckel abnehmen, den 

Einsatz mit den Membranen herausnehmen, den Puffertank ausleeren und die Sandwicher 

ausbauen. Zum Entnehmen der Membran eine Pinzette verwenden, nicht mit den Fingern 

(auch nicht mit Handschuhen) anfassen, da sonst Protein-Fingerabdrücke auf der Membran 

erscheinen! Die verwendeten Filterpapiere und das Acrylamidgel entsorgen (Feststofftonne!), 

Schwämme, Sandwicher und den Tank unter fließendem Wasser ausspülen. 

Membran 5-10 min mit TBS-Puffer waschen, um mögliche Transferpuffer-Reste zu entfernen. 

Blocken: (Das Blocken und die Inkubation mit dem Erstantikörper wird nicht im Praktikum 

durchgeführt, da es zu zeitintensiv wäre) 

Vor der Inkubation der Membran in der Antikörper-Lösung wird diese zur Absättigung der 

restlichen Proteinbindungsstellen der Blotmembran 1h in Blocking Buffer geschwenkt. 

� 1 h in Blocking-Lösung schwenken 

� Membran für mind. 12 h in Lösung mit primärem Antikörper schwenken 

Diese aufeinanderfolgenden Schritte erfolgen unter leichter Bewegung der Membran, um 

ständige Benetzung zu gewährleisten. 

Detektion: 

� 4 x 5 min mit PBS-Tween waschen (zum Entfernen von ungebundenem prim. AK) 

� Membran für 45 min in Lösung mit sekundärem Antikörper schwenken 

� 4 x 5 min in PBS-Tween waschen (LICHTGESCHÜTZT!!!)


� 1 x 5 min in PBS ohne Tween (LICHTGESCHÜTZT!!!) 

Danach kann die Membran auf dem Licor Odyssey ® eingescannt werden. 

4.4. Auswertung 

� Das gescannte Gel wird direkt auf dem Odyssey ® Rechner quantifiziert. Die Daten 

können wahlweise ausgedruckt oder als Datei mitgegeben werden (USB-Stick nicht 

vergessen!!). 

� Aus den ermittelten Intensitäten der Standardverdünnungen müssen sie eine Eichgerade 

erstellen, mit deren Hilfe sie die unbekannte Probe quantifizieren können. 

� Protokoll/Ansage: beschrifteter Ausdruck des Blots, Eichgerade, nachvollziehbare 

Rechnung und Endergebnis der unbekannten Probe.


Kurzzusammenfassung Sicherheitsinformationen 


sowie R-Sätze bzw. H-Sätze 

Acrylamid 

Methanol reinst 


H350, H340, H361f, H301, 

H372, H332, H312, H319, H315, 

H317 



Spuren im Gel 

500ml Reinsubstanz, daraus 2,5l 

20% (v/v) Lösung in Puffer 

Signalwort : 

“Gefahr” 

H225, H331, H311, H301, H370 





und 

� Einmalhandschuhe tragen und bei Kontamination sofort wechseln/ Hände waschen 

� Abfall in gekennzeichnete Behälter 


1) Lottspeich, F., Zorbas, H. Bioanalytik, Spektrum Verlag, Heidelberg Berlin 1998 

2) Kleber, H.-P., Schlee, D., Schöpp, W. Biochem. Praktikum, Fischer Verlag, Jena 1997 

3) Rehm, H. Der Experimentator: Proteinbiochemie / Proteomics, Spektrum Verlag, Heidelberg 

Berlin 2002 

4) Wagner H., Blasius E. Hersg. Praxis der elektrischen Trennmethoden, Springer Verlag, 

Berlin Heidelberg (1989) 1-2, 223-261


5 BC-5: ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) 


In der Molekularbiologie spielen Antikörper (oder Immunglobuline) eine wichtige Rolle. 

Durch die hochspezifische Reaktion zwischen Antikörper und Antigenen sind sie das Mittel 

der Wahl bei der Analyse von biologischen Extrakten. 

5.1.1. Das Immunsystem 

Um den Körper effektiv gegen Krankheiten und Infektionen zu schützen, muss das Immunsystem 

eine Infektion erkennen und sie schnellstmöglich stoppen und eliminieren. Diese Aufgabe 

wird von beiden, dem angeborenen und dem adaptiven Immunsystem erledigt. 

Die erste Barriere für eindringende Bakterien bilden die Haut und die Schleimhäute. Sie sind 

dicht von Mikroorganismen besiedelt, so dass das Ansiedeln von Keimen oder Erregern weitgehend 

unterbunden wird. Schafft es ein Erreger, z.B. durch eine kleine Wunde in den Körper 

einzudringen, wird er zuerst von dem angeborenen Immunsystem angegriffen. Die ersten Zellen, 

die auf die Infektion regieren sind die Phagozyten, z.B. Makrophagen, sie erkennen und 

töten eingedrungene Mikroorganismen ab. Währendessen schütten sie Cyto- und Chemokine 

aus, um weitere Immunzellen sowie das Komplementsystem zu rekrutieren. 

Zwar nicht so schnell aber viel effektiver als das angeborene Immunsystem, ist das adaptive 

Immunsystem. Zu dem adaptiven Immunsystem gehören die B- und T- Lymphozyten. Wird 

ein Antigen von einem membranständigen B-Zell Rezeptor (Antikörper der Klasse M) gebunden, 

so differenziert diese zur Plasmazelle. Plasmazellen produzieren große Mengen von 

löslichen Antikörpern, die die gleiche Antigenspezifität besitzen wie die gebundenen Rezeptoren. 

Wird eine T-Zelle über ihren Rezeptor aktiviert, so kann sie in drei verschiedene T-Zell Formen 

differenzieren. Die cytotoxischen T-Zellen töteten infizierte körpereigene Zellen, die T- 

Helferzellen aktivieren andere Immunzellen und die regulatorischen T-Zellen regulieren die 

Aktivität des Immunsystems.


5.1.2. Struktur der Antikörper 

Antikörper bzw. Immunglobuline sind Y-förmige Proteine, sie bestehen aus zwei molekular 

identischen schweren und zwei identischen leichten Polypeptidketten. Die beiden schweren 

Ketten und jeweils eine leichte und eine schwere Ketten sind durch Disulfidbrücken kovalent 

verbunden. 

Die Arme der Y-Struktur bestehen aus den Aminoenden der vier Ketten, an deren Enden die 

Antigenbindestellen liegen. Diese Bereiche beinhalten hypervariable Bereiche, die sich bei 

jedem Antikörper unterscheiden, sie bestimmen die Spezifität des Antikörpers. Man geht davon 

aus, dass der Mensch 10 11 verschiedene Antikörperspezifitäten besitzt. 

Der Stamm der Y-Struktur besteht aus den C-terminalen Domänen der beiden schweren Ketten. 

Dieser Bereich variiert strukturell kaum und wird deswegen als konstante Region bezeichnet. 

Die konstante Region des Antikörpers bestimmt zum einem die Hauptform (Isotyp) 

des Antikörpers und löst bei Antigenbindung verschiedene immunologische Effektormechanismen 

gegen das erkannte Antigen aus. 

Es gibt fünf Isotypen von Immunglobulinen, die auf die Aktivierung unterschiedlicher Immunwirkungsmechanismen 

spezialisiert sind, Immunglobulin M (IgM), Immunglobulin D 

(IgD), Immunglobulin G (IgG), Immunglobulin A (IgA) und Immunglobulin E (IgE). Die 

Arme und der Stamm der Y-Struktur werden durch einen wenig strukturierten Bereich verbunden, 

er sorgt für eine große räumliche Flexibilität des Antikörpers (außer Immunglobulin 

M und E). 

Abb.1: Struktur eines Antikörpers am 

Beispiel des Immunglobulin G. 

Der Aufbau ist achsensymmetrisch aus 

je zwei leichten und zwei schweren 

Polypeptidketten. Die Ketten bestehen 

aus einer variablen und einer (leichte) 

bzw. drei (schwere Kette) konstanten 

Regionen. . Zwischen der ersten und 

zweiten konstanten Region der 

schweren Kette befindet sich eine 

Gelenkregion, die so genannte Hinge- 

Region. Sie verbindet die 

Antigenbindende und das konstante 

Fragment. Hypervariable Regionen der 

leichten und schweren Kette bilden die 

zwei identischen 

Antigenbindungsstellen


5.1.3. Antigen/Antikörper Bindung 

Antigene sind Bakterien, Vieren oder andere große Moleküle. Antikörper binden nicht das 

komplette Antigen, sonder nur einen bestimmten Bereich, das so genannte Epitop. Die meisten 

Antigene besitzen verschiedene Epitope und eine Immunreaktion ist gegen eine Vielzahl 

von ihnen gerichtet. Haptene sind kleine Moleküle, die zwar von Antikörpern erkannt werden, 

jedoch zu klein sind um eine Immunantwort hervorzurufen. 

Die Bindung zwischen Antikörper und Antigen ist reversibel und beruht auf Wasserstoffbrücken, 

elektronischen und hydrophoben Wechselwirkungen. Diese Bindungskräfte können 

sehr hohe Affinitäten erreichen, die hochspezifisch auf ein bestimmtes Epitop wirken. Damit 

es zu einer Bindung kommen kann, müssen die Epitope auf der Antigenoberfläche zugänglich 

sein und Epitop und Antigenbindungsstelle müssen komplementär zu einander sein. 

Aus diesen Gründen nutzt man die Antigen/Antikörper Bindung für effiziente und spezifische 

Nachweisverfahren, den Immunoassays. Zum Nachweis des entstandenen Antikörper- 

Antigen-Komplexes werden markierte Antikörper oder Antigene eingesetzt. Zur Markierung 

können Radioisotope, Enzyme, die die Reaktionen zu chromogenen Reaktionsprodukten katalysieren, 

oder fluoreszierende Farbstoffe eingesetzt werden. 

. 

Abb. 2: Antigene können verschiedene Epitope tragen


5.1.4. Antigenerkennung durch T-Lymphozyten 

Im Gegensatz zu den B-Lymphozyten 

und Antikörpern können T-Lymphozyten 

T-Zell- 

T-Zellnicht 

direkt an das vollständige Antigen Rezeptor 

Rezeptor 

binden. 

Peptid 

CD8 

Peptid 

CD4 

Sie können Antigene nur erkennen, wenn 

Fragmente des Antigens durch so genannte 

Antigen-präsentierenden Zellen (APC) 

MHC I 

MHC II 

präsentiert werden. 

Diese Antigene können von Viren stam- 

antigenpräsentierende Zelle antigenpräsentierende Zelle 

men, die sich in der körpereigenen Zelle vermehren oder die Antigen-präsentierende Zelle hat 

das Antigen endozytotisch aufgenommen. Befinden sich in einer Zelle nun fremde Proteine, 

so können sie als Peptid-Fragmente von MHC-Molekülen der Klasse I oder II gebunden und 

als MHC-I/II-Peptid-Komplex an die Zelloberfläche gebracht werden. MHC-I Moleküle präsentieren 

Antigenfragmente von z.B. Viren. Die MHC-I Komplexe werden durch die CD8 

Co-Rezeptoren der cytotoxischen T-Zellen erkannt. Die cytotoxischen T-Zellen töten erkannte, 

infizierte Zellen um eine Ausbreitung des Virus zu verhindern. Bis auf die roten Blutkörperchen 

exprimieren alle Körperzellen MHC-I Moleküle. 

MHC-II Moleküle werden von spezialisierten Zellen des Immunsystems exprimiert. Über 

diesen Komplex werden extrazelluläre Antigene präsentiert, die z.B. endozytotisch aufgenommen 

wurden. Der MHC-II Komplex wird von den CD4 Co-Rezeptoren der T- 

Helferzellen erkannt. Die T-Helferzellen aktivieren die erkannten Antigen-präsentierenden 

Immunzellen. 

5.1.5. Herstellung monoklonaler Antikörper 

cytotoxische CD8-T-Zelle 

CD4-T-Helferzelle 

Man kann Antikörper gegen fast jede Substanz erzeugen. Meist verwendet man aber als Antigen 

Proteine, denn nur sie können eine vollständige Immunantwort auslösen. Zur Antikörperproduktion 

werden meistens Mäuse mit dem Antigen immunisiert. Um einen hohen 

Serumtiter an hochaffinen Antikörpern zu erhalten sind mehrere Antigen-Applikationen notwendig. 

Die Immunogenität von Antigenen lässt sich z.B. durch Freundsches Adjuvanz (Öl-


in-Wasser-Emulsion mit abgetöteten Mycobakterien) verstärken. Antigene mit einem Molekulargewicht 

von weniger als 10kDa wirken in der Regel nur schwach immunogen und werden 

daher an einen hochmolekularen Träger (Serumalbumin) gekoppelt. Im Blut werden die 

Antigene von der Milz, einem lymphatischen Organ mit vielen Lymphozyten, festgehalten. 

Die B-Lymphozyten der Milz sezernieren nun spez. Antikörper. Sobald der Antikörper-Titer 

hoch genug ist, wird der Maus die Milz entnommen. 

In Anwesenheit von PEG (Polyethylenglykol) fusioniert man die Milzzellen mit unsterblichen 

Myelomzellen (Tumor der Plasmazellen). Die Myelomzellen hat man vorher so selektiert, 

dass sie selber keine Antikörper produzieren. Bei der Fusionierung entstehen 

Hybridome, die sich unbegrenzt vermehren und kontinuierlich Antikörper produzieren können. 

Diese Hybridzellen werden mit Hilfe von Substanzen selektiert (HAT-Selektion: Hypoxanthin, 

Aminopterin, Thymidin), die die unfusionierten Myelomzellen abtöten. Da die 

unfusionierten Milzzellen eine beschränkte Lebensdauer besitzen, sterben sie ebenfalls ab. 

Die Hybridome testet man anschließend auf ihre Antikörperproduktion. Antikörper als extrazelluläre 

Moleküle können im Kulturmedienüberstand nachgewiesen werden. Nach Vereinzelung 

kloniert man Zellen mit der gewünschten Spezifität und lässt sie in Massenkulturen 

wachsen, um große Antikörpermengen zu erhalten. Jedes Hybridom leitet sich als Klon von 

einem einzigen B-Lymphozyt ab, deshalb besitzen alle Antikörper, die es produziert, die gleiche 

Struktur und richten sich gegen das gleiche Epitop (Stelle am Antigen, an die sich der 

Antikörper anlagert; auch antigene Determinante genannt). Diese Antikörper sind daher monoklonal. 

5.1.6. Immunologische Testprinzipien 

Immunologische Tests sind Ligandenbindungsassays, es erfolgt somit der Nachweis einer 

Substanz mit einem Antikörper. Antikörper können in einem Säugetierorganismus nur gebildet 

werden, wenn das Antigen eine Immunreaktion verursacht. Das Antigen muss dem Organismus 

fremd sein und ein Molekulargewicht > 3000 g /mol haben. Antigen und Antikörper 

bilden einen Komplex / ein Agglutinat. Dieser ist meist nicht direkt detektierbar und muss mit


einer Indikatorreaktion sichtbar gemacht werden. Die Tests teilt man nach der Art dieser Indikatorreaktion 

ein: 

� Latexagglutinationstest: Der Antikörper ist an farbige Latexpartikel gebunden. 

� Präzipitationstest: Der Antigen-Antikörperkomplex wird mit einem zweiten Antikörper, 

der gegen ein anderes Epitop des Antigens gerichtet ist, präzipitiert. Komplexe aus zwei 

Antikörpern und einem Antigen heißen Sandwichkomplexe. 

� ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay): Der Antikörper ist an ein Enzym (z.B. 

alkalische Phosphatase) gebunden. Die Detektion erfolgt durch die enzymatische Umsetzung 

eines Substrates zu einem farbigen Produkt (z.B. mit einem p-Nitrophenylphosphat). 

Die alkalische Phosphatase hydrolisiert Phosphorsäureester, sie arbeiten am effektivsten 

bei einem alkalischen pH. Sie entfernt Phosphat-Gruppen von verschiedenen Molekülen. 

Das verwedete Substrat in diesem Versuch ist ein p-Nitrophenylphosphat, durch Abspaltung 

eines Phosphates ensteht p-Nitrophenol, welches schwach gelb ist. 

� SPIA-Test (Soluble particle immunoassay): Silberpartikel verändern durch die Agglutination 

ihre Farbe. 

� Hämagglutinationstest: Visualisierung des Agglutinats durch Erythrozyten. 

5.1.7. ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) 

Ein Nachweisverfahren das auf einer enzymatischen Farbreaktion beruht, ist der ELISA Test. 

Es gibt zwei Hauptvarianten der ELISA- Technik: 

1. Indirekter ELISA 

Mit dem indirekten ELISA werden spezifische Antikörper in 

einer Probe nachgewiesen. Das Antigen wird hierbei auf dem Boden 

einer Mikrotiterplatte fixiert. Nach Aufgabe der Probe, wird 

mit einem enzymgekoppelten Antikörper der gesuchte Antikörper 

nachgewiesen. Eine positive Probe zeigt einen Farbumschlag, eine 

negative hingegen nicht. 

Enzym Enzym Enzym 

Antigen


2. Sandwich ELISA (direkter ELISA) 

Der Sandwich ELISA ist die zweite Variante der ELISA Technik. 

Hierbei benötigt man zwei monoklonale Antikörper, die 

unterschiedliche Epitope des gleichen Antigens binden. Einer der 

Antikörper wird am Plattenboden fixiert. Nach Aufgabe der Probe 

und Bindung des Antigens 

an den 1. Antikörper wird der 2. enzymgekoppelte Antikörper 

aufgetragen, auch er bindet das Antigen. Es entsteht ein so genanntes 

Sandwich. Nach Zugabe des Substrates kann bei positiven Proben ein 

Farbumschlag beobachtet werden. 

Um ein schwaches Farbsignal zu verstärken, kann mit drei Antikörpern 

gearbeitet werden. Bei dieser Variante ist der zweite Antikörper 

nicht enzymgekoppelt. In einen weiteren Schritt wird ein dritter 

Antikörper aufgetragen, der enzymgekoppelte ist und den zweiten 

Antikörper polyklonal bindet. 

5.2.1. Puffer 

Coating-Puffer: 100mM pH 9,6 

3,03g Na2CO3 

6,00g NaHCO3 

add 1l Milli Q H2O 

Wasch-Puffer: 1 x PBS + 0,05% Tween 20 

Blocking-Puffer: 1 x PBS + 5% BSA (bovine serum albumine) 

Diethanolamine-Puffer 1M pH 9,8 

97ml Diethanolamine 

100mg MgCl2 

add 1l Milli Q H20


1. Antikörper Mouse Anti-Taq-Polymerase Antikörper 

Novagen 71088 

2. Antikörper Anti-Mouse IgG (whole molecule)-Alkaline Phosphatase 

Sigma Aldrich CN: A3562 

Substrat: p-Nitorphenylphosphat 

Bovine Serum Albumin (BSA) Stammlösung: 1mg/ml 

5.2.2. Versuchsbeschreibung: 

1. Der Coatingpuffer in der Platte wird über dem Spülbecken ausgeleert, noch verbleibende 

Tropfen werden durch Aufschlagen der umgedrehten Platte auf einem Papiertuch 

entfernt. Anschließend werden die Wells 3x mit 200µl Waschpuffer gefüllt und 

wieder ausgeleert. 

2. Um noch freie Bindungsstellen abzusättigen werden die Wells mit 200µl PBS/BSA gefüllt 

und die Platte abgedeckt 2h bei RT inkubiert. 

(Diese Schritte werden von dem Assistenten am Vormittag des Versuchtages durchgeführt.) 

3. Nach der Inkubation mit PBS/BSA folgen drei Waschschritte (siehe 1.) (3x 200µl 

Waschpuffer). 

4. Stellen Sie während die Platte gewaschen wird 3,5ml der 1. Antikörperverdünnung 

her. Der Novagen Taq-Polymerase Antikörper wird 1:5000 mit Waschpuffer verdünnt. 

Es werden 200µl der Verdünnung in die Wells gegeben. Es folgt eine 

30min Inkubation der abgedeckten Platte bei 37°C.


5. Anschließend wird die Platte drei Mal gewaschen, (siehe 1) um nicht gebundene 1. 

Antikörper zu entfernen. 

6. Während der drei Waschschritte werden 3,5ml der 2. Antikörperverdünnung hergestellt. 

Der Anti-Mouse IgG (whole molecule) - Alkaline Phosphatase wird 1:5000 mit 

Waschpuffer verdünnt. Es werden 200µl pro Well aufgetragen. Anschließend wird die 

Platte abgedeckt und 30min bei 37°C inkubiert. 

7. Während die Platte gewaschen wird stellen Sie 3,5ml der Substratverdünnung her. Die 

Verdünnung enthält 1mg/ml pNPP (4-Nitrophenyl phosphat di(2-amino-2-ethyl-1,3propandiol) 

in Diethanolamin-Puffer. 

Nach der Inkubation folgen drei Waschritt (siehe 1.), der ungebundene 2. Antikörper 

entfernen soll. 

8. Im letzten Schritt werden 200µl pNPP Verdünnung in jedes Well gegeben. Die Platte 

wird mit Alufolie abgedeckt und 20 min bei RT inkubiert. 

9. Während der Inkubation wird eine BSA Verdünnungsreihe hergestellt. Dabei wird die 

Stammlösung 1mg/ml mit MQ- Wasser verdünnt. Folgende Konzentrationen werden 

hergestellt: 100µg/ml; 200µg/ml; 300µg/ml; 400µg/ml und 500µg/ml. 

10. BCA (Bicinchoninic Acid) Test zur Konzentrationsbestimmung der Taq-Polymerase. 

Auf eine 2. Platte werden für eine Doppelbestimmung je 2 Mal 10µl der Elutionsfraktion 

1,3 und 6 und je 2 Mal 10µl der BSA Verdünnungsreihe aufgetragen. Pro Well 

werden 200µl der BCA A/B Lösung benötigt. BCA Lösung A und B werden im Verhältnis 

50:1 gemischt. Berechnen Sie die benötigte Menge der Lösung. 

11. Nach 30min Inkubation bei 37°C wir die Platte im Tecan Platten Reader bei einer 

Wellenlänge von 562nm ausgelesen.


12. Für das Protokoll der Versuche 5 und 8: 

a. Wie wurde die Taq Polymearse aufgereinigt? 

b. Wie wurde die Hitzestabilität ausgenutzt? 

c. Kurze Beschreibung des Trennprinzips beider Chromatographien. 

d. Welche Art von ELISA wurde durchgeführt? Kurze Beschreibung! 

e. Welche Antikörper wurden verwendet? 

f. Welches Substrat wird von dem Enzym (gekoppelt an Antikörper) umgesetzt? 

g. Wie ensteht der Farbumschlag? Reaktion und Produkt. 

h. In welchen Fraktionen der Elution erwarten Sie das Protein und warum? 

i. Entspricht das Ergebnis des ELISA dem erwarteten Elutionsverhalten? 

j. Erklären Sie das Prinzip des BCA Testes. Reaktion und Produkt. 

k. Geben Sie die Taq Polymerase Konzentration der jeweiligen Fraktionen an. 

l. Eichgerade und Rechenweg der Konzentrationsbestimmung bitte angeben. 

m. Fehlerdiskussion! 

5.3. Fragen zur Selbstkontrolle 

1. Wie ist das Immunsystem eines Menschen aufgebaut? 

2. Wie ist ein Antikörper aufgebaut? 

3. Wie werden monoklonale Antikörper hergestellt? 

4. Wie binden Antikörper ein Antigen? 

5. Wie werden Antigene durch T-Lymphozyten erkannt? 

6. Welche immunologischen Testprinzipien kennen Sie? 

7. Welche ELISA – Techniken kennen Sie? 

8. Wie ensteht der Farbumschlag der positiven Proben? 

9. Erklären Sie das Prinzip des BCA Testes.



Stoff Kennzeichen/ Klassifizierung sowie R- 

Sätze bzw. H-Sätze 

Natriumcarbonat 

Natriumhydrogencarbonat 

Diethanolamin 

Magnesiumchlorid 

Signalwort: “Achtung” 

H319 

Signalwort: “Achtung” 

H319 


H302, H373, H315, H318 

Angabe nach alter EU-Verordnung: Kein 

gefährliches Produkt im Sinne der Richtlinie 

67/548/EWG. 

S-Satz: S 30. 




pro Praktikumstag und 

Gruppe 

Coating-Puffer: 

3,5 ml Puffer pH 9,6, mit 0,3% 

(m/v) Natrium-carbonat und 0,6% 

(m/v) Natriumhydrogencarbonat 

(100 mM Carbonat). 

Es werden pro Gruppe 10-15 ml 

zur Verfügung gestellt. 

Diethanolamin-Puffer: 3,5ml Puffer 

pH 9,8 mit 9,7% (v/v) Diethanolamin 

(=1M) und 0.01% (m/v) 

MgCl2. 

Es werden pro Gruppe 10-15 ml 


4-Nitrophenylphosphat als Angabe nach alter EU-Verordnung: 3,5ml Diethanolamin-Puffer mit 

Salz mit 2 Äquivalenten 2- Keine gefährliche Substanz oder Zube- 0,1% (m/v) DNPP. 

amino-2-ethyl-1,3reitung 

im Sinne der EG-Richtlinien Es werden pro Gruppe 10-15 ml 

propandiol (pNPP) 

67/548/EWG oder 1999/45/EG. 







Sicherheitsmaßnahmen 


� Aufgrund des pH-Wertes der verwendeten Lösungen (alkal. Puffer) wird besonders auf 

die Verwendung der Schutzbrille hingewiesen 

� Bei Kontamination sofort Hände waschen. 

� Keine Handschuhe erforderlich bei ordnungsgemäßem Versuchsablauf (D. h. kontaminationsfreie 

Handhabung der Lösungen mit Eppendorf-Pipetten) 

5.5.Literatur 

� Janeway: Immunobiology 

� Schütt: Grundwissen Immunologie 

� Karlson: Biochemie 

� Pindur: Klinische Chemie 

� Dörner: Klinische Chemie 

� Dingermann: Gentechnik,Biotechnik


6 BC-6: Kompetitive PCR 


Im Jahre 1983 fand der Biochemiker Kary B. Mullis eine Möglichkeit zur Replikation kleiner, 

definierter DNA-Abschnitte in vitro mit Hilfe einer bakteriellen DNA-Polymerase. Ganz 

in Analogie zur Replikation in vivo werden die Einzelstränge zuerst voneinander getrennt und 

anschließend die Synthese des jeweils fehlenden Partnerstranges durch Oligonukleotide 

„geprimed“ (DNA-Polymerasen können nur an vorhandene 3‘-Enden anknüpfen, nicht jedoch 

einen Strang de novo aufbauen) und damit die DNA verdoppelt. Wiederholt man den Vorgang 

n-fach vermehrt sich die DNA exponentiell (2 n ). Theoretisch lässt sich so ausgehend 

von wenig Material eine unbegrenzte Zahl identischer Moleküle erzeugen. Dieses Verfahren 

wurde als Polymerase Chain Reaction (PCR) bekannt. Da die Trennung der Doppelstränge in 

vitro durch Erhitzen auf über 90° C erfolgt, wurde das in der Anfangszeit verwendete Enzym 

aus E. coli bei jedem Zyklus denaturiert und mußte neu zugegeben werden. Den endgültigen 

Durchbruch brachte die Einführung thermostabiler Polymerasen aus thermophilen Bakterien 

(ursprünglich aus Thermus aquaticus, Taq-Polymerase genannt; heute finden Enzyme aus 

verschiedenen Quellen Anwendung), die ihre Aktivität auch über viele Zyklen behalten. Damit 

war die PCR automatisierbar. 

Bei einem typischen PCR-Ansatz hat man zumindest einige Sequenzinformation über das 

interessierende DNA-Fragment. So kann man Oligonukleotide (Länge ca. 20 Basen) herstellen, 

die komplementär zu Sequenzen sind, die den zu amplifizierenden Abschnitt flankieren 

(jeweils „forward“ und „reverse Primer“). Nach der Trennung der beiden Stränge durch Erhitzen 

auf 90 – 95° C wird die Probe dann auf eine niedrigere Temperatur abgekühlt, bei der 

die Primer mit den ihnen komplementären Sequenzen hybridisieren können. Diese Temperatur 

ist, zumindest theoretisch, aus der Primersequenz errechenbar. Die Synthese des neuen 

Stranges erfolgt anschließend beim Temperaturoptimum des Enzyms (70 – 72° C). Da auch 

eine Taq-Polymerase beim Erhitzen Aktivität verliert, sind nicht beliebig viele Zyklen möglich. 

In der Praxis werden in der Regel 20 – 35 Zyklen durchgeführt. Danach häufen sich 

falsch eingebaute Basen und teilamplifizierte Sequenzen zu sehr an. Aber natürlich kann man 

die so erhaltene DNA in einem neuen PCR-Ansatz erneut amplifizieren…


5’ 

3’ 

3’ 

5’ 

Ausgangsmaterial: 

doppelsträngige DNA 

1. Schritt: 

“Schmelzen”, Trennen der Stränge 

durch Erhitzen 

2. Schritt: 

Abkühlen zum Andocken der Primer 

3. Schritt: 

Erhitzen zur Synthese des 

komplementären Stranges 

durch die Polymerase 

(Temperaturoptimum). 

1. Zyklus 

2. Zyklus: 

Schritte 1-3 wiederholen 

Primer 

den Primern komplementäre Sequenzen 

Prinzip der PCR. Nach dem 2. Zyklus werden vornehmlich Stränge gebildet, die am 5‘-Ende einen Primer und 

am 3‘-Ende die dem anderen Primer komplementäre Sequenz tragen. 

Viele spezielle PCR-Verfahren für unterschiedliche Aufgaben wurden inzwischen entwickelt 

(siehe Handout). Eines davon ist die sog. kompetitive PCR. Sie dient üblicherweise dazu, die 

Menge an Transkript (mRNA) eines bestimmten Gens zu bestimmen. Dazu wird die mRNA 

aus den Zellen isoliert und in cDNA (cDNA = copyDNA) umgeschrieben. Die Menge an 

cDNA kann dann quantifiziert werden. Die Amplifikation eines DNA-Fragmentes ist von 

vielen Faktoren abhängig (Qualität des Enzyms, Primersequenz, Hybridisierungstemperatur, 

Genauigkeit der Temperierung in der PCR-Maschine, etc.). Auch Unterschiede in der Effektivität 

der Amplifikation werden sich mit jedem Zyklus verstärken, so dass eine winzige Dif-


ferenz zwischen zwei Ansätzen letztendlich zu sehr verschiedenen Ausbeuten führen kann. 

Und selbst, wenn es gelingt, diese Unterschiede zu minimieren, so ist die Menge an Amplifikat 

doch nur ein relatives Maß für die Transkriptmenge, erlaubt aber noch keine Aussage 

darüber, wie groß die molare Konzentration war. Abhilfe kann nur ein interner Standard 

schaffen. Dieser ist natürlich ein DNA-Abschnitt, der unter den gleichen Bedingungen amplifizierbar 

sein muss, also als Minimalforderung auch die gleichen flankierenden Sequenzen 

besitzt wie das zu quantifizierende Fragment, damit die Primer „passen“. Ansonsten sollten 

die beiden Amplifikate später leicht zu unterscheiden sein. Da die anschließende Analyse des 

Ergebnisses üblicherweise mittels Gelelektrophorese erfolgt, bedeutet das, die amplifizierten 

Fragmente sollten sich hinreichend in ihrer Größe unterscheiden. Werden in einem PCR- 

Ansatz beide DNAs eingesetzt (als template, Matritze), so konkurrieren sie um alle anderen 

Resourcen darin (Primer, Enzym). Deshalb der Name „kompetitive“ PCR. Der interne Standard 

wird auch Kompetitor genannt. Die Signalintensität, also die DNA-Menge nach der 

Amplifikation, ist abhängig von der Ausgangsmenge. Ist mehr Standard- als Proben-DNA im 

Ansatz, wird das Standardfragment stärker amplifiziert, und umgekehrt. Mit der bekannten 

Konzentration des Standards kann aus dem Verhältnis der Amplifikatmengen die Konzentration 

des gesuchten Fragmentes bestimmt werden. 

Lg (rel. Signalstärke) 

0 

Lg (eingesetzte Konz. Kompetitor)


„Relative Signalstärke“ steht dabei für den Term: (SignalstärkeStandard / SignalstärkeProbe) x k. 

Der Korrekturfaktor k muß eingeführt werden, weil die Intensität der Färbung proportional 

der DNA-Menge ist. Das größere Fragment liefert also ein entsprechend stärkeres Signal als 

das kleinere. 

Ist z.B. das zu quantifizierende Fragment (im folgenden „Probe“ genannt) 300 Basenpaare 

(bp) lang und beim Kompetitor wird nur ein 200 bp Fragment amplifiziert, so ist k = 1,5. 

Für y = 0 gilt: 

wegen lg 1 = 0 folgt: 

� Signal 

lg 

� 

� 

� Signal 

Signal 

Signal 

Standard � k � 

Probe 

Standard 

Probe 

� 

� 

� 

� 

�k�1 k � SignalStandard � SignalProbe 

Das heißt, da mathematisch gesehen das Signal eine Funktion der Konzentration ist, die Konzentration 

von Probe und Standard sind am Abszissenschnittpunkt gleich, wenn es für Standard 

und Probe die gleiche Funktion ist. In molekularen Begriffen: Voraussetzung ist, dass 

Probe und Standard gleich effizient amplifiziert werden! Um dieser Voraussetzung möglichst 

nahe zu kommen, sollten sich die Sequenzen möglichst ähnlich sein. 

In unserem Fall soll die Konzentration eines Fragmentes des Primärtranskriptes des humanen 

5-Lipoxygenase-Gens in einer cDNA-Präparation bestimmt werden. Die Sequenz des Fragmentes 

ist bekannt. Seine Größe beträgt 4459 bp. Die Primer sind so gewählt, dass ein Amplifikat 

von 266 bp entsteht. Als Kompetitor wird das gleiche Fragment verwendet, das durch 

Einfügen einer ebenfalls bekannten Sequenz zwischen den Andockstellen der Primer um 100 

bp verlängert wurde. Das Amplifikat, das vom Kompetitor stammt, ist also 366 bp lang. 

0


6.2. Material / Reagenzien 

Enzym 

Taq DNA-Polymerase (NatuTec GmbH, Frankfurt), aus Thermus aquaticus. Stammlösung in 

„Storage buffer“ (50 mM Tris-HCl pH8; 0,1 mM EDTA; 1 mM Dithiothreitol (DTT); 50 % 

Glycerin (v/v); 0,5 % Igepal CA-630) bei –20° C gelagert. 

Konzentration der Stammlösung: 50 U/µl; Definition der Unit: 1 U ist die Menge Polymerase, 

die 10 nmol dNTPs in 30 Minuten bei 72° C unter Standardbedingungen (bestimmter Puffer, 

„aktivierte“ DNA aus Kälberthymus als Substrat) in säureunlösliche Form (= DNA) 

überführt. 

Vor Verwendung in unserem PCR-Ansatz wird das Enzym 1:50 vom Assistenten verdünnt. 

Von der verdünnten Lösunge werden pro Vial 2 µl eingesetzt. 

10x PCR-Reaktionspuffer 

500 mM KCl; 100 mM Tris-HCl, pH 8,3; 20 mM MgCl2; 0,1 % Gelatine 

Primer 

Beide Primer werden vom Assistenten 1:20 mit autoklaviertem Wasser verdünnt zur Verfügung 

gestellt. Von der verdünnten Lösung werden je 2 µl pro Vial eingesetzt. 

Kompetitor 

Diese Sequenz von 4559 bp (4459 bp Lipoxygenase-Fragment, verlängert um 100 bp) wurde 

in das Plasmid pT7T3 18 U inseriert, um es mit Hilfe dieses Vektors in Bakterien vermehren 

zu können. Die Gesamtgröße des Plasmids beträgt: 4559 bp + 2883 bp Vektor = 7442 bp. Das 

mittlere Molekulargewicht eines Basenpaares ist 660 g/mol. 

Sie bekommen eine Verdünnungsreihe des Kompetitors mit 10 pg/µl, 5 pg/µl und 1 pg/µl 

vorgelegt. Berechnen Sie die Anzahl der Moleküle des Kompetitors in jedem Ihrer Ansätze!


TAE (Tris/Acetat/EDTA)-Puffer (10x) pH 8,0 

Tris 48,4 g 

Essigsäure (konz.) 11,4 ml 

0,5 M EDTA (pH 8,0) 20 ml 

=> ad 1 l mit H2O 

Probenpuffer (Gel Loading Buffer) (6x) 

Bromphenolblau 0,25 % 

Glycerin 30 % 


6.3.1. PCR 

Bei einer kompetitiven PCR wird üblicherweise in allen Ansätzen die gleiche Menge der 

Probe eingesetzt (also der Lösung mit dem zu quantifizierenden Fragment) und die Konzentration 

des Kompetitors variiert. Um sicher zu gehen, dass die Konzentration der Probe im 

Bereich der Kompetitor-Verdünnungsreihe liegt, werden wir sie hier einmal unverdünnt und 

einmal 1:5 mit autoklaviertem Wasser verdünnt einsetzen (vom Assistenten vorbereitet). Außerdem 

wird als Kontrolle auf Kontamination ein blank, eine Leerprobe ohne DNA, mitgeführt. 

Um Ihnen zu demonstrieren, dass tatsächlich etwas amplifiziert wird (und nicht etwa 

die später gefundene DNA schon vorher vorhanden war), stellen Sie einen weiteren Ansatz 

her, bei dem Sie kein Enzym zugeben. Um alle Ansätze so vergleichbar wie möglich zu halten 

(und sich außerdem eine Menge Arbeit zu ersparen) wird zunächst ein „Master-Mix“ aus 

den Komponenten hergestellt, die in allen Ansätzen enthalten sind. Alle Lösungen immer im 

Eisbad halten, alles auf Eis pipettieren! Nur autoklavierte Pipettenspitzen verwenden, immer 

Handschuhe tragen, um Kontamination des Materials zu vermeiden!


Pro Ansatz benötigen Sie: 

? µl 10x Puffer (= 10x PCR) 

1 µl dNTP-Mix 

2 µl forward Primer (= FP A5) 

2 µl reverse Primer (= RP A6) 

2 µl Taq-Polymerase 

? µl autoklaviertes Wasser 

Von Probe und Kompetitor werden jeweils 2 µl pro Ansatz zugegeben. Um ein Gesamtvolumen 

von 50 µl pro Ansatz zu erhalten wird mit autoklaviertem Wasser aufgefüllt. 

Pipettierschema A: 

Vial Nr. 1 2 3 4 5 6 7 8 

Probe A unv. unv. unv. 1:5 verd 1:5 verd 1:5 verd – unv. 

Kompetitor 10 pg/µl 5 pg/µl 1 pg/µl 10 pg/µl 5 pg/µl 1 pg/µl – 10 pg/µl 

Pipettierschema B: 

Vial Nr. 1 2 3 4 5 6 7 8 

Probe B unv. unv. unv. 1:3 verd 1:3 verd 1:3 verd – unv. 

Kompetitor 9 pg/µl 3 pg/µl 1 pg/µl 9 pg/µl 3 pg/µl 1 pg/µl – 9 pg/µl 

Achtung: In vial Nr. 8 kommt kein Enzym (Also kein Mastermix, da dieser ja das Enzym 

bereits enthält!) Dieser Ansatz soll Ihnen ja zeigen, dass es ohne Amplifikation keine Banden 

gibt. 

Zunächst wird die jeweilige DNA (Probe und Kompetitor) in die Reaktionsgefäße pipettiert, 

danach der Mastermix (1-7).


Ein PCR-Gerät ist nichts anderes, als ein mikroprozessorgesteuerter Trockenheizblock mit 

zusätzlicher Peltierkühlung. Bei vielen Geräten (so auch bei unserem) ist der Deckel des Probenraumes 

heizbar. Dies verhindert, dass aus dem Reaktionsansatz Wasser verdampft und am 

Deckel des Vials kondensiert. Das Temperaturprogramm für unsere kompetitive PCR ist folgendes: 

1. Zyklus 94° C 5,0 Min. 

60° C 2,5 Min. 

72° C 3,5 Min. 

28 Zyklen 94° C 1,0 Min. 

60° C 2,5 Min. 

72° C 3,5 Min. 

Letzter Zyklus 94° C 1,0 Min. 

60° C 2,5 Min. 

72° C 10 Min. 

Nach dem letzten Schritt werden die Proben auf 4° C gekühlt und bei dieser Temperatur 

gehalten, also gewissermaßen automatisch in den Kühlschrank gestellt. Daher kann dieses 

Programm auch unbeaufsichtigt über Nacht laufen. 

6.3.2. Analyse der PCR-Produkte 

Die Produkte werden elektrophoretisch auf einem Agarose-Gel aufgetrennt. Da recht kleine 

Amplifikate erwartet werden (266 bzw. 366 bp ist klein), wird ein Gel mit 2 % Agarose hergestellt. 

Vorbereiten der Proben 

Aus jedem der PCR-Ansätze werden 10 µl entnommen und 2 µl der blauen 6x Gel-Loading- 

Lösung zugegeben (diese wird also sozusagen mit der Probe auf 1x verdünnt).


Gießen des Gels 

Bereiten Sie einen Gel-Gießblock vor. Stecken Sie den Taschenformer („Kamm“, mit 16 Taschen) 

in die vorgesehene Halterung. 

Das Volumen eines Gels beträgt 80 ml. Wiegen Sie daher 1,6 g Elektrophorese-Agarose ein 

und füllen Sie mit 1x TAE-Puffer auf. Kochen Sie die Agarose im Mikrowellenofen auf (ist 

die bequemste Methode). Lassen Sie zunächst ca. 1 min bei maximaler Leistung kochen. 

Wenn sich beim Schwenken des Kolbens darin noch Agarosepartikel oder Schlieren zeigen, 

noch etwas länger kochen. Wenn die Agarose auf etwa 60° C abgekühlt ist und nicht mehr 

dampft (Thermometer nicht notwendig, einfach fühlen und abschätzen!) werden 0.5 µl Ethidiumbromid-Lösung 

zugegeben (Vorsicht! Ethidiumbromid hat akut toxische und muta- 

gene Eigenschaften. Beachten Sie die Hinweise des Assistenten über den richtigen 

Umgang damit! Tragen Sie unbedingt Nitrilhandschuhe! Lassen Sie keine Ethidiumbromidabfälle 

ins Abwasser oder in den Hausmüll gelangen. Alles in die gekennzeichneten 

Sammelgefäße!). Gießen Sie dann die Gel-Lösung in den vorbereiteten Gießblock 

und lassen Sie diese erstarren (ca. 15 Min.). Fertige Gele können über Nacht im 

Kühlschrank aufbewahrt werden. 

Gellauf 

Am zweiten Praktikumstag werden Kamm und Klebestreifen entfernt und der Block mit dem 

Gel in die Elektrophoresekammer eingesetzt und mit 1x TAE gefüllt, bis das Gel damit bedeckt 

ist. Die gesammte Probe wird jeweils in die Geltaschen pipettiert. Gegenbenfalls wird 

die Probe zuvor mit einer Tischzentrifuge runterzentrifugiert. Die Trennung dauert bei konstant 

150 mA etwa 1 h 30 min. 

Achten Sie darauf, dass die Stecker herausgezogen sind, bevor Sie in die Kammer hineingreifen 

um das Gel herauszunehmen. Die Fluoreszenz der Ethidiumbromid gefärbten Banden 

werden auf dem UV-Transilluminator visualisiert (Vorsicht, UV! Nicht ohne geeignete 

Schutzbrille oder Schutzschirm in die UV-Lampe schauen!) und fotografiert. 

Auswertung 

Für eine genaue Quantifizierung des Lipoxygenase-Fragmentes müssten Sie die Bandenstärken 

fluorimetrisch vermessen. Die dazu notwendige Hard- und Software können wir jedoch 

im Praktikum nicht zur Verfügung stellen. Sie beschränken sich daher darauf, aus Ihren An-


sätzen den herauszusuchen, bei dem die Banden von Probe und Kompetitor ungefähr gleich 

stark sind (ggf. zwischen 2 Ansätzen interpolieren). Dies soll hier als Abschätzung genügen. 

Geben Sie die so ermittelte Anzahl der Moleküle des gesuchten Fragments in 1 µl der unverdünnten 

Probenlösung an! Den Korrekturfaktor k können Sie bei dieser Methode zwar nicht 

sinnvoll anwenden (so genau kann eine subjektive Beurteilung der Bandenstärke nicht sein), 

Sie sollen ihn aber dennoch berechnen. 


1. Welche Komponenten sind für eine PCR mindestens nötig? 

2. Ablauf der PCR. 

3. Unterschiede und Gemeinsamkeiten von PCR und DNA-Replikation in der Zelle. 

4. Was ist die Besonderheit der kompetitiven PCR? 

5. Wieso wird ein interner Standard verwendet? 

6. Wie kann man DNA sichtbar machen? 

7. Verschiedene PCR-Methoden und deren Anwendung (Handout). 

6.5. Kurzzusammenfassung Sicherheitsinformationen Übung 6 

Stoff Kennzeichen/ Klassifizie- Verwendete Menge/ Konzentration 

rung sowie R-Sätze bzw. 

H-Sätze 


Ethidiumbromid 

Signalwort : 

“Gefahr” 

H330, H341 

0,5 µl einer 1% Lösung auf 80 ml 

Gel. Endkonzentration 160 nM im 

Gel 






und 



� unter gekennzeichnetem Abzug arbeiten (Ausnahmen nach Anweisung des Assistenten) 


� Abfall in gekennzeichnete Behälter. 


Rolf Knippers: Molekulare Genetik. Thieme Verlag, Stuttgart.


7 BC-7: Der Ames Test 


7.1.1. Mutationen 

Mutationen können bei der DNA-Replikation, -Reparatur und -Rekombination spontan auftreten. 

Sie können aber auch durch zahlreiche physikalische und chemische Einflüsse, sogenannte 

Mutagene, induziert werden. Man kennt verschiedene Genmutationstypen: 

� die Substitution: Austausch eines o. mehrerer Basenpaare durch ein anderes 

� die Deletion und die Insertion: Entfernung bzw. Addition eines oder mehrerer Basenpaare. 

Diese beiden Mutationstypen können zu einer Verschiebung des Leserasters führen (Frameshiftmutation). 

Ist ein einziges Basenpaar bei einer Mutation betroffen, spricht man von einer Punktmutation. 

Je nach Auswirkung unterscheidet man folgende Typen: 

� Stille Mutationen führen nicht zu einer Veränderung des codierten Proteins. 

� Missense-Mutationen liegen vor, wenn zwar keine Verschiebung des Leserasters vorliegt, 

aber für eine abweichende Aminosäure codiert wird. Dieser Typ entsteht meist durch Substitutionen. 

� Nonsense-Mutation: Hier wird ein Stopcodon eingeführt. Das resultierende Protein wird 

kürzer als das normale Polypeptid und höchstwahrscheinlich nicht funktionell sein.


Die verschiedenen Genmutationstypen sollen durch die folgenden Beispiele verdeutlicht werden: 

Wildtyp Originalsatz 

ATG TCA TGC CCT GTA CTA GGC GCG The nun saw our cat eat the rat. 

Basenpaarsubstitution (missense): 

ATG CCA TGC CCT GTA CTA GGC GCG The sun saw our cat eat the rat. 

Basenpaarsubstitution (nonsense): 

ATG TCA TGA CCT GTA CTA GGC GCG The nun. 

Insertion, frameshift : 

ATG TCA TGG CCC TGT ACT AGG CGC G The nun sag wou rca tea tth era t. 

Diese Beispiele zeigen auch, dass eine Substitution nur durch eine Substitution und eine Frameshiftmutation 

nur durch eine Frameshiftmutation revertiert werden kann. Daher müssen im 

Amestest Stämme mit verschiedenen Mutationstypen verwendet werden. Dies erlaubt auch 

eine Klassifizierung des Wirkungsmechanismus der mutagenen Substanz. 

7.1.2. Amestest 

Um die mutagenen und carcinogenen Risiken von Chemikalien abschätzen zu können, benötigt 

man geeignete Testsysteme. Der schnelle und preiswerte Amestest, in dem Substanzen 

auf ihre Mutagenität in Bakterien überprüft werden, ergänzt epidemologische Untersuchungen 

und Tierversuche. 80-90% untersuchter (bekannter) Mutagene fallen im Test positiv und 

70-90% bekannter Nichtmutagene negativ aus. Viele Carcinogene werden erst durch Metabolisierung 

mit Cytochrom P-450-Oxidasen in eine reaktive Form überführt. Bakterien fehlen 

diese Enzyme, deshalb wird dem Testsystem ein Homogenat aus Säugetierleber (S9-Mix) 

zugefügt. Einige Stoffe (z.B. Dioxin) sind nicht mutagen, fördern jedoch als sogenannte Tumorpromotoren 

die Proliferation bereits vorhandener Krebszellen.


Man verwendet im Amestest einen speziellen Stamm von Salmonella-Bakterien (S. typhimurium). 

Dieser Stamm ist im Gegensatz zum Wildtyp aufgrund eines Gendefekts unfähig zur 

Histidin-Biosynthese/histidindefizient (his - ), er ist auxotroph. Deshalb kann er sich in Histidin-freiem 

Minimalmedium nicht vermehren. Die Bakterien können jedoch spontan revertieren 

und wieder selbst Histidin produzieren. Mutagene Substanzen erhöhen das Auftreten 

einer solchen Reversion. Die Revertanten sind wie der Wildtyp prototroph (his + ). Damit die 

Sensitivität des Tests erhöht wird, tragen die Bakterien weitere Mutationen. Ihr DNA- 

Reparatursystem ist beschädigt (uvrB-Mutation) und das normale Zellmembran- 

Lipopolysaccharid (LPS) wird nicht gebildet (rfa-Mutation). Dadurch wird die Passage vieler 

Stoffe durch die defekte Zellwand erleichtert. Der Bakterienstamm enthält ausserdem ein 

Plasmid zur Ampicillin-Resistenz (pKM101), um eine Selektion ausführen zu können. 

Im Versuch werden zwei Salmonellenstämme verwendet (TA98, TA100). Beide Stämme 

tragen eine his - -Mutation mit Basenpaarsubstitution (TA100) bzw. Frameshiftmutation 

(TA98). Diese Mutationen liegen an verschiedenen Stellen des Operons. Ein Operon ist eine 

als genetische Steuer- und Regeleinheit dienende Gruppe von Genen. Es besteht aus einem 

Promotor, einem Operator und einem oder mehreren Strukturgenen, die meist funktionell 

zusammengehören. Operons gibt es ausschließlich bei Prokaryoten, bei Eukaryoten hat jedes 

Gen einen eigenen Promotor. Der Operator dient zur Transkriptionskontrolle indem seine 

Sequenz es verschiedenartigen Regulatorproteinen ermöglicht an ihn zu binden und so die 

Transkription zu verhindern. Die Regulatorproteine werden ihrerseits durch verschiedenste 

niedermolekulare Induktoren (z.B. Lactose, Aminosäuren, IPTG oder Nucleotide) aktiviert 

bzw. inhibiert. 

7.2. Materialien und Lösungen für den Ames-Test (werden zur Verfügung gestellt) 

Lösungen (bis auf 5x M9-Lösung sterilfiltriert): 

1 M MgSO4-Lösung; 20%ige Glucoselösung; 1 M CaCl2-Lösung; 1x PBS-Puffer; 5x M9- 

Salzlösung (64 g Na2HPO4x7H2O, 15 g KH2PO4, 2,5 g NaCl und 5,0 g NH4Cl in dem. Wasser 

lösen, ad 1L)


LB/Amp-Platten (zur Lebendkeimzahlbestimmung, Vollmedium): 

25 g Life Broth Pulver und 15 g Agar-Agar auf 1L auffüllen und autoklavieren. Nach Abkühlung 

unter 50°C mit Ampicillin (50 mg) supplementieren; Platten giessen (30-50). 

M9-Minimalplatten (zur Testung der Substanzen auf Mutagenität, Minimalmedium): 

200 ml 5xM9-Salzlösung und 15 g Agar-Agar mit dem. Wasser auf 1L auffüllen und autoklavieren. 

Danach 2 ml MgSO4-Lösung (1 M), 20 ml Glucoselösung (20%), 100 µl CaCl2- 

Lösung (1 M) und Ampicillin (50 mg) zugeben; Platten giessen (30-50). 

Top-Agar: 

6 g Agar-Agar und 6 g NaCl auf 1L auffüllen, autoklavieren und mit Ampicillin supplementieren 

(50 mg); steril aliquotieren (50 ml). 

S9-Mix: enthält pro 10 ml 

1000 µl S9 (Leberhomogenat), 16 mg Glucose-6-Phosphat, 35 mg NADP, 18 mg MgCl2, 

27 mg KCl, 28 mg NaH2PO4, 113,6 mg Na2HPO4, mit H2O auf 10 ml auffüllen, sterilfiltrieren. 

0,5 mM Histidin/Biotin-Lösung: 

30,9 mg D-Biotin und 24,0 mg L-Histidin in 250 ml dem. Wasser lösen, sterilfiltrieren. 

Na-Azid-Lösung (1 mg/ml): 

10 mg Natriumazid in 10 ml autoklaviertem dem. Wasser lösen, sterilfiltrieren. 

2-Aminoanthracen (0,1 g/ml) 

1 g in 10 ml DMSO (Dimethylsulfoxid). Eingesetzt werden davon 2 µl ad 100 µl PBS.



Vorsicht! Einige der Substanzen, die in diesem Versuch benutzt werden sind mutagen/ 

potentiell cancerogen. Die Substanzen nur mit Nitrilhandschuhen handhaben. Die Anweisungen 

des Assistenten zur Handhabung dieser Substanzen sind strikt zu befolgen! 

Um Kontaminationen zu vermeiden, sind alle verwendeten Materialien steril. Alle Versuchsschritte 

werden unter möglichst aseptischen Bedingungen durchgeführt. Platten, 

Lösungen und Stämme werden im Praktikum fertig zur Verfügung gestellt. 

7.3.1. Versuchsvorbereitungen 

Die Kulturen der Bakterienstämme TA98 und TA100 werden als sog. Stocks bei –70°C in 

30-50% Glycerol gelagert. Mit wenig abgeschabter, noch gefrorener Kultur werden 5 ml 

LB/Amp-Medium vom Assistenten angeimpft und über Nacht bei 37°C und 250 rpm geschüttelt 

und auf Eis gestellt. 

Lebendkeimzahlbestimmung 

Bei der Herstellung der Verdünnungsreihe muss unbedingt darauf geachtet werden, dass die 

Volumina exakt pipettiert und die Zellsuspensionen sowie ihre Verdünnungen vor dem 

Pipettieren gut gemischt werden. 14 Eppendorftubes (je Stamm 7) werden mit 900 µl PBS- 

Puffer gefüllt und nummeriert. 100 µl Zellsuspension wird in den Tubes wie folgt mit einer 

Verdünnungsreihe verdünnt: 

100 µl Suspension in 1. Tube (entspricht 10 -1 -Verdünnung) 

100 µl aus 1. Tube in 2. Tube 10 -2 




aus- 


plattieren 

100 µl aus 6. Tube in 7. Tube 10 -7 .


Je 50 µl (vorher gut mischen!) aus den Verdünnungsreihen 10 -4 , 10 -5 , 10 -6 und 10 -7 werden 

auf beschrifteten Vollmedium-LB/Amp-Platten (BC/Gruppennummer/Datum/Verdünnung/ 

Stamm) ausplattiert und 1 Tag bei 37°C inkubiert. 

Nach der Inkubation bei 37°C werden die gewachsenen Kolonien ausgezählt und die Lebendkeimzahl 

des jeweiligen Stammes (pro ml (!) unverdünnter (!) Kultur) berechnet. 

7.3.2. Mutagenisierung / Plattentest 

Der Plattentest findet auf den M9-Minimalplatten statt. Vor dem Ausplattieren werden die 

Bakterien mit Puffer, evtl. S9-Mix und den zu testenden Substanzen präinkubiert. Durch diese 

Präinkubation wird die Testsensitivität erhöht, da die effektive Konzentration des S9-Mix 

im Tube höher ist als auf der Platte und kurzlebige mutagene Metabolite eine erhöhte Chance 

haben, mit den Stämmen zu reagieren. 

Pro Gruppe wird eine unbekannte Substanz auf ihre Mutagenität getestet. Als Kontrollen 

werden die bekannten Mutagene Natriumazid und 2-Aminoanthracen eingesetzt. Dafür werden 

sterile Eppendorftubes beschriftet. Folgende Lösungen werden in die Tubes pipettiert: 

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 

PBS-Puffer 600 µl 600 µl 100 µl 100 µl 500µl 500µl 500µl 500µl 

Natriumazid 100µl 100µl 100µl 100µl 

2-Aminoanthracen 100µl 100µl 100µl 100µl 

Substanz 1 

Stamm TA98 100µl 100µl 100µl 100µl 100µl 100µl 

Stamm TA100 100µl 100 µl 100µl 100 µl 100µl 100 µl 

S9-Mix (zuletzt!) 500µl 500µl 500µl 500µl 500µl 500µl


13 14 15 16 

PBS-Puffer 

Natriumazid 

2-Aminoanthracen 

500µl 500µl 

Substanz 1 100µl 100µl 100µl 100µl 

Stamm TA98 100µl 100µl 

Stamm TA100 100µl 100 µl 

S9-Mix (zuletzt!) 500µl 500µl 

Den S9-Mix erst zuletzt zugeben und immer auf Eis halten. 

Die Tubes werden kurz geschüttelt und inkubieren 20 Minuten bei 37°C auf dem Wasserbad. 

Währenddessen wird folgendes vorbereitet: 

� In 16 sterile 15 ml-Probenröhrchen („Falcontubes“) werden an der Flamme 300 µl 

Histidin/Biotin-Lösung pipettiert (Endkonzentration 0,05 mM). Mit einer sterilen 10 

ml-Pipette werden jeweils 3 ml Top-Agar zugegeben. Damit der Agar nicht vorzeitig 

aushärtet, müssen die Tubes bei 60°C im Wasserbad stehen. 

� 16 Minimal-M9-Platten werden beschriftet (BC/Gruppennr./Datum/ Plattennr.). 

Der Inhalt der Eppendorftubes wird (nacheinander) dem Top-Agar in den Falcontubes zugefügt. 

Der Agar wird gevortext, auf die M9-Platten gegossen und durch sanftes Schwenken der 

Platte gleichmässig verteilt. Nach dem Erstarren werden die Platten 2 Tage bei 37°C inkubiert. 

Durch die Histidinspuren im Top-Agar können sich die his - -Zellen teilen. Währenddessen 

erfahren einige die Mutagenese zum his + -Typ. 

7.4. Auswertung/ Protokoll 

- N N + 

N - 

Der zahlenmäßige Anteil von Mutanten in einer Zellpopulation bezeichnet man als Mutantenhäufigkeit. 

Sie wird wie folgt berechnet: 

Na + 

Natriumazid 

Mutanten � Mutanten 

Mutantenhäufigkeit � 

Lebendkeimzahl 

Testplatte Kontrollplatte 

NH 2 

2-Aminoanthracen


Die Wahrscheinlichkeit einer Mutation pro Zelle und pro Generation bezeichnet man als Mutationsrate. 

Die Mutationsrate ist bei hohen Wachstumsraten konstant und wird bei unter optimalen 

Bedingungen wachsenden, also sich exponentiell vermehrenden Zellen bestimmt. Sie 

ist abhängig von der Dosis der mutagenen Substanz. 

Wichtig: Zur Berechung müssen die Werte auf die unverdünnte Lösung (pro ml) zurückgerechnet 

werden! 

Stellen Sie die im Versuch erhaltenen Ergebnisse in Tabellenform dar, erläutern Sie sie. Charakterisieren 

Sie Natriumazid, 2-Aminoanthracen und die Substanz 1 bezüglich ihrer mutagenen 

Eigenschaften. Begründen Sie ihre Zuordnung anhand der aufgetretenen Kolonien und 

der sich daraus errechneten Mutantenhäufigkeit. 


1. Welche Genmutationstypen gibt es? 

2. Wozu wird der Amestest durchgeführt? Was sind seine Vor- und Nachteile? 

3. Welche Eigenschaften besitzen die bei dem Test verwendeten Bakterien und warum? 

4. Weshalb werden zwei Bakterienstämme verwendet? 

5. Wozu erfolgt eine Präinkubation der Bakterien? 

6. Weshalb versetzt man die Bakterien mit S9-Mix? 

7. Wieso enthält der Top-Agar Histidin? 




Natriumazid 

Signalwort : 

„Gefahr“ 

H300, H410, EUH032 



500 µl einer ~15 mM Lösung 

2-Aminoanthracen Wird von unterschiedlichen Firmen 500 µl einer ~0.5 mM Lösung


verschieden eingestuft. 

Fa. Acros: 

H341 


Fa. Sigma-Aldrich 

H315, H319, H335 






und 



� unter Abzug (Ausnahmen nach Anweisung des Assistenten) bzw. in abgegrenztem Bereich 

(gelb-schwarzes Klebeband) arbeiten 


� Abfall in gekennzeichnete Behälter 


1. Ames (1979), Science 204: 597-93 

2. Alberts, Bray, Lewis, Watson: Molecular Biology of the Cell 

3. Campbell: Biology 

4. Devoret (1979), Spektrum der Wissenschaft 10: 34-41 

5. Maron, Ames (1983), Mutation Research 113: 173-215 

6. Mortelmans, Zeiger (2000), Mutation Research 455: 29-60 

7. Stryer: Biochemistry


8 BC-8: Taq-DNA-Polymerase: Isolierung und Aufreinigung 


Taq-DNA-Polymerase 

Die Taq-DNA-Polymerase stammt aus dem Bakterium Thermus aquatis (Taq), das in 70° 

heißen Geysiren lebt. Sie hat ein Molekulargewicht von 94kDa und einen isoelektrischen 

Punkt (pI) von 6,04. Polymerasen katalysieren die Polymerisation von Nukleotiden während 

der DNA Replikation. Die Taq-DNA-Polymerase ist auch bei hohen Temperaturen sehr stabil, 

das macht sie zum optimalen molekularbiologischen Reagenz für die Polymerase Kettenreaktion 

(PCR). Die PCR ist ein Verfahren um DNA zu vervielfältigen (siehe Ü6). 

Das für die Taq-Polymerase kodierende Gen liegt auf einem Plasmid, das durch ein Lactose(Lac)- 

Operon reguliert und in E.coli exprimiert wird. 

Lac Operon 

Das Lactose(Lac)-Operon spielt bei dem Transport und beim Abbau von Lactose in E.coli 

eine wichtige Rolle. Da Lactose eine uneffizientere Energiequelle als z.B. Glucose darstellt, 

wird Lactose erst dann verstoffwechselt, wenn kein anderes Substrat zur Verfügung steht. Um 

diesen effizienten Energiestoffwechsel zu gewährleisten ist das Lac-Operon inaktiviert. Ein 

Repressor lagert sich an den Operator des Operons an und verhindert so die Bindung der 

RNA-Polymerase. Um das Lac-Operon zu aktivieren wird ein Inducer benötigt, der den Lac- 

Repressor bindet. Ein solcher Inducer ist Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG). Durch 

die Bindung des Repressor wird das Lac-Operon aktiviert. Die RNA-Polymerase bindet an 

den Operator, das Gen der Taq-Polymerase wird transkribiert und in Taq-Protein translatiert.


lacZ: kodiert für das Enzym β-Galctosidase, dieses Enzym spaltet Lactose in Galactose und 

Glucose 

lacY: kodiert für das Transportprotein β-Galactosid-Permease, welches die Aufnahme von 

Lactose in die Zelle ermöglicht 

lacA: kodiert für das Enzym β-Galactosid-Transacetylase, dieses Enzym acetyliert nicht abbaubare 

β-Galactoside, man vermutet eine Entgiftungsfunktion der Zelle. 

Ionenaustauschchromatographie 

Das ihr zugrunde liegende Prinzip ist die Wechselwirkung von gelösten positiv oder negativ 

geladenen Teilchen (mobile Phase, Puffer und darin enthaltenes Protein), mit einer komplementär 

geladenen festen Matrix (stationäre Phase). Man unterscheidet Anionenaustauscher, 

die positiv geladen sind und negativ geladene Teilchen (Anionen) binden und Kationenaustauscher, 

die negative geladen sind und positiv geladene Teilchen (Kationen) binden. Die 

Bindung von Proteinen ist abhängig von dem isoelektrischen Punkt der bindenden Moleküle, 

pH und Salzkonzentration der Puffer. Liegt der pH-Wert der Proteinlösung (mobilen Phase)


oberhalb des isoelektrischen Punktes (pI) des Proteins, so ist das Peptid negativ geladen und 

bindet an einen Anionenaustauscher. Ist der pH der mobilen Phase niedriger als der pI des 

Proteins, dann wird das Peptid über einen Kationenaustauscher aufgereinigt. Wir verwenden 

im Versuch DEAE-Sepharose: DiEthylAminoEthyl. DEAE enthält positiv geladene Gruppen 

und eignet sich somit als stationäre Phase für einen Anionenaustausch. 

Die Hitzestabilität der Taq-DNA- Polymerase wird für ihre Aufreinigung ausgenutzt. Das 

Zellhomogenat wird auf 75°C erhitzt. Durch diesen Schritt denaturieren und aggregieren die 

meisten Proteine aus E.Coli und können durch einen Zentrifugationsschritt von der in Lösung 

verbleibenden Taq-DNA-Polymerase abgetrennt werden. 

Ionenaustauschchromatographie unterteilt sich in 3 Phasen: 

- Probenauftrag 

- Waschen der Säule; dadurch werden schwach gebundene Proteine von der Säule gewaschen 

- Eluieren der gebundenen Moleküle z.B. durch einen Ionenstärkegradienten (z.B. mit 

KCl) oder mittels einem pH-Gradienten. 

Gelchromatographie 

Die Auftrennung bei der Gelchromatographie beruht auf der Masse der einzelnen Moleküle. 

Die stationäre Phase der Gelchromatographie besteht aus porösen Polymeren, wie z.B. 

Sephadex. Sephadex ist ein vernetztes Dextrangel, der Name steht für Separation Pharmacia 

Dextran. Durch den Vernetzungsgrad des Geles wird die Porenweite und somit die Ausschlussgrenze 

bestimmt. 

Wird eine Probe auf das Gel gegeben, so diffundieren die Moleküle in das gequollene Netzwerk, 

je kleiner das Molekül, desto tiefer kann es in das Gel eindringen. Große Moleküle, 

deren Größe das Porendurchmessser überschreiten, können nicht in das Gel diffundieren, sie 

werden zuerst von der Säule eluiert. Tiefer eingedrungene kleine Moleküle, werden länger im 

Gel zurückgehalten und eluieren dementsprechend später.


8.2. Verwendete Lösungen: 

Puffer 1: Resuspensionspuffer 

50 mM Hepes-KOH, pH 7,9 

50 mM Glucose 

1 mM EDTA 

Es werden pro Bakterienpellet 6,4 ml Resuspensionspuffer verwendet, dazu werden frisch 9,6 

mg Lysozym gegeben. Diesen Schritt übernimmt der Assistent am Vormittag des Versuchtages) 

Puffer 2: Bindungspuffer 


1 mM EDTA 

0,5 % (v/v) Tween-20 

0,5 % (v/v) IGEPAL CA630 

50 mM KCl 

Zu Puffer 2 werden Proteaseinhibitoren frisch zugegeben: 

� AEBSF (Serinproteasen Inhibitor):Stocklösung c=100 mM, 10µl/ml einsetzen 

� Leupeptin (LP) (Trypsin ähnliche Proteasen, Cysteinylprotease-Inhibitor): 

Stocklösung c=10mg/ml , 1µl/ml einsetzen 

� STI (Trypsininhibitor aus Sojabohnen): Stock c= 60mg/ml, 1µl/ml einsetzen 

Alle Proteaseinhibitoren werden auf Eis gehalten. Nach Zugabe zu den Puffern 

wird dieser ebenfalls auf Eis getan. 

Die Handhabung auf Eis ist wichtig, da Proteaseinhibitoren in wässrigen Lösungen 

schnell inaktiviert werden. 

Puffer 3: Elutionspuffer (Ionenaustauscher Chromatographie)) 


1 mM EDTA 

0,5 % (v/v) Tween-20 

0,5 % (v/v) IGEPAL CA630 

200 mM KCl


PBS/EDTA (Gelfiltration) 

100ml 10x PBS 

1mM EDTA 

add MilliQ H2O to 1l 

8.3. Versuchsdurchführung 

Es wird eine 20ml E.coli Übernachtkultur angesetzt, es wird ein LB-Nähr-Medium, das mit 

Ampicillin versetzt is, verwendet. Das Lac-Operon liegt auf einem Plasmid, das auch eine 

Ampicillin-Resistenz trägt, so dass nur die Bakterien wachsen, die das Plasmid mit dem Lac- 

Operon aufgenommen haben und somit resistent gegen Ampicillin sind. Mit 5ml der Übernachtkultur 

wird eine 500ml Hauptkultur angeimpft. Nach ca. 3h (0,8 OD650) wird sie mit 

125mg/l IPTG (Isopropyl-�-D-thiogalactopyranosid) induziert und über Nacht bei 37°C in- 

kubiert. 

Anschließend werden die Zellen bei 24°C, 15 min bei 5500U durch Zentrifugation geerntet. 

Das Zellpellet wird in 6,4 ml Resuspensionspuffer resuspendiert. Durch Lysozymzugabe werden 

die Zellen lysiert, es folgt eine 15 min Inkubation auf Eis. 

Da in diesem Praktikum nicht mit gentechnischen veränderten Organismen gearbeitet wird, 

werden die kursiv gedruckten Schritte von der Assistentin durchgeführt. 

Ionenaustauschsäule (DEAE-Sepharose) 

� 1600µl Bindungspuffer werden in einem 15ml Falcon mit Proteaseinhibitoren (16µl 

AEBSF, 1,6µl LP, 1,6µl STI) versetzt. 

� Anschließend werden 1600µl der lysierten Bakterien hinzugegeben und gemischt: Das 

Gemisch wird bei 75°C 1h im Wasserbad inkubiert. 

� Danach wird die Lösung in zwei 2ml Eppendorf Cap aufgeteilt und zentrifugiert. 

(Tischzentrifuge 15min, max Geschwindigkeit). 

� Gleichzeitig wird die Säule equilibriert.


Equilibrierung 

� Die Ionenaustauschersäule wird unten und oben geöffnet, so dass die Aufbewahrungsflüssigkeit 

auslaufen kann. Auf der oberen Fritte darf keine Flüssigkeit mehr stehen, 

jedoch darf das Säulenbett nicht vollständig austrocknen. 

� 5ml Bindungspuffer auf die Säule geben, und vollständig durchlaufen lassen. Anschließend 

wird die Säule unten geschlossen. 

Probenauftrag 

� Nach der Zentrifugation Eppis vorsichtig aus der Zentrifuge holen, da sich kein festes 

Pellet bildet. 

� Der komplette Überstand wird vorsichtig abgenommen und in ein neues 15ml Falcon 

überführt. Anschließend wird die gleich Menge Bindungspuffer dazugegeben. 

� Das komplette Gemisch wird auf die Säule geben. 

Waschen und Elution 

� Es folgen Waschschritte: 3 x 1ml Bindungspuffer auf die Säule geben und durchlaufen 

lassen. 

� Nun erfolgt die Elution mit 6 x 600µl Elutionspuffer. 

� Die 600µl-Fraktionen werden in Eppendorf Cap (E1 bis E6) gesammelt. 

Regeneration 

� Regeneration der Säule mit 5ml 2M NaCl Lösung, gefolgt von 5ml 1M NaCl und 5ml 

0,5M NaCl Lösung. 

� Anschließend werden 5ml 70%iger Ethanol auf die Säule gegeben, anschließend wird 

die Säule mit 70%igem Ethanol befüllt und verschlossen. 

Vorbereitung Versuch BC 5 ELISA 

� Für den nächsten Praktikumstag wird nun die ELISA Platte vorbereitet. 

� Für eine Doppelbestimmung werden in zwei Spalten die jeweiligen Proben aufgetragen. 

� In Zeile A werden nur 2 x 200µl Coating Puffer gegeben, die Negativkontrolle.


� In Reihe B werden 2 x 10µl Taq- Verdünnung und 190µl Coating Puffer gegeben, die 

Positivkontrolle. 

� In Reihe C –H werden 2 x 20µl der Elutionsfraktionen 1-6 gegeben, anschließend 

werden 180µl Coating Puffer hinzugegeben. 

200µl 

A Coating 

Puffer 

B 10µl Taq 

190µl 

C 20µl 

180µl 

D 20µl 

180µl 

E 20µl 

180µl 

F 20µl 

180µl 

G 20µl 

H 

� Die Platte wird abgedeckt bei 4°C über Nacht inkubiert 

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 

180µl 

20µl 

180µl 

200µl 

Coating 

Puffer 

10µl Taq 

190µl 

20µl 

180µl 

20µl 

180µl 

20µl 

180µl 

20µl 

180µl 

20µl 

180µl 

20µl 

180µl 

Gelfiltrations Säule (PD10) 

� 1600µl Bindungspuffer werden in einem 15ml Falcon mit Proteaseinhibitoren (16µl 

AEBSF, 1,6µl LP, 1,6µl STI) versetzt. 

� Anschließend werden 1600µl der lysierten Bakterien hinzugegeben und gemischt: Das 

Gemisch wird bei 75°C 1h im Wasserbad inkubiert. 

� Danach wird die Lösung in zwei 2ml Eppendorf Cap aufgeteilt und zentrifugiert. 

(Tischzentrifuge 15min, max Geschwindigkeit). 

� Gleichzeitig wird die Säule equilibriert.


Equilibrierung 

� Die PD 10 Säule wird unten und oben geöffnet, so dass die Aufbewahrungsflüssigkeit 

auslaufen kann. Auf der oberen Fritte darf keine Flüssigkeit mehr stehen, jedoch darf 

das Säulenbett nicht vollständig austrocknen. 

� Anschließend wird die Säule mit 5ml PBS/EDTA gespült und wieder verschlossen. 

� Nach der Zentrifugation die Eppis vorsichtig aus der Zentrifuge holen, da sich kein 

festes Pellet bildet. 

Probenauftrag 

� Der komplette Überstand wird vorsichtig abgenommen und in ein neues 15ml Falcon 

überführt. Anschließend wird der Überstand mit PBS/EDTA auf 2,5ml aufgefüllt. 

� Die 2,5ml Überstand werden komplett auf die Säule geben. 

Elution 

� Die Elution erfolgt in 6 x 600µl Fraktionen mit PBS/EDTA. 

� Die 600µl-Fraktionen werden in Eppendorf Cap (E1 bis E6) gesammelt. 

Regeneration 

� Regeneration der Säule mit 15ml MilliQ. 

� Anschließend wird die Säule mit MilliQ gefüllt und geschlossen. 

Vorbereitung Versuch Nr. 5 ELISA 

� Für den nächsten Praktikumstag wird nun die ELISA Platte vorbereitet. 

� Für eine Doppelbestimmung werden in zwei Spalten die jeweiligen Proben aufgetragen. 

� In Reihe A werden nur 2 x 200µl Coating Puffer gegeben, die Negativkontrolle. 

� In Reihe B werden 2 x 10µl Taq- Verdünnung und 190µl Coating Puffer gegeben, die 

Positivkontrolle. 

� In Reihe C - H werden 2 x 10µl der Elutionsfraktionen 1-6 gegeben, anschließend 

werden 190µl Coating Puffer hinzugegeben. 

� Die Platte wird abgedeckt bei 4°C über Nacht inkubiert.


200µl 

A Coating 

Puffer 

B 10µl Taq 

190µl 

C 10µl 

190µl 

D 10µl 

190µl 

E 10µl 

190µl 

F 10µl 

190µl 

G 10µl 

H 

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 

190µl 

10µl 

190µl 

200µl 

Coating 

Puffer 

10µl Taq 

190µl 

10µl 

190µl 

10µl 

190µl 

10µl 

190µl 

10µl 

190µl 

10µl 

190µl 

10µl 

190µl 


1. Welche Proteinaufreinigungsmethoden kennen Sie? 

2. Wie entsteht ein Protein? (vom Gen zum Protein) 

3. Warum wird die Lösung auf 75 °C erhitzt? 

4. Was ist der isoelektrische Punkt? 

5. Welche funktionellen Gruppen der Aminosäuren tragen zur Nettoladung eines 

Proteins bei? 

6. Warum bindet die Taq-DNA-Polymerase an einem Anionenaustauscher? 

7. Was passiert bei der Elution der Taq-DNA-Polymerase? 

8. Was passiert bei der Gelchromatographie? 

9. Welche Unterschiede bestehen zwischen Gel- und Ionenaustauscherchromatographie?




sowie R-Sätze bzw. H- 

Sätze 

IGEPAL CA-630 

AEBSF 


H318 


H314 

Achtung - noch nicht vollständig 

geprüfter Stoff 


pro Praktikumstag 

und Gruppe 

15 ml Bindungspuffer, darin 

0,5% (v/v) IGEPAL CA-630 

enthalten 

Maximal verwendete Menge/ 

Konzentration: 16 ml einer 

100 mM AEBSF-Stocklösung 

Durch weitere in der Übung vorkommende und nicht in dieser Tabelle genannte Stoffe sind bei 

Handhabung der Reagenzien nach üblichem Laborstandard keine besonderen Gefahren zu erwarten. 


� Üblicher Laborstandard (Laborkittel, Schutzbrille…, s. Allgemeine Betriebsanweisung) 


� Aufgrund der Gefahreneigenschaften der o. g. Gefahrstoffe wird besonders auf die Verwendung 

der Schutzbrille hingewiesen 

� Einmalhandschuhe tragen beim Umgang mit Bakterienlysat. 

� Ansonsten keine Handschuhe erforderlich bei ordnungsgemäßem Versuchsablauf (D. h. 

kontaminationsfreie Handhabung der Lösungen mit Eppendorf-Pipetten) 


� Lodish H. und andere, Molekulare Zellbiologie , Spektrum 

� Lottspeich F. , Bioanalytik , Spektrum 

� Stryer, Biochemisty, Spektrum


Teil 3 

Metabolisierung 

von 

Arzneistoffen

Metabolismus von Arzneistoffen 104 

9 BC-9: Bestimmung des Proteingehaltes und der Enzymaktivität der Cy- 

tochrome b5 und P- 450 


Mit der Nahrung werden ständig lipidlösliche Xenobiotika aufgenommen. Vom Organismus 

können diese Fremdsubstanzen besonders gut resorbiert und verteilt werden. Ohne eine Biotransformation 

sind sie jedoch nicht ausscheidbar, da in der Niere oder im Darm eine Rückresorption 

und schliesslich vor allem im Fettgewebe eine Ablagerung erfolgen würde; ihre 

Biotransformation ist somit lebensnotwendig. Einzige Ausnahme sind flüchtige Stoffe, die 

über die Lunge abgeatmet werden können. Die zuvor lipidlöslichen Stoffe werden in eine 

wasserlösliche und somit ausscheidbare Form überführt. Phase I der Biotransformation dient 

der Oxidation, Reduktion und Hydrolyse, Phase II der Konjugation mit körpereigenen Stoffen. 

Besonders bedeutend für die oxidative Biotransformation von Arzneimitteln ist die Monooxygenase 

Cytochrom P-450. Während dessen Funktion weitgehend aufgeklärt ist, wird für die 

Funktion von Cytochrom b5 lediglich vermutet, dass es am Elektronentransport für die Reduktion 

des zweiten Sauerstoffatoms beteiligt ist. Mit Monooxygenasen wird ein Sauerstoffatom 

aus einem Sauerstoffmolekül in den Fremdstoff eingebaut, das andere Atom wird zu 

Wasser reduziert. An dieser Reaktion, welche sich vereinfacht wie folgt darstellen lässt, ist 

NADPH beteiligt: 

R-H + NADPH + H + + O2 R-OH + NADP + + H2O 

Meist führt die Biotransformation zu einer Inaktivierung. Der entstehende Metabolit kann 

aber auch toxischer als die Ausgangssubstanz werden und zu einer Giftung führen. Gut lipidlösliche 

Xenobiotika verweilen lange in der Leber und können dort als Induktor innerhalb 

weniger Tage zu einer vermehrten Enzymproduktion, vor allem des P-450, führen. Dadurch 

werden sämtliche zu metabolisierenden Substanzen rascher abgebaut, ihre biologische Halbwertszeit 

ist verringert. Daher sollte bei gleichzeitiger Einnahme eines Arzneimittels, das über 

das gleiche Enzymsystem metabolisiert wird, während der Induktoreinnahme eine Dosiserhö-


hung erfolgen. Dazu muss der Plasmaspiegel des Patienten kontrolliert werden. Wird der Induktor 

abgesetzt, so wird die Biotransformationsrate innerhalb von Tagen oder Wochen wieder 

auf das ursprüngliche Niveau gesenkt. In dieser Phase kann es zu einer Arzneimittel- 

Überdosierung kommen, wenn eine erneute Dosisanpassung des Arzneimittels nicht durchgeführt 

wurde. 

Die Biotransformationsrate ist alters- und individuenabhängig. Neugeborene sind noch nicht 

mit allen Enzymen ausgestattet. Kinder zwischen 1-8 Jahren haben im Vergleich zu Erwachsenen 

eine höhere Biotransformationsrate. Bei älteren Menschen sind die Reaktionen der Phase 

I verlangsamt. Weiterhin existieren in der Bevölkerung Polymorphismen; jedes Individuum 

kann Enzymsysteme mit einer anderen Effizienz besitzen. Somit müsste eine optimale medikamentöse 

Dosierung für jede Person individuell eingestellt werden. 

Das wichtigste Organ für die Biotransformation und somit auch für einen Arzneimittelabbau 

ist die Leber, sie enthält die meisten metabolisch wirksamen Enzyme. Viele dieser weitgehend 

substratunspezifischen Enzyme sind im Bereich des ER (endoplasmatisches Reticulum) 

lokalisiert. Um sie in vitro untersuchen zu können, wird ein metabolisierendes Organ (z.B. 

Leber, Niere, Milz, Haut, Lunge, Blut, Muskulatur) zerkleinert und einer Präparation unterzogen. 

Dabei wird das ER zerstört, seine Membranen, in denen die Enzyme noch stets funktionsfähig 

sitzen, lagern sich zu Mikrosomen (Micellen) neu zusammen. 


9.2.1. Präparation der Lebermikrosomen 

Ausgangspunkt für die Gewinnung von Lebermikrosomen ist eine frische Schweine- oder 

Rinderleber vom Schlachthof. Aufgrund der Proteolyse muss die Präparation ohne Zeitverzögerung 

und bei 4°C erfolgen. Die Mikrosomen werden im Praktikum fertig zur Verfügung 

gestellt; sie wurde wie folgt präpariert: 

Homogenisierung 

Die Leber wurde auf Eis oder im Kühlraum mit einem Skalpell in ca. 2-3 cm große Stücke 

geschnitten, gewogen und im 2-fachen Volumen 250 mM Tris-KCl-Puffer pH 7,4 aufge-


nommen. Die Homogenisierung wurde zuerst mit dem Ultraturax und anschließend mit dem 

Potter-Elvehjem (Teflon/Glas) durchgeführt. 

Fraktionierung 

Das Homogenat wurde in der Sorvall RC5B-Kühlzentrifuge mit dem Rotor SS34 20 min bei 

4°C und 12.000 rpm zentrifugiert (Sedimentation der Zellkerne, Zellmembranen, Mitochondrien, 

Lysosomen und der intakten Zellen). Der Überstand wurde anschließend in der Ultrazentrifuge 

bei 40.000 rpm nochmals zentrifugiert (Sedimentation der Mikrosomen und der 

Glykogene). Der Überstand ist klar und rötlich und besteht hauptsächlich aus Cytoplasma und 

dem Hämoglobin zerstörter Erythrozyten. Das Glykogen bildet unter den Mikrosomen eine 

klare durchscheinende Gelschicht. Der Überstand wurde vorsichtig abgegossen, die Mikrosomen 

mit einer Pipette vorsichtig abgehoben und in eiskaltem Tris/KCl-Puffer resuspendiert 

(2 ml Suspension pro g Lebereinwaage). 

9.2.2. Nachweis der mikrosomalen Cytochrome 

Die Messung der mikrosomalen Cytochrome erfolgt photometrisch bei 390 – 500 nm am 

Spektralphotometer. 

1) Aufnahme der Basislinie 

In einer Küvette werden 2 ml Tris/KCl-Puffer (0,25 M, pH 7,4) vorgelegt, 500 µl Mikrosomenfraktion 

zupipettiert, gemischt und die Basislinie aufgenommen. 

2) Nachweis von Cytochrom b5 

In die Küvette werden 2-3 Spatelspitzen Natriumdithionit zugegeben und gemischt. Hierbei 

wird Cytochrom b5 reduziert. Nach der Aufnahme des Spektrums zeigt sich das für Cyt b5 

spezifische Absorptionsmaximum bei 424 nm. 

3) Nachweis von Cyt P-450 

In die gleiche Küvette werden 2-3 Spatelspitzen Natriumdithionit gegeben und gemischt; 

eine neue Basislinie wird aufgenommen. Danach wird die Küvette etwa 20 sec mit Kohlenmonoxid 

begast. Hierbei lagert sich das CO anstelle von O2 an CYP-450 an. Es wird wieder 

ein Spektrum aufgenommenund das Absorptionsmaximum notiert.


9.2.3. Bestimmung des Proteingehaltes in der Mikrosomenfraktion 

Die Proteinbestimmung erfolgt modifiziert nach Lowry. In alkalischer Kupfersulfatlösung 

bildet sich ein Kupferaminosäurekomplex. Durch Zugabe von Folin-Ciocalteus-Reagenz entsteht 

in einer Redoxreaktion Molybdän- bzw. Wolframblau, deren Absorption bei 730 nm 

gemessen wird. Zur quantitativen Proteinbestimmung wird die Farbreaktion zusätzlich am 

Referenzprotein Rinderserumalbumin durchgeführt. 

Lösungen / Materialien 

� 60°C - Wasserbad 

� 10 mM Tris/KCl-Puffer: 250 mM Tris/KCl-Puffer (pH 7,4) wird 1:25 verdünnt 

(d.h. auf 2,4 ml dem. Wasser werden 100 µl Puffer gegeben) 

� Lösung A (0,5 N NaOH + 10% Na2CO3; 0,1% Natriumtartrat) 

� Lösung B (0,5 % Kupfersulfat-Lösung) 

� Lösung C (500 µl Lösung B in 5 ml Lösung A aufnehmen) 

� Lösung D ( Folin-Reagenz ) 

� Standardlösungen Rinderserumalbumin (100 �g /ml, 200 �g /ml, 300 �g /ml und 400 �g /ml in 

250 mM Tris/KCl-Puffer, pH 7,4) 

Die Lebermikrosomenfraktion wird mit demin. Wasser 1:25 verdünnt. Dazu werden auf Eis 6 

ml Wasser vorgelegt und 250 µl der vorsichtig gemischten (schwenken, sanftes auf- und abpipettieren) 

Mikrosomenfraktion zupipettiert. 250 µl und 500 µl dieser Suspension werden 

auf Eis in 1,5 ml-Tubes mit 10 mM Tris/KCl-Puffer, pH 7,4 auf 1000 µl aufgefüllt. Dies ergibt 

Verdünnungen von 1:25, 1:50 und 1: 100. 

Farbreaktion: 

Die Farbreaktion soll doppelt (a, b) angesetzt werden! 

� In (2x!) 8 beschrifteten 1,5 ml-Tubes werden je 200 µl Lösung C vorgelegt. 

� Danach gibt man je 200 µl der Proben (4 Standards, 3 Verdünnungen der Mikrosomenfraktionen 

und Wasser als Nullwert) dazu und inkubiert 10 min bei RT. 

� Nun werden möglichst zügig je 600 µl Lösung D zugegeben. Die Gefässe werden gut 

verschlossen und gemischt. 

� Danach werden sie im Wasserbad in einem Schwimmkissen 10 min bei 60°C inkubiert.


� Anschliessend werden sie gegebenenfalls kurz herunter zentrifugiert. Die Absorptionen 

der Proben werden bei 730 nm gemessen. 

Die Auswertung der gemessenen Absorptionen erfolgt per Excel. 

Die ermitteleten Absorptionen für die Standards und Verdünnungen der beiden Messreihen 

werden tabellarisch aufgeschrieben und der Mittelwert der Absorptionen ausgerechnet. Die 

Absorption (y) wird gegen die Konzentration (x) aufgetragen. Über diese Eichgerade wird 

dann die Geradengleichung ermittelt. Die Proteinkonzentration für die Verdünnungen werden 

erechnet (Rechenweg angeben!) und daraus der Proteingehalt (mg/g Lebereinwaage) ermittelt. 

(Immer auf die Einheiten achten!). 


1. Weshalb ist es falsch, die Biotransformation nur als "Entgiftung" zu bezeichnen? 

2. Nennen Sie weitere wichtige Enzyme der Leber-Biotransformation! 

3. Unterscheiden Sie die Begriffe Bioaktivierung und Biotransformation von Arzneistoffen! 

Erklären Sie den Begriff „Prodrugs“ und nennen Sie einige Beispiele. 

9.4. Kurzzusammenfassung der Sicherheitsinformationen zur Übung 9 

Stoff Kennzeichen/ Klassifizierung sowie R- 

Sätze bzw. H-Sätze 

Natriumdithionit 

Kohlenmonoxid 


H521, H302, EUH031 


H331, H220, H360D, H372, H280 

Verwendete Menge/ Konzentration pro 

Praktikumstag und Gruppe 

~20 mg Reinsubstanz 

Max. ~5l


Natriumhydroxid 

Als „Lösung A“: 

5 ml einer 0,5 N wässrigen NaOH-Lösung 

(pH > 13!) 


[Weitere Bestandteile: 10% (m/m) Natrium- 

H314, H290 

carbonat und 0,1% (m/m) Natriumtartrat] 

Durch weitere in der Übung vorkommende und nicht in dieser Tabelle genannte Stoffe sind bei Handhabung der 

Reagenzien nach üblichem Laborstandard keine besonderen Gefahren zu erwarten. 



� mit Kohlenmonoxid stets unter dem Abzug arbeiten! 

� Aufgrund des pH-Wertes der verwendeten Lösung A wird besonders auf die Verwendung 

der Schutzbrille hingewiesen 


� Ansonsten keine Handschuhe erforderlich bei ordnungsgemäßem Versuchsablauf (D. h. 

kontaminationsfreie Handhabung der Lösungen mit Pipetten) 


1. Auterhoff, Knabe und Höltje: Lehrbuch der Pharmazeutischen Chemie 

2. Mutschler: Arzneimittelwirkungen 

3. Pfeifer, Pflegel, Borchert: Grundlagen der Biopharmazie


10 BC-10: Biotransformation von Acetylsalicylsäure 

10.1. Einführung: 

Biotransformation von exogenen und endogenen Substanzen findet in allen lebenden Zellen 

statt. Der Hauptort für metabolische Prozesse ist beim Menschen die Leber. Der Vorgang der 

Metabolisierug lässt sich beim Menschen in zwei Phasen einteilen: 

Phase I-Reaktionen: Hydrolysen, Hydroxylierungen, Reduktionen usw. 

Phase II-Reaktionen: Konjugation mit Glucuronsäure, Glycin, Gluthation, aktivem Sulfat 

usw. 

Acetylsalicylsäure (ASS) wird im Organismus durch enzymatische Hydrolyse zum größten 

Teil schnell zu Salicylsäure abgebaut. Im weiteren Verlauf der Biotransformation wird diese 

durch Konjugation mit Glycin in Salicylursäure (Hauptmetabolit) überführt, die ihrerseits 

noch zu 10% glucuronidiert werden kann. Neben diesem Hauptabbauweg wird Salicylsäure 

auch direkt glucuronidiert, wobei sich sowohl das Etherglucuronid als auch das Esterglucuronid 

bilden. Neben diesen Abbauwegen kommt der Ringhydroxylierung, die zu Gentisinsäure 

und zu 2,3-Dihydroxybenzoesäure führt, geringe Bedeutung zu. 

Acetylsalicylsäure gehört zu den nicht steroidalen Antiphlogistika (NSAID). Der Wirkmechanismus 

ist die Hemmung der Cyclooxygenase (COX). Im Gegesatz zu anderen Vertretern 

dieser Gruppe hemmt ASS COX irreversibel, was auf der Acetylierung des Serins-530 zurückzuführen 

ist. COX kann dann nur durch Neusynthese des Enzyms gewonnen werden. Die 

Cyclooxygenase ist im Thrombozyten für die Synthese von Thromboxan A2 und in Endothelzellen 

für die Synthese von Prostacyclin I2 (PGI2) verantwortlich. Bei der Anwendung der 

Acetylsalicylsäure als Thrombocyten-Aggregationshemmer (Colfarit�) nutzt man aus, daß 

die Neusynthese des Enzyms in Thrombozyten nicht möglich ist, wohingegen sich die COX- 

Aktivität in den Endothelzellen schneller regeneriert. Das Gleichgewicht von PGI2 und 

Thromboxan A2 ist verschoben, die PGI2 Wirkungen überwiegen.


O 

O Glucuronsaeure 

OH 

Salicylsäure - Esterglucuronid 

20 % 

O 

enzymat. 

OH 

Hydrolyse 

O 

O 

Acetylsalicylsäure 

10 % 

OH 

O 

OH 

OH 

2,3-Dihydroxybenzoesäure 

< 1 % 

HO 

O 

OH 

Salicylsäure 

10 - 80 % 

O 

OH 

Gentisinsäure 

1 % 

O 

OH 

O Glucuronsaeure 

Salicylsäure - Etherglucuronid 

OH 

OH 

Glycin 

ATP, CoA 

O 

N 

H 

OH 

Salicylursäure 

70 % 

Abbildung 1 Übersicht Metabolisierung der Acetylsalicylsäure 

Die Konjugation mit Glycin erfolgt in 2 Stufen: 

1. Salicylsäure wird unter ATP-Verbrauch enzymatisch an Coenzym-A gebunden. Es entsteht 

aktivierte Salicylsäure. 

2. Die aktivierte Salicylsäure reagiert mit Glycin zum Säureamid. 

COOH 

1. Stufe: Ar-COOH + CoA-SH + ATP � ArCO-S-CoA + AMP + PPi + H20 

2. Stufe: ArCo-S-CoA + H2N-CH2-COOH � ArCO-NH-CH2-COOH + CoA-SH 

10.2. Versuchsdurchführung: 

Am Tag vor dem Versuch wird eine Urinprobe als Leerwert gesammelt (~60ml). Danach erfolgt 

die Einnahme von 1 bis 2 Tabletten zu je 0,5 g Acetylsalicylsäure. Nach 5 Stunden 

(möglichst wenig trinken!) wird der nächste Harn gesammelt. Der Leerurin und der Probenurin 

(mit ASS) werden vor der Aufarbeitung auf das gleiche Volumen gebracht. 

Von den Harnproben werden je ~2ml für die direkte Untersuchung (Metabolitennachweis 

mittels DC) entnommen und filtriert. Die Hauptmenge wird angesäuert und danach halbiert; 

die erste Hälfte wird direkt nach dem Ansäuern, die zweite Hälfte nach 1-stündigem Erhitzen


mit Säure (Hydrolyse des Säureamids) mit Chloroform ausgeschüttelt. Die organischen Phasen 

werden jeweils dünnschichtchromatographisch untersucht. 

Als Referenzen werden folgende weitere Lösungen aufgetragen: 

1. Salicylsäure 

2. Acetylsalicylsäure 

3. Gentisinsäure 

4. Salicylursäure 

Fließmittel (200ml): Toluol/Diethylether/Essigsäure/Methanol: 60 + 30+ 9 + 1 

Detektion: UV-Licht 254 nm 

FeCl3-Reagenz (2 %ige wässrige Lösung) 

10.2.1. Ansäuern des Urins 

Der unfiltrierte Harn wird mit ½ Volumen an 6N H2SO4 versetzt und danach in zwei Hälften 

geteilt. 

10.2.2. Aufarbeitung der ersten Urinhälfte 

Die angesäuerte erste Urinhälfte wird zweimal mit je 50ml Chloroform ausgeschüttelt. Die 

vereinigten organischen Phasen werden über Na2SO4 getrocknet, filtriert, auf ~2 ml eingeengt 

und auf die DC-Platte aufgetragen.


10.2.3. Aufarbeitung der zweiten Urinhälfte 

Der angesäuerte zweite Urinhälfte wird 1h unter Rückfluß gekocht (Siedesteine!). Nach dem 

Abkühlen auf Eis wird zweimal mit 50 ml Chloroform ausgeschüttelt. 

Die vereinigten organischen Phasen werden über Na2SO4 getrocknet, filtriert, auf ~2 ml eingeengt 

und wie für die erste Hälfte beschrieben, untersucht. 

10.3. Auswertung / Protokoll 

Die DC-Folie zeichnen Sie bitte in Ihr Laborjournal und erläutern Sie was sie sehen. Bitte 

nehmen Sie eine grobe Abschätzung der Metabolitenverteilung vor. Diskutieren Sie die Unterschiede 

der nicht hydrolysierten Proben zu den hydrolysierten. Erläutern sie die Laufhöhen 

der Metabolite auf der DC. 


1. Was geschieht in Phase I der Metabolisierung einer Substanz? 

2. Was ist der Unterschied zwischen Phase I und Phase II Reaktionen? 

3. Was geschieht bei der Hydrolyse der Proben? 


Stoff Kennzeichen/ Klassifizierung sowie R-Sätze bzw. H- 

Sätze 

Schwefelsäure 

Chloroform 

Toluol 


H314, H290 


H351, H302, H373, H315 

Verwendete Menge/ 

Konzentration pro 

Praktikumstag und 

Gruppe 

50 ml 6N H2SO4 

500ml reines Chloroform 

In Form eines Fließmittels 

für die Dünnschicht-


Diethylether 

Essigsäure 

Methanol 


H225, H304, H361, H373, H315, H336 


H224, H302, H336, EUH019, EUH066 


H226, H314 


H225, H331, H311, H301, H370 

chromatographie: 120 

ml Toluol + 60 ml 

Diethylether + 18 ml 

Essigsäure + 2 ml Methanol 

FeCl3 

100 ml Lösung in 

7705-08-0 

Sprühflasche zur Detektion 

nach der Dünn- 


schicht 

H302, H315, H318, H411 

chromatographie: 2% 

(m/m) FeCl3 in Wasser. 





� unter gekennzeichnetem Abzug arbeiten (Ausnahmen nach Anweisung des Assistenten) 


Hände waschen, 

� gekennzeichnete Apparaturen benutzen. 

� Bei Verschütten von Urin Desinfektion aller betroffenen Flächen mit 70% EtOH 

� Nach Abschluss der Arbeiten Desinfektion aller Flächen und Geräte, an denen mit Urin 

gearbeitet wurde, mit 70% EtOH 

� Arbeiten am Rotationsverdampfer: Abzugsschieber geschlossen halten, Schutzbrille! 

� Bei der Betrachtung der DC-Platte unter UV-Licht Handschuhe/ Schutzbrille tragen



1. D. Steinhilber, Cyclooxygenasen- Angriffsorte nichtsteroidaler Antirheumatika 

Pharmazie in unserer Zeit, Nr.2, 31, 140-144

Teil 4: KLINISCHE CHEMIE

Klinische Chemie 117 

Unfallverhütungsvorschriften 

Die gesetzlichen Unfallverhütungsvorschriften zur Betriebssicherheit in klinisch-chemischen 

Laboratorien gelten für jedes Labor. 

* Das Probenmaterial (Standard- und Kontrollserum; Blut, Serum, Plasma bzw. Urin) sind 

prinzipiell als infektiös anzusehen. Arbeiten Sie deshalb hygienisch sorgfältig, vorsichtig 

und sauber. 

Während des Praktikums muß Schutzkleidung getragen werden. 

Vermeiden Sie die Kontamination Ihrer Kleidung mit dem Probenmaterial. 

* Waschen Sie die Hände nach jeder möglichen Kontamination und am Ende des 

Praktikums. 

* In den Praktikumsräumen ist das Essen, Trinken und Rauchen nicht gestattet! 

* Versehentlich verschüttetes Probenmaterial muß sorgfältig entfernt und kontaminierte 

Geräte sorgfältig mit Desinfektionsmittel gesäubert werden. 

* Zum Pipettieren nur Pipettierhilfen verwenden. 

* Gebrauchte Pipetten, Pipettenspitzen, Küvetten, Reagenzgläser u.a. in die dafür 

vorgesehenen Behälter legen. 

Ordnung und Sauberkeit schützen Sie und andere! 

Einteilung: 

KC-1: Immunhämatologie 

KC-2: Hämatologie 

KC-3: Kohlenhydratstoffwechsel, Lipidstoffwechsel 

KC-4: Nierenfunktionsdiagnostik, Enzymdiagnostik


11 KC-1: Immunhämatologie 

11.1. Einleitung: 

Die Blutgruppen der Erythrozytenmembran sind Antigene, die mit spezifischen Antikörpern im 

Hämagglutinationstest nachgewiesen werden. Die Hämagglutination ist eine für das Auge 

sichtbare Verklumpung von Erythrozyten. Da die Erythrozyten an ihrer Oberfläche einen 

Überschuß an negativer Ladung tragen, stoßen sie sich untereinander ab. Damit es zur 

Ausbildung der Hämagglutinationsreaktion kommt, ist eine Reaktion des spezifischen 

Antikörpers mit mindestens zwei Erythrozyten nötig. Fast ausschließlich IgM-Antikörper sind, 

bedingt durch ihren Moleküldurchmesser, in der Lage die Distanz zwischen zwei Erythrozyten 

zu überbrücken und durch die sog. Antigen-Antikörper-Reaktion eine sichtbare 

Hämagglutination zu bewirken (In vitro ist dies z. T. auch durch IgG-Antikörper möglich, die im 

Salzmilieu der Probenlösung durch Proteine überbrückt werden. So können Störreaktionen 

entstehen) 

Im Praktikumsteil "Immunhämatologie" ermitteln Sie 

� Die eigene Blutgruppe nebst Rhesus-Faktor 

� Die Blutgruppe und den Rhesus-Faktor aus 24 bereitgestellten Blutproben. Hierzu wird jede 

Praktikumsgruppe in vier Untergruppen unterteilt, die jeweils 6 Blutproben untersucht. 

Ihre Ergebnisse sagen Sie dem Assistenten schriftlich an. 

� Aus einer dieser Blutproben (wird Ihnen vom Assistenten bekanntgegeben) ermitteln Sie die 

vollständige Rhesusformel. 

Nachdem die Blutgruppen (incl. Rhesus-Faktor) aller Blutproben bekannt sind, ermitteln Sie 

� aus den bereitgestellten Seren (4 Stück) die Blutgruppe. Jede Untergruppe bestimmt ein Serum. 

In der Abschlussbesprechung werden die Fragen zur Selbstkontrolle besprochen, auf die Sie sich 

vorbereiten sollen.


11.2. Ermittlung der eigenen Blutgruppe mit Rh-Faktor: 

1. Dokutest-Karte (siehe Abbildung 2) beschriften (Name, Vorname, Geburtsdatum). 

2. Auf die Felder Anti-A, Anti-B, Anti-A,B und Anti-D jeweils einen Tropfen 

Blut aus der Fingerbeere geben. 

3. Jeweils einen Tropfen Antiserum auf das entsprechende Feld tropfen. 

4. Blut und Antiserum gut vermischen und auf Agglutination prüfen. 

5. Ergebnis notieren. 

Abbildung 2 Im Praktikum verwendete Blutgruppendokumentationskarten 

Anmerkung: 

In jedem Feld befinden sich zwei blaue Punkte. Sie dienen als Orientierungshilfe für das 

Auftragen von Blut und Antiserum. Das Berühren des Blutstropfens mit der Antiserumpipette ist 

zu vermeiden (Verschleppung von Blut liefert falsche Ergebnisse). Zur Vermeidung von 

Verschleppungen muß vor jedem Mischen von Blut und Antiserum die Pipettenspitze mit einem 

sauberen Tupfer abgewischt werden.


11.2.1. Bestimmung der Blutgruppe mit Rh-Faktor aus den bereitgestellten 

Blutproben: 

Die technische Ausführung erfolgt wie bereits unter Punkt 2 beschrieben, jedoch tragen Sie 

anstelle des Blutstropfens aus dem Finger 10 µl Patientenblut auf. 

Ergebnis der Blutgruppenbestimmung: 

Anzahl 

1 

2 

3 

4 

5 

6 

7 

8 

9 

10 

11 

12 

13 

14 

15 

16 

17 

18 

19 

20 

21 

22 

23 

24 

Nummer der Blutprobe Blutgruppe Rh-Faktor


11.3. Ermittlung der Blutgruppe aus den bereitgestellten Serumproben: 

Mit Hilfe der bereits ermittelten Blutgruppen der 24 Blutproben können Sie die Blutgruppe der 

Serumspender ermitteln. 

Dazu 20 µl Serum und 10 µl Erythrozytensuspension mischen und auf Agglutination prüfen. 

Ergebnis Ihrer Blutgruppenbestimmung aus dem Serum: 

Bezeichnung des Serums Blutgruppe 

Fragen zur Selbstkontrolle: 

1. Welche Bedingungen müssen vorliegen, damit ein Morbus hämolyticus neonatorum (Mhn) 

entsteht? 

2. Erläutern Sie den Unterschied zwischen ABO-Isoagglutininen und Rhesusantikörpern. 

3. Erläutern Sie, warum ABO-Inkompatibilitäten in der Geburtshilfe eine geringere Rolle 

spielen als Rhesusinkompatibilitäten? 

4. Wie kann es trotz unauffälliger blutgruppenserologischer Befunde zu einer 

Transfusionsreaktion kommen? 

5. Erläutern Sie die Bedeutung des Kategoriebluts D VI für Klinik und Diagnostik. 

6. Erläutern Sie die Bedeutung des „ c “ für die Blutkonservenauswahl. 

7. Was wird mit dem direkten Coombstest nachgewiesen? Nennen Sie auch 

Anwendungsbeispiele?


11.4. Kurzzusammenfassung Sicherheitsinformationen 

Gefahrstoffe: 

Stoff Kennzeichen/ Klassifizierung sowie Verwendete Menge/ Konzentration 



Ethanol 


H225 

~200 ml einer 70% (v/v) Lösung in 

Wasser für Desinfektionsmaßnahmen 



Weiterhin findet im Versuch Umgang mit potentiell infektiösem Material statt! 



� Weitere Sicherheitsmaßnahmen, insbesondere im Hinblick auf eine Infektionsgefahr durch 

Blut der Praktikumsteilnehmer und Patientenmaterial, werden vor Ort erläutert!


12 KC-2: Hämatologie 


In den ersten Schwangerschaftswochen findet die Blutbildung (Hämatopoese) hauptsächlich im 

Dottersack statt. Von der 6. Woche bis ca. 7. Fetalmonat übernehmen überwiegend Leber und 

Milz die Hämatopoese. Anschließend wird das Knochenmark das wichtigste Blutbildungsorgan. 

Humane Erythrozyten erreichen im Mittel ein Alter von 120 Tagen. Das Hämoglobin der 

Erythrozyten wird über Biliverdin, welches bereits den Protein- und Eisenanteil verloren hat, 

zum Bilirubin abgebaut. Da Bilirubin praktisch wasserunlöslich ist, kommt es entweder an 

Albumin gebunden oder in Lösung gehalten als Glukuronsäure-Konjugat vor. 

Das sog. "Kleine Blutbild" beinhaltet neben der Bestimmung der Anzahl von Erythrozyten, 

Leukozyten und Thrombozyten ebenfalls die Ermittlung des Hämatokrits (HK) und des mittleren 

Volumens des Einzelerythrozyten (MCV). Unter dem Hämatokrit wird der Volumenanteil der 

Erythrozyten am Vollblut verstanden. Zwischen Erythrozytenzahl, MCV und HK gilt folgende 

Beziehung: 

HK (%) = MCV (fl) x Erythrozytenzahl (/nl) / 10 

Bezieht man die Hämoglobinkonzentration und die Erythrozytenzahl einer Vollblutprobe 

aufeinander, so läßt sich der mittlere Hämoglobingehalt des Einzelerythrozyten (MCH) 

bestimmen. 

MCH (pg) = Hb (g/dl) x 10 / Erythrozytenzahl (/nl) 

Hb, MCV und MCH benötigen Sie im Praktikum zur Einteilung der Anämie. 

Laut den nachfolgenden WHO-Grenzwerten für den Hämoglobingehalt einer Blutprobe liegt 

für 

Männer mit einem Hb-Gehalt unter 13 g/dl und 

Frauen mit einem Hb-Gehalt unter 12 g/dl 

eine Anämie vor.


Zum sog. "Großen Blutbild" gehört neben dem kleinen Blutbild noch das Differentialblutbild. 

Unter dem Differentialblutbild wird die relative Verteilung der unterschiedlichen 

Leukozytenarten im Vollblut verstanden. Die diagnostische Bedeutung des Differentialblutbildes 

liegt vor allem in der Aussage über das Alter der neutrophilen Granulozyten und über 

ihr Zahlenverhältnis zu den Lymphozyten. Nimmt der Anteil an jugendlichen neutrophilen 

Granulozyten (sog. Stabkernigen) zu, so spricht man von einer "Linksverschiebung". Eine 

Linksverschiebung kommt bei den meisten bakteriellen Infektionskrankheiten, bei 

Intoxikationen und nach Blutverlusten vor. Einen Anstieg des Lymphozytenanteils beobachtet 

man hingegen bei Virusinfektionen (Grippe, Masern, Röteln, Mumps, Windpocken, Hepatitis). 

Im Praktikumsteil Hämatologie erstellen Sie einen Blutausstrich von sich selbst, führen eine 

panoptische Färbung nach Pappenheim durch und differenzieren anschließend die Leukozyten. 

12.2. Erstellung eines Blutausstrichs: 

Objektträger mit einem Bleistift namentlich kennzeichnen. Das Blut wird punktförmig (siehe 

Abbildung 3) aufgetragen. Mit einem zweiten schräggestellten Objektträger wird das Blut so 

ausgezogen, daß der Ausstrich am Ende des Objektträgers in Form einer dünnen Fahne ausläuft. 

Je flacher der Anstellwinkel und je langsamer man ausstreicht, desto dünner wird der 

Blutausstrich. Es darf nur einmal über den Objektträger ausgestrichen werden. 

Das frische Präparat wird an der Luft getrocknet und anschließend nach Pappenheim gefärbt.


12.3. Panoptische Färbung nach Pappenheim: 

Färbeküvette 1: Eosin-Methylenblau-Lösung nach May-Grünwald. 

Färbeküvette 2: Eosin-Methylenblau-Lösung nach May-Grünwald (1 Teil) und Puffer 

nach Weise (7 Teile). 

Färbeküvette 3: Azur-Eosin-Methylenblau-Lösung nach Giemsa (1 Teil) und Puffer 

nach Weise (37 Teile). 

Entfärbeküvette 4: Puffer nach Weise. 

Färbedauer der luftgetrockneten Blutausstriche: 

Küvette 1: 3 Minuten. 

Küvette 2: 1 Minute. 

Küvette 3: 15 Minuten. 

Küvette 4: Objektträger 5 mal eintauchen. 

Anschließend die gefärbten Objektträger an der Luft trocknen lassen.


12.4. Charakteristika der normalen Zellen des peripheren Blutes: 

Erythrozyten 7 µm 

Neutrophile 

Granulozyten 

ca. 14 µm 

Metamyelozyt 

Stabkerniger 

neutrophiler 

Granulozyt 

Eosinophile 

Granulozyten 

ca. 16 µm 

Basophile 

Granulozyten 

14 µm 

Monozyten 

15-20 µm 

Lymphozyten 

9-12 

(-20) µm 

Plasmazellen 

(fakultativ) 

Thrombozyten 

1-4 µm 

Rot, zentrale Delle 

rosa 

� 16-18 µm 

Kern: mehr als ein Drittel eingebuchtet, grobe Struktur 

Kernkörperchen: nicht erkennbar 

Zytoplasma: wie bei Myelozyt 

� �14 µm 

Kern: deutliche Einkerbungen, keine fadenförmigen 

Verbindungen der Kernabschnitte 

Kernkörperchen: infolge kräftiger Anfärbung des 

Chromatins nicht erkennbar 

Zytoplasma: Farbe und Granula wie bei Metamyelozyt 

Rötlich meistens 2 Segmente - - 

Bläulich rund, stabkernig oder chromatinarm - 

segmentiert 

Graublau, (taubenblau) meist eingebuchtet locker streifig selten 

trüb, mit Vakuolen oder (2-3 Lappen, sich 

phagozytiertem Material. überlagernd) 

Eventuell Pseudopodien 

breiter Plasmasaum 

Hellblau (klar) evtl. wolkig rund, evtl. leicht chromatinreich, 

oder schaumig. Lädierbar, eingebuchtet grobe Felderung, 

Ausziehungnen (Artefakte). in Peripherie bes. 

Plasmasaum sehr schmal dunkel 

bis sehr breit 

Tiefblau, schaumig mit exzentrisch, rund, grob, schollig, 

Vakuolen, sehr breiter kleiner perinukleärer dunkel 

Plasmasaum Hof 

bläulich 

30 ° 

a) stabkernig verklumpt nur Chromatin- neutrophil, sehr 

b) segmentiert schollen fein 

(Fadenverbindung) 

3-4 Segmente 

45 ° 

Ausstrichtechnik 

Rotbraun, grob, gleich 

groß, lichtbrechend 

(decken Kern nicht) 

Abbildung 3 Charakteristika der normalen Zellen des peripheren Blutes und die 

Ausstrichtechnik auf dem Objektträger 

grob, blauviolett (basophil), 

ungleich groß, über Kern, 

auswaschbar. Vakuolen = 

Heparin? 

Sehr feine, unregelmäßig 

verteilte Azurgranula (evtl. 

nur spärlich) 

evtl. wenig Azurgranula 

mit Hof, ungleichmäßig 

verteilt. 

rot


12.5. Differenzierung von 100 Leukozyten des eigenen Blutausstrichs: 

Der gefärbte Blutausstrich wird unter dem Mikroskop betrachtet. An einer dünnen Stelle werden 

mäanderformig 100 Leukocyten ausgezählt. 

Zellart 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 � 

Metamyelozyten 

Stabkernige 

Segmentkernige 

Basophile 

Eosinophile 

Lymphozyten 

Monozyten 

unbest. Zellen 

Beurteilung 

Abbildung 4 Mäanderformiges Auszählen der Leukocyten auf dem Objektträger


Fragen zur Selbstkontrolle: 

1. Was versteht man unter dem Begriff Anämie? Welche Formen der Anämie kennen Sie? 

Nennen Sie die Erkrankungsursache die der entsprechenden Anämie zugrunde liegt. 

2. Was versteht man unter den Begriffen Leukozytose, Leukämie, Leukopenie, Thrombozytose 

und Thrombozytopenie? 

3. Welche Veränderungen der Erythrozyten finden Sie im Blutausstrich bei einer 

ausgeprägten Perniziosa und wie heißen diese Erythrozyten? 

4. Was können Sie zu folgenden "Kleinen Blutbildern" sagen? 

Leukozyten 9.31 /nl ( 4.0 - 9.4 ) 

Erythrozyten 4.26 /pl ( 4.6 - 6.2 ) 

Hämoglobin 9.5 g/dl ( 14.0 - 18.0 ) 

Hämatokrit 28.9 % ( 40.0 - 54.0 ) 

MCV 67.9 fl ( 80.0 - 94.0 ) 

MCH 22.3 pg ( 27.0 - 32.0 ) 

Thrombozyten 427 /nl (140.0 - 440.0) 

7.3.2 Leukozyten 7.8 /nl ( 4.0 - 9.4 ) 



Hämatokrit 31.2 % ( 40.0 - 54.0 ) 

MCV 122.5 fl ( 80.0 - 94.0 ) 

MCH 42.6 pg ( 27.0 - 32.0 ) 


7.3.3 Leukozyten 16.23 /nl ( 4.0 - 9.4 ) 



Hämatokrit 28.7 % ( 40.0 - 54.0 ) 

MCV 84.2 fl ( 80.0 - 94.0 ) 

MCH 26.3 pg ( 27.0 - 32.0 ) 


5. Wie kann der Hämatokritwert ermittelt werden?


6. Beurteilen Sie das folgende „Große Blutbild“. Wie lautet Ihre Interpretation? Wie heißt 

die Blutbildveränderung und welche Ursachen/Erkrankungen führten möglicherweise zu 

dieser Blutbildveränderung? 

Leukozyten 34.5 /nl 

Referenzbereich 

( 4.0 - 9.4) 

Erythrozyten 3.73 /pl ( 4.6 - 6.2) 

Hämoglobin 11,5 g/dl ( 14.0 - 18.0) 

Hämatokrit 34,0 % ( 40.0 - 54.0) 

MCV 90,0 fl ( 80.0 - 94.0) 

MCH 31,0 pg ( 27.0 - 32.0) 


stabkernige neutrophile Granulozyten: 2 % (3-5) 

segmentkernige neutro. Granulozyten 18 % (50-70) 

eosinophile Granulozyten 0 % (2-4) 

basophile Granulozyten 0 % (0-1) 

Monozyten 2 % (2-8) 

Lymphozyten 78 % (25-40) 

7. Erklären Sie die Begriffe Links- und Rechtsverschiebung. 


Gefahrstoffe: 



Ethanol 


H225 



200 ml einer 70% (v/v) Lösung in 

Wasser für Desinfektionsmaßnahmen


Giemsa-Lösung Angabe nach alter EU-Verordnung: 

F, T 

R: 11-23/24/25-39/23/24/25 



May-Grünwald-lösung Angabe nach alter EU-Verordnung: 

F, T 

R: 11-23/24/25-39/23/24/25 


Verordnung verfügbar 

20 ml 

900 ml 






� Umgang mit den giftigen Stoffen: Einmalhandschuhe tragen und bei Kontamination sofort 

wechseln 


Blut der Praktikumsteilnehmer, werden vor Ort erläutert!


13 KC-3: Kohlenhydrat- und Lipidstoffwechsel 


Nach den Empfehlungen der Expertenkommission der WHO sind Nüchternblutzuckerwerte bis 

110 mg/dl noch als normal zu betrachten. Wiederholt im oberen Normbereich oder knapp 

darüber liegende Blutzuckerwerte deuten auf einen latenten Diabetes mellitus hin. 

Im Praktikumsteil Kohlenhydratstoffwechsel ermitteln Sie trockenchemisch bzw. reagenzienträgergebunden 

die Glucosekonzentration aus dem bereitgestellten Kontrollmaterial und 

beurteilen die Richtigkeit der Methode. Anschließend bestimmen Sie die eigene Glucosekonzentration 

aus einer kapillären Blutprobe. Die mehrfache Messung der Glucosekonzentration 

aus einer bereitgestellten Serumprobe und eines Probanden dient dem Vergleich der 

Präzision der Methode. 

Für die normale Verdauung und Resorption der Nahrungsfette ist die Anwesenheit von Galle 

und Pankreassekret (Pankreaslipase) Voraussetzung. Die Pankreaslipase spaltet von den Triglyceriden 

unter Bildung von Di- und Monoglyceriden bzw. Glycerin die freien Fettsäuren ab. Aus 

freien Fettsäuren, Monoglyceriden, konjugierten Gallensalzen, Cholesterin und Lecithin entstehen 

Molekülaggregate, die sog. Mizellen. Die Mizellenbildung ermöglicht einen intensiven Kontakt 

mit der Bürstensaummembran der Dünndarmwand, eine Voraussetzung für die normale 

Fettresorption. Die Fettsäuren und Monoglyceride werden von der Mukosa des oberen Dünndarms 

(Jejunum) resorbiert, während die Gallensalze erst im unteren Dünndarm (Ileum) aufgenommen 

werden (enterohepatischer Kreislauf). In der Mukosa erfolgt der Aufbau der 

Chylomikronen aus Triglyceriden, Cholesterin, Phospholipiden und Lipoproteinen. Über die 

Lymphbahnen gelangen anschließend die Chylomikronen ins Blut. Im Blut werden von Lipoproteinlipasen 

freie Fettsäuren abgespalten und die Chylomikronen werden zu Remnants. Über 

Apoprotein B erfolgt das Andocken der Remnants an Leberzellrezeptoren. Nach der Aufnahme 

findet ein Umbau in VLDLs statt. VLDLs werden ins Blut freigesetzt. Lipoproteinlipasen 

wirken dort weiter, sodass zunächst IDL und dann LDL entsteht. Der Cholesteringehalt 

nimmt dabei immer weiter zu und der Triglyceridgehalt ab. LDL dockt an LDL-Rezeptoren 

von allgem. Körperzellen an und wird durch Endozytose aufgenommen.


Zur Diagnostik der Hyperlipidämien stellen die Triglyceride und das Cholesterin die wichtigsten 

Parameter dar. Das Risiko an einer atheromatösen Gefäßwandveränderung zu leiden wird beim 

Vorliegen einer leichten Hypercholesterinämie dann als gering eingestuft, wenn der Anteil des 

HDL-Cholesterins bei Männern größer 55 mg/dl und bei Frauen größer 65 mg/dl liegt. 

Im Praktikumsteil Lipidstoffwechsel ermitteln Sie trockenchemisch bzw. reagenzienträgergebunden 

die Gesamtcholesterin- und Triglyceridkonzentration aus dem bereitgestellten 

Kontrollmaterial zur Beurteilung der Richtigkeit der Methode. Anschließend bestimmen Sie ihre 

eigene Cholesterin- und Triglyceridkonzentration aus einer kapillären Blutprobe. Aus der 

bereitgestellten Serumprobe bestimmen Sie naßchemisch die HDL- und LDL-Cholesterinkonzentration 

und trockenchemisch die Cholesterin- und Triglyceridkonzentration. 

Anschließend vergleichen Sie die naßchemisch bestimmte LDL-Cholesterinkonzentration mit 

der rechnerisch (Friedewald-Formel) ermittelten LDL-Cholesterinkonzentration. 


� Welche Lipoproteinfraktionen kennen Sie? Wie unterscheiden sich diese hinsichtlich 

Funktion, Aufbau und Zusammensetzung? 

� Was sind die häufigsten Störungen im Lipidstoffwechsel? Wie können diese hinsichtlich 

ihrer Entstehung unterteilt werden? Welche therapeutischen Maßnahmen kann 

man ergreifen und welche sind wann sinnvoll? 

� Welche Funktionen hat Cholesterin im Körper? 

� Normwerte im Lipidstoffwechsel 

� Was versteht man unter Diabetes mellitus und welche unterschiedlichen Typen kennen 

Sie? Welche therapeutischen Optionen stehen jeweils zur Verfügung? 

� Welche Aussage liefert der HbA1c-Wert? 

� Was sind die Folgen von Hyper- und Hypoglykämien? 

� Normwerte im Kohlenhydratstoffwechsel


13.3. Richtigkeit der Glucosebestimmung: 

Alle Glucosebestimmungen werden am Reflotron (Boehringer Mannheim) durchgeführt. Nach 

dem Einschalten des Gerätes zeigt das Reflotron nach der Aufwärmzeit und dem Segmenttest die 

Messbereitschaft in der Anzeige des Gerätes an. Achten Sie bitte darauf, dass die richtige Einheit 

und Meßtemperatur am Gerät eingestellt sind. Vor der ersten Messung bitte den Reflexionstest 

durchführen. Ist der Test in Ordnung kann mit der Messung der Glucose aus dem 

Kontrollmaterial begonnen werden. Aluminiumschutzfolie vom Teststreifen entfernen, mit 

Reflotronpipette (gelbe Pipettenspitze vorher aufsetzen) Kontrollmaterial (Precinorm U � ) 

blasenfrei zentral auf die rot markierte Auftragszone pipettieren. Meßkammer öffnen und den 

Teststreifen innerhalb von 15 Sekunden nach dem Pipettieren waagrecht in die Lade einlegen. 

Die Anzeige "SCHIEBER ZU" bestätigt, daß der Teststreifen richtig arretiert wurde. Schieber 

der Meßkammer schließen, Meßergebnis notieren und mit dem angegebenen Kontrollbereich 

vergleichen. 

Glucosekonzentration aus Kontrollmaterial:........................... mg/dl 

Sollwert für Glucosekonzentration: ............................ mg/dl 

Sollbereich für Glucosekonzentration: ............................. mg/dl 

13.4. Reagenzträgergebundene Bestimmung der eigenen Blutglucose: 

Die Gewinnung des Blutstropfen kann mittels heparinisierter Glaskapillare und Probenapplikator 

oder Reflotronpipette mit gelber Pipettenspitze erfolgen. Weiterer Arbeitsablauf wie unter 

Punkt 1 beschrieben. 

Eigene Blutglucosekonzentration: .......................... mg/dl 

Referenzbereich für die kapilläre Glucosekonzentration (nüchtern): 70 - 120 mg/dl.


13.5. Mehrfachbestimmung der Glucosekonzentration aus einer Serumprobe 

und Beurteilung der Präzision der Methode: 

1. Messung: .......... mg/dl Mittelwert (M): .......... .............. 

2. Messung: .......... mg/dl Standardabweichung (S): .............. 

3. Messung: .......... mg/dl Variationskoeffizient (VK): ........... 

4. Messung: .......... mg/dl (VK = S / M x 100) 

5. Messung: .......... mg/dl 

13.6. Mehrfachbestimmung der Glucosekonzentration bei einem Probanden zur 

Beurteilung der Präzision der Methode: 

1. Messung: .......... mg/dl Mittelwert (M): .......... .............. 

2. Messung: .......... mg/dl Standardabweichung (S): .............. 

3. Messung: .......... mg/dl Variationskoeffizient (VK): ........... 

4. Messung: .......... mg/dl 

5. Messung: .......... mg/dl


13.7. Bestimmung der Cholesterin- und Triglyceridkonzentration aus dem Kon- 

trollmaterial (Precinorm U � ) zur Beurteilung der Richtigkeit der Methode: 

Alle Bestimmungen werden am Reflotrongerät durchgeführt. 

Cholesterinkonzentration aus Kontrollmaterial: .............................mg/dl 

Sollwert für Cholesterinkonzentration: ............................ mg/dl 

Sollbereich für Cholesterinkonzentration: ............................ mg/dl 

Triglyceridkonzentration aus Kontrollmaterial: ......................... mg/dl 

Sollwert für Triglyceridkonzentration: .............................. mg/dl 

Sollbereich für Triglyceridkonzentration: .............................. mg/dl 

13.8. Reagenzträgergebundene Bestimmung der eigenen Cholesterin- und 

Triglyceridkonzentration: 

Die Durchführung erfolgt am Reflotrongerät. 

Cholesterinkonzentration :................. mg/dl Triglyceridkonzentration:............... mg/dl 

Referenzbereich für: 

Cholesterin: bis 220 mg/dl Triglyceride: bis 150 mg/dl


13.9. Bestimmung des HDL-, LDL-Cholesterins, des Cholesterins und der Triglyceride 

aus einer Serumprobe: 

Die Bestimmung des Gesamtcholesterins und der Triglyceride erfolgt am Reflotrongerät. 

Die HDL-Cholesterinbestimmung erfolgt mittels CHOD-PAP-Methode und die Bestimmung des 

LDL-Cholesterins mit der PVS-Methode naßchemisch. Die Arbeitsvorschriften liegen am 

Arbeitsplatz aus. Kontrollen müssen mitgeführt werden. 

Ergebnis aus Serumprobe: 

Cholesterin: ................ mg/dl Triglyceride: ................ mg/dl 

HDL-C: .................. mg/dl LDL-C: ................... mg/dl 

Sollwert für: 

Cholesterin:............. mg/dl Triglyceride:............. mg/dl 

HDL-C: .................. mg/dl LDL-C: ................... mg/dl 

13.10. Rechnerische Ermittlung des LDL-Cholesterins mit der Friedewald-Formel 

und Vergleich mit dem unter Punkt 9 naßchemisch gemessenen Wert für LDL- 

Cholesterin: 

Friedewald-Formel: 

LDL-Chol. (mg/dl) = Gesamtchol. - HDL-Cholesterin - ( Triglyceride / 5 ) 

LDL-Cholesterin: ……....... mg/dl



Gefahrstoffe: 



Ethanol 

„CHOL Calibrator“ 

(laut Gefäßetikett, entspricht 

„CHOL Standard“ laut 

Sicherheitsdatenblatt) 

Als eines von drei Reagenzien 

im in vitro Test 

“CHOL” 

Fa. Analyticon 

"Fluitest HDL-CHOL R1” 

(laut Gefäßetikett, entspricht 

„Fluitest HDL-CHOL 

HDL Cholesterol Precipitating 

Reagent” 

laut Sicherheitsdatenblatt) 


H225 

Angabe nach alter EU-Verordnung: 

T 

R: 60-61-20/21/22-52/53 



Angabe nach alter EU-Verordnung: 

Xi 

Noch keine Angaben nach EU- GHS- 






2 x 10 µl 

2 x 1000 µl 






� Weitere Sicherheitsmaßnahmen, insbesondere im Hinblick auf 

o eine Infektionsgefahr durch Blut der Praktikumsteilnehmer und Patientenmaterial, 

o den Umgang mit dem Reagenz „CHOL Calibrator“ (KMR-Eigenschaften) 

werden vor Ort erläutert!


14 KC-4: Nierenfunktionsdiagnostik, Enzymdiagnostik 


Die Creatinin-Clearance gilt als Meßgröße der Nierenfunktion. Durch die gleichzeitige 

Bestimmung des Serumspiegels und der Ausscheidung des Creatinins in einem 24-Stunden- 

Sammelurin erhält man eine zuverlässige Aussage über die Nierenfunktion. Das Clearance- 

Volumen errechnet sich nach: 

Urin-Creatinin (mg/dl) x Urinvolumen (ml) x 1,73 

CC (ml/min) = _________________________________________________ 

Serum-Creatinin (mg/dl) x 1440 x Körperoberfläche 

Erst bei einer Einschränkung der Nierenfunktion unter 90 ml/min beginnt die 

Serumkonzentration des Creatinins über den Referenzbereich hinaus anzusteigen. 

Im Praktikum führen Sie neben der Ermittlung der Creatinin-Clearance den Nachweis von Blut 

(Hämaturie, Hämoglobinurie), Protein (Proteinurie), Leukozyten (Leukozyturie), Ketonkörper 

und Nitrit aus bereitgestellten Harnproben mit der Teststreifenmethode durch. Anschließend 

beurteilen Sie das Ergebnis hinsichtlich Sensitivität, Spezifität und mögliche Erkrankung des 

Patienten. 

Jede Veränderung der normalen Serumenzymaktivität wird einer Schädigung der Ursprungszelle 

zugeordnet. Zur Interpretation von Enzymaktivitätsänderungen im Serum ist daher die Kenntnis 

über die Herkunft des Enzyms (Organ und intrazelluläre Lokalisation) notwendig. Eine 

Aktivitätssteigerung von Enzymen, die im Zytoplasma vorkommen, zeigt eine leichte, meist 

reversible Zellschädigung an. Steigt die Aktivität vorwiegend mito-chondrialer Enzyme im 

Serum an, deutet dies auf eine Schädigung der Zelle mit Untergang der Mitochondrien hin. 

Im Praktikum bestimmen Sie aus bereitgestellten Serumproben und von einem Probanden die 

Enzymaktivitäten der Transaminasen GOT, GPT sowie der Creatinkinase (CK) am 

Reflotrongerät. Auf die Richtigkeit der Bestimmungen ist zu achten.


14.2. Nachweis von Blut, Protein, Leukozyten, Ketonkörper und Nitrit im Harn mit 

der Teststreifenmethode: 

Untersuchung der bereitgestellten Harnproben mit Hilfe des Teststreifens (Nephur-7) und 

Beurteilung der erhaltenen Ergebnisse im Hinblick auf das mögliche Krankheitsbild. 

Harnprobe 1 Harnprobe 2 Harnprobe 3 Harnprobe 4 

Beurteilung:


14.3. Bestimmung der Creatinin-Clearance: 

Bestimmung des Creatinins aus den bereitgestellten Seren und den Harnproben. Die Creatininbestimmung 

erfolgt am Reflotron. Vorverdünnungen können mit Aqua dest. vorgenommen 

werden (z.B. 1 + 9). Kontrollen für die Beurteilung der Richtigkeit der Messung bitte nicht 

vergessen. 

Die Berechnung der Creatinin-Clearance (CC) wird auf ein Ausscheidungsvolumen von 2.5 

Litern, ausgeschieden in 24 Stunden, bezogen. 

Urin-Creatinin (mg/dl) x Urinvolumen (ml) 

CC (ml/min) = ___________________________________________ 

Probe 1: 

Serum-Creatinin (mg/dl) x 1440 

Creatinin (Serum)= mg/dl, Creatinin (Harn)= mg/dl, CC= 

Probe 2: 


Probe 3: 


Probe 4: 

Creatinin (Serum)= mg/dl, Creatinin (Harn)= mg/dl, CC=


14.4. Bestimmung der Enzymaktivität der Transaminasen GOT, GPT sowie der 

Creatinkinase (CK) eines Probanden und aus den bereitgestellten Seren: 

Die Bestimmung der Transaminasen und der Creatinkinase erfolgt am Reflotron. 

Zur Beurteilung der Richtigkeit der Messung die Kontrollen bitte nicht vergessen. 

GOT 

GPT 

CK 

Kontrolle Proband Serum 1 Serum 2 Serum 3 

Anmerkung: Für die Beurteilung der Ergebnisse können der DeRitis-Quotient (GOT/GPT) und 

der Szasz-Quotient (CK / GOT) eingesetzt werden. 

DeRitis-Quotient: 

GOT/GPT < 0.7 : Leberschaden leichteren Grades, bes. Erkr. entzündl. Natur 

GOT/GPT > 0.7 : Leberschaden schwereren Grades, bes. Erkr. vom Nekrosetyp 

Szasz-Quotient: 

CK/GOT < 10 : Herzmuskelschädigung, bes. Herzinfarkt 

CK/GOT > 10 : Skelettmuskelschädigung, bes. Schock 

Beurteilung der Ergebnisse:



1. Wie ist eine Niere aufgebaut und welche Funktion habem die einzelnen Teile? 

2. Welche 4 Parameter aus der Herzinfarktdiagnostik kennen Sie und bewerten Sie diese 

hinsichtlich ihrer klinischen Relevanz? 

3. Was ist Mittelstrahlurin, Sammelurin und 2. Morgenurin und wann verwendet man diese? 

4. Was versteht man unter einer tubulären, einer glomerulären und unter einer prärenalen 

Proteinurie und bei welchen Erkrankungen treten diese auf? 

5. Was versteht man unter einer Mikroalbuminurie und wie kann man diese nachweisen? 

6. Was versteht man unter einem einfachen, was unter einem zusammengesetzten Test? 

7. Welche Enzyme können zur Diagnose einer akuten Hepatitis bestimmt werden? 

8. Welche Enzyme können zur Beurteilung der Leberfunktion (Fragestellung: schwere Leberhädigung, 

Leberzirrhose) herangezogen werden? 


Gefahrstoffe: 

Stoff Kennzeichen/ Klassifizierung sowie Verwendete Menge/ Konzentration 



Ethanol 


H225 









Blut der Praktikumsteilnehmer und Patientenmaterial, werden vor Ort erläutert!

Praktikumsunterlagen für das Praktikum ... - Pharmazie

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